0

1.- IntroduccinContexto del problema y la prctica profesional

La

importancia

del

estudio

de

la

medicina

de

altura

radica

fundamentalmente en la prevalencia de la gran actividad laboral a gran altura

existente en el norte grande de Chile, la cual se desarrolla sobre los 3000 metros
de altitud, considerando principalmente la minera, la cual involucra un elevado
nmero de personas, sobre los 50.000 de acuerdo al Instituto Nacional de
Estadsticas (INE), los cuales se encuentran sometidos a la exposicin a gran
altura de forma intermitente, lo que se conoce como el Modelo Chileno de Hipoxia
Intermitente (Richalet, et al; 2002). Asimismo la medicina de altura tiene
importancia porque genera ciencia bsica y aplicada en las patologas asociadas
en esta rea.
Uno de los pilares fundamentales para generar ciencia bsica en el rea de
la medicina de altura es el desarrollo de la medicina molecular, la medicina
genmica, la farmacogenmica, el diagnstico molecular y la terapia gnica, que
han resultado ser de gran impacto en la biologa molecular y en todas las ciencias
mdicas (Tenover et al., 1997).
En la ltima dcada, las investigaciones en biologa molecular provocaron,
desarrollos biotecnolgicos de fundamental importancia en el campo de la salud,
el cual ha sido uno de los ms beneficiados con el desarrollo de esta tecnologa.
Las investigaciones que se realizan en esta rea estn enfocadas a un diagnstico
oportuno de enfermedades, as como su posible tratamiento a travs de la terapia
que entrega este tipo de tcnicas moleculares. Adems, proporciona una
herramienta fundamental para la solucin de futuras enfermedades mortales para
el hombre (Cerezo y Madrid, 1995).

El Instituto de Estudio de la Salud y Medicina de Altura, centra su

investigacin en las patologas asociadas a la exposicin a la altura,
1

principalmente en el rea cardiovascular, donde una de la lneas importantes de

estudio la constituye una de las patologas ms prevalentes en altura como es la
Hipertensin Pulmonar de Altura. Esta enfermedad, se caracteriza por presentar
una presin arterial pulmonar promedio de > 30 mmHg o una presin pulmonar
arterial sistlica > 50 mmHg medidas en la altura, hipertrofia ventricular derecha,
insuficiencia cardaca, hipoxemia moderada y hematocrito elevado. La prevalencia
de esta patologa a nivel mundial en poblaciones de altura es de un 10 a un 15%
(Len-Velarde, 2003), y en poblaciones chilenas expuestas en forma intermitente
se ha establecido una prevalencia de un 12% de sintomatologa y de hipertensin
configurada de un 4% (Brito et al., 2007).
Dentro de todos los estudios realizados en el IES se utilizan diversas
tcnicas, con las cuales se puede dilucidar los posibles mecanismos involucrados
en patologas asociadas a la altura, algunas de estas tcnicas involucran:
extraccin de protena, a travs del uso del buffer de lisis RIPA, obtencin de RNA
por medio del Mtodo de Chomczynski, adems de tcnicas colorimtricas
correspondiente al Mtodo de Bradford y la determinacin de los Niveles de
Lipoperoxidacin Lipdica.
La motivacin de esta prctica profesional, en el Instituto de Estudios de la
Salud y Medicina de Altura, fue no solo conocer, estandarizar y realizar tcnicas
especficas, sino tambin ser parte de un proyecto conjunto, que llev a participar
en otras etapas del protocolo e interactuar en un ambiente cientfico, donde se
particip activamente en todas las diferentes actividades del IES: como reuniones
de coordinacin, vigilancia del protocolo general, interaccin con acadmicos
extranjeros, discusin de problemas, discusin de resultados, ingreso de datos,
anlisis de datos y procesos administrativos.

2.- Objetivos
2

2.1.- Objetivo General

Conocer y desarrollar tcnicas de laboratorio, procesos de gestin
administrativa, cooperacin internacional, aprendizaje de mtodo cientfico de
investigacin en el Instituto Estudios de la Salud de la Universidad Arturo Prat, el
cual est enfocado en la Salud Ocupacional en la Medicina de Altura.

2.2.- Objetivos Especficos

- Conocer el manejo administrativo del Instituto Estudios de la Salud, con el fin de
adquirir experiencia a la hora de generar la peticin de algn bien o producto
necesario en una empresa.
- Relacionarse con acadmicos extranjeros, hacindose participe del aporte que
estos entregan al Instituto Estudios de la Salud.
- Efectuar tcnicas de extraccin de muestras de tejido, adems del mtodo
cientfico y el proceso de una investigacin.
- Realizar la extraccin de RNA de tejido de rin a travs del Mtodo de
Chomczynski.
- Efectuar la extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar, atreves del
buffer de lisis RIPA.
- Medir la concentracin de protena por medio del Mtodo de Bradford.
- Adquirir experticia en el diseo y desarrollo de investigacin.
- Adquirir conocimientos de un mtodo para medir dao oxidativo, utilizando TBARS.
3

3.- Descripcin de la Empresa

El Instituto de Estudios de Salud y Medicina de Altura (IES), perteneciente
a la Universidad Arturo Prat, el cual depende de Vicerrectora de Investigacin, se
4

crea el 13 de Agosto de 1996 en la ciudad de Iquique, con la misin de responder

a las crecientes demandas de Educacin de pre y postgrado, investigacin en
Salud y de los fenmenos fisiolgicos y patolgicos de la minera en altura de la
1ra regin. Esto con el objetivo de poder entregar y / o proponer respuestas y / o
soluciones a las necesidades acadmicas y de investigacin de la regin en el
mbito de la salud. Especialmente en aquellos que sean de especial preocupacin
de la UNAP. Asimismo, actuar como facilitador y puente en el desarrollo de estas
materias entre la Universidad y la Comunidad externa demandante. Su visin es
poder lograr un centro de investigacin de primera lnea que abarque desde el
rea de salud pblica en conjunto con la fisiologa molecular de acuerdo a las
necesidades de salud regionales.
Las lneas de investigacin estn centrada en:
1)Lnea Matriz Primaria, (Hipoxia Hipobrica Intermitente): estudiados en dos
mbitos.
- Seres Humanos (Epidemiologa Clnica y sus variantes): esto involucra
enfermedades de altura, efectos sobre la salud de las personas, calidad de
vida y efectos de la adaptacin y desadaptacin en seres humanos.
- Laboratorio (Adaptacin en Animales): Efectos fisiolgicos, celulares,
moleculares, y efectos morfolgicos de adaptacin en animales y rganos
especficos; adems de la lnea de nutracuticos posibles para mitigacin.
2) Lnea Matriz Secundaria, (Epidemiologa General): involucra enfermedades
y salud poblacional, estudios poblacionales focalizados y estudio factores
riesgo de enfermedad.
Actualmente el Instituto de Salud cuenta con un grupo consolidado en hipoxia y
trabajo en altura intermitente, multidisciplinario y transversal en el enfrentamiento
de la investigacin. Se orienta hacia la investigacin aplicada y para esto tiene
investigadores con alto grado acadmico (doctorados) que adems realizan
5

docencia. El Instituto de Salud tiene como soporte una amplia red de investigacin
Internacional y Nacional, donde se ha convertido en un referente en el orden
nacional, en relacin a los 4 grupos existentes en Chile e Internacional en Hipoxia
Intermitente. Realiza consultoras pblicas y privadas, adems de realizar
consultoras en el diseo de polticas pblicas sobre el tema de hipoxia de altura,
lo que ha convertido a los integrantes del Instituto en miembros de la comunidad
internacional en hipoxia de altura, en calidad de expertos cientficos.
Algunas de las redes nacionales e internacionales que cooperan con el
Instituto de Salud en las diferentes lneas de investigacin son la Universidad
Cayetano Heredia de Per, La Universidad Autnoma de Madrid, Espaa y la
Universidad de Hamburgo Alemania, Universidad Catlica del Norte de la Serena,
Universidad de Chile, Universidad de Concepcin y Universidad de Tarapac, con
destacadsimos

acadmicos y doctorados en el rea, como lo es la Doctora

Fabiola Len Velarde, de la Universidad Cayetano Heredia del Per, as como, el

Dr. Rainer Boger de la Universidad de Hamburgo, Alemania entre otros igualmente
importantes tanto en el campo internacional como el nacional.
Adems dentro de sus redes de investigacin y cooperacin con instituciones o
empresas del sector pblico se encuentra, la SEREMIA de Salud, Tarapac,
Servicio de Salud, Iquique y el Ejrcito de Chile. Por otra parte el sector privado
como el Consejo Minero, la Compaa Minera Doa Ins de Collahuasi y el
Instituto de Seguridad del Trabajo que han sido un gran soporte para el desarrollo
de un vstago de investigaciones realizadas por el Instituto de Salud.

La organizacin por lo tanto del grupo integral, que realiza la investigacin est
constituido de la siguiente forma:

Figura 1: Estructura organizacional del Instituto de Estudios de Salud.

La prctica profesional fue realizada en el laboratorio del IES, con dependencia

administrativa del Encargado de Investigacin, que est dedicado al desarrollo de
proyectos en el rea de Salud Ocupacional en la Medicina de Altura, desde
estudios poblacionales hasta estudios de carcter biotecnolgicos aplicados en
animales y en humanos.

El trabajo realizado en el Instituto de Salud, consisti en una serie de

actividades que involucraron el anlisis molecular, como extraccin y purificacin
de ADN y RNA, tcnicas colorimtricas. Adems de tareas administrativas,
atingentes a la investigacin, tales como cotizaciones, participacin en diseos de
primer, compras de insumos, interactuar con acadmicos, participacin en cursos
de post grados.

4.- Desarrollo del Tema

La prctica se inici a partir de la entrega del protocolo diseado por el IES
en conjunto con la Universidad de Eppedorff de Hamburgo, Alemania, asimismo se
realiz la compra de los insumos y materiales necesarios, adems del tratamiento
de las muestras para su posterior uso en la realizacin de todas las pruebas como:
la extraccin, purificacin de ADN, RNA y tcnicas colorimtricas, en el IES.

4.1.- Variables a realizar

En esta prctica se realizarn las siguientes variables: se proceder a la
extraccin de los tejidos de rin, hgado y pulmn, para su posterior uso en las
tcnicas utilizadas en el IES. Se efectuaran tcnicas de extraccin, purificacin y
concentracin para obtener tanto protena como RNA, adems se medir el dao
oxidativo provocado por la exposicin a la altura. Todas estas tcnicas sern
explicadas a continuacin.

4.1.1.- Extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar

La metodologa empleada para la extraccin de protena en tejido de arteria
pulmonar consisti en lo siguiente: Previo al protocolo de extraccin de la protena
en arteria pulmonar se debe preparara el buffer de lisis RIPA, el cual debe ser
preparado en el momento de procesar las muestras, este buffer consiste en
diversos reactivos. La cantidad de buffer a preparar depende del peso de la
muestra.

Tabla 1: Preparacin del buffer de lisis RIPA

9

Reactivos para el buffer de Lisis

Concentraciones de los reactivos

(RIPA)

utilizados

Leupeptina
NaF
NaCl
DTT
Hepes
EDTA
EGTA
PMSF
Glicerol

1mg/mL
0,5M
5M
1M
1M
0,1M
0,5M
0,2M
20%

La metodologa utilizada para la extraccin de protena en tejido de arteria

pulmonar con RIPA fue: se procedi a pesar (Balanza Analtica, BEL Ingineering,
Ser N: IT1001526, Max 210g, Made In Italy) y utilizar la totalidad de la arteria, la
cual se introduce en un tubo Eppendorf, posteriormente se aade nitrgeno lquido
para que la muestra quede congelada, de esta forma ser ms eficaz la
homogenizacin de la muestra. Seguido se pulveriza la arteria con la ayuda de un
homogenizador de vstago (Glass-Col Terre Haute, in USA, 6000rpm) para
Eppendorf. A continuacin se aaden 200-300L de buffer por cada arteria, agitar
las muestras en vortex. Enseguida dar un choque trmico a las muestras, despus
congelar las muestras con nitrgeno lquido nuevamente y descongelar en bao a
37C (se debe repetir este procedimiento por 4 veces). Terminado lo anterior,
extraer el sobrenadante. Finalmente cuantificar la protena por el Mtodo de
Bradford.

4.1.2.- Cuantificacin de Protena: Mtodo de Bradford

La tcnicas utilizada para determinar la concentracin de protenas totales
presentes en el tejido de arteria pulmonar fue: se realiz previamente una curva de
calibrado, donde en tubos con concentraciones ya determinadas de BSA (1,5; 2,5;
5,0 y 10 g/mL) diluidas en agua destilada se le agreg el colorante Bradford
10

(Comassie Blue G-250) y se dej incubar por 5 minutos a temperatura ambiente

libre de luz, luego se midi la absorbancia por triplicado (Tabla 6) en un
biofotometro (eppendorf AG Biophotometer) a una longitud de onda de 595 m.
Tabla 2: Concentracin estndar de BSA por mtodo de Bradford (triplicado) a 595m

BSA
[1,5 g/mL]

BSA
[2,5g/mL]

BSA
[5,0g/mL]

BSA
[10g/mL]

TUBO 1

ABS

TUBO 2

ABS

TUBO 3

ABS

TUBO 4

ABS

0,184

0,260

0,484

0,833

1`

0,183

1`

0,258

1`

0,481

1`

0,825

1``

0,184

1``

0,260

1``

0,483

1``

0,822

BLANCO

0,000

Una vez estandarizada la curva de calibrado, se extrae una alcuota de

sobrenadante (1,5L) de la muestra y se almacena en tubos de 1,5mL donde se
diluye con agua destilada y se agrega el colorante Bradford (Comassie Blue G250), se deja incubar por 10 minutos a temperatura ambiente libre de luz,
finalmente se mide la absorbancia y se determina la concentracin de protenas en
la muestra por medio de un biofotometro (Eppendorf AG Biophotometer,
Hamburgo; Alemania),a una longitud de onda de 595nm.

La determinacin de la concentracin de protena se vio afectado por la

inadecuada homogenizacin del tejido arterial de pulmonar, por lo cual se postergo
la medicin de estas concentraciones y solo se obtuvo la curva de calibrado.

11

4.1.3.- Extraccin de RNA total: Mtodo de Chomczynski

4.1.3.1.- Homogenizado del Tejido

Se utiliza el siguiente mtodo estandarizado previamente: se procede a
pesar (Balanza Analtica, BEL Ingineering , Ser N: IT1001526, Max 210g, Made in
Italy) la cantidad necesaria de tejido, en este caso se utiliz rin, se tomaron
50mg de ste, seguido se agregan 0,5mL de la solucin de Chomczynski,
posteriormente

se

centrifuga

12.000rpm

por

10min.

Finalizada

la

homogenizacin se realiza la separacin de fases.

4.1.3.2.- Separacin de Fases

Para la separacin de faces se procede de la siguiente forma: la muestra
obtenida en la homogenizacin anterior se deja incubar a temperatura ambiente
durante 5min. En este paso se puede guardar la muestra a -20C. Si se utiliza la
muestra el mismo da se extraer el sobrenadante y se agrega 01mL de cloroformo,
a continuacin se agita vigorosamente por 15seg. incubndose la muestra durante
por 2-3min. a temperatura ambiente, finalmente se centrifuga la muestra a
12.000rcf por 15min. a 28C.

4.1.3.3.- Precipitacin del RNA

El precipitado de RNA se obtiene de la siguiente manera: Finalizada la
separacin de fases se procede a la precipitacin del RNA, se debe transferir la
fase acuosa superior a un tubo Eppendorf nuevo, se precipita el RNA aadiendo
0.25mL de alcohol isoproplico. Mezclar e incubar por 10min. a -20C. Seguido se
12

centrifuga la muestra a 12.000rcf por 15min. a 2-8C, pasado el tiempo se elimina

el sobrenadante y se lava el precipitado de RNA con 0,5mL de alcohol etlico al
75%, en esta etapa se retira el sobrenadante quedando solo el precipitado. A
continuacin la muestra se centrifuga a 7.500rcf por 5min. a 2-8C. Terminada la
centrifugacin se elimina el sobrenadante y secar el precipitado al aire por 510min. Disolver el RNA en 50L de agua libre de nucleasa (no se debe
resuspender y se debe guardar inmediatamente a -20C). Finalmente cuantificar
por espectrofotmetro (Thermo Electron Corporation GENESYS 6 , USA) a una
concentracin de 260 m para RNA. Con el propsito de verificar la integridad del
RNA extrado y descartar aquellas preparaciones que presentaran degradacin y
contaminacin con protenas y alcoholes, se procedi a medir a travs del
biofotmetro (Eppendorf AG, Biophotometer, Hamburgo, Alemania) con un rango
de absorbancia de 260-280m y de 260-230m, respectivamente, al da siguiente.
El RNA obtenido se utilizara con posterioridad para el anlisis de Real TimePCR.

4.1.4.- Mtodos para medir el dao oxidativo: Nivel de Lipoperoxidacin de

Lpidos por medio de TBARS
Para medir el dao oxidativo se procede con el siguiente protocolo:
previamente al protocolo de extraccin, se debe preparar el buffer de RIPA el cual
consiste en los siguientes reactivos, con sus respectivas concentraciones.
Tabla 3: Preparacin del buffer de RIPA para medir Nivel de Oxidacin de Lpidos
Reactivos para el buffer de lisis

Concentraciones de los reactivos

(RIPA)

utilizados

EDTA
PMSF
NaCl
Tris-HCl
SDS

1M
2M
150L
50M
0,1%
13

Tritn X-100

1%

Se deben pesar (Balanza Analtica, BEL Ingineering , Ser N: IT1001526,

Max 210g, Made In Italy) 0,05mg de tejido (se utilizo hgado y rin) a las
muestras se le agrega el buffer de lisis RIPA (la descripcin de los reactivos para
realizar el RIPA se encuentran en la tabla 3), posteriormente se procede a
homogenizar la muestra por medio del homogenizador de vstago (Glass-Col
Terre Haute, in USA, 6000rpm). En esta etapa la muestra homogenizada se puede
guardar a -20C, si as se lo requiere. Siguiendo el protocolo se extraen 100L del
homogenizado y se incorporan 200L de TCA (Tricloroacetico). Se debe esperar
30min. Luego se centrifuga la muestra a 2.200rfc por 15min. a 4C. Seguido se
elimina el sobrenadante y se aade el TBA al 0,67% (200L). Despus se lleva a
100C por 30min. Pasado los 30min. se debe dejar en completa oscuridad la
muestra por 15min. hasta enfriar y en ltimo lugar se toman 400L de la muestra
para medir la concentracin a travs del espectrofotmetro (Thermo Electron
Corporation GENESYS 6, USA) a una longitud de 532m. Los datos obtenidos
fueron normalizados con respecto a la concentracin de protena obtenida
mediante el ensayo micro Bradford.

4.1.5.- Ensayo de micro Bradford

La metodologa para la cuantificacin de protenas extradas fue: el mtodo
de micro Bradford (Bradford, 1976), para el cual se requiri realizar una curva
estndar utilizando albmina de suero bovino (BSA) preparada como indica la
tabla 3, punto 4.1.2. Posteriormente se procedi a cuantificar las muestras en
estudio con un factor de dilucin 1:999. Se adicion 960L del reactivo Bradford
(bioRad) a los estndares y muestras en estudio. A continuacin estas fueron
incubadas en obscuridad durante 15 minutos y ledas en un biofotomtro
14

(Eppendorf AG, Hamburg, Germany). Obteniendo la concentracin de protenas

en g/mL. Cada muestra se midi por duplicado.

4.1.6.- Otras actividades: Curso de Estadstica en Ciencias de la Salud y su

Aplicacin Informatizada
Dentro de las actividades realizadas en el IES se describe el siguiente
curso: Como parte de las actividades realizadas en la prctica profesional se
particip en el curso de - Estadstica en Ciencias de la Salud y su aplicacin
informatizada -, enmarcado dentro del proyecto Gore - Tarapac, denominado,
"Medicina y Biologa de Altura para la Regin de Tarapac", FNDR - BIP
30125349-0. El curso, se efectu desde el 8 de abril y culmino el 10 de abril,
donde se trataron los conceptos y herramientas estadsticas utilizadas en
Estadstica en Ciencias de la Salud, adems de su aplicacin informatizada para
profesionales con inters en investigacin de origen regional en salud de altura o
en temas relacionados, curso que equivale a un crdito correspondiente a
diplomado o mster (Anexos 1, 2, 3, 4).
El curso fue dictado por el Profesor, Dr. Juan Jos de la Cruz Trocca,
Profesor asociado del Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pblica, de
la Facultad de Medicina, de la Universidad Autnoma de Madrid., posee una gran
experiencia en estadstica aplicada, a participado en mltiples proyectos de
Investigacin Europeos y cuenta con una extensa cantidad de publicaciones.
Adems, posee una colaboracin de ms de 8 aos con la Universidad Arturo Prat
a travs del convenio existente y con el Instituto de Estudios de la Salud, habiendo
participado en mltiples proyectos colaborativos y publicaciones en conjunto
especialmente en el tema de Medicina de Altura.
Al finalizar el curso se realiz una evaluacin la cual consisti en preguntas
estadsticas aplicadas a un modelo de estudio poblacional, dicha evaluacin fue
15

realizada en conjunto con otros dos alumnos del IES, con lo cual la suscrita
aprob con nota 6.9.

4.1.7.- Estudio de Cohorte

Dentro de las actividades realizadas en el IES se dio apoyo al estudio de
cohorte realizado en el mes de abril en la ciudad de Arica, con el fin de medir
diversas condiciones de resistencia en conscriptos del fuerte militar de Arica, tanto
a nivel del mar como en altura. Adems se tomaron muestras de sangre para
determinar la Actividad Arginasa especfica en el IES.

4.1.7.1.-Estudio en humanos
Finalizadas las pruebas y exmenes basales a los conscriptos militares se
precedi a extraer una muestra de sangre las cuales en parte fueron analizadas
por el laboratorio clnico BIONET de Arica y el plasma fue alcuotado para efectuar
la determinacin de Actividad Arginasa en el IES.

5.- Resultados

5.1.- De la prctica general

1.- Se logr la integracin a un equipo de trabajo cientfico, en una institucin
como el IES, que lleva varios aos en investigacin y que posee un
reconocimiento nacional e internacional en el tema de hipoxia.

16

2.- Durante la prctica se gener un contacto directo, entre alumno y distinguidos

acadmicos en el rea de investigacin tanto nacional (Dr. Patricia Siques; Dr.
Julio Brito, IES), como internacional (Dr. Fabiola Len-Velarde, Universidad
Peruana Cayetano Heredia; Lima, Per; Dr. Juan Jos de la Cruz Universidad
Autnoma de Madrid, Espaa). El Dr. Juan Jos de la Cruz, dicto el curso de
Estadstica en Ciencias de la Salud y su aplicacin informatizada, el cual
aporto al conocimiento y manejo de estudios estadsticos para la salud
aplicable al rea de medicina de altura.
3.- La prctica permiti adquirir una mayor experiencia, con nuevos grupos de
trabajo multidisciplinarios en el laboratorio (IES) durante el transcurso de una
investigacin en la prctica.
4.- Se adquiri un aprendizaje y el logro de experticia en tcnicas de estudio
biomolecular, importante para el desempeo profesional a futuro, cmo
tcnicas de extraccin y purificacin de protena a travs del lisado de la
muestra con RIPA y RNA por medio del mtodo de Chomczynski, adems de
tcnicas colorimtricas como es el mtodo de Bradford y la medicin de nivel
oxidativo en lpidos.
5.- Esta prctica fue tutelada en las diferentes etapas de una investigacin
cientfica.
5.1.1.- De la investigacin
A continuacin se presentan un resumen de las tcnicas realizadas
correspondiente a la extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar de rata y
RNA de rin e hgado de rata, en conjunto con tcnicas colorimtricas como el
mtodo de Bradford y Nivel de Oxidacin de Lpidos, realizadas durante la prctica
profesional efectuada en el IES.

17

5.1.2.- Variables Realizadas

1.- En este caso se quiso obtener de manera ntegra la mayor cantidad de
protena posible de arteria pulmonar, esta cantidad ser utilizada para su
posterior anlisis con la tcnica de Western Blot, con el fin de medir los niveles
de protena especficas. Para poder extraer la protena en el tejido se utiliz el
buffer de lisis RIPA el cual consiste en un stock de reactivos a diferentes
concentraciones (Tabla 2), esta buffer se prepara dependiendo de la cantidad
que se quiera utilizar. Una de las funciones que cumple el buffer RIPA es
inhibir proteasas y fosfatasas presente en la muestra, ya que estas pueden
interferir en la obtencin de la protena de inters.
2.- El mtodo utilizado para cuantificar la cantidad de protena presente en el
tejido de arteria pulmonar fue el mtodo de Bradford. El principio se basa en
emplea un colorante hidrofbico cuya disoluciones acuosas en presencia de
Ac. Fosfrico tiene un color pardo y que, al encontrarse en el entorno
hidrofbico del interior de una protena, origina un color azul intenso que se
puede medir fcilmente. Para determinar la concentracin de protena total
presente en una muestra se requiere la preparacin de una curva de calibrado
empleando una protena patrn, que generalmente suele ser la seroalbmina
bovina. Con esta tcnica se pudo cuantificar de manera eficiente la protena
en el tejido de estudio.
3.- Para la extraccin de RNA se utiliz el mtodo de Chomczynski, el cual se
basa en el uso de una solucin monofsica de fenol e isotiocianato de
guanidina para la lisis de las clulas y la separacin de las muestras en dos
fases (acuosa y orgnica). Seguida de la extraccin y precipitacin del RNA
total con cloroformo e isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa.
A travs de este mtodo se pudo obtener RNA, comprobando tanto su
concentracin como su pureza, por medio de espectrofotometra y
biofotometro respectivamente.

18

4.- La tcnica de TBARS, determina la reaccin de sustancias reactivas al cido

tiobarbitrico (TBARS) de las cuales el MDA (malondialdehdo) es el producto
ms importante de la oxidacin de los cidos grasos poliinsaturados. El MDA
es el aldehdo ms significativo obtenido en dicha degradacin y tambin el
ms cuantificado. El MDA, en condiciones de bajo pH y alta temperatura,
reacciona con el cido tiobarbitrico (TBA) dando lugar a un aducto MDA-TBA
cromgeno o pigmento rojo que es detectable por espectrofotometra. El
objetivo de este estudio ha sido determinar las condiciones experimentales
ptimas para la determinacin de los lipoperxidos, mediante la reaccin con
TBA, con el fin de establecer una pauta de trabajo que permita el anlisis
rutinario y la obtencin de resultados reproducibles. Bajo este protocolo se
logr medir el dao oxidativo en tejido de hgado y rin.
5.- En cuanto al curso de estadsticas se logr el aprendizaje del programa
estadsticos SPSS para ser aplicados en el rea de la salud, especficamente
en el rea de altura, guiado por el profesor experto en estadstica Dr. Juan
Jos de la Cruz, quien explico de manera didctica con un caso de estudio
estadstico real, pudiendo comprender cada una de las funciones estadsticas
del SPSS

6.- Por ltimo la participacin en el estudio de cohorte, como en el caso del

proyecto de investigacin con los conscriptos militares de la regin de Arica y
Parinacota, a cargo de la Dra. Patricia Siqus, fue de mucho agrado y de gran
importancia para el rea de la biotecnologa mdica, ya que permite tener
conocimiento sobre las etapas, los protocolos a utilizar y las etapas
administrativas y burocrticas necesarias para realizar estudios de este tipo,
con seres humanos, como parte del desarrollo en el rea profesional, para
futuros ensayos clnicos.

19

6.- Discusin
1.- Un paso importante al momento de tratar un tejido y obtener protena, es
extraer de manera eficiente la mayor cantidad de protenas en la muestra. En
este caso fue uno de los puntos ms complicados ya que el tejido de arteria
pulmonar a utilizar era demasiado fibroso, lo cual hace que el tejido vuelva a
su estado original dificultando su homogenizacin. No tan solo la constitucin
del tejido fue una dificultad, tambin lo fue el homogenizador, puesto que no
se tena el vstago adecuado para poder homogenizar de manera eficiente la
muestra de tejido. Tambin un probable problema es la falta de detergente que
se deben adicionar para tratar la muestra de forma ms eficaz y as conseguir
20

la mayor cantidad de protena posible. A pesar de que el RIPA es uno de los

buffer de extraccin altamente eficiente para la lisis celular rpida y posee una
buena solubilizacin sobre una amplia gama de protenas, aumentada an
ms su compatibilidad con la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa, la
capacidad para minimizar la unin de protenas no especficas conducen a un
menor error en la inmunoprecipitacin y su idoneidad para la cuantificacin de
protena (Ngoca, 2008), no pudo lograr una adecuada extraccin de protena,
por lo que puede modificarse el protocolo para que sea mucho ms eficiente
en este tipo de tejido.
2.- Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una
tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una
protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una
preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para
otros muchos propsitos (Suelter, 1985). El mtodo de Bradford es simple,
rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las
sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas
(Bradford, 1976).
Considerando lo anteriormente mencionado se debe tener mucho cuidado al
momento de realizar esta tcnica, ya que si el reactivo de Bradford llega ser
expuesto a la luz este reacciona dando resultados invlidos al momento de la
lectura de la concentracin de protenas, por lo tanto, puede llegar a ser una
tcnica fcil y adecuada para medir protenas, pero verse obstaculizada por no
controlar de manera exhaustiva el procedimiento del protocolo en su totalidad.
3.- La purificacin de RNA es otro paso clave en la experimentacin en Biologa
Molecular. Cuando se trabaja con clulas de mamfero existen dos
posibilidades: purificar RNA total o mRNA (en base a la cola de poliA) (Prieto
et al 2006). La purificacin de RNA es la base de la cuantificacin de
transcritos en estudios de expresin gnica. La clave de la purificacin de
21

RNA radica en evitar su degradacin por accin de las ribonucleasas (Falcn

et al 2004). De manera que todos los protocolos existentes se basan en la
rpida inactivacin de dichas enzimas. El mtodo de "Un solo Paso"
originalmente descrito por Chomczynski y Sacchi permite aislar ARN de
manera ms simple y rpida, aunque se le atribuyen dificultades en la
recuperacin (Sambuccetti y Snchez, 1996). Es por esta razn que se debe
tener gran precaucin al momento de seguir el protocolo de manera
adecuada, para no provocar algn tipo de contaminacin sobre la muestra, ya
sea con agentes externos, como polvo en suspensin, amilasa salival entre
otros, tambin otro punto a considerar es tener los reactivos adecuados, ya
que si se realiza este protocolo con un reactivo con aos de uso, puede que la
muestra no sea extrada apropiadamente, provocando lecturas errneas. No
tan solo estos puntos son importantes, si no que el trasvasije de la muestra a
los tubos Eppendorf y la homogenizacin se deben considerar para poder
obtener de manera eficiente y eficaz la mayor cantidad de RNA de la muestra.

4.- Entre la variedad de mtodos analticos desarrollados para determinar el dao

oxidativo de los lpidos, el ms comnmente utilizado se basa en la reaccin
del malondialdehdo con el cido 2-tiobarbitrico (TBA) para formar aductos
cromgenos y fluorescentes de MDA-TBA muy estables y que se pueden
cuantificar por espectrofotometra de absorcin visible o por fluorimetra
(Estepa et al, 2001). En este caso la se pudo ver la formacin de cromgenos
en la muestra la cual dio una lectura indicando la presencia del nivel oxidativo
en las muestras utilizadas, no obstante uno de los pasos que dificulto la
formacin de este cromgeno fueron los tubos Eppendorf utilizados para
realizar el ensayo, ya que al momento de colocarlos a una temperatura de
100C estos tubos se abran de manera abrupta haciendo que se volatilizara
22

en su totalidad la muestra, lo cual provocaba un retraso en el protocolo, al

repetir las muestras perdidas por esta proceso del protocolo, esto se pudo
solucionar sellando de forma hermtica los tubos con parafilm, lo cual mejoro
bastante el procedimiento.
5.- El curso de estadstica fue de gran ayuda ya que se podr usar todo lo
aprendido en las tesis a realizar en el IES, aplicando el conocimiento a
cabalidad, al momento de generar los modelos estadsticos con los resultados
obtenidos en una tesis.
6.- Al participar en el estudio de cohorte se pudo apreciar los diversos
procedimientos y recursos que se requieren para elaborar en este tipo de
estudios.

7.- Aportes de la Prctica profesional

7.1.- Aporte de la prctica hacia la institucin patrocinante

Esta prctica permiti desarrollar tcnicas utilizadas en el laboratorio de altura,
para ser usado por los investigadores y futuros alumnos en prctica, tesistas u
otros interesados en el aprendizaje de estas tcnicas, como fueron extraccin
de protena por RIPA, extraccin de RNA por Chomczynski y tcnicas
colorimtricas como Bradford y TBARS. Tambin la colaboracin en otras
investigaciones del IES.

23

7.2.- Aporte de la prctica hacia la profesin

Fortalecer y ampliar los conocimientos de la suscrita en un aspecto novedoso y
muy til en su futura profesin. As, se ve fortalecido desde el rea molecular,
las diversas tcnicas conocidas y empleadas en el laboratorio del IES las cuales
tienen una variedad de funciones

y aplicaciones. Este conocimiento tiene

aplicabilidad profesional tanto en aspectos laborales como de investigacin.

Integrarse al mundo cientfico y a redes internacionales de investigacin, que
sern de extraordinaria utilidad en el futuro para el desarrollo profesional de la
suscrita.
Familiarizarse con diferentes aspectos de los procesos administrativos de una
organizacin y los requisitos en toda investigacin.

7.3.- Aporte de la prctica como cientfico

Colaborar y aprender las metodologas del desarrollo y de un diseo de
protocolo, desde la extraccin de protena y RNA, junto con tcnicas
colorimtricas como RIPA y TBARS conociendo cada etapa de estos protocolos
para su futura reproduccin ya sea en tesis o colaborando en dichos protocolos
realizados en la IES.
Creacin de vnculos profesionales con otras instituciones interesados en
realizar anlisis con la tcnica implementada.
Familiarizarse con la metodologa en una investigacin.
Conseguir el financiamiento para la tesis profesional.
24

7.4.- Limitaciones
Conocer las tcnicas lleva tiempo y gasto de insumos ya que en el proceso de
aprendizaje, se suelen demorar los tiempos, para llegar a obtener los resultados
adecuados y estos sean reproducibles a futuro.
Se presentaron problemas administrativos que dificultaron la adquisicin de
recursos, pero fueron subsanado rpidamente por el equipo a cargo del
proyecto.

7.5.- Fortalezas
El apoyo cientfico del personal de del instituto fue de gran ayuda en esta
prctica profesional para poder familiarizarse, conocer y aprender a cabalidad
las tcnicas aprendidas, ya que estas tcnicas sern aplicadas en diversas tesis
profesionales que se realizaran durante el ao 2013.
La implementacin del laboratorio del IES que permiti la realizacin de todas
las tcnicas necesarias.
Cursos de capacitacin, integracin a equipo de trabajo y participacin en
proyectos como Proyecto de Medicina y Biologa de Altura para la Regin de
Tarapac GORE Tarapac (FNDR - BIP - 30125349-0), 2012-2014.
Conseguir apoyo para la tesis profesional con la ayuda del Proyecto de
Medicina y Biologa de Altura para la Regin de Tarapac GORE Tarapac
(FNDR - BIP - 30125349-0), 2012-2014.

25

8.- Conclusin
Esta prctica permiti conocer:
Las diversas tcnicas utilizadas en el IES para obtener de manera apropiada
protena y RNA, bajo un protocolo adecuado y si es necesario ser adaptado
dependiendo del tipo de tejido a utilizar en el estudio.
No tan solo conocer tcnicas de obtencin si no tambin tcnicas de
cuantificacin, las cuales a travs de la colorimetra se puede obtener la
concentracin de protenas de inters o bien el nivel de Lipoperoxidacin
Lipdica presente en una muestra.

El conocimiento en el rea estadstica gracias al curso de Estadstica en

Ciencias de la Salud y su aplicacin informatizada, fue de gran ayuda ya que
26

reafirmo los conceptos ya adquiridos en mis aos de estudios y a la ves podr

ser aplicados en mi tesis profesional.
Igualmente acrecent mi formacin profesional, el aprendizaje

amplio y

completo, del manejo administrativo desde cotizaciones hasta compra de

insumos y materiales, de interrelacionar y mantener comunicaciones con
personas expertas en el rea local, nacional e internacional. Asimismo, la
administracin de conceptos claves para desarrollar y aprender la lnea de
investigacin en hipoxia hipobrica crnica e intermitente y por ltimo lograr
mediante todo el conocimiento adquirido en la prctica.

Se logr la participacin en un grupo de trabajo y el aprendizaje de medos de

investigacin aplicados, adems de la participacin de estudio de cohorte en la
regin de Arica y Parinacota.

9.- Bibliografa
1.- Cerezo J., Madrid V. (1995). Tcnicas, estrategias y usos de biologa molecular
en medicina. Rev Invest Clin, 126, 603-11.
2.- Richalet, J., Donoso, M., Jimenez, D., Antezana, A., Hundson, C., Cortes, G.,
Osorio, J. and Len, A. 2002. Chilean miners commuting from sea level to
4500 m: a prospect study. High Alt. Med. Biol. 3(2):159166.
3.- Leon-Velarde, F., Maggiorini, M., Reeves, J., Aldashev, A., Asmus, I., Bernardi,
R., Hackett, P., Kobayashi, T., Moore, L., Penaloza, D., Richalet, J., Roach,
R., Wu, T., Vargas, E. y Zubieta-Calleja, G.2005. Consensus Statement on
Chronic and Subacute High Altitude Diseases. High Altitude Medicine and
Biology. 6(2):147-57.
27

4.- Brito, J., Siqus, P., Len Velarde, F., De la Cruz, JJ., Lopez, V. y Herruzo, R.
2007. Chronic intermittent hypoxia at high altitude exposure foro ver 12 years:
assessment of hematological, cardiovascular, and reanl effects. High Alt Med
Biol 8(3):236-244.
5.- Tenover, F., Robert, D. and Goering, R. 1997. How to select and interpret
molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial
infections: a review for healthcare epidemiologists. Infection Control and
Hospital Epidemiology. 18 (6): 426-439.
6.- Falcn, L. I., E. J. Carpenter, F. Cipriano, B. Bergman y D. G. Capone. 2004.
N2-fixation by unicellular bacterioplankton in the Atlantic and Pacific Oceans:
phylogeny and in situ rates. Applied Environmental Microbiology 70: 765-770.
7.- Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72: 248-254.
8.- Suelter CH. 1985. A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley &
Sons, New York.
9.- Prieto,

J., Lpez,

J., Pueyo, C. 2006. Purificacin de cidos nucleicos.

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de

Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba.
10.- Ngoka, L.C. 2008. Sample prep for proteomics of breast cancer: proteomics
and gene ontology reveal dramatic differences in protein solubilization
preferences of radioimmunoprecipitation assay and urea lysis buffers.
Proteome Sci. Oct 24;6:30.

28

11.- Sambuccetti, N. y Snchez, M. 1996. Modificaciones al Mtodo de "Un Solo

Paso" para la Obtencin de ARN de Clulas y Tejidos Animales.
Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de
Colombia, A.A. 14490, Santaf de Bogot, Colombia. Revista Colombiana de
Qumica. Bogot (Colombia). Volumen 25. Nos. I - 2 de 1996.
12.- Estepa, V., Rdenas, S., Martn M.C. 2001. Optimizacin de un Mtodo para
la Determinacin de la Peroxidacin Lipdica en Suero Humano. Seccin
Departamental de Qumica Analtica. Facultad de Farmacia. Universidad
Complutense. 28040. Madrid (Espaa). Anal. Real Acad. Farm. 67.

10.- Anexos

Curso de Estadstica en Ciencias de la Salud y su Aplicacin Informatizada

1.-

29

2.-

3.-

30

4.-

Id

Nombre de la tarea

Duracin

Comienzo

Fin

PRACTICA LABORAL

2 meses y 12 das

1 Marzo

12 Mayo

Etapa 1

Adquisicin de Insumos y Materiales

13 das

2 marzo

15 Marzo

Preparacin de Material de Investigacin

13 das

2 Marzo

15 Marzo

Etapa 2 Toma de Muestras

3 das

17 Marzo

20 Marzo

Etapa 3

Extraccin de Protena de Arteria

pulmonar

25 das

15 Marzo

10Abril

Cuantificacin Proteica y Enzimtica

8 das

10 Abril

18 Abril

10

Extraccin de ARN de Rin

30 das

12 Abril

12 Mayo

11

Participacin Estudio de Cohorte

10 das

16 Abril

26 Abril

31

12

Etapa 4

13

Anlisis de Datos

14

Etapa 5

15

Informes

16

Informe Final
Total de Horas

4 das

13 Mayo

17 Mayo

Abril

Mayo
20 Mayo

576 horas

5.- Organizacin del tiempo, durante la prctica laboral.

*no se incluyen las horas por fines de semana.

32