Efectos diferenciales de inhibidores

selectivos de la ciclooxigenasa-2 sobre los

canales ionicos de clulas de Musculo liso
vascular pueden explicar las diferencias en
los perfiles de riesgo cardiovascular
Lioubov I. Brueggemann , Alexander R. Mackie , Bharat K. Mani , Leanne L. Cribbs , y
Kenneth L. Byron
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Abstracto
Celecoxib, rofecoxib, diclofenaco y se utilizan clnicamente (COX-2) inhibidores de la
ciclooxigenasa-2, que han estado bajo un intenso escrutinio debido a largo plazo rofecoxib
(Vioxx; Merck, Whitehouse Station, NJ) de tratamiento se encontr a aumentar el riesgo de
cardiovascular adverso eventos. Un perfil de riesgo diferenciado para estos frmacos ha
surgido, pero los mecanismos subyacentes no han sido completamente aclarada. Se
investigaron los efectos de celecoxib, rofecoxib, diclofenaco y en las corrientes inicas y la
sealizacin del calcio en las clulas del msculo liso vascular (CMLV) utilizando tcnicas
de patch-clamp y fura-2 fluorescencia y en la constriccin arterial utilizando miografa de
presin. El celecoxib, pero no rofecoxib o diclofenaco, mejorados dramticamente (v 7 K)
las corrientes de potasio KCNQ y suprimidas las corrientes de calcio sensibles al voltaje de
tipo L en A7r5 rata clulas musculares lisas de aorta (corrientes KCNQ nativo o corrientes
KCNQ5 humanos sobreexpresados) y recin aisladas mesentrica de rata miocitos arteria.
Los efectos de celecoxib fueron dependiente de la concentracin en el rango de las
concentraciones teraputicas, y se invirtieron en el lavado. El celecoxib, rofecoxib, pero no,
tambin inhibi respuestas de calcio a la vasopresina en clulas A7R5 y las arterias
mesentricas de ratas intactas o endotelio-desprovistas dilatados. Un anlogo de celecoxib,
2,5-dimetil-celecoxib, que no inhibe la COX-2, celecoxib imitaba en su mejora de las
corrientes vasculares KCNQ5, la supresin de las corrientes de calcio de tipo L, y la
vasodilatacin. Llegamos a la conclusin que el celecoxib inhibe respuestas de calcio en
CMLV mediante la mejora de las corrientes KCNQ5 y suprimir las corrientes de calcio de
tipo L, lo que reduce en ltima instancia, el tono vascular. Estos efectos son independientes
de sus COX-2 acciones inhibitorias y pueden explicar el riesgo diferencial de eventos
cardiovasculares en pacientes que toman diferentes frmacos de esta clase.
El celecoxib (Celebrex, de Pfizer, Nueva York, NY) y rofecoxib (Vioxx, Merck,
Whitehouse Station, NJ) son medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) que
inhiben selectivamente la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Fueron introducidos al mercado en
1999 y se convirti rpidamente en los nuevos frmacos prescritos con ms frecuencia en
los Estados Unidos. Estos medicamentos se utilizan clnicamente para tratar el dolor y la
inflamacin. COX-1 y COX-2 convierten el cido araquidnico en prostaglandina H 2, que

se convierte despus en una variedad de prostanoides, incluyendo prostaglandinas,

tromboxanos, y prostaciclinas. El tromboxano A 2, un producto de la actividad COX-1 en
las plaquetas, promueve la vasoconstriccin, proliferacin del msculo liso, y la agregacin
plaquetaria. En contraste, la prostaciclina generada por COX-2 en las paredes de los vasos
sanguneos promueve la vasodilatacin y la inhibicin de la agregacin plaquetaria. Como /
agentes anti-inflamatorios analgsicos, inhibidores de la COX-2 se consideraron una
mejora sobre / COX-2 inhibidores de menos selectivos de la COX-1, ya que impiden la
generacin de prostaglandinas involucradas en la inflamacin y el dolor sin afectar a
algunos de los efectos beneficiosos de la COX-1 prostanoides -generated. Sin embargo,
estos frmacos han estado bajo intenso escrutinio desde 2004, cuando Vioxx fue retirado
voluntariamente del mercado debido a un aumento en el riesgo reportado de infarto de
miocardio y accidente cerebrovascular en pacientes que toman el medicamento durante
perodos prolongados de tiempo ( Marnett, 2009 ).
Una revisin sistemtica de los ensayos clnicos aleatorios de inhibidores de la COX revel
que rofecoxib, un agente altamente COX-2 selectivo, y diclofenaco, un AINE con COX-2 /
COX-1 selectividad similar a la de celecoxib, tanto aument significativamente el riesgo de
enfermedades cardiovasculares eventos ( McGettigan y Henry, 2006 ). En contraste, un
nmero de estudios clnicos no han demostrado un aumento del riesgo cardiovascular con
celecoxib con respecto a placebo ( McGettigan y Henry, 2006 ; White et al., 2007 ). Las
razones de las diferencias entre celecoxib y otros inhibidores de la COX-2 estn siendo
ampliamente debatidas.
Efectos antihipertensivos pueden dar lugar a un menor nmero de complicaciones
cardiovasculares con celecoxib en comparacin con otros inhibidores de la COX-2. Metaanlisis de los resultados de 19 ensayos clnicos con inhibidores de la COX-2 revel un
riesgo significativamente menor de desarrollar hipertensin en los pacientes tratados con
celecoxib en comparacin con rofecoxib ( Aw et al., 2005 ). Asimismo, un anlisis
retrospectivo de las historias clnicas de los pacientes tratados con celecoxib o rofecoxib
durante un perodo de 90 das, revel que, mientras que la presin arterial sistlica fue
significativamente elevado despus de 90 das entre los pacientes tratados con rofecoxib, la
presin arterial sistlica disminuy ligeramente entre los tratados con celecoxib- pacientes (
Cho et al., 2003 ).
Varios estudios recientes han reportado efectos vasodilatadores de celecoxib ( Hermann et
al., 2003 ; Widlansky et al., 2003 ; . Klein et al, 2007 ), lo que puede explicar sus efectos
diferenciales sobre la presin arterial en relacin con otros inhibidores de la COX-2 (
Hermann et al., 2003 ). En este artculo, hemos explorado los mecanismos que podran ser
la base de las acciones vasodilatadoras y menor riesgo de complicaciones cardiovasculares
para celecoxib, que examinan los efectos de celecoxib y otros AINE sobre los canales
inicos del msculo liso vascular y funciones fisiolgicas. Hemos centrado nuestra atencin
en dos tipos de canales inicos que son tal vez el ms importante para determinar el estado
contrctil de las clulas del msculo liso vascular (CMLV): los canales de K + que
determinan la tensin de membrana en reposo, y de tipo L voltaje de Ca 2+ canales, la
activacin de los cuales induce Ca 2 + afluencia, contraccin del msculo liso, y la
vasoconstriccin. Proporcionamos una clara evidencia de que ambos tipos de canales
inicos estn robustamente afectados por celecoxib, pero no por rofecoxib o diclofenaco a

concentraciones teraputicas comparables. Estos efectos de los canales inicos tienen

importantes consecuencias funcionales para CMLV Ca 2+ de sealizacin y el tono
vasomotor de las arterias de resistencia.

Materiales y mtodos
El aislamiento de los miocitos.
Todos los estudios con animales fueron aprobadas por el Comit de Animales Chicago
Institucional de Cuidado y Uso de la Universidad Loyola. Ratas macho adultas SpragueDawley (n = 20) fueron anestesiados por inhalacin con isoflurano, y los segmentos de
mesenterio intestinal se eliminaron quirrgicamente como se describe anteriormente (
Henderson y Byron, 2007 ). Mtodos para el aislamiento de las clulas del msculo liso de
las arterias mesentricas (MASMCs) se describieron previamente ( Mackie et al., 2008 ).
Recin MASMCs aisladas se mantuvieron en hielo hasta su uso. Las clulas fueron
dispensadas sobre una base de cubreobjetos de vidrio de la cmara de registro y se dejaron
adherir durante al menos 15 min a temperatura ambiente.
Cultivo celular.
Clulas A7R5 se cultivaron como se ha descrito previamente ( Byron y Taylor, 1993 ). Para
los estudios de sobreexpresin KCNQ5, se subcultivaron clulas A7R5 en 50 a 70% de
confluencia fueron transfectadas con una secuencia de ADN KCNQ5 humana marcado con
FLAG (insertado en un pIRES2-mejorado verde fluorescente vector de la protena) usando
Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con reactivo de transfeccin el
protocolo del fabricante. Subculturas confluentes de clulas A7R5 se tripsinizaron y se
volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio. Las clulas que expresan la protena
fluorescente verde se utilizaron para el registro electrofisiolgico 5 a 10 das despus de la
transfeccin.
Patch Clamp.
La configuracin de parche perforado conjunto de clulas se utiliz para medir corrientes
de membrana en condiciones de fijacin de voltaje. La anfotericina B (120 mg / ml) en la
solucin interna se utiliza para la perforacin parche de membrana. Todos los experimentos
se realizaron a temperatura ambiente con perfusin continua de solucin del bao como se
ha descrito previamente ( Brueggemann et al., 2007 ; Mackie et al., 2008 ).
Los potenciales de orden de voltaje-clamp se generaron utilizando un amplificador
Axopatch 200B bajo el control del software pCLAMP8 (Molecular Devices, Sunnyvale,
CA). Procedimientos para la grabacin KCNQ corrientes de K + y de tipo L de Ca 2 +
corrientes fueron esencialmente como se describe anteriormente ( Brueggemann et al., 2005
, 2007 ; . Mackie et al, 2008 ). Los detalles de los protocolos de tensin y condiciones de
registro se proporcionan en los materiales suplementarios.

[Ca 2 +] i Las mediciones con Fura-2.

Esencialmente como se describe anteriormente ( Mani et al., 2009 ), las monocapas
confluentes de clulas A7R5 cultivadas en placas de seis pocillos se lavaron dos veces con
medio de control (NaCl 135 mM, 5,9 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgCl 2, 11,5
mM de glucosa y 11,6 mM HEPES, pH 7,3) y despus se incubaron en el mismo medio con
1 mM fura-2 / acetoximetil ster (Invitrogen), 0,1% de albmina de suero bovino, y 0,02%
de detergente Pluronic F127 durante 60 min a temperatura ambiente ( 22-25 C) en la
oscuridad. Fura-2 fluorescencia se midi usando un lector de placa Biotek Sinergia HT
(340- y 380-nm de excitacin, emisin 510 nm) (BioTek Instruments, Winooski, VT).
Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Frecuencia de clavar se
calcul como el nmero de espigas por minuto a partir del momento de inicio de la
repetitiva Ca 2+ clavar. Cada "n" representa la media de pocillos por triplicado.
Miografa presin.
Los mtodos utilizados para aislado miografa presin de la arteria se han descrito
anteriormente ( Henderson y Byron, 2007 ). Para algunos experimentos, despus de la
diseccin de una arteria mesentrica, denudacin endotelial se realiz frotando suavemente
la luz arterial con un cabello humano. Una pequea cantidad de aire (~ 0,5 ml) y despus se
pas a travs del lumen de perturbar an ms el endotelio, seguido de solucin salina
fisiolgica para eliminar las clulas endoteliales. Para confirmar la atenuacin de la funcin
endotelial, la vasodilatacin dependiente del endotelio se evalu despus de preconstriction
de las arterias con 100 pM [Arg 8] vasopresina (AVP). Tras el desarrollo de un nivel estable
de constriccin, concentraciones crecientes del vasodilatador carbacol dependiente del
endotelio se administraron. En las arterias intactas, carbacol 10 mM indujo 97 1,2%
dilatacin (n = 7), pero en las arterias denudadas, la misma concentracin indujo
significativamente menos dilatacin (49 14%, n = 6, p <0,005, prueba de la t de Student;
Suplementario La Fig. 3). Despus de la evaluacin de dosis-respuesta carbacol, la atropina
(100 mM) se administr a revertir los efectos de carbacol. Cuando la constriccin inducida
por AVP fue restaurado a su nivel original, se administr celecoxib (ver Resultados; Fig. 5
A).
Estadsticas.
SigmaStat (Systat Software, Inc., Point Richmond, CA) se utiliz para todos los anlisis
estadsticos. Prueba de la t de Student pareada se utiliz para la comparacin de los
parmetros medidos antes y despus de los tratamientos. Las comparaciones entre mltiples
grupos de tratamiento se evaluaron por anlisis de varianza (ANOVA) seguido por una
prueba post hoc Holm-Sidak. Datos de concentracin-respuesta acumulativas fueron
analizados por ANOVA de medidas repetidas y el test post hoc Holm-Sidak. Las diferencias
asociadas con p 0,05 se consideraron estadsticamente significativos.
Materiales.
Medios de cultivo celular fueron de Invitrogen o MediaTech (Herndon, VA). Reactivo
Lipofectamine fue de Invitrogen. El celecoxib y rofecoxib eran de LKT Laboratories, Inc.

(St. Paul, MN). Linopirdine, flupirtina, sal de diclofenaco de sodio, colagenasa, elastasa,
[Arg 8] vasopresina, carbacol, la atropina, y verapamil fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO). La anfotericina B era de Calbiochem (San Diego, CA). cDNA que codifica la bandera
de etiquetado KCNQ5 humana fue generosamente proporcionada por el profesor Thomas
Jentsch (Leibniz-Institut fr Molekulare Pharmakologie, Berln, Alemania). 2,5-dimetilcelecoxib fue generosamente proporcionada por el Dr. Axel Schnthal (Universidad del Sur
de California, Los Angeles, CA).

Resultados
COX-2-Independientes Efectos de celecoxib en clulas de msculo liso vascular Ion
Channels.
K + y Ca 2 + corrientes en las clulas musculares de rata A7r5 articas lisas vasculares se
registraron simultneamente bajo condiciones inicas aproximadamente fisiolgicos, como
se ha descrito previamente ( Brueggemann et al., 2007 ). Inward Ca 2 + corrientes se
registraron a principios del 5-s etapas de tensin, y K + corrientes en estado estacionario se
registraron en los extremos de los pasos de voltaje ( Fig. 1 A). Aplicacin de 10 mM
celecoxib mejora considerablemente K + corrientes hacia el exterior (por 2.3- 0,3 veces a
-20 mV; Fig. 1 , B-D; Tabla Suplementaria 1) y aboli el Ca 2+ hacia adentro de corriente (
Fig. 1 , A y E). La inhibicin de Ca 2 + corrientes reproducible precedida mejora de
corrientes de K + ( Fig. 1 C). Ambos efectos fueron reversibles en lavado de celecoxib
(Tabla Suplementaria 1).

Fig. 1.

Mejora de K + actual y la inhibicin de la corriente de Ca 2+ por celecoxib y DMC, pero no

rofecoxib o diclofenaco, en clulas A7R5. A, trazas representativas de su conjunto de
clulas K + y Ca 2 + corrientes medidos en una sola clula A7r5 (capacitancia = 215 pF); i,
control; ii, en la presencia de 10 mM celecoxib. Inward Ca 2 + corrientes, activados al
comienzo de las etapas de tensin, se muestran en inserciones en escala ampliada para
mayor claridad. B, curvas IV, correspondiente a las trazas en A, para el estado de
equilibrio K + corrientes (smbolos rellenos) y del pico hacia el interior Ca 2+ actual
(smbolos abiertos) en el control (crculos), en presencia de 10 mM celecoxib (tringulos),
y despus de lavado de celecoxib (tringulos invertidos). Se llev a cabo la sustraccin de
fugas. C, curso del tiempo de la inhibicin del pico hacia el interior Ca 2+ corriente medida
con rampas de voltaje de 100 ms -74 a 36 mV () y K + de activacin actual () medida

como corrientes de medios correspondientes en los extremos de 5- s pasos de voltaje a -20

mV. Bar abierto indica que la aplicacin de 10 mM celecoxib. Un descanso de 10 minutos
en la grabacin transcurso de tiempo se indica. Se llev a cabo la sustraccin de fugas. El
recuadro muestra los cambios iniciales en las corrientes, previa solicitud celecoxib en
escala ampliada. D y E, K + densidades de corriente a -20 mV y pico hacia adentro Ca 2+
densidades de corriente, respectivamente, registrados en la presencia de 10 mM celecoxib
(CXB, n = 5) dimethylcelecoxib 10 mM (DMC, n = 4), 10 rofecoxib mu M (R, n = 5), 10
mM diclofenaco (D, n = 5), 10 mM de flupirtina (F, n = 6), y 10 mM verapamil (V, n = 5).
*, Diferencia significativa con el control (p <0,05, emparejado prueba de la t de Student);
#, Ausencia de corriente interna detectable. Las salidas de corrientes de K + se midieron en
los extremos de 5-s pasos de voltaje a -20 mV, mientras que las corrientes de tipo L se
midieron como el pico de corriente de entrada durante el paso de tensin que produjo la
mxima corriente de entrada (pasos de voltaje que van desde -74 a 36 mV). En ambos
casos, se aplic la substraccin de fugas, y se hicieron mediciones despus de que los
efectos de los tratamientos se haban estabilizado (entre 10 y 20 min, dependiendo del
tratamiento).
El mismo conjunto de experimentos se repiti con la altamente selectivo de la COX-2
rofecoxib ( Patrono et al., 2001 ) y con diclofenaco, que exhibe un perfil de selectividad de
la COX-2 / COX-1 similar a la de celecoxib ( Patrono et al. , 2001 ). Ni rofecoxib (10 mM)
ni diclofenac (10 mM) afectado significativamente Ca 2 + o K + corrientes ( Fig. 1 , D y E).
Sin embargo, la aplicacin de 10 mM celecoxib despus de lavado de diclofenac o
rofecoxib todava robusta reforzada corrientes de K + y Ca 2 + corrientes inhibida (Tablas
Suplementarios 2 y 3). (Un anlogo de celecoxib, 2,5-dimethylcelecoxib (DMC, 10 M), que
no inhibe la COX-2 (IC 50> 100 mM) . Schnthal et al, 2008 ), imita los efectos tanto de
celecoxib: mejora de corrientes de K + y la inhibicin de Ca 2 + corrientes ( Fig. 1 , D y E;
Suplementario las Tablas 1 y 2). Flupirtine (10 M), un activador de KCNQ canales de K +,
imit slo la mejora de K + corrientes, mientras que el verapamilo (10 M), un bloqueador
conocido de tipo L de Ca 2 + corrientes, aboli las entraas Ca 2 + corrientes y parcialmente
inhibido el K + corrientes (hacia fuera Fig 1. , D y E; Tabla Suplementaria 3).
Efectos de celecoxib en Corrientes KCNQ5.
Las salidas de K + corrientes medidas en las clulas A7R5 en los potenciales de membrana
-20 mV previamente se han atribuido a K v 7.5 (KCNQ5) la actividad del canal (
Brueggemann et al., 2007 ; Mani et al., 2009 ). Usando condiciones para registrar corrientes
KCNQ5 en aislamiento, se evalu la relacin dosis-respuesta acumulativa para celecoxib (
Fig. 2 , A y B). A concentraciones 1 mu M, celecoxib robusta y significativamente
realzada corrientes KCNQ5 nativas, con un efecto mximo (mejora de> 3 veces) en 20 mM
celecoxib ( Fig. 2 B;. Supplemental Fig 1A). El aumento de la amplitud de la corriente por
KCNQ5 10 mM celecoxib no se asoci con un cambio en el voltaje de la dependencia de la
activacin (Supplemental Fig. 1B).

Fig. 2.

Mejora de las corrientes KCNQ en clulas A7R5 y miocitos arteria mesentrica recin
aisladas. A, IV relaciones de corriente aislado KCNQ5 endgena en clulas A7R5. Control
(, n = 14); Celecoxib 1 mM (crculos grises oscuros, n = 9); Celecoxib 10 mM (tringulos
de color gris claro, n = 9); 20 mM celecoxib ( , N = 8). Se llev a cabo la sustraccin de
fugas. B, acumulativos celecoxib dosis-respuesta: densidades de corriente KCNQ5
medidos a -20 mV se normalizaron para controlar las densidades de corriente a -20 mV. *,
Una diferencia significativa del control (1 mM celecoxib, p <0,05, n = 9; 5 mM celecoxib,
p <0,05, n = 5; 10 mM celecoxib, p <0,001, n = 9; 20 mM celecoxib, p <0,001 , n = 8; 30
mM celecoxib, p <0,001, n = 3; emparejado prueba de la t de Student). C, relaciones IV de
corrientes KCNQ en MASMCs; control (); 10 mM celecoxib (); despus de lavado de
celecoxib (); y 10 mM linopirdine (). *, Diferencia significativa de control (n = 5, p

<0,05, emparejado prueba de la t de Student). D, transcurso de tiempo representativa de la

corriente de KCNQ registrada a -20 mV en un solo MASMC (C = 43 pF) antes y durante la
aplicacin de 10 mM celecoxib (barra blanca). E, relaciones corriente-tensin medidos en
las clulas que sobreexpresan A7R5 canales KCNQ5 humanos; control (); 10 mM
celecoxib (); y despus de lavado de celecoxib (). *, Diferencia significativa de control
(n = 5, p <0,05, emparejado prueba de la t de Student). F, transcurso de tiempo
representativa de la corriente hKCNQ5 registrada a -20 mV en una sola clula A7r5 (C =
83 pF) antes y durante la aplicacin de 10 mM celecoxib (barra blanca).

Canales KCNQ5 se expresan tambin en los miocitos arteriales, y se han encontrado

recientemente corrientes KCNQ contribuir al potencial de reposo de la membrana en
MASMCs rata ( Mackie et al., 2008 ). Encontramos que las corrientes KCNQ en MASMCs
fueron fuertemente reforzadas por 10 mM celecoxib. Despus del tratamiento a corto plazo
con 10 mM celecoxib, las corrientes KCNQ fueron establemente mejorado, y este efecto se
revirti despus de lavado de celecoxib ( Fig. 2 , C y D). Como se inform anteriormente (
Mackie et al., 2008 ), en estas condiciones de grabacin, corrientes hacia el exterior miden
a voltajes -20 mV fueron completamente abolido por el canal selectivo KCNQ linopirdine
bloqueador ( fig. 2 C). Ni rofecoxib (10 mM) ni diclofenac (10 mM) afectadas las
corrientes KCNQ en MASMCs (Fig Suplementario. 1, C y D).
Tambin midieron los efectos de celecoxib en los canales KCNQ5 humanos
sobreexpresados utilizando las clulas A7R5 como sistema de expresin. Debido a que los
canales exgenos producen corrientes de reposo que son aproximadamente 2 rdenes de
magnitud mayor que las corrientes nativas (comparar las escalas en la Fig. 2 , A y E),
grabaciones reflejan predominantemente la actividad de los canales humanos con poca
contribucin de los canales nativos. Se encontr que celecoxib robustamente mejorado
corrientes KCNQ5 humanos, y este efecto se invierte completamente despus de lavado de
celecoxib ( Fig. 2 , E y F).
Efectos de celecoxib en los canales de tipo L de Ca 2+.
Usando condiciones para grabar de tipo L Ca 2 + corrientes en aislamiento, se observ una
supresin dependiente de la concentracin y reversible de las corrientes por celecoxib (IC 50
= 8,3 1,3 M; Fig. 3 , A y B). Celecoxib (10 M) indujo una inhibicin pronunciada de Ca 2+
amplitud de la corriente, junto con un cambio positivo significativo de la curva de
activacin (~ 12 mV) ( Fig. 3 C). Se observ un efecto similar cuando se us Ba 2+ como el
portador de carga ( Fig. 3 D). En ambos casos, el cambio en la activacin se invirti
despus de lavado de celecoxib (datos no mostrados).

Fig. 3.

El celecoxib inhibe de tipo L de Ca 2 + corrientes en las clulas A7R5 y MASMCs. A, curvas

IV representativas de Ca 2 + corrientes registrados en una sola clula A7r5 (2 mM Ca 2+
como un portador de carga; capacitancia = 140 pF); control (); 1 mM celecoxib (); 3
mM celecoxib (); 10 mM celecoxib ( ); y 30 mM celecoxib (). B, parcela acumulativa
dosis-respuesta del pico hacia el interior Ca 2 + corrientes, normalizados para controlar Ca
2+
actual y ajuste a una ecuacin de Hill (IC 50 = 8,3 1,3 M). *, Diferencia significativa
de control (n = 3.12, p <0,001, ANOVA de una va seguida por pareja comparacin con el
mtodo de Holm-Sidak). C y D, la conductancia fraccional normalizado medido en clulas

A7R5 con 2 mM Ca 2+ (n = 11) y 10 mM Ba 2+ (n = 5), respectivamente, instalado en una

distribucin de Boltzmann; control (, V 0,5 = -18,8 0,2 mV en Ca 2+; V 0,5 = -20,9 0,3
mV en Ba 2+); 10 mM celecoxib (, V 0,5 = -6,8 0,3 mV en Ca 2+; V 0,5 = -12,1 0,7 mV en
Ba 2+). E, significa curvas IV: tipo L de Ca 2 + corrientes registradas en MASMCs (n = 3) con
10 mM Ba 2+ como un portador de carga; control (); 10 mM celecoxib (); despus de
lavado de celecoxib (). F, la conductancia fraccionaria normalizada mide en MASMCs,
instalado en una distribucin de Boltzmann; control (, V = 0,5 -6,5 0,3 mV, n = 3); 10
mM celecoxib (, V = 0,5 -2,0 0,4 mV, n = 3).

Tipo L de Ca 2 + corrientes tambin se midieron en los miocitos arteriales mesentricos

recin aisladas. Uso de Ba 2+ como un portador de carga, encontramos que las corrientes de
tipo L se suprimieron significativamente por 10 mM celecoxib ( Fig. 3 , E y F). Con 2 mM
Ca 2+ como portador de carga, las corrientes de tipo L eran ms pequeos, pero el efecto de
10 mM celecoxib fue similar (datos no mostrados).
Efectos funcionales de KCNQ5 Activacin del canal y / o inhibicin de los canales de
tipo L de Ca 2+.
Ambos canales KCNQ5 y tipo L de Ca 2 + canales son importantes para las respuestas
funcionales de CMLV. Hemos demostrado la implicacin de ambos tipos de canales en la
estimulacin de repetitivo Ca 2+ enriquecidas en clulas A7R5 tratados con una
concentracin fisiolgica de AVP ( Byron, 1996 ; Brueggemann et al., 2007 ; Mani et al.,
2009 ). Celecoxib (10 mM), pero no rofecoxib (10 mM) completamente abolida AVP
estimulada por Ca 2+ spiking cuando se aade al mismo tiempo como 25 pM AVP ( Fig. 4 se
aadieron), y al remate ces cuando celecoxib (pero no rofecoxib) despus de el logro de
una Ca 2 + respuesta clavar sostenida a 25 AVP pM (Fig Suplementario. 2).

Fig. 4.

El celecoxib, rofecoxib, pero no, suprime inducida por AVP Ca 2+ enriquecidas en clulas
A7R5. A, Ca 2+ clavar en una monocapa confluente de fura-2-cargado clulas A7R5
tratados con AVP 25 pM. Trazas representativos muestran la ausencia de Ca inducida por
AVP 2+ clavar con adicin simultnea de celecoxib (10 mM, medio), pero no con la adicin
de vehculo (parte superior) o rofecoxib (10 M, parte inferior). En ocho de los nueve pozos
tratados con celecoxib estimulada por AVP Ca 2+ clavar estaba ausente, mientras que
todos los pozos tratados con vehculo o rofecoxib pinchos robusta. B, grfico de barras
muestra reduce significativamente la frecuencia de inducida por AVP Ca 2+ spiking en
presencia de celecoxib (n = 3) en comparacin con el control (n = 6) o rofecoxib (n = 3)
(*, p <0,05; uno ANOVA de un factor seguido de comparacin por pares con el mtodo de
Holm-Sidak).

Tambin se examinaron los efectos funcionales de celecoxib sobre las respuestas

vasoconstrictoras de las arterias mesentricas de ratas sometidas a presin. Celecoxib
inducida por la dilatacin dependiente de la concentracin de las arterias mesentricas
preconstricted con 100 AVP pM ( Fig. 5 A). Hemos encontrado que la interrupcin del
endotelio (. Supplemental Fig 3) no redujo la vasodilatacin inducida por celecoxib, lo que
sugiere que la respuesta estaba mediada a nivel de las clulas musculares lisas ( Fig. 5 B).
Los valores de EC50 (11,2 1,1 m para las arterias intactas, 8,9 0,8 m para las arterias
desnudas) no fueron significativamente diferentes. En un conjunto separado de
experimentos, rofecoxib o diclofenac (ambos a 20 mM) inducida por la dilatacin muy
modesto (11,5 2,5 y 5,8 2,0%, respectivamente) de las arterias preconstricted con 100
AVP pM, mientras que celecoxib a la misma concentracin completamente dilatado de la
misma arterias (a ~98% del dimetro exterior mximo; Fig. 5 C). DMC fue tambin muy
eficaz como un vasodilatador: arterias constreidas por 100 pM AVP se relajaron a 99,9
0,1% (n = 3) de su dimetro original en la presencia de 20 mM DMC ( Fig 5. D).
Vasoconstriccin Las acciones vasodilatadores de celecoxib pueden deberse a la activacin
de canales de K + KCNQ o inhibicin de tipo L de Ca 2 + canales, ya sea de las que hemos
mostrado anteriormente puede revertir AVP-inducidos en arterias mesentricas de rata (
Henderson y Byron, 2007 ; Mackie et al., 2008 ). Para evaluar si el Ca 2+ -canal acciones de
bloqueo de celecoxib son suficientes para inducir la dilatacin, se trataron las arterias
mesentricas con una concentracin mxima del vasoconstrictor KCNQ bloqueador de los
canales linopirdine y luego agregamos 20 mM celecoxib (en estudios de patch-clamp, se
verific que celecoxib no puede revertir los efectos inhibitorios de linopirdine sobre
corrientes KCNQ en MASMCs;. Suplementario figura 1F). A pesar de que la activacin de
los canales de KCNQ vasculares fue impedido por linopirdine, celecoxib produjo cerca de
la relajacin completa de todas las arterias ensayadas (95 1,4% dilatacin mxima, n = 3;
una grabacin representativo se muestra en la figura 5. E).

Fig. 5.

El celecoxib dilata las arterias mesentricas preconstricted. A, grabacin representante de

dependiente de la dosis que demuestra el dimetro del vaso dilatacin exterior de una
arteria mesentrica tratada con crecientes concentraciones de celecoxib. La atropina (ver
Materiales y Mtodos) se utiliza para restaurar 100 constriccin inducida por AVP pM
despus del tratamiento con el dilatador carbacol dependiente del endotelio (vase Fig
Suplementario. 3). B, celecoxib relacin dosis-respuesta para las arterias intactas y
endotelio-desprovistas. C, trazas representativas (izquierda) que ilustran la incapacidad de
20 mM rofecoxib (arriba) y diclofenac 20 micras (parte inferior) para dilatar arterias
preconstricted con AVP 100 pM. Celecoxib (20 mM) dilata completamente de las mismas
arterias cuando se aade despus de que cualquiera rofecoxib o diclofenac. El grfico de
barras a la derecha de cada traza representante ilustra la dilatacin media causada por
cada medicamento. *, Significativamente menor dilatacin de celecoxib, p <0,001, prueba
de la t de Student. D, representante de grabacin que demuestra que DMC (20 M) produce
dilatacin completa de las arterias preconstricted con 100 pM AVP; representativos de tres
experimentos similares. E, representante de grabacin que demuestra que el celecoxib (20

M) tambin produjo completa dilatacin de las arterias preconstricted con el linopirdine

bloqueador de los canales KCNQ selectiva (10 M); representativos de tres experimentos
similares.

Discusin
Nuestros hallazgos podran ayudar a explicar por qu el celecoxib es un frmaco ms
seguro en trminos de complicaciones cardiovasculares en comparacin con rofecoxib o
diclofenaco. Hemos encontrado que, a diferencia de rofecoxib o diclofenaco, celecoxib
aumenta potentemente corriente de potasio KCNQ e inhibe la corriente de calcio de tipo L
en CMLV, resultando en marcada dilatacin de las arterias intactas. Estas acciones de la
COX-2-independientes pueden compensar lo que de otro modo sera un aumento
perjudicial en la vasoconstriccin mediada por la inhibicin de la COX-2. En contraste,
para rofecoxib y diclofenac, que no presentan este efecto protector mediado por canales de
iones, los COX-2 efectos vasoconstrictores de inhibicin mediada son sin oposicin, tal vez
representa el aumento de sus complicaciones cardiovasculares.
Las concentraciones mximas medidas de celecoxib en el plasma de los pacientes que
tomaron el medicamento para el dolor y / o inflamacin en general promedio entre 1 y 3 m,
mientras que las concentraciones teraputicas de rofecoxib y diclofenaco son ligeramente
inferiores ( Hinz et al., 2006 ). Las concentraciones plasmticas considerablemente mayor
de celecoxib se pueden lograr en pacientes con metabolismo ms lento ( Lundblad et al.,
2006 ; Shi y Klotz, 2008 ) o cuando se administran dosis ms altas (por ejemplo, como una
terapia contra el cncer) ( . Sauter et al, 2008 ) . Los efectos significativos de celecoxib
sobre corrientes CMLV KCNQ5 y tipo L de Ca 2 + corrientes fueron evidentes dentro de la
gama de concentraciones clnicamente obtenidos, mientras que ni el rofecoxib ni diclofenac
mostraron estos efectos, incluso en concentraciones superiores a los niveles plasmticos
teraputicos. A concentraciones suprateraputicas, efectos adicionales de celecoxib pueden
afectar a las corrientes inicas y dar cuenta de una relacin dosis-respuesta un tanto en
forma de campana para la activacin de KCNQ5. Por ejemplo, celecoxib se ha informado
de inducir estrs del retculo endoplsmico en concentraciones 40 m ( Pyrko et al., 2007 ),
un efecto asociado con citoslica elevada [Ca 2 +] que pueden inhibir directamente o
indirectamente canales KCNQ ( Delmas y Brown, 2005 ). Una reduccin de la corriente
KCNQ5 cuando la concentracin de celecoxib se increment de 20 a 30 micras de CMLV (
Fig. 3 B;. Supplemental Fig 1A) tambin se observ en clulas 293T de rin embrionario
humano que sobreexpresan KCNQ5 humano (resultados no mostrados), lo que sugiere que
es KCNQ5 un objetivo especfico, tanto para las acciones positivas y negativas de
celecoxib.
Aunque celecoxib inhibe potentemente la COX-2, con una CI50 de 0,87 micras ( Mardini y
Fitzgerald, 2001 ), es poco probable que implican la inhibicin de la COX-2 el mecanismo
de modulacin de canales de iones. Otros inhibidores COX-2 selectivos, rofecoxib y
diclofenaco, no imitan celecoxib en sus efectos moduladores de canales inicos, y DMC, un
anlogo de celecoxib que no inhibe la COX-2, fue tan eficaz como celecoxib, tanto en la
mejora de las corrientes de KCNQ5 y la supresin de tipo L de Ca 2 + corrientes.

Queda por determinar si los efectos de celecoxib o DMC en KCNQ5 o de tipo L de Ca 2 +

canales se deben a la interaccin directa con las protenas de los canales respectivos o
indirectas (por ejemplo, con la participacin intermedios de transduccin de seales). Otros
activadores conocidos de KCNQ5, tales como retigabina y flupirtina, se cree que se unen
directamente al canal para estabilizar su estado abierto ( Lange et al., 2009 ). Estos
compuestos tambin desplazan la dependencia de voltaje de activacin de los canales
KCNQ a potenciales ms negativos ( Wickenden et al., 2000 ; Schenzer et al., 2005 ;
Wladyka y Kunze, 2006 ), mientras que no se encontraron cambio en la dependencia de
voltaje de activacin con celecoxib.
Los efectos de celecoxib en los canales KCNQ5 y de tipo L de Ca 2 + canales son
probablemente independiente. Los efectos se ejercen con un poco diferente cursos, tanto en
tiempo de la aparicin del efecto y la reversin despus de lavado fueron temporalmente
distinta para la inhibicin de las corrientes de tipo L en comparacin con el aumento de las
corrientes KCNQ5. Adems, las corrientes KCNQ5 KCNQ activador del canal de flupirtina
mejoradas sin inhibir de tipo L Ca 2 + corrientes, y el Ca 2+ bloqueador -canal verapamilo fue
capaz de inhibir Ca 2 + corrientes sin mejorar corrientes KCNQ5. Aunque estos resultados
sugieren que las actividades de estos tipos de canales no estn inextricablemente unidos,
nuestros resultados no descartan la posibilidad de una sealizacin aguas arriba intermedio
comn de cualquiera de estos efectos de celecoxib.
Hemos encontrado previamente que, o bien la activacin de canales KCNQ (con flupirtina)
o la inhibicin de tipo L de Ca 2 + canales (con verapamilo) fue suficiente para dilatar
totalmente arterias mesentricas de rata preconstricted con AVP ( Henderson y Byron,
2007 ; . Mackie et al, 2008 ). Las observaciones reportadas aqu, que el celecoxib pueden
provocar estos dos efectos de los canales inicos, apoyan la hiptesis de que las acciones
vasodilatadores de celecoxib, y de ah su menor propensin a inducir efectos secundarios
cardiovasculares, el resultado de estas acciones. Es, sin embargo, sigue siendo posible que
los efectos sobre otros canales inicos o efectos no relacionados de celecoxib tambin
contribuyen a la vasodilatacin u otras acciones de proteccin cardiovascular.
El celecoxib no se ha informado anteriormente para activar los canales KCNQ, pero
diclofenaco, un AINE que se utiliza ampliamente para tratar la inflamacin y el dolor, se ha
informado para activar KCNQ2-KCNQ3 (K v 7.2 hasta 7.3) canales heteromricos ( Peretz
et al., 2005 ). Canales KCNQ2-KCNQ3 se encuentran en las neuronas, en las que median
las corrientes "M" bien conocidas que regulan la excitacin neuronal ( Jentsch, 2000 ). El
hallazgo de que las corrientes de KCNQ5 vasculares no se ven reforzadas por diclofenac
puede sugerir la selectividad en las acciones de este medicamento, lo que le permite
distinguir entre los diferentes canales de KCNQ se encuentran en diferentes tejidos.
Muchos de los activadores de los canales KCNQ conocidos, como retigabina y flupirtina,
puede activar canales KCNQ sea neuronales o vasculares ( Mackie y Byron, 2008 ).
Anlogos estructurales de diclofenac se identificaron recientemente en la que la actividad
inhibidora de la COX puede disociarse de la activacin de los canales KCNQ2-KCNQ3, lo
que sugiere que estas actividades implican diferentes restos dentro de la estructura de
drogas ( Peretz et al., 2007 ).

El celecoxib se ha encontrado previamente para inhibir voltaje K + (K v) canales en varios

otros tipos de clulas, incluidas las neuronas de la retina de rata ( Frolov et al., 2008 b) y los
miocitos cardacos ( Frolov et al., 2008 a). Aunque encontramos que el celecoxib mejorado
corrientes KCNQ en MASMCs, tambin encontramos que el celecoxib suprime las
corrientes de K v mucho ms grandes que activan a potenciales ms positivos
(Supplemental Fig. 1E), en consonancia con los efectos observados en las neuronas y
miocitos cardacos. En los miocitos vasculares, la supresin de corrientes de K + por lo
general conduce a Ca 2 + afluencia y la vasoconstriccin, mientras que un aumento de la
actividad de los canales de K + se asocia tpicamente con la vasodilatacin ( Standen y
Quayle, 1998 ). Celecoxib induce la dilatacin de las arterias mesentricas, lo que sugiere
que la mejora de KCNQ actual y / o la supresin de tipo L Ca 2 + corrientes son mayores que
el efecto inhibidor sobre las corrientes de K V en MASMCs.
Aunque estudios previos han implicado a los efectos sobre la funcin endotelial para
explicar las acciones antihipertensivos y vasodilatadores de celecoxib ( Hermann et al.,
2003 ; Widlansky et al., 2003 ; . Klein et al, 2007 ), se observ la concentracin que
dependen efectos vasodilatadores de celecoxib en arterias mesentricas de ratas a presin
que no se atena cuando se interrumpi el endotelio. Esto es consistente con un papel ms
directo de los canales de iones lisas vasculares del msculo en el vasodilatador y acciones
antihipertensivos de celecoxib. El celecoxib (pero no rofecoxib) se haba encontrado para
inhibir tipo L voltaje de Ca 2 + canales en clulas de feocromocitoma PC12 ( Zhang et al.,
2007 ). Bloqueadores del canal de calcio, como verapamilo, diltiazem y nifedipino, se
utilizan clnicamente agentes antihipertensivos que inhiben selectivamente tipo L de Ca 2 +
canales en miocitos vasculares y, en consecuencia dilatan las arterias. Presentamos aqu por
primera vez que el celecoxib acta como un bloqueador de los canales de calcio en los
miocitos vasculares.
La inhibicin de tipo L de Ca 2 + canales en CMLV puede dar cuenta de la mayor parte de
las acciones vasodilatadores de celecoxib en arterias mesentricas a presin, teniendo en
cuenta que la dilatacin mxima se consigue, incluso cuando la activacin del canal KCNQ
fue bloqueado por linopirdine. Sin embargo, a concentraciones submximas de celecoxib,
tipo L Ca 2+ inhibicin del canal se combina con el mejoramiento de las corrientes de K +
KCNQ5. Este ltimo efecto se debe estabilizar el potencial de la membrana en los voltajes
ms negativos. El celecoxib tambin cambia el umbral para la activacin dependiente de la
tensin de los canales de tipo L a voltajes ms positivos; por lo tanto, su probabilidad de
apertura se reduce an ms y el efecto vasodilatador mejorada. A concentraciones de
celecoxib logrado clnicamente, los efectos combinados se observ en las corrientes de tipo
L y corrientes KCNQ5 pueden representar importantes efectos secundarios
cardiovasculares que podran explicar la vasodilatacin observada y pueden dar lugar a una
reduccin en la presin arterial entre los pacientes que recibieron celecoxib en comparacin
con los que tomaban rofecoxib ( Cho et al., 2003 ; Aw et al., 2005 ; Sembradores et al.,
2005 ).
En resumen, celecoxib, y su DMC analgica, son potentes moduladores de vascular KCNQ
K + y L-tipo Ca 2 + canales. Estos efectos se manifiestan por la supresin de VSMC Ca 2+ de
sealizacin y vasorrelajacin, incluso en la ausencia de un endotelio intacto. Estos efectos
potencialmente protectores no son inducidas por otros miembros de esta clase de los AINE,

tales como rofecoxib y diclofenaco, que se han encontrado para aumentar el riesgo de
complicaciones cardiovasculares. Las acciones moduladoras de los canales inicos de la
COX-2-independientes de celecoxib puede explicar el menor riesgo de eventos
cardiovasculares en pacientes tratados con celecoxib. La comprensin de los efectos de
celecoxib o sus anlogos sobre los canales inicos vasculares puede ayudar a predecir los
efectos secundarios cardiovasculares adversos o beneficiosos potenciales y puede conducir
a usos alternativos de estos frmacos en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.