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Curso de Especializao em Biologia Forense

Fundamentos de Gentica Forense

Marcelo Andr de Souza Baptista

Rio de Janeiro, Setembro de 2008

ndice
1. Conceitos Bsicos de Gentica e Biologia Molecular

03

1.1. Estrutura do DNA

03

1.2. Organizao Cromossmica do DNA

04

1.3. Organizao dos Cromossomos Humanos

04

1.4. Organizao do Genoma Humano

06

1.4.1. Classes de DNA no Genoma Humano

07

1.4.1.a. Seqncias de DNA de Cpia nica

07

1.4.1.b. Famlias de DNA Satlite

07

1.4.1.c. Famlias de DNA Repetitivo Disperso

08

2. Variao Individual no DNA

09

2.1. Polimorfismos de DNA de Interesse Forense

10

2.2. Deteco e Medida da Variao Gentica ao Nvel de DNA

11

2.3. Polimorfismos de Tamanho de Fragmento de Restrio (RFLPs)

12

2.4. Polimorfismos de Nmero de Repeties em Tandem (VNTRs e STRs) 13


2.4.1. Amplificao de DNA pela Reao em Cadeia da Polimerase
2.5. Polimorfismos de Nucleotdeos Individuais (SNPs)
2.5.1. Seqenciamento de DNA

14
17
17

3. Base Estatstica e Populacional para Anlise de Perfis de DNA


3.1. Gentica de Populaes e a Teoria das Freqncias Allicas

19
19

3.1.1. Estimativa das Freqncias Allicas

19

3.1.2. O Princpio de Hardy-Weinberg

20

3.1.3. Aplicaes do Princpio de Hardy-Weinberg

22

4. Bibliografia

24

5. Anexo I: Figuras

25

1. Conceitos Bsicos de Gentica e Biologia Molecular


O texto a seguir tem como propsito fornecer ao aluno uma viso geral sobre os
conceitos de gentica e biologia molecular aplicados identificao humana. Os temas
especficos, inovaes tecnolgicas e estudos de casos em Gentica Forense sero
apresentados em sala de aula.
1. 1. Estrutura do DNA
A informao gentica dos organismos vivos, que determina suas caractersticas
orgnicas hereditrias, est estocada em grandes macromolculas chamadas cidos
nucleicos. Estes cidos nucleicos podem ser de dois tipos: o DNA (cido
desoxirribonucleico) e o RNA (cido ribonucleico). Em todos os organismos celulares,
inclusive ns, o material gentico o DNA que permanece estocado no ncleo (ou
nucleide) na forma de cromossomos. O DNA uma molcula linear na forma de uma
dupla hlice, similar a uma escada em caracol. A dupla hlice composta de duas
cadeias (ou fitas) intercaladas de unidades menores chamadas nucleotdeos (Figuras 1 e
2). Cada nucleotdeo consiste em um grupamento fosfato, um acar desoxirribose e
uma das quatro bases nitrogenadas diferentes, adenina, citosina, guanina, ou timina.
Cada um dos quatro nucleotdeos geralmente designado pela primeira letra da base
que contm: A, C, G ou T. Os quatro nucleotdeos so mostrados na Figura 1. Os
carbonos da desoxirribose recebem nmeros seguidos de apstrofo (1, 2, e assim por
diante) para distingu-los na numerao dos tomos das bases. No DNA, os nucleotdeos
so conectados uns aos outros nas posies 3 e 5, como mostrado na Figura 2. Assim,
cada cadeia dita como tendo uma polaridade, com uma ponta apresentando um grupo
fosfato (PO42) 5 e a outra um grupo hidroxila (OH) 3. As ligaes covalentes entre
os grupos repetidos de fosfato e acar so chamadas ligaes fosfodister.
As polaridades das duas cadeias de nucleotdeos entrelaadas esto em sentidos
opostos (Figura 2). As duas cadeias de nucleotdeos so mantidas juntas por ligaes
fracas chamadas pontes de hidrognio. As pontes de hidrognio so muito especficas
devido a um ajuste tipo chave-e-fechadura entre a forma e a carga atmica das bases
(Figura 2). A adenina pareia-se apenas com timina, e a guanina apenas com citosina. As
bases que formam os pares so ditas complementares.

Embora as pontes de hidrognio sejam fracas individualmente, suas ligaes


combinadas mantm as duas cadeias juntas de modo estvel. Alm disso, importante
que as ligaes entre as bases sejam relativamente fracas porque as duas cadeias tm
que ser separadas para que o processo de replicao da molcula ocorra. Os pares de
bases, que se posicionam no interior da dupla hlice, so estruturas hidrofbicas
achatadas que tm uma tendncia a se empilhar devido excluso de molculas de gua.
Este empilhamento confere aos dois filamentos entrelaados do DNA sua estrutura
helicoidal.
1.2. Organizao Cromossmica do DNA
Quando uma clula divide, seu material nuclear (cromatina) perde a aparncia
relativamente homognea tpica das clulas que esto em diviso e condensa-se numa
srie de organelas em forma de basto, denominadas cromossomos (Figura 3). Embora
os cromossomos sejam visveis como estruturas distintas apenas nas clulas em diviso,
eles conservam sua integridade entre divises celulares. A cromatina compe-se de
acido desoxirribonucleico (DNA) e uma classe complexa de protenas cromossmicas.
Os genes, neste ponto, definimos simplesmente como unidades de informaes
genticas, esto localizados no DNA cromossmico.
Cada espcie tem um conjunto cromossmico tpico (caritipo) em termos do
nmero e da morfologia dos cromossomos, cada gene possuindo uma posio precisa ou
locus. O mapa gnico, grfico da localizao cromossmica dos genes, tambm tpico
de cada espcie, sendo, at onde sabemos, idntico em todos os indivduos de uma
mesma espcie. A posio relativa de alguns genes parece ter sido altamente conservada
na evoluo recente, at mesmo entre espcies to diversas quanto homem e
camundongo.
1.3. Organizao dos Cromossomos Humanos
Os 46 cromossomos das clulas somticas humanas constituem 23 pares. Destes,
22 so semelhantes em ambos os sexos e denominados autossomos. O par restante
compreende os cromossomos sexuais XX no sexo feminino e XY no masculino. Os
membros de um par (descrito como cromossomos homlogos ou apenas homlogos)
possuem informaes genticas equivalentes; isto , possuem os mesmos loci gnicos
na mesma seqncia, mas em qualquer locus especfico eles podem ter formas idnticas
ou um pouco diferentes, quais so denominadas alelos. Um membro de cada par dos

cromossomos herdado do pai, o outro da me. Normalmente, os membros de um par


de autossomos so microscopicamente indistinguveis um do outro. Nas mulheres, os
cromossomos sexuais, os dois cromossomos X, tambm so indistinguveis. Nos
homens, contudo, os cromossomos sexuais diferem. Um um X, idntico aos Xs da
mulher, herdado de sua me por um homem transmitido s suas filhas; o outro, o
cromossomo Y, herdado do pai e transmitido aos filhos.
H dois tipos de diviso celular: mitose e meiose. A mitose a diviso habitual
das clulas somticas, pela qual o corpo cresce, se diferencia e realiza reparos. A diviso
mittica resulta normalmente em duas clulas-filhas, cada uma com cromossomos e
genes idnticos aos da clula-me. Pode haver dzias ou mesmo centenas de mitoses
sucessivas numa linhagem de clulas somticas. A meiose ocorre somente nas clulas
da linhagem germinativa e apenas uma vez numa gerao. Resulta na formao de
clulas reprodutivas (gametas), cada uma das quais tem apenas 23 cromossomos: um de
cada tipo de autossomo e um X ou Y. As clulas somticas tm o complemento
cromossmico diplide ou 2n (isto , 46 cromossomos), enquanto os gametas possuem
o complemento haplide ou n (isto , 23 cromossomos). As anormalidades do nmero
ou estrutura dos cromossomos, que em geral so clinicamente significativas, podem
surgir nas clulas somticas e gametas por erros na diviso celular.
A variao hereditria do genoma a base da gentica humana e mdica. As
formas alternativas de informaes genticas num determinado locus denominam-se
alelos. Muitos genes possuem apenas uma verso normal, que chamamos de alelo do
tipo selvagem. Outros loci genticos exibem polimorfismo (literalmente, muitas
formas), o que significa que na populao existe pelo menos dois alelos normais
relativamente comuns no locus. Alm do alelo ou alelo normais, a maioria dos loci
identificados tambm tem um ou mais alelos raros; de fato, muitos loci humanos foram
identificados atravs de um distrbio clinicamente significativo causado alelo mutante
raro.
O gentipo de uma pessoa a sua constituio gentica, seja coletivamente em
todos os loci ou, mais tipicamente, em um locus isolado. O fentipo a expresso
observvel de um gentipo como um carter morfolgico, bioqumico ou molecular.
Um fentipo pode ser normal ou anormal num dado indivduo.
Um carter monognico aquele determinado por um alelo especfico num
nico locus em um ambos os membros de um par de cromossomos. O alelo variante,
5

que surgiu por mutao em alguma poca do passado recente ou remoto, e em geral
relativamente raro, substitui um alelo do tipo selvagem normal em um ou ambos os
cromossomos. Quando uma pessoa tem um par de alelos idnticos diz-se que
homozigtica (um homozigoto); quando os alelos so diferentes, ela heterozigtica
(um heterozigoto). Esses termos (homozigtico, heterozigtico) podem ser aplicados a
uma pessoa ou a um gentipo. Usa-se o termo mutao em gentica com dois sentidos:
para indicar uma nova alterao gentica que no era previamente conhecida numa
famlia e, s vezes, meramente para indicar um alelo alternativo.
1.4. Organizao do Genoma Humano
O genoma humano, na sua forma diplide consiste em aproximadamente 6 a 7
bilhes de pares bases (ou 6 a 7 milhes de quilobases [kb]) de DNA organizados
linearmente em 23 pares de cromossomos. Pelas estimativas atuais, o genoma contm
30.000 a 70.000 genes que controlam todos os aspectos da embriognese,
desenvolvimento, crescimento, reproduo e metabolismo essencialmente todos os
aspectos do que faz o ser humano um organismo funcional. Assim a influncia dos
genes e da gentica nos estados de sade e doena ampla e suas razes so as
informaes codificadas no DNA encontrado no genoma humano. Conhecemos o papel
de apenas uma pequena percentagem do nmero total de genes. No entanto, o projeto
molecular e estrutural geral do genoma, de seus cromossomos e de seus genes est
sendo esclarecido. A anlise da organizao do genoma humano uma rea de
considervel entusiasmo na gentica humana e mdica atual; espera-se que muitas (se
no todas) informaes genticas no genoma sero num futuro prximo identificadas e
examinadas a nvel molecular como parte do que foi denominado Projeto Genoma
Humano, um esforo internacional para mapear e estabelecer a seqncia de todo o
genoma humano.
Embora a grande maioria dos genes se localize no ncleo, um subgrupo pequeno
reside no citoplasma, nas mitocndrias. Os genes mitocondriais exibem herana
exclusivamente materna. Todas as clulas humanas possuem centenas de mitocndrias,
cada uma contendo vrias cpias de uma pequena molcula circular, o cromossomo
mitocondrial. A molcula de DNA mitocondrial mede apenas 16 kb de comprimento
(menos de 0,03% do comprimento do menor cromossomo nuclear) e codifica 13 genes
estruturais-chave, bem como vrios genes de cido ribonucleico (RNA) estruturais.

1.4.1. Classes de DNA no Genoma Humano


A organizao do DNA no genoma humano bem mais complexa do que se
imaginava at pouco tempo atrs. Apenas trs quartos de comprimento linear total do
genoma consistem no denominado DNA singular ou de cpia nica, isto , o DNA cuja
seqncia de nucleotdeos representada apenas uma vez (ou no mximo algumas
vezes) por genoma haplide. O resto do genoma consiste em diversas classes de DNA
repetitivo e abrange o DNA cuja seqncia de nucleotdeos se repete, seja perfeitamente
ou com alguma variao, centenas a milhes de vezes no genoma. Embora a maioria
dos (mas no todos os) 30.000 a 70.000 genes estimados no genoma seja representada
em DNA de cpia nica, acredita-se que a frao de DNA repetitivo desempenhe um
papel na manuteno da estrutura do cromossomo, mas talvez no desempenhe um
papel essencial.
1.4.1.a. Seqncias de DNA de Cpia nica
Embora o DNA de cpia nica constitua a maior parte do DNA no genoma, sua
funo ainda um mistrio porque as seqncias que codificam protenas (isto , a
poro codificadora dos genes) compreendem apenas uma pequena proporo do DNA
de cpia nica. Longas extenses de seqncias de DNA singular (>25kb) so bastante
raras no genoma. A maior parte do DNA de cpia nica encontra-se em extenses curtas
(vrios kb ou menos), entremeadas com diversas famlias de DNA repetitivo.
1.4.1.b. Famlias de DNA Satlite
So conhecidas vrias categorias diferentes de DNA repetitivo. Uma
caracterstica distintiva til se as seqncias repetidas (repeties) esto agrupadas
em um ou em alguns locais, ou se esto espalhadas por todo o genoma, intercaladas com
seqncias repetidas agrupadas de cpia nica ao longo do cromossomo. Estima-se que
as seqncias repetidas agrupadas constituem 10 a 15% do genoma e consistem em
sries de vrias repeties curtas organizadas em tandem direto. Os diferentes tipos
dessas repeties em tandem so denominados coletivamente DNAs satlites, assim
chamados porque muitas das famlias de repeties em tandem originais podem ser
purificadas do resto do genoma via centrifugao por gradiente de densidade como
fraes satlites do DNA. O uso do termo satlite est atualmente disseminado na
gentica humana e deve-se ter cuidado para no confundir DNAs satlites como os
satlites citolgicos vistos nos cromossomos acrocntricos.

As famlias de DNA satlite variam quanto localizao no genoma, tamanho


total da srie de tandem, e tamanho das unidades repetidas que constituem a srie.
Algumas seqncias satlites humanas baseiam-se em repeties ou variaes, ou
ambas, de uma curta seqncia como um pentanucleotdeo. Longas sries dessas
repeties so encontradas nas regies de heterocromatina nos braos curtos proximais
dos cromossomos 1, 9 e 16 e em quase todo o brao longo do cromossomo Y. Outros
DNAs satlites baseiam-se em repeties bsicas um pouco mais longas. Por exemplo, a
famlia satlite de DNA compe-se de sries em tandem de diferentes cpias de uma
unidade de aproximadamente 171 pares bases, encontradas na regio centromdia de
cada cromossomo humano. Em geral, as sries satlites estendem-se por vrios milhes
de pares de bases ou mais e constituem at uma alta frao do contedo de DNA de um
cromossomo humano.
Um subgrupo particular de DNAs satlites no genoma humano compreende as
seqncias designadas minissatlites porque o tamanho total da srie parece ser bem
mais limitado. Cada minissatlite baseia-se em repeties cabea-para-cauda de um
monmero de tamanho intermedirio (15 a 65 pares de bases) e geralmente abrange
apenas alguns quilobases (at 20kb) no total. diferena das sries satlites altamente
localizadas, acima descritas, os minissatlites distribuem-se mais ou menos ao longo da
extenso de cada cromossomo. Muitas seqncias de minissatlites so importantes
como instrumentos moleculares para examinar a variao acentuada que existe entre
genomas de indivduos diferentes. Como uma classe, esses marcadores do DNA ,
como so chamados, esto revolucionando muitas reas de gentica: mapeamento do
genoma humano, anlise dos cromossomos, medicina forense e diagnstico de doenas
hereditrias atravs de tcnicas moleculares.
1.4.1.c. Famlias de DNA Repetitivo Disperso
Alm dos DNAs satlites repetitivos em tandem, outra classe importante de
DNA repetitivo no genoma consiste em seqncias relacionadas que se espalham por
todo o genoma, e vez de ficarem localizadas. Embora muitas famlias pequenas de DNA
satisfaam esta descrio genrica, duas em particular merecem destaque porque juntas
perfazem uma proporo significativa do genoma e porque foram implicadas em
doenas genticas.
Os elementos repetidos dispersos mais extensamente estudados pertencem
famlia Alu, assim denominada porque a maioria dos seus membros clivada por uma
8

endonuclease de restrio bacteriana designada AluI, que era usada na purificao


inicial deste DNA. (vide descrio sobre endonucleases de restrio no item 2.3). Os
membros dessa famlia tm um comprimento de cerca de 300 pares de bases e so
relacionados uns aos outros, mas no exibem uma seqncia idntica. No total, existem
cerca de 500.000 membros da famlia Alu no genoma, estimando-se que constituam 3%
do DNA humano. A segunda famlia importante de DNA repetitivo disperso a famlia
L1. Os elementos L1 so seqncias repetitivas longas (com comprimento de at 6kb)
encontradas em cerca de 10.000 cpias por genoma
Num genoma to complexo e sofisticado quanto o nosso interessante que uma
proporo to grande do DNA cromossmico (incluindo os DNAs satlites e repetitivos
dispersos e parte do DNA de cpia nica) no tenha nenhuma funo bvia ou
identificada. De fato, embora a idia seja execrvel para alguns, props-se que muitas
destas seqncias (s vezes denominadas DNA egostas ou sucata) no tem
absolutamente nenhuma funo, mantendo-se no genoma apenas porque exploram
processos celulares para garantir a prpria propagao.

2. Variao Individual no DNA.


O genoma humano mais ou menos o mesmo em todas as pessoas, os mesmos
genes estaro na mesma ordem com as mesmas regies intergnicas os separando. Mas
o genoma humano, bem como o dos demais organismos contm muitos polimorfismos,
posies onde a seqncia de nucleotdeos no a mesma em cada membro da
populao. Dentre os polimorfismos (ou marcadores genticos) conhecidos, incluem-se
como os mais importantes: polimorfismos de tamanho de fragmento de restrio
(RFLP), nmero varivel de repeties em tandem (VNTR), repeties curtas em
tandem (STR) e polimorfismos de nucleotdeos individuais (SNP) vide abaixo, para
um descrio detalhada. Cada um desses polimorfismos pode ser analisado como uma
regio gentica em si mesma e, em virtude da variabilidade observada, podem existir em
duas ou mais formas allicas, em geral vrios alelos alternativos so descritos para um
determinado locus. No devemos esquecer que para cada locus, seja de um gene ou de
um marcador gentico, possvel encontrar um ou dois alelos (no mximo) por
indivduo, identificado respectivamente como homozigoto ou heterozigoto para esse
locus.

2.1. Polimorfismos de DNA de Interesse Forense


Devido ao grande nmero de polimorfismos observados em seres humanos,
virtualmente certo que cada um de ns geneticamente nico (com exceo de gmeos
idnticos, vide Figura 4). Esta mesma variao gentica pode ser usada para identificar
pessoas, como a impresso digital o faz. Tendo em vista que o DNA pode ser
encontrado em qualquer amostra de tecido, incluindo sangue, smen, e at mesmo em
saliva e cabelo, a anlise da variao gentica pode contribuir de maneira substancial na
elucidao de casos forenses (casos criminais, disputas de paternidade, identificao de
vtimas de acidentes, pessoas desaparecidas, e assim por diante, vide Figura 5).
O princpio subjacente a um perfil de DNA bem simples. Se forem examinados
polimorfismos suficientes em uma determinada pessoa, a probabilidade de que qualquer
pessoa da populao tenha os mesmos alelos em cada locus, torna-se extremamente
reduzida (Figura 5). O DNA deixado na cena de um crime sob a forma de sangue ou
smen, por exemplo, pode ser tipificado quanto a uma srie de polimorfismos genticos.
Devido a extrema sensibilidade da tcnica de PCR, at mesmo uma amostra residual de
muitos anos pode conter DNA suficiente para uma anlise de laboratrio (Figura 6). O
perfil gentico obtido a partir da anlise de laboratrio ento comparado com o de um
suspeito. Se os alelos que compem estes perfis forem correspondentes ento o suspeito
implicado.
Uma questo importante se outra pessoa na populao geral poderia ter os
mesmos alelos que o suspeito. O perfil do DNA poderia ento implicar falsamente a
pessoa errada? Nos casos criminais, a probabilidade de se obter uma correspondncia de
alelos com um membro aleatrio na populao calculada. Em funo do alto grau de
variao gentica nos polimorfismos mais utilizados para finalidades forenses (mini- e
microssatlites, vide abaixo), estas probabilidades so, via de regra, desprezveis. Um
conjunto de apenas quatro loci de VNTR tipicamente fornecer a probabilidade de
correspondncia aleatria de um em um milho. O uso de loci adicionais tornar esta
probabilidade muito menor. Portanto, que um nmero suficiente de loci seja usado sob
condies laboratoriais bem definidas e que os dados sejam coletados e avaliados
cuidadosamente, estes perfis de DNA fornecero uma evidncia forense altamente til.
Embora tenhamos a tendncia de pensar em tal evidncia em termos de
identificao do culpado, devemos ter em mente que quando no obtida a
correspondncia, um suspeito pode ser libertado. Foi relatado que aproximadamente um
10

tero dos casos de estupro nos quais foi usado o perfil de DNA, o suspeito foi libertado
porque o seu DNA no correspondia amostra de evidncia. Assim, os perfis de DNA
podem beneficiar os que so falsamente acusados.
2.2. Deteco e Medida da Variao Gentica ao Nvel de DNA
Durante sculos, ficamos intrigados com as diferenas existentes entre as
pessoas. A ateno era enfocada nas diferenas observveis, como a colorao da pele e
a forma e o tamanho do corpo. Apenas no sculo XX tornou-se possvel examinar as
variaes dos genes, conseqncia de mutaes que se acumularam com o tempo. A
avaliao da variao gentica ao nvel dos genes foi levada a cabo pela anlise direta
dos polimorfismos de seus produtos, as protenas. Contudo, esta abordagem mostrou-se
insuficiente para finalidades forenses.
As diferenas genticas identificveis via polimorfismos de protenas tm sido
usada em laboratrios forenses desde o final da dcada de 1960. Inicialmente, os
marcadores proteicos baseavam-se nos grupos sangneos do sistema ABO.
Posteriormente, outros grupos sanguineos, protenas do soro, e, mais recentemente,
antgenos de histocompatibilidade (HLA) foram tipados por reao imunolgica ou
eletroforese. Como os genes, em sua maioria, representam regies do DNA
codificadoras de protenas e, portanto, sujeitas a rgidas presses seletivas, uma
desvantagem do uso de polimorfismos de protenas o limitado grau de variao
associado com esses marcadores. Assim, a identificao de alelos com alta freqncia
na populao entre duas amostras de menor valor se a probabilidade de ocorrncia
alta simplesmente por mero acaso. Portanto, a nfase na aplicao legal tem sido para a
excluso em vez da identificao positiva quando duas amostras so comparadas.
Outros problemas inerentes analise de protenas relacionam-se quantidade de
tecido necessrio para o teste e relativa facilidade com que as protenas se degradam.
Essas consideraes so particularmente relevantes quando se tem em mente a cena de
um crime onde freqentemente as condies de anlise da amostra esto longe da ideal.
Por fim, as regies codificadoras de protenas correspondem a apenas 3% do
genoma humano. E o que dizer sobre a diversidade gentica nos demais 97% de DNA?
Avalia-se que os seres humanos difiram em aproximadamente 1/300 a 1/500 pb. Assim,
aproximadamente 10 milhes de polimorfismos podem existir entre os 3 bilhes de
pares de bases que compem o genoma humano. Como existem apenas uns 100 grupos

11

sangneos e polimorfismos eletroforticos de protenas, estes enfoques detectam


apenas uma pequena frao de nossa variao de DNA. E como acessar ento a enorme
variabilidade gentica humana? Felizmente novas tcnicas moleculares foram
desenvolvidas nos ltimos 20 anos, possibilitando a deteco direta de milhares de
novos polimorfismos a nvel de DNA. Estas anlises que revolucionaram tanto a prtica
quanto o potencial da gentica mdica e forense, sero discutidas a seguir.
2.3. Polimorfismos de Tamanho de Fragmento de Restrio (RFLPs)
O primeiro enfoque importante para a deteco da variao gentica em nvel de
DNA tirou proveito da existncia de enzimas bacterianas conhecidas como
endonucleases de restrio ou enzimas de restrio. Essas enzimas so produzidas por
vrias espcies de bactrias para restringir a entrada de DNA exgeno na clula
bacteriana, cortando o DNA em seqncias especficas feito verdadeiras tesouras
moleculares. As seqncias reconhecidas pelas enzimas de restrio so chamadas
stios de restrio. Por exemplo, a bactria intestinal Escherichia coli produz uma
enzima de restrio, a EcoRI, que reconhece a seqncia de DNA 5GAATTC3. Cada
vez que este stio encontrado, a enzima cliva a seqncia entre G e A em ambas as
fitas do DNA. Isto resulta em fragmentos de restrio de DNA.
Imagine agora uma regio do DNA que tem milhares de pares de bases de
comprimento e inclua trs stios de restrio para EcoRI. Suponha que exista um
polimorfismo no meio do stio de restrio (por exemplo, algumas pessoas podem ter a
seqncia 5GAATTT3 em vez de 5GAATTC3 reconhecida pela EcoRI. A enzima
no cortar a seqncia 5GAATTT3, embora corte os stios de restrio normais que
estejam situados em ambos os lados da seqncia polimrfica. Este fragmento de DNA
ser maior na pessoa que no tem o stio do que nas que o tm (Figura 7). Se estes
tamanhos diferentes puderem ser diretamente visualizados, ser possvel observar
diferenas de seqncias de DNA entre as pessoas (polimorfismo de DNA).
Foram criadas vrias etapas que permitem esta visualizao. Primeiro, o DNA
genmico total extrado de uma amostra de tecido, geralmente sangue. Ento o DNA
exposto a uma enzima de restrio tal como a EcoRI. Este processo chamado de
digesto enzimtica. A digesto produz mais de um milho de fragmentos de DNA. Para
avaliar a variao de tamanho, estes fragmentos so submetidos eletroforese em gel,
onde os fragmentos menores migram mais rapidamente que os maiores. O DNA
desnaturado (convertido de bifilamentar para a forma unifilamentar) por exposio a
12

solues alcalinas. Para fixar permanentemente as posies dos fragmentos de DNA,


eles so transferidos por capilaridade para uma membrana slida, tal como
nitrocelulose, o que conhecido como transferncia de Southern, em homenagem ao
inventor do processo, em meados da dcada de 1970. Neste ponto, a membrana slida
contm muitos milhares de fragmentos dispostos de acordo com o seu tamanho. Diante
de tantos fragmentos de DNA seria impossvel distinguir um do outro devido a sua
abundncia. Como obter fragmentos especficos de DNA?
Aqui, possvel explorar o princpio do pareamento complementar de bases do
DNA. Para identificar um ou mais fragmentos relevantes dentre os milhes de
fragmentos na membrana, utiliza-se uma sonda radiomarcada. A sonda consiste em um
pequeno fragmento de DNA humano purificado que foi marcado, em geral com um
istopo radioativo, e desnaturado at a condio de filamento nico. A membrana
exposta a milhares de cpias da sonda que, em condies que favorecem a formao de
DNA bifilamentar, ir ento hibridizar, isto , formar um pareamento complementar de
bases, apenas com os fragmentos unifilamentares de DNA apropriados. Para visualizar a
posio da sonda hibridizada, a membrana exposta a um filme de raios X, que
escurece na posio da sonda devido emisso de partculas radioativas dela emanadas,
formando as bandas de DNA.
Ao final desta descrio metodolgica, cujas etapas podem ser vistas
esquematizadas na Figura 8, o termo polimorfismos de tamanho de fragmentos de
restrio (abreviados como RFLP, pronuncia-se riflip) agora deve ser auto-explicativo.
Os RFLPs so polimorfismos revelados pela variao nos tamanhos de fragmentos de
restrio.
2.4. Polimorfismos de Nmero de Repeties em Tandem (VNTRs e STRs)
O enfoque descrito acima geralmente detecta a presena ou ausncia de um stio
de restrio. Estes polimorfismos so em geral chamados de polimorfismos de stios de
restrio (RSPs). Neste caso, um polimorfismo s tem dois alelos possveis,
estabelecendo um limite na quantidade de diversidade gentica que pode ser vista. Mais
diversidade pode ser observada se um sistema polimrfico tiver muitos alelos e no
apenas dois. Uma variao no enfoque de RFLP forneceu tal sistema. Esta variao em
particular explora os minissatlites que existem pelo genoma. Os minissatlites so
regies nas quais a mesma seqncia de DNA repetida vrias vezes, em tandem. A
variao gentica medidas aqui est no nmero de repeties em uma determinada
13

regio, que varia substancialmente de indivduo para indivduo (origem do termo


nmero varivel de repeties em tandem ou VNTRs).
Os VNTRs so detectados usando-se um enfoque similar ao usado para os RFLPs
convencionais. O DNA digerido com uma enzima de restrio, e os fragmentos so
submetidos a eletroforese, desnaturados e transferidos para o meio slido. A diferena
principal que as sondas especiais so usadas para se hibridizar apenas com uma
determinada regio de minissatlite (Figura 9). Enquanto os RSPs revelam
polimorfismo devido a presena ou ausncia de um stio de restrio, os VNTRs
revelam polimorfismos devido a nmeros diferentes de repeties situadas entre dos
stios de restrio (compare os enfoques analisando a Figura 10). O nmero dessas
repeties pode variar consideravelmente nas populaes: uma regio de minissatlite
pode ter apenas duas ou trs repeties, ou at 20 ou mais. Estes polimorfismos podem,
portanto, revelar um alto grau de variao gentica.
Do mesmo modo que as regies de minissatlites podem variar de tamanho, os
microssatlites tambm pode variar em comprimento como resultado de nmeros
diferentes de repeties. Cada repetio de microssatlite substancialmente menor que
uma repetio de minissatlite (2, 3, 4 ou 5 pb de comprimento). Elas so chamadas de
repeties de dinucleotdeos, trinucleotdeos, tetranucleotdeos e pentanucleotdeos,
respectivamente, que em conjunto recebem a denominao de repeties curtas em
tandem (STR). Uma repetio de microssatlite pode ocorrer em tandem at vrias
centenas de vezes, e este nmero varia consideravelmente entre as pessoas (e
geralmente entre os dois cromossomos homlogos de uma pessoa). Estes polimorfismos
de repetio de microssatlites diferem dos VNTRs j discutidos, em termos de seus
tamanhos, e tambm porque no so definidos por stios de restrio que flanqueiam a
regio de repetio. A tcnica da reao em cadeia de polimerase (PCR), discutida a
seguir, usada para isol-las (Figura 11). Os STRs so mais abundantes que os VNTRs,
mais uniformemente distribudos no genoma, e mais fceis de se avaliar no laboratrio.
Assim, eles se tornaram o polimorfismo de escolha da maioria dos estudos de tipagem
gentica individual. Ambos os tipos de polimorfismos so teis em aplicaes forenses,
como os testes de paternidade e a identificao de suspeitos de crimes.
2.4.1. Amplificao de DNA pela Reao em Cadeia da Polimerase
As anlises de RFLP e VNTR, que foram teis em muitas aplicaes,
originalmente dependiam da transferncia de Southern e dos procedimentos de
14

clonagem. Estas tcnicas apresentam algumas limitaes. A clonagem consome muito


tempo, em geral precisando de uma semana ou de mais de tempo de laboratrio. Alm
disso, o enfoque padro da transferncia de Southern requer quantidades relativamente
grandes de DNA purificado, em geral vrios microgramas (at 1 ml de sangue fresco
seria necessrio para produzir esse DNA). Um enfoque mais novo para se fazer cpias
do DNA, a reao em cadeia da polimerase (PCR), tornou a deteco da variao
gentica ao nvel de DNA muito mais eficiente. Essencialmente, a PCR um meio
artificial de replicar uma seqncia curta especfica de DNA (vrios kb pelo menos)
muito rapidamente, de modo que so feitas milhes de cpias da seqncia.
O processo da PCR exige quatro componentes principais:
I)

Dois iniciadores (ou primers), consistindo de 15 a 20 bases de DNA cada. Estas


pequenas seqncias de DNA so chamadas de oligonucleotdeos, oligo
indicando poucos. Os iniciadores correspondem a seqncia de DNA
imediatamente adjacentes seqncia de interesse (esta seqncia pode conter
uma mutao que cause doena, pode conter um polimorfismo de repetio de
microssatlite). Estes iniciadores oligonucleotdeos so sintetizados usando-se
um instrumental de laboratrio;

II)

DNA polimerase. Uma forma termicamente estvel desta enzima, inicialmente


derivada da bactria Thermus aquaticus, efetua o processo vital de replicao do
DNA (aqui chamado de amplificao);

III)

Nucleotdeos livres: dATP, dCTP, dGTP, dTTP;

IV)

DNA genmico humano. Devido extrema sensibilidade da PCR, a quantidade


deste DNA pode ser muito pequena (aproximadamente 20ng);
O DNA genmico inicialmente aquecido a uma temperatura relativamente alta

(95C mais ou menos) de modo que a molcula se desnatura e fica uniflamentar. Este
DNA ento exposto a grandes quantidades de iniciadores, com os quais se hibridiza por
meio das bases complementares do DNA, medida que resfriado a uma temperatura
de helicoidizao de aproximadamente 35 a 65C. O DNA ento aquecido a uma
temperatura intermediria (70 a 75C). Na presena de um grande nmero de
nucleotdeos livres, um novo filamento de DNA sintetizado pela DNA polimerase a
esta temperatura, estendendo a seqncia do iniciador. O DNA recm-sintetizado
consiste em um duplo filamento que tem a ponta 5 do iniciador em uma extremidade,

15

seguido das bases adicionadas por meio da extenso do iniciador pela DNA polimerase.
O DNA bifilamentar ento aquecido novamente a uma alta temperatura, fazendo com
que ele se desnature. O ciclo de aquecimento-resfriamento ento repetido. Agora, o
DNA recm-sintetizado serve como molde para outras snteses. medida que os ciclos
de aquecimento-resfriamento so repetidos, o DNA ligado ao iniciador amplificado
geometricamente: o nmero de cpias dobra a cada ciclo (2,4,8,16, e assim por diante).
Da o processo ser chamado reao em cadeia. Tipicamente os ciclos so repetidos a
cada 20 a 30 vezes, produzindo milhes de cpias do DNA original. Em resumo, o
processo de PCR consiste em trs etapas bsicas: desnaturao do DNA em alta
temperatura, hibridizao do iniciador a uma temperatura intermediria e polimerizao.
O resultado um produto que consiste quase que inteiramente de uma seqncia de
DNA especfica. A Figura 12 resume todo o processo.
Como cada ciclo de aquecimento-resfriamento requer apenas alguns minutos ou
menos, uma tpica molcula de DNA pode ser amplificada para fazer milhes de cpias
em poucas horas. Sendo o procedimento simples e autocontido, foram desenvolvidos
aparelhos para automatiz-lo totalmente. Uma vez que o DNA tenha sido amplificado,
ele pode ser analisado de vrios modos.
A PCR tem vrias vantagens em relao s tcnicas anteriores. Primeiro, pode
ser usada com quantidades extremamente pequenas de DNA (nanogramas ou mesmo
picogramas, em oposio aos microgramas necessrios para clonagem). A quantidade
de DNA em uma mancha de sangue de vrios anos, um nico fio de cabelo ou mesmo a
parte de uma goma de um selo lambido so em geral suficientes para anlise. Segundo,
como no requer clonagem gnica, o procedimento portanto muito mais rpido. Um
exame de DNA, que requeria uma semana ou mais usando tcnicas antigas pode ser
feito em um nico dia com PCR. Finalmente, como a PCR pode produzir grandes
quantidades de DNA purificado, menos freqentemente necessrio usar sondas
radioativas para detectar seqncias ou polimorfismos especficos. Ao invs disso,
compostos marcadores no radioativos, como biotina, podem ser usados.
A PCR tem algumas desvantagens. Primeira, a sntese dos iniciadores
obviamente requer o conhecimento das seqncias de DNA que flanqueiam o DNA de
interesse. Quando no h nenhuma informao disponvel sobre a seqncia, outras
tcnicas devem ser usadas. Segunda, a extrema sensibilidade da PCR a torna suscetvel
contaminao no laboratrio. Vrias preocupaes so comumente tomadas de modo a

16

se proteger contra contaminao. Finalmente, difcil aplicar a PCR para seqncias


maiores que um ou alguns kb. Assim, ela no poder ser usada para detectar regies
maiores que isso. Nestes casos, so usadas tcnicas tpicas, como a transferncia de
Southern.
Como a PCR uma tcnica poderosa e verstil, ela hoje amplamente usada no
diagnstico de doenas genticas, medicina forense e gentica evolutiva. Ela suplantou
a transferncia de Southern em muitas aplicaes, e hoje freqentemente usada para
avaliar RFLPs e VNTRs, e principalmente STRs. A PCR to sensvel que tem sido
usada para estudar o DNA de mmias, e mesmo de um neandertal com 30.000 anos. A
anlise deste material mostrou que os seres humanos modernos so geneticamente bem
diferentes dos neandertais, e portanto improvvel que descendam deles.
2.5. Polimorfismos de Nucleotdeos Individuais (SNPs)
Os polimorfismos de nucleotdeos individuais (SNPs) so os polimorfismos mais
comuns no genoma humano e consistem em posies de um genoma em que qualquer
um de dois ou mais nucleotdeos pode ocorrer (Figura 13). Tais mutaes pontuais
podem ser tipificadas por RFLP, caso o polimorfismo recaia dentro de um stio de
restrio; anlise com sondas de oligonucleotdeos especficos (tcnica abreviada como
ASO, de Allele Specific Oligonucleotides), as quais se hibridizam com formas
alternativas de SNP; e mais diretamente por seqenciamento de DNA.
2.5.1. Seqenciamento de DNA
O mtodo didesoxi de seqenciamento por terminao de cadeia do DNA
inventado por Frederick Sanger que faz uso de didesoxinucleotdeos terminadores de
cadeia. Eles so quimicamente muito similares aos desoxinucleotdeos comuns, a no
ser por falta do grupo hidroxila na posio 2 (Figura 14). Isto impede a formao
subseqente de ligaes fosfodister com bases livres de DNA. Assim, embora os
didesoxinucleotdeos passam a ser incorporados hlice crescente de DNA, nenhum
nucleotdeo adicional pode ser acrescentado aps terem sido includos. So usados
quatro didesoxinucleotdeos diferentes, cada um correspondendo a um dos quatro
nucleotdeos (A, C, G e T). O DNA unifilamentar cuja seqncia desejamos determinar
misturado a iniciadores marcados com radiao, DNA polimerase, nucleotdeos
comuns e um tipo de didesoxinucleotdeos. O iniciador se hibridiza posio
complementar apropriada no DNA unifilamentar, e a DNA polimerase adiciona bases

17

livres molcula crescente de DNA, similar etapa de extenso de iniciador no


processo de PCR. Os didesoxinucleotdeos so incorporados s cadeias do mesmo modo
que o nucleotdeo correspondente. Entretanto, uma vez que o didesoxinucleotdeo se
incorpore, a polimerizao interrompida e a cadeia terminada. Em qualquer posio
pode ser incorporado ou o nucleotdeo comum ou o didesoxinucleotdeo
correspondente. Este um processo aleatrio. O procedimento produz fragmentos de
DNA

de

tamanhos

variados,

cada

um

terminado

com

um

dos

quatro

didesoxinucleotdeos. Os fragmentos de DNA podem ser separados de acordo com o


seu tamanho pela eletroforese (Figura 15). Assim, so efetuadas quatro reaes
diferentes de seqenciamento, uma para cada base. Os fragmentos obtidos de cada
reao so submetidos a eletroforese lado a lado no mesmo gel, de modo que a posio
de cada fragmento pode ser comparada. Como cada banda corresponde a uma
terminao de cadeia de DNA com uma nica base, a seqncia de DNA pode ser lida
observando-se a ordem das bandas no gel aps a auto-radiografia (o iniciador radioativo
indica a posio dos fragmentos no filme de raio X). Vrias centenas de pares de bases
podem em geral ser seqenciadas em uma srie de reaes (Figuras 14 e 15).
Seqenciar o DNA deste modo um processo relativamente lento, trabalhoso e
sujeito a erro. Mais recentemente, foram desenvolvidas estratgias para seqenciamento
automatizado

de

DNA

usando-se

sistemas

de

deteco

fluorescente,

quimioluminescente ou colorimtrico. O uso de iniciadores ou didesoxinucleotdeos


marcados com fluorocromos tornou-se o mais popular destes mtodos, em parte, porque
pode ser facilmente adaptado rpida automao.
Tipicamente, um molde de DNA seqenciado usando-se um mtodo similar
etapa de extenso de iniciador da PCR. Cada um dos quatro nucleotdeos diferentes
pode ser marcado com um fluorocromo que emite um espectro diferente de luz. Os
produtos de reao marcados com o fluorocromo so submetidos a eletroforese em um
gel fino de poliacrilamida, e medida que migram, so excitados por um feixe de luz de
um laser. A luz emitida capturada por uma cmera digital para a traduo em um sinal
eletrnico, sendo, gerada uma imagem composta do gel. Esta imagem do gel estudada
para produzir um grfico, no qual cada um dos quatro nucleotdeos diferentes
representado por um pico de luz diferente. Atualmente o sistema de separao em gel
em placa foi otimizado para capilares. Seqenciadores automatizados tambm podem

18

ser adaptados para triar polimorfismos de microssatlites (STRs) e polimorfismos de


nucleotdeos nicos (SNPs).
Usando-se computadores e tcnicas de automao avanadas, enfoques como
esses tm aumentado muito a velocidade potencial de seqenciamento do DNA. Estas
tcnicas permitiram o seqenciamento de todos os trs bilhes de pares bases do
genoma humano.

3. Base Estatstica e Populacional para Anlise de Perfis de DNA


3.1. Gentica de Populaes e a Teoria das Freqncias Allicas
A teoria da gentica de populaes uma teoria de freqncias allicas. Cada
gene no genoma existe em diferentes estados allicos, e se for enfocado um determinado
gene, um indivduo diplide um homozigoto ou heterozigoto. Em uma populao de
indivduos, podemos calcular as freqncias dos diferentes tipos de homozigotos e
heterozigotos de um gene, e por estas freqncias podemos avaliar a freqncia de cada
um dos alelos dos genes. Estes clculos so a fundao da teoria da gentica de
populaes.
3.1.1. Estimativa das Freqncias Allicas
Como uma populao inteira em geral muito grande para ser estudada,
analisamos uma amostra representativa de indivduos dela apresentando dados de uma
amostra de pessoas que foram testadas quanto aos tipos sangneos M-N. Estes tipos
sangneos so determinados por dois alelos de um gene no cromossomo 4: LM, que
produz o tipo sangneo M e LN , que produz o tipo sangneo N. As pessoas que so
heterozigotas LMLN tm o tipo sangneo MN.

Freqncia de Tipo Sangneos M-N em uma Amostra de 6.129 Pessoas

Tipo Sangneo

Gentipo

Nmero de Pessoas

LMLM

1.787

MN

LMLN

3.039

LNLN

1.303

19

Para estimar as freqncias dos alelos LM e LN, simplesmente calculamos a


incidncia de cada alelo entre todos os alelos demonstrados.
1- O nmero total de alelos na amostra duas vezes o tamanho da amostra: 2 x
6.129 = 12.258.
2- A freqncia de alelo LM duas vezes o nmero de homozigotos LMLM mais o
nmero de heterozigotos LMLN e o total dividido pelo nmero total de alelos
amostrados: [(2 x 1.787) + 3.039]/12.258 = 0,5395.
3- A freqncia do alelo LN duas vezes o nmero de homozigotos LNLN mais o
nmero de heterozigotos LMLN e o total dividido pelo nmero total de alelos
amostrados: [(2 x 1.303) + 3.039]/12.258 = 0,4605.
Assim se p representar a freqncia do alelo LM e q representar a freqncia do
alelo LN, avaliamos que na populao onde a amostra foi obtida p = 0,5395 e q =
0,4605. Alem disso, como LM e LN so nicos dois alelos deste gene em particular, p + q
= 1. Quando a contagem direta do nmero de alelos em uma amostra no possvel
porque um dos alelos fenotipicamente dominante, no podemos estimar as freqncias
allicas. Entretanto, outro mtodo, discutido na sesso seguinte, fornece estas
estimativas.
Neste exemplo, cada um dos alelos tem uma freqncia razoavelmente alta, uma
que pode ser avaliada confiavelmente com uma amostra de tamanho moderado.
Entretanto, alguns alelos tm freqncias de 0,01 ou menos, e a avaliao de suas
freqncias, ou mesmo a sua deteco, requer uma grande amostra. Sempre que o
segundo alelo mais freqente de um gene tem uma freqncia maior que 0,01, nos
referimos situao como um polimorfismo gentico.
3.1.2. O Princpio de Hardy-Weinberg
As freqncias allicas avaliadas tm algum valor preditivo? Podemos us-las
para prever as freqncias genotpicas? Na primeira dcada do sculo XX, estas
perguntas foram feitas independentemente por G. H. Hardy, um matemtico britnico, e
por Wilhelm Weinberg, um mdico alemo. Em 1908, Hardy e Weinberg publicaram,
cada um, trabalhos descrevendo uma relao matemtica entre freqncias allicas e
freqncias genotpicas de uma populao por suas freqncias allicas.

20

Suponhamos que em uma populao um determinado gene est segregando dois


alelos, A e a, e que a freqncia A p e a de a q. Se considerarmos que os membros
da populao se reproduzem aleatoriamente, ento os gentipos diplides da gerao
seguinte sero formados pela unio aleatria de ovcito (ou espermatozide). A
probabilidade que o gameta carregue o alelo A p, e a probabilidade que carregue o
alelo a q. Assim, a probabilidade de produzir um homozigoto AA na populao
simplesmente p x p = p2, e a probabilidade de produzir um homozigoto aa q x q = q2.
Para os heterozigotos Aa existem duas possibilidades. Um espermatozide A pode se
juntar a um ovcito a, ou um espermatozide a pode se unir a um ovcito a. Cada um
destes eventos ocorre com a probabilidade p x q , e como so igualmente provveis, a
probabilidade total de formar um zigoto Aa 2pq. Assim, supondo um casamento
aleatrio, as freqncias previstas para os trs gentipos na populao so:

Gentipo

Freqncia

AA

p2

Aa

2pq

aa

q2

Estas freqncias previstas so os termos na expanso binomial (p + q)2 = p2 +


2pq + q2. Os geneticistas de populao referem-se a elas como freqncias genotpicas
de Hardy-Weinberg. A suposio final adjacente ao Princpio de Hardy-Weinberg que
os membros da populao se reproduzem aleatoriamente com relao ao gene em
estudo. Esta suposio significa que os adultos na populao essencialmente formam
um pool de gametas, que na fertilizao, combinam-se aleatoriamente para produzir os
zigotos da gerao seguinte. Se estes zigotos tm chances iguais de sobreviver at o
estgio adulto, ento as freqncias genotpicas no momento da fertilizao sero
preservadas, e quando a gerao seguinte se reproduzir, estas freqncias novamente
aparecero na prole. Assim com a reproduo aleatria sem sobrevida e reproduo
diferencial entre os membros da populao, as freqncias genotpicas de HardyWeinberg e, logicamente, as freqncias allicas subjacentes persistem gerao aps
gerao. Esta condio chamada de Equilbrio de Hardy-Weinberg. O equilbrio de
Hardy-Weinberg muitas vezes no observado em populaes naturais devido
21

interferncia de foras que perturbam este equilbrio alterando freqncias allicas.


Estas foras mutao, migrao, seleo natural e deriva gentica aleatria tm
papis importantes no processo evolutivo.
3.1.3. Aplicaes do Princpio de Hardy-Weinberg
O Princpio de Hardy-Weinberg se aplica ao exemplo do tipo sangneo M-N em
populao real. A partir dos dados do quadro a seguir, a freqncia do alelo LM foi
estimada como sendo p = 0,5395 e a freqncia do alelo LN foi estimada como sendo q
= 0,4605. Com o Princpio Hardy-Weinberg, agora podemos usar freqncias allicas
para prever as freqncias genotpicas dos genes para o tipo sangneo M-N:

Gentipo

Freqncia de Hardy-Weinberg

LMLM

p2 = (0,5395)2 = 0,2911

LMLN

2pq = 2 (0,5395) (0,4605) = 0,4968

LNLN

q2 = (0,4605)2 = 0,2121

Estas previses correspondem aos dados originais dos quais as duas freqncias
allicas foram estimadas? Para responder a esta pergunta, devemos comparar os
nmeros de gentipos observados com os nmeros previsto pelo Princpio de HardyWeinberg. Obtemos estes nmeros previstos multiplicando as freqncias de HardyWeinberg pelo tamanho da amostra obtida da populao.

Gentipo

Nmero Previsto

LMLM

0,2911 X 6.129 = 1.784,2

LMLN

0,4968 X 6.129 = 3.044,8

LNLN

0,2121 X 6.129 = 1.300,0

Assim, os resultados so extraordinariamente prximos aos dados da amostra


original apresentados e os desvios observados foram obtidos por obra do acaso.
Podemos verificar a concordncia entre os nmeros observados e os previstos

22

calculando uma estatstica apropriada como a do teste do qui-quadrado. No entanto, o


desenvolvimento da estatstica do qui-quadrado est alm do objetivo deste texto.
Conclumos ento que as freqncias genotpicas previstas esto de acordo com
as freqncias observadas na amostra, e mais ainda, deduzimos que na populao da
qual a amostra foi obtida dos gentipos M-N esto nas propores de Hardy-Weinberg,
um achado que no surpreendente tendo em vista que o casamento em geral no
baseado no tipo sangneo.
Para os genes alelos mltiplos, as propores genotpicas de Hardy-Weinberg
so obtidas expandindo-se a expresso multinomial. Por exemplo, os tipos sangneos
ABO so determinados pelos trs alelos IA, IB e IO . Se as freqncias deles so p, q, r,
respectivamente, ento as freqncias dos seis gentipos diferentes no sistema de tipo
sangneo ABO so obtidas pela expanso trinomial (p + q + r)2 = p2 + q2 + r2 + 2pq +
2qr + 2pr:

Tipo Sangneo

Gentipo

Freqncia

IAIA

p2

IAIO

2pr

IBIB

q2

IBIO

2qr

AB

IAIB

2pq

IOIO

r2

Existem muitos motivos pelos quais o Princpio de Hardy-Weinberg no pode


ser aplicado a uma populao particular. A reproduo pode no ser aleatria, os
membros da populao portadores de alelos diferentes podem no ter chances iguais de
sobrevida e reproduo, a populao pode ser dividida em unidades parcialmente
isoladas ou pode ser um amlgama de populaes diferentes que se juntaram
recentemente por migrao.

23

4. Bibliografia
Brown, T. A. (2003). Clonagem Gnica e Anlise de DNA: Uma Introduo. 4 Ed.
ARTMED.
Comit sobre a Tecnologia do DNA na Cincia Forense. (1999). A Tecnologia do DNA
na Cincia Forense. FUNPEC, Ribeiro Preto.
Jeffreys, A. J., Wilson, V., & Thein, L. S. (1985). Individual-specific fingerprints of
human DNA. Nature. 314: 67-73.
Krawczak, M. & Schmidtke, J. (1998). DNA Fingerprinting. 2nd edn. BIOS. Scientific
Publishers, Oxford.

24

5. Anexo: Figuras

Figura 1. Estrutura qumica dos quatro nucleotdeos que so os blocos de construo


fundamentais do DNA.

25

Figura 2. A dupla hlice do DNA desenrolada para mostrar as ligaes desoxirribosefosfato e os degraus de pares de bases.

26

Figura 3. Organizao cromossmica do DNA.

Figura 4. Perfis de DNA de dois pares de gmeos monozigticos (ou idnticos) e um par
de gmeos dizigticos (ou fraternos).

27

(A)

(B)

VNTR

Figura 5. Perfis de DNA de interesse forense utilizando sondas multilocal (A) e unilocal
(B) de VNTR.

Figura 6. Perfis de DNA de interesse forense utilizando sistema de PCR multiplex para
oito loci de STR.

28

Figura 7. Polimorfismo de Tamanho de Fragmento de Restrio (RFLP).


Heterozigosidade no stio de restrio da enzima HpaII (isolada de Haemophilus
parainfluenzae) que reconhece a seqncia 5CCGG 3.

29

Figura 8. Transferncia e Hibridizao de Southern.

30

Figura 9. Deteco de polimorfismos de minissatlites (VNTR) por hibridizao de


Southern.

Figura 10. Comparao entre dois tipos de polimorfismo detectados por hibridizao de
Southern: (A) RFLP diallico e (B) VNTR multiallico.

31

1 STR
Oligo A

Oligo B

Alelo 1

Oligo A

Oligo B

Alelo 2

Figura 11. Deteco de polimorfismos de microssatlites (STR) por PCR.

Figura 12. A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR).

32

...ATAGACCACATGGCAA...
...ATAGACTACATGGCAA...

Figura 13. Polimorfismo de Nucleotdeos Individuais (SNP).

Figura 14. Seqenciamento de DNA pelo mtodo didesoxi de Sanger.

33

Figura 15. Interpretao da auto-radiografia de um seqenciamento de DNA pelo


mtodo didesoxi.

34