REPORTE DE PRCTICA

PROFESORA:
Guillermina Castillo Rivera
ALUMNO:
Mariana Del Carmen Garca Sandoval

NO. CONTROL:
09070113
MATERIA:
Tratamiento de Aguas Residuales

DETERMINACIN DE COLIFORMES FECALES Y TOTALES

PROY-NMX-AA-042-SCFI-2005
CALIDAD DEL AGUA.-DETERMINACION DEL NUMERO MS
PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES
FECALES (TERMOTOLERANTES) Y ESCHERICHIA COLI
PRESUNTIVA (CANCELAR A LA NMX-AA-042-1987)
INTRODUCCIN
La presencia y extensin de contaminacin fecal es un factor importante en la determinacin de la
calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de
resistencia de los mismos, involucrando organismos patgenos, los cuales son un riesgo para la
salud pblica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para
determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el
intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicacin sensible de dicho tipo
de contaminacin fecal. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos
coliformes para sobrevivir en agua; sus nmeros tambin pueden emplearse para estimar el grado
de contaminacin fecal.
PRINCIPIO DEL MTODO
El mtodo se basa en la inoculacin de alcuotas de la muestra diluida o sin diluir, en una serie de
tubos de un medio de cultivo lquido conteniendo lactosa.
Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubacin ya sea a 35 a- 37C. Cada uno de los
que muestren turbidez con produccin de gas se resiembra en un medio selectivo para
confirmacin.
Se lleva a cabo la incubacin de estos medios selectivos hasta por 48 horas a 35 - 37 C para la
deteccin de organismos coliformes y por 24 horas a 44.0 1 C para organismos coliformes
fecales (termotolerantes) y E. coli.
Mediante tablas estadsticas, se lleva a cabo el clculo del numero ms probable (NMP) de
organismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) y E. coli que
puedan estar presentes en 100 mL de muestra a partir del nmero de tubos que den resultados
confirmativos positivos.
OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIN
Esta Norma Mexicana establece un mtodo para la deteccin y enumeracin en agua de
organismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia coli
presuntiva (E. coli) mediante el cultivo de un medio lquido en tubos mltiples y el clculo de sus
nmeros ms probables (NMP) en la muestra.
Este mtodo es aplicable en todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen una cantidad
apreciable de materia en suspensin.
La seleccin de las pruebas usadas en la deteccin y confirmacin del grupo de organismos
coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como una parte de la secuencia continua. El grado de
confirmacin con una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y de
las razones para realizar el examen. En la practica la deteccin de E. coli presuntiva, como se
define en el punto 4.8 de esta norma da usualmente una indicacin satisfactoria de la
contaminacin fecal.

REACTIVOS:

Caldo Lactosado
Caldo bilis lactosa verde brillante
Medio EC.

MATERIAL Y EQUIPO

1 parrilla elctrica
Autoclave
Incubadora para coliformes
Bao mara
Bata
Cubre bocas
15 campanas Durham
15 tubos de ensayo
4 pipetas de 10 ml
1 pipeta de 5ml
1 pipeta de 1 ml
1 esptula
1 frasco bacteriolgico
3 matraces de 125 ml
1 gradilla
1 perilla
1 agitador
1 matraz erlenmeyer de 500ml
1 vaso de precipitado de 50 ml
1vaso de precipitado de 250ml
1 vaso de precipitado de 500 ml

PLAN DE TRABAJO

Mayra y Juan de dios se encargaran de realizar la preparacion de los medios.

Yuliana y nataly tambin se encargaran de realizar lavar, envolver el material y esterilizarlo.

Juan y yuliana realizaran las siembras.

PROGRAMA DE ACTIVIDADES
HORA
1 dia antes de la practica
7:00am
8:00am
8:15am

ACTIVIDAD
Lavando el material y esterilizando,
Tomar la muestra del paso del zacate
Estar preparados con todo el equipo de
seguridad y los materiales que se utilizaran.
Hablar de lo que se va realizar y despejar
dudas.

8:20am
9:00am
10:00am
11:00am

Preparacion de los medio, lactosado

Esterilizando el medio
sembrando
Inoculando los medios de cultivo.

NOTA: SE TUVO QUE CONTINUAR EN HORAS EXTRA DEBIDO A QUE ES UN POCO LARGA.
Y PORQUE SE TIENE QUE ESPERA PARA VER LOS CULTIVOS.

DIAGRAMAS
ESTERILIZACIN DEL MATERIAL.

Envolver todo el material con papel tipo estraza

colocar en la olla de presin, al marcar la vlvula
15 lb dejar 15 min mas sobre la parrilla sacar y
guardar el material.

Se cerraran bien y se pondrn a esterilizar en

la olla de presin.

Al terminar la esterilizacin del medio, se

dejara enfriar y se proceder a hacer las
diluciones de la muestra y se har la
siembra.

Preparar el caldo lactosado doble

concentracin;Preparar el caldo
lactosado concentracin sencilla.

Al tener las
preparaciones de los
caldos se vertern 10ml en 5 tubos del
caldo de doble concentracin y 10ml
en 10 tubos del caldo
de
concentracin sencilla

PRUEBAS PRESUNTIVAS
Preparacin de la muestra e inoculacin del medio.
Se mide con la pipeta de 10ml
de muestra y se agregan a un
matraz limpio y esterilizado, se
afora con agua esterilizada a
100.

Despus de
24 horas se
examinan los tubos. Aquellos
que presentan una pequea
burbuja de gas dentro de las
campanas
Durham
se
consideran positivos.

De la dilucin anterior se
mide con la pipeta otros
10 ml y se vierte en un
segundo matraz y se
afora
con
agua
esterilizada

Se va a agregar a los 5
tubos de concentracin
doble 10 ml de muestra, a
5 tubos con concentracin
sencilla se agregan 1 ml
de muestra, y a los otros 5
tubos se les agrega 0.1 ml
de muestra.

Se miden con una pipeta

otros 10ml de la dilucin
de la muestra anterior y
se afora.

Para realizar la siembra

se utiliza la tercera
dilucin.

ETAPA CONFIRMATIVA
Incubar los tubos que no
presenten formacin de
gas otras 24 horas.

Una vez preparados los

medios colocamos 10 ml de
caldo verde brillante en cada
uno de los 10 tubos con
campana
(tubos
largos).

Se coloca 5 ml de caldo
escherichia coli en cada uno
de los 10 otros tubos (tubos
ms pequeos)

La formacin de gas dentro de

48 horas de incubacin total,
constituye
una
prueba
confirmativa de la presencia de
coliformes totales.

Se prepara caldo bilis lactosa

verde brillante y medio E.coli

Los
ponemos
a
esterilizar en la olla de
presin,
cuando
la
vlvula marque a 15 lb
de presin se deja por
15 min.

PRUEBA CONFIRMATIVA
DE COLIFORMES FECALES

Resembrar a partir de cada tubo

de medio de aislamiento que
muestre un resultado positivo en
uno o ms tubos de medio
confirmativo para detectar la
produccin de gas e indol.

Una vez esterilizados los tubos y el

medio, se le afloja un poco la tapa
y se dejan enfriar una vez enfriados
se prepara el rea de trabajo para
resembrar

Se repite esta operacin

para los tubos restantes
con caldo verde
brillante.

Se
hace
el
mismo
procedimiento para los 10
tubos que dieron positivos en
caldo lactosado y se repite la
operacin descrita antes para
hacer la resiembra en el caldo
escherichia coli.

se acercan hacia el mechero los

tubos que dieron positivos al
caldo lactosado y se pasa uno a
uno la boca por el mechero y se
le
introduce
el
asa
bacteriolgica, esta de inmediato
se introduce en el tubo con caldo
verde brillante y se tapa el tubo

Se esteriliza el rea de trabajo

con alcohol, y se flamea la
mesa,
despus
el
asa
bacteriolgica la esterilizamos
en el mechero

Al terminar la resiembra de los tubos

con caldo verde brillante, estos se
introducen
en
la
estufa
de
incubacin por un periodo de 48 hrs,
y los tubos con caldo E.coli se
introducen a incubacin en bao
mara y estos se dejan por un lapso
de 24 hrs

PROCEDIMIENTO ESCRITO Y GRAFICO

Esterilizacin del material y el agua, preparacin del caldo lactosado.
1. Se llego al laboratorio y se pidi el material a esterilizar
2. Se procedi a lavar el material.

3.

Se lleno la olla de presin para ponerla a precalentar y

est lista para empezar a esterilizar.

4.

El material lavado se envolvi en papel de estraza.

5.

El material debidamente envuelto se puso en la olla de

presin.

6. Se tap la olla y se espero a que llegara a 15 lb de presin, despus de que llego a esa
presin se puso la parrilla elctrica en el numero 7 y se mantuvo esa presin y esa
determinada temperatura por 15 min.

7. Despus de pasados los 15 min se espero a que la olla se depresionara y se abri.

8. Se saco el material ya esterilizado y se guardo en la gaveta para el da de la siembra de la
muestra.
9. De igual manera se esterilizo el agua que se ocupara para preparar las disoluciones de la
muestra para la resiembra.
10. Despus se pesaron los gr de caldo que se iban a necesitar para preparar los de doble
concentracin y concentracin sencilla.

11. Se prepararon 50 ml de caldo lactosado de doble concentracin y 100 ml de caldo de

concentracin sencilla.

12.

Se metieron los tubos de fermentacin tipo Durham en

los tubos de ensayo con tapn de rosca.
Se procedi a verter en los tubos de ensayo 10 ml de
caldo lactosado de doble concentracin en 5 tubos de

13.
ensayo.

14. Se llenaron 10 tubos de ensayo con 10 ml de caldo lactosado de concentracin sencilla.

15. Se procedi a esterilizar el caldo en los tubos, metindolos a la olla de presin.

16.

Despus del tiempo adecuado en la olla (a 15 lb de

presin durante 15 min), se sacaron de la olla y se
verifico que no hubiera burbujas en las campanas Durham, en caso de tener se abri poco
y cerraba el tubo para sacar el aire en los tubos y se mova un poco el caldo. Tambien los
enfriamos con agua, y utilizamos guantes para poder sostenerlos mientras los
enfribamos.

17. Despus se pusieron los tubos en un vaso de precipitado de 2000 ml y se metieron al

refrigerador para el da de la siembra.

Siembra de la muestra.
18. Un miembro del equipo fue el da de la siembra por la muestra ya que debe de ser
analizada al instante, la muestra se recolecto en un frasco bacteriolgico previamente
esterilizado.

19. Se saco el resto del material esterilizado y se puso en la mesa.

20. Se procedi a limpiar la mesa de trabajo con alcohol y se prendi el mechero Fisher.

21. Se saco una pipeta de 10 ml y el primer matraz, se vertieron 10 ml de la muestra en el

matraz 1 y se afor a 100 ml.

22. Despus con otra pipeta esterilizada se tomaron 10 ml del primer matraz y se aadieron al
2do y se afor tambin a 100 ml.

23. Con otra pipeta se midieron 10 ml del 2do matraz y se pusieron en un 3er matraz el cual
tambin se aforo a 100 ml.

24. Del tercer matraz se tomaron las muestras para sembrar en el caldo lactosado, se
inocularon 10 ml en 5 tubos con caldo lactosado de concentracin doble, 5 tubos con caldo
de concentracin sencilla con 1 ml de la muestra del 3er matraz y por ultimo otros 5 tubos
de concentracin sencilla con 0.1 ml de muestra.

25.

Despus de sembrar la muestra en los tubos se

metieron a la incubadora.

Resiembra:
26. Se llego al laboratorio al da siguiente y se observ la presencia de burbujas en la
campana Durham por lo que se determino la presencia de coliformes en la etapa
presuntiva.

27. Se observaron que solo 12 tubos eran positivos.

28. Se prepara el material para empezar la etapa
campanas que se van a utilizar.

confirmativa, lavando los tubos y las

29. Se hacen los clculos para la preparacin de los medios de bilis verde brillante y el E. Coli.

Clculos:

Verde Brillante:
40 gr ------------------------ 1000 ml
X --------------------------- 120 ml
X = 4.8 gr

E. Coli
37 gr ----------------- 1000 ml
X --------------------- 120 ml
X= 4.44gr
30. Se preparan los dos medios de cultivo y se comienzan a llenar los tubos.
31. Los de verde brillante se llenan con 5 ml del medio preparado y los de E. coli con 10 ml.

32. Se ponen los tubos a esterilizar.

33. Despus de la esterilizacin se procede a sembrar de nuevo los 24 tubos.

34. Se limpia la mesa de trabajo para proceder a la resiembra.
35. Con ayuda de un haza bacteriolgica se toma una muestra de los 12 tubos anteriormente
sembrados para efectuar la resiembra en los nuevos tubos para la etapa confirmativa.

36. Despus de efectuada la resiembra los tubos de medio verde brillante se metieron a la
incubadora y los de medio E. coli a bao Mara.

37.

Se dejaron por 48 hrs y se observaron los

tubos para observar la presencia de
burbujas en las campanas Durham.

38. Despus de la observacin de los tubos se procedi a esterilizarlos, para posteriormente

verter los residuos a la tarja del laboratorio.

CLCULOS Y FORMULAS
Se puede obtener el nmero ms probable de coliformes fecales y totales por medio de una
formula o buscando en las tablas anexadas en la Norma para coliformes.
La formula es:

NMP/100 ml=

No . de tubos positovos x 100

( ml de muestra en tubos negativos ) ( ml de muestra en todos lostubos )

Tabla 1 ndice del NMP y lmite confiable de 95 % para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 mL, 5 porciones de 1 mL y 5
porciones de 0.1 mL

RESULTADOS DE TODOS LO EQUIPOS EN TABLA Y LAS NORMAS DE ANLISIS Y DEL

LIMITE MXIMO PERMISIBLE, SEALANDO AL EQUIPO QUE PERTENECES.
RESULTADOS:
Tabla 2. Resultados grupales del NMP de coliformes en la etapa presuntiva caldo lactosado.

Equipo

Cantidad
de tubos

Concentracin
Del caldo

5
5
5

Doble
Sencilla
Sencilla

Cantidad
de
muestra
[ml]
10
1
0.1

positivos

Resultado
NMX-042
NMP/100 ml

5
4
3

280

Tabla 3.1. Resultados grupales del NMP de coliformes en la etapa confirmativa verde
Brillante
Equipo
Cantidad
Concentracin
Cantidad
positivos
Resultado
de tubos
Del caldo
de
NMX-042
muestra
NMP/100 ml
[ml]
1
5
Doble
10
5
33
4
Sencilla
1
1
3
Sencilla
0.1
0

Tabla 3.2. Resultados grupales del NMP de coliformes en la etapa confirmativa medio E. coli
Equipo

Cantidad
de tubos

Concentracin
Del caldo

5
4
3

Doble
Sencilla
Sencilla

Cantidad
de
muestra
[ml]
10
1
0.1

positivos

Resultado
NMX-042
NMP/100 ml

2
0
0

INTERPRETACIN Y ANLISIS DE LOS RESULTADOS

Tabla comparativa con la norma:
Etapa presuntiva, Caldo Lactosado:
Equipo #

Resultado
NMP/100 mL

Norma

Mximo permisible
NMP/100 mL

Cumple con la
norma
S

280

NOM-003-

P.M
240

No

SEMARNAT-1997

Etapa confirmativa:
Caldo Bilis Verde Brillante
Equipo #

Resultado
NMP/100 mL

Norma

33

NOM-003SEMARNAT1997

Resultado
NMP/100 mL

Norma

Mximo
permisible
NMP/100 mL

Cumple con la
norma
S

P.M
240

No

Medio E. coli
Equipo #

NOM-003SEMARNAT1997

Mximo
permisible
NMP/100 mL
P.M
240

Cumple con la
norma
S

No

CONCLUSIN Y BIBLIOGRAFA
El agua de rio, muestra el contenido de coliformes, un bajo contenido de coliformes deacuerdo a
los resultados.Solo uno de los equipos no pudo realizar este anlisis, puesto que su muestra de
agua no dio positivo desde la etapa presuntativa, por lo tanto no continuaron con las prueba.
REPORTE DEL VOLUMEN DE RESIDUO GENERADO POR EQUIPO Y GRUPO.

1 litro aprox.