Aplicaciones Biotecnolgicas en el Mejoramiento del Arroz Revista Digital CENIAP HOY Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias de Venezuela

Revista Digital del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias de Venezuela

CENIAP HOY
Nmero
6.
septiembre-diciembre 2004

Aplicaciones Biotecnolgicas en el Mejoramiento del Arroz

Iris
Perez-Almeida
Unidad de
Biotecnologa Vegetal

CENIAP-INIA, Maracay

SUMARIO
Introduccin
Cultivo
de anteras
Variacin
somaclonal
Marcadores
moleculares
Perspectivas
Bibliografa
Introduccin
^
El
programa nacional ha logrado avances notables en la obtencin de nuevas
variedades mediante el
mejoramiento de germoplasma. Las variedades
mejoradas de arroz permiten a los agricultores producir el
cultivo en
forma ms eficiente y a un costo unitario ms bajo. Las nuevas
variedades de arroz benefician
tambin al medio ambiente, pues tienden
a disminuir el uso de plaguicidas y reducen la presin para
incorporar
nuevas tierras a la produccin de arroz.
Los
objetivos del Programa Nacional de Mejoramiento de Arroz incluyen la
obtencin de cultivares adaptados
con caractersticas de alto
potencial de rendimiento, buena calidad de grano, fortaleza del tallo,
reaccin de
resistencia a piricularia (Pyricularia grisea),
virus de la hoja blanca (VHB) y sogata (Tagosodes orizicolus)
(lvarez y col, 2000).
La
biotecnologa agrcola ofrece un amplio espectro de oportunidades para
aumentar la productividad, entre
ellas la produccin de biopesticidas,
las tcnicas de cultivo de tejidos, las tcnicas avanzadas de
biologa
molecular, la transformacin gentica y el anlisis
genmico asociado al mejoramiento gentico y al
diagnstico de
enfermedades.
En la
ltima dcada, el programa tradicional de mejoramiento de arroz en
Venezuela ha sido apoyado en
forma creciente por el uso de herramientas
biotecnolgicas implementadas por la Unidad de Biotecnologa
Vegetal
del INIA-CENIAP, tales como cultivo de anteras, uso de la seleccin
asistida por marcadores
moleculares y la identificacin de razas de los
patgenos ms importantes, con la reaccin en cadena de la
polimerasa
(PCR= Polymerase chain reaction, por sus siglas en ingles).
La
Unidad de Biotecnologa Vegetal (UBV) est ubicada en el Campo
Experimental del INIA-CENIAP, Edificio 9,
en la ciudad de Maracay,
Estado Aragua, y tiene como objetivos generales:
1)
Desarrollar y adaptar biotecnologas para fortalecer los
programas de
mejoramiento gentico del INIA, mediante la
identificacin de
marcadores bioqumicos y moleculares,
incorporacin de genes de
resistencia a factores biticos y
abiticos, haciendo uso de variaciones
somaclonales, mutaciones
inducidas y/o transformacin gentica, y la
obtencin de
plantas haploides o doble-haploides;
2)
Servir como laboratorio de referencia para el desarrollo de
tcnicas
biotecnolgicas, y
3)
Capacitar y asesorar a estudiantes de pre y postgrado, tcnicos
medios, tcnicos superiores y otros profesionales universitarios
(Albarrn

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y col., 2004; documento interno).

En la
actualidad, en la UBV se aplican las tcnicas de cultivos de anteras,
variacin somaclonal y marcadores
moleculares en el mejoramiento del
arroz.

Cultivo de Anteras
^
El
cultivo de anteras de arroz fue sealado por primera vez por Niizeki y
Oono en 1968, siendo este el primer
informe exitoso de la obtencin de
una planta haploide regenerada en cereales.
El uso
de la tcnica de cultivo de anteras in vitro presenta algunas
ventajas comparada con los mtodos
tradicionales de mejoramiento. Sin
duda, una de las mayores es la simplicidad del mtodo. La tcnica ha
sido
utilizada en especie cultivadas como trigo, arroz, cebada, maz, y
papa (Withers y Alderson, 1986). Como
cada cruzamiento genera una planta
hbrida F1, cada grano de polen constituye una gameta
diferente. As,
una poblacin de plantas doble-haploides (DH)
provenientes del cultivo de anteras, representar la
variabilidad
gentica de la poblacin F2, siendo las plantas DH
homocigotas genticamente. Otras ventajas
son: la economa en el
tiempo necesario para la obtencin de lneas puras, lo cual reduce el
tiempo en
obtener las generaciones cuando se est procurando ampliar la
diversidad en los reservorios genticos; hay
economa de recursos
financieros y materiales, al no requerir grandes reas de siembra, ni
otros costos de
produccin; y, aumento de la eficiencia de seleccin
tanto en caracteres cualitativos como cuantitativos,
facilitando la
seleccin de los genotipos superiores.
Entre
las desventajas se puede mencionar una alta dependencia del genotipo.
Los genotipos indica han
mostrado hasta ahora poca respuesta a la
induccin de callos, observndose la necrosis temprana de las
anteras
y un desarrollo pobre de los callos, mientras que los japonica de
secano presentan generalmente bajo
porcentaje de regeneracin de
plantas verdes (factible de superar si se utiliza el medio adecuado).
Adems, el
costo inicial de equipamiento de un laboratorio de cultivo
de anteras puede ser relativamente alto. Sin
embargo, a mediano plazo,
esta inversin puede ser recuperada si se considera la reduccin de
alrededor de
30% en costos de desarrollo de un material empleando
cultivo de anteras versus usando el mtodo de pedigr
solamente (Sanint
y col., 1993). Esta dependencia genotpica de la respuesta in vitro
ha obstaculizado la
adopcin amplia del cultivo de anteras de arroz
como herramienta rutinaria en el mejoramiento. En otros
cereales
tambin se han encontrado diferencias genotpicas en la produccin de
plantas verdes en la
aplicacin practica de la tcnica.
En la
UBV del INIA-CENIAP se estandariz el protocolo de cultivo de anteras
desarrollado en el CIAT (Lentini y
col., 1991; 1994). Durante el periodo
1993-1997 se procesaron alrededor de 243 materiales procedentes del
Centro de Investigacin Agropecuaria del INIA-Portuguesa, as como 8
materiales de la Fundacin DANAC,
ubicada en San Javier, estado Yaracuy,
(Prez-Almeida, 1998). Brevemente, la metodologa consisti en lo
siguiente: las panculas recolectadas en el campo se colocaron en una
bolsa transparente de polietileno,
debidamente identificada con el
genotipo del material, el lugar y la fecha de recoleccin. Estas bolsas
se
transportaron desde el campo al laboratorio en una cava plstica con
hielo. Una vez en el laboratorio, este
material se roci con alcohol
95% y se someti a un pretratamiento o shock a baja temperatura, entre
8 y
12 C, y en condiciones de oscuridad. Luego de 8 das, se
removieron las hojas banderas y las florecillas del
tercio medio de la
pancula, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 0.5% por tres
minutos, y se
enjuagaron cuatro veces con agua destilada estril. Se
seleccionaron las florecillas del tercio medio de la
pancula
colocndolas en una cpsula de Petri con varias hojas de papel Whatman
para proceder a la
extraccin de las anteras. Para la incubacin de
las anteras se utilizaron los medios NL (Lentini y col., 1997),
y los
medios MS (Murashige y Skoog, 1962) con modificaciones hormonales
(Prez-Almeida, 1998). Estas
modificaciones se probaron durante tres
aos, obtenindose mayor respuesta en los genotipos indica. Los
frascos conteniendo las anteras en medios de induccin se incubaron a
26 2 C durante 30 a 45 das, la
primera semana en condiciones de
oscuridad. Los microcallos inducidos se transfirieron a medio MS
slido, a
razn de 10 callos/frasco, incubndolos en luz indirecta
por una semana y luego a 80 m Mol m-2s-1, 26
2
C y 16 h foto periodo. Las plantas verdes obtenidas in vitro
se aclimataron en tierra estril y bajo condiciones
controladas de luz
y temperatura. Observaciones citolgicas permiten suponer dos formas
mediante las cuales
podra ocurrir la diploidizacin de clulas a
partir de las microsporas. La primera es por fusin nuclear en la
cual
no hay formacin de la membrana celular en las primeras divisiones
mitticas del ncleo vegetativo,
haciendo posible la fusin de dos o
ms ncleos y originando los callos diploides o poliploides, la
segunda es
por endoreduplicacin, cuando al presentarse la mitosis de
las clulas haploides no hay separacin de los
cromosomas duplicados,
lo cual conduce a la formacin de un solo ncleo con un nmero doble
de
cromosomas (Lentini y col., 1994). La semillas de las lneas
regeneradas fueron suministradas al mejorador
para su inclusin dentro
de los procesos de evaluacin y seleccin.
Variacin
somaclonal

La
variacin somaclonal es un fenmeno que se presenta durante el cultivo
in vitro, cuyo origen y naturaleza
son diversas, quiz originada
por mutaciones de punto (Bouharmont y col., 1991). Otra investigacin
seala
que las variaciones somaclonales podran deberse a la
ocurrencia de rearreglos cromosomales (cambios de

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posicin de secciones
de cromosomas), metilacin del ADN, o inserciones de transposones (Jain,
2001).
Algunas de las modificaciones de caracteres pueden ser de
inters agronmico, aunque pocas han sido
aplicadas en el mejoramiento
varietal. Existen dos maneras de aprovechar estas variaciones
somaclonales.
Primero, a travs de la seleccin de la poblacin
regenerante a partir de cultivos celulares. La segunda forma
implica la
seleccin de lneas celulares que resultan resistentes a algn
estrs de tipo fsico o qumico. En
arroz se ha usado sta ltima,
para seleccionar materiales mas tolerantes a condiciones de alta
salinidad,
toxicidad por aluminio, y estrs por fri. Variantes
somaclonales producidos en el Laboratorio de Cultivo de
Anteras del CIAT
han sido evaluados por el Plan Nacional de Mejoramiento Gentico de
Arroz (Torrealba y
col., 2000). Algunos de ellos presentaron mejores
caractersticas de calidad de grano (mayor porcentaje de
grano entero,
reduccin en centro blanco y yeso, mejor temperatura de gelatinizacin),
y otros resistencia al
dao por sogata y al VHB. Actualmente algunas
lneas derivadas de estos materiales se evalan con ayuda de
tcnicas
de PCR para probar su identidad gentica (G. Torrealba, 2004,
comunicacin personal).

Marcadores Moleculares
^
Para el
ao 2000, se report el primer esfuerzo de secuenciacin del genoma
del arroz (Oryza sativa) (Sasaki
y Burr, 2000; Barry, 2001). La
compaa Monsanto produjo un primer borrador del genoma usando
el
cultivar Nipponbare, una variedad japnica usada ampliamente
por el Instituto Internacional de
Investigaciones en Arroz (IRRI,
Filipinas), como apoyo a sus programas de investigacin en materia
genomita
y mejoramiento de plantas. Adems de ser uno de los cultivos
alimenticios ms importantes del mundo, el
arroz es el modelo gentico
para los cereales. Existe una relacin de sintenia entre el arroz y
otras especies
gramneas, incluyendo maz, trigo, cebada, sorgo, y
otros (sintenia = conservacin del orden gnico, o sea, la
posicin
de los genes en el genoma). Por tanto, al acumular informacin
detallada acerca del genoma del
arroz, se avanza simultneamente en los
esfuerzos globales para mejorar otros cultivos.
El
Proyecto Internacional para la Secuenciacin del Genoma del Arroz, un
consorcio internacional cuya meta es
completar la secuenciacin del
genoma del arroz (International Rice Genome Sequencing Project IRGSP,
http://rgp.dna.affrc.go.jp/Seqcollab.html
,
compuesto por pases de Asia, Europa, Norte y Sur Amrica, puso
a la
disposicin del publico una secuencia mas refinada del genoma en
diciembre del 2002 (Goff y col., 2002;
Yu y col., 2002). As, Japn
estuvo a cargo de secuenciar los cromosomas 1, 2, 6, 7, 8 y 9, casi la
mitad del
genoma; Estados Unidos, cromosomas 3, 10 y 11; China,
cromosoma 4; Taiwan, cromosoma 5; Francia,
cromosoma 12 y una region
duplicada del 11; y, Corea, Tailandia, Brasil e Inglaterra, regiones
especificas de
los cromosomas 1, 2, 9 y 11. En el sitio web http://www.rice-research.org/
los investigadores del cultivo
pueden acceder a esta informacin. Las
secuencias tambin han sido depositadas en el Banco de genes
(GenBank, http://www.ncbi.nih.gov
),
siendo que a fines del 2005 se espera tener la secuencia completa del
genoma.
Existen
tres tipos de marcadores que se pueden emplear en la seleccin e
identificacin varietal: los
marcadores morfolgicos, los
bioqumicos, y los moleculares. Los morfolgicos son fciles de ver,
pero tienen
como principal inconveniente que hay un bajo nmero de
ellos, la mayora son dominantes, puede haber
problemas de epistasia (epistasia
= interaccin gnica en la cual un par de alelos inhibe la
manifestacin de
otros pares) y su expresin no siempre es temprana en
el desarrollo.
Los
marcadores bioqumicos, basados en la generacin de patrones
electroforticos isoenzimticos, se
caracterizan por su simplicidad,
mnima cantidad del material en estudio, bajo costo y una cobertura del
genoma de 10-20 loci por especie, ausencia de epistasis e influencias
ambientales. La expresin allica es de
tipo codominante, lo que
permite establecer comparaciones entre especies, poblaciones de una
misma
especie, y detectar la presencia de hbridos e introgresin de
genes. Entre sus desventajas se incluye un nivel
bajo de polimorfismo al
presentar pocos alelos por locus, especialmente cuando la base gentica
es estrecha.
Otro aspecto a considerar es que las protenas, siendo un
producto de la expresin gnica, pueden ser
afectadas cualitativa y
cuantitativamente en su nivel de expresin por factores ambientales.
Para aumentar la
eficiencia de la tcnica ante este factor, deben
identificarse los estados de desarrollo de la planta durante los
cuales
la protena es estable. Adems, al igual que con las protenas de
reserva, las isoenzimas pueden o no
reflejar los cambios genticos que
ocurren en el ADN, adems slo un set de genes estructurales est
representados en estas protenas, vale decir, slo parte del genoma se
puede evaluar.
Los
marcadores moleculares se basan en la amplificacin del ADN o parte del
mismo por PCR, como en el caso
de los ADN polimrficos amplificados al
azar o RAPDs (Random Amplified Polymorphism DNA), o en la
generacin de
sitios de corte en la secuencia del ADN, como en el caso de los
polimorfismos de longitud de
fragmentos de restriccin o RFLPs (Restriction
Fragment Length Polymorphisms) y dentro de ellos se pueden
diferenciar
varios tipos. Los productos de amplificacin que representan
polimorfismos genmicos tienen
herencia Mendeliana estricta. Los
marcadores moleculares se caracterizan porque su deteccin es fcil y
rpida, muchos son codominantes, hay ausencia de pleiotropismo y
epistasia, la expresin es temprana, su
distribucin es homognea en
muchos casos y presentan un alto polimorfismo (pleiotropia = un nico
par de
genes acta en la manifestacin de varios caracteres). Con la
ayuda de marcadores moleculares, es posible
identificar caracteres
tiles de tolerancia o resistencia a los principales tipos de estrs
bitico y abitico en el
germoplasma silvestre de arroz, hacer
cruzamientos interespecficos y seleccionar germoplasma respecto a

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estos caracteres tiles.

Su uso
ha revolucionado el mejoramiento tradicional aportando herramientas
genmicas, que pueden
utilizarse en la seleccin asistida por
marcadores moleculares para el desarrollo de cultivares. Estos
marcadores son particularmente tiles para la incorporacin de genes
que estn altamente influidos por el
ambiente, y otros de difcil
estudio como los que confieren resistencia a enfermedades, y para
acumular
mltiples genes para resistencia a patgenos especficos y
plagas dentro del mismo cultivar (piramidizacin
gnica). El uso
de los marcadores moleculares en lo que se denomina mejoramiento
asistido, permite al
fitomejorador el avance generacional ms rpido,
ya que a travs del uso de PCR se puede detectar si el gen
est
presente en las lneas evaluadas en generaciones ms tempranas durante
el proceso de mejoramiento.
En la
actualidad a travs de una iniciativa internacional se han construido
mapas moleculares detallados que
incluyen miles de marcadores
moleculares, bases de ESTs y libreras genmicas de arroz. El trabajo
conjunto
del IRRI y la Universidad de Cornell, produjo un mapa de
cromosomas de esta gramnea
http://www.gramene.org
donde se
ubican marcadores moleculares que determinan las caractersticas
tiles
de la planta con respecto a la tolerancia de la sequa,
resistencia a plagas y enfermedades, entre los cuales
resalta la
marcacin de genes que controlan la resistencia al virus de la
hoja blanca y al hongo Pyricularia.
Haciendo
uso de la tcnica denominada "huella dactilar" o
fingerprinting, y con la colaboracin del FLAR
(Fondo Latinoamericano
de Arroz de Riego), en el ao 1995 se emprendi el proyecto
"Identificacin y
caracterizacin de razas y linajes genticos
del hongo Pyricularia grisea en Venezuela", con el fin de
identificar
las poblaciones de Pyricularia en reas endmicas
de los estados Portuguesa, Guarico, Barinas y Cojedes, en
trminos de
razas y compatibilidad con genes de resistencia conocidos, as como
caracterizar los aislamientos
de P. grisea obtenidos en las zonas
endmicas en linajes genticos utilizando la tcnica de "fingerprinting",
se
estableci en campo la siembra de ocho diferenciadores
internacionales y once variedades comerciales
liberadas en Venezuela. De
cada uno de los cultivares se procedi a realizar aislamientos
monosporicos de las
hojas que presentaron lesiones tpicas de P. grisea.
Una vez crecidos los aislamientos se preservaron para su
posterior
utilizacin, tanto para la caracterizacin de razas como de linajes
genticos. La caracterizacin de
los linajes genticos se logro con
la ayuda de la tcnica de fingerprinting en la cual se recurre a una
sonda de
ADN conocida como MGR-586 obtenida del genoma de P. grisea. A
los aislamientos obtenidos se les extrajo el
ADN y se determinaron sus
patrones por la asociacin ADN-MGR586, que permite agrupar a los
aislamientos
de P. grisea de acuerdo con el grado de similitud de los
patrones obtenidos. Con la utilizacin de esta
metodologa se lograron
identificar 7 linajes para Venezuela (R. Cardona, 2004, comunicacin
personal).
La
estandarizacin de la tcnica de PCR para la caracterizacin del
hongo P. grisea en una poblacin
venezolana (Arnao y col.,
2003), permiti el desarrollo de una metodologa adaptada a nuestras
condiciones y
menos costosa, la cual puede ser utilizada de manera
rutinaria en estudios a gran escala, con la finalidad de
conocer la
diversidad gentica del hongo. El conocimiento del espectro de
virulencia de los linajes genticos,
estructura gentica de P.
grisea y sus frecuencias en cada zona agroecolgica permitir
apoyar al Programa
Nacional de Mejoramiento para el desarrollo de
resistencia ms estable al aublo, seleccionando aquellos
genes o
fuentes de resistencia cuyas combinaciones sean efectivas contra los
linajes presentes dentro de la
poblacin, en las principales reas
productoras de arroz en el pas.
Utilizando
toda esta informacin, la biotecnologa podra cambiar el escenario
del arroz en dos reas
principales: (1) protegiendo el cultivo contra
estrs bitico y abitico, (2) modificando el concepto de
produccin
de mediante la obtencin de materia prima de mayor valor agregado
(galletitas, masa congelada,
pan de molde, pasta, almidones, plsticos
biodegradables, etc.), o sencillamente aumentando la calidad del
grano
para satisfacer demandas del consumidor.

PERSPECTIVAS
^
En los
ltimos taos, el desarrollo de cultivos modificados por la
transferencia de genes o transformacin
gentica intra- o inter-
especie ha cobrado un fuerte impulso gracias a la metodologa de ADN
recombinante
que permite insertar genes entre especies en poco tiempo.
Ejemplo de la aplicacin de la tecnologa al
mejoramiento de los
cultivos son las investigaciones que se han realizado para incorporar la
provitamina A al
arroz dorado o golden rice (Potrykus, 2001; Hoa et
al., 2003). En teora, la alimentacin con estas
variedades de
arroz permite reducir el riesgo de ceguera en grandes grupos de
poblacin del mundo que se
alimentan a base de este cereal.
Recientemente,
se obtuvieron en Tailandia dos variedades de arroz enriquecidas en
hierro que pueden
desarrollarse y utilizarse en la lucha contra la
anemia en la poblacin de bajos recursos
http://www.eufic.org/de/tech/database/rice.htm
.
El uso de la ingeniera gentica al incrementar el contenido
de hierro
en estas variedades, mejora la calidad nutritiva de este cereal.
En la UBV se considera la aplicacin de esta tcnica de transformacin
gentica a mediano plazo en el cultivo
del arroz, principalmente para
la incorporacin de genes asociados a estrs de tipo bitico y
abitico que sean
de herencia simple.

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Otras tcnicas susceptibles de ser aplicadas son el rescate de

embriones a partir de cruces interespecificos, lo
cual creara
nuevos genotipos con tolerancia a las principales plagas y enfermedades
del arroz, puesto que,
en general, las especies silvestres poseen genes
de resistencia a enfermedades, insectos, y factores del medio
ambiente.
Por ejemplo, cruzamientos con O. glaberrima interesan para
aumentar tolerancia al estrs hdrico,
competencia con las malezas y
resistencia a enfermedades como el aublo y el entorchamiento, y la
especie
O. rufipogon han servido para obtener rendimientos muy
superiores http://www.flar.org/pdf/ladosilvestre.pdf
.
Tales cruzamientos ya se han realizado en organismos internacionales
como el CIAT, y estas poblaciones
podran incorporarse al Programa
Nacional de Mejoramiento para ser evaluadas, o se pueden generar
nuestros propios cruzamientos de variedades nacionales con estas u otras
especies silvestres.
La
micro propagacin puede utilizarse dentro del proceso de produccin de
semilla para conservacin de la
pureza gentica de la variedad, y
parael saneamiento de enfermedades comola Hoja Blanca,
piricularia,
raquitismo, carbn, etc.El hecho de obtener plantas
libres de las enfermedades mencionadas, no quiere decir
que sean inmunes
a las mismas, dependiendo sto del medio ambiental y la resistencia
gentica de cada una
de las variedades.

Actualmente las tcnicas biotecnolgicas se aplican como herramientas

de apoyo al Programa Nacional de
Mejoramiento Gentico para la
obtencin de variedades con mayor calidad molinera del grano y en la
bsqueda de materiales resistentes a las principales enfermedades del
cultivo presentes en el pas, haciendo
nfasis en el uso de marcadores
moleculares para asistir el mejoramiento del cultivo y la incorporacin
del
cultivo de anteras en forma rutinaria a fin de lograr avances
generacionales en el corto plazo.
BIBLIOGRAFA
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Referencia de este artculo:

Perez-Almeida, Iris. 2004. Aplicaciones

Biotecnolgicas en el Mejoramiento del Arroz. Revista Digital CENIAP
HOY
N 6, septiembre-diciembre 2004. Maracay, Aragua, Venezuela. URL:

www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n6/arti/perez_almeida_i/arti/perez_almeida_i.htm
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ISSN: 1690-4117
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