CAPITULO I:

INTRODUCCION A LOS FUNDAMENTOS

1.1

Introduccin General

La primera parte de este libro trata de la produccin y utilizacin de las

enzimas, mientras que la segunda es una recopilacin de datos para uso
industrial y de una serie de aplicaciones de las enzimas. En este libro se
menciona muchos temas, aunque solo unos pocos fueran objeto de anlisis
detallado.
Desde que se public la primera edicin de este libro MANUAL DE
BIOTECNOLOGA ENZIMTICA hace ya 10 aos muchas de las posibilidades
tericas se han cumplido. Sin embrago, un gran nmero de ellas an no se ha
aplicado a nivel industrial, debido quizs a que fala la informacin cientfica
real necesaria para su xito. Otro factor a tener en cuenta es el costo
econmico de un proceso en un momento dado.
Una vez ms el MANUAL DE BIOTECNOLOGA ENZIMTICA resume de forma
concisa los principios y practicas asociadas a las enzimas industriales en el
ms amplio sentido, extendiendo su alcance al campo de las enzimas utilizadas
en los laboratorios clnicos, donde el uso reiterado de estos procedimientos
origina una parte de la demanda industrial global de enzimas.

1.2
Introduccin a la parte
Biotecnologa Enzimtica II. Fundamentos
utilizacin industrial de las enzimas

A del Manual de
del Aislamiento y

Los fundamentos ms importantes implicados en la utilizacin de enzimas se

han ido aclarando cada vez ms a medida que se ha avanzado en el uso de
enzimas inmovilizados en distintas formas. Gran parte de los mecanismos de la
cintica enzimtica clsica han tenido que readaptarse ante las exigencias
particulares de la formacin de productos y en cada proceso han debido
revisarse alguna claves de la enzimologa.
Las enzimas se compran y se venden en funcin de su actividad ms que de su
peso. No hace falta utilizar una enzima muy purificada, o modificada, ms que

cuando la exija un proceso particular. Sin embargo, la presencia de inhibidores

podra dificultar la prediccin del efecto de la enzima, especialmente en
trminos de la cintica enzimtica. Decidir si el proceso puede llevarse a cabo
realmente a gran escala puede depender de esto.
Muchos de los principios importantes estn asociados con el uso de reactores
con enzimas inmovilizadas. Esta parte de la ingeniera enzimtica tiene gran
importancia a la hora de poner en prctica una aplicacin particular de las
enzimas o las clulas inmovilizadas, pero en primer lugar la enzima tiene que
ser aislada e inmovilizada. Algunas de las aplicaciones ms sofisticadas de las
enzimas se encuentran en bioqumica clnica, donde el uso de anticuerpos ha
permitido el desarrollo de una gran variedad de tcnicas singulares, como el
inmunoanalisis enzimtico.

CAPITULO II:
EXTRACCION Y PURIFICACION DE ENZIMAS Y OTRAS PROTEINAS A
GRAN ESCALA
2.1 INTRODUCCIN
Este
captulo
est
dedicado
fundamentalmente
al
aislamiento
y
purificacin de protenas a partir de fuentes
microbianas, aunque las tcnicas descritas
pueden utilizarse tambin a la extraccin de
materiales a partir de tejidos vegetales y
animales.
Las protenas bacterianas pueden clasificarse en protenas extracelulares y
protenas intracelulares, pudiendo ser las segundas a su vez ligadas o libres. La
purificacin de la protenas intracelulares requiere un proceso de ruptura de la
clula, pero una vez que este se ha realizado, no existen diferencias
fundamentales en los procedimientos de purificacin de estos grupos de
protenas, excepto en que en el caso de las protenas extracelulares los
volmenes implicados son mucho menores.

Antes de describir en detalle los mtodos individuales utilizados en el

aislamiento y purificacin de protenas, merece la pena considerar las
relaciones entre los procesos a pequea y gran escala. De las muchas tcnicas
disponibles, no todas son adecuadas para trabajar a gran escala, debido a
restricciones inherentes a las tcnicas o a los aparatos disponibles al aumento
del tiempo que usualmente acompaa la transicin a un proceso a gran escala.

En muchos casos el aumento de escala de estas tcnicas no es prctico, y en

otros el resultado no es el adecuado. De forma similar la ultracentrifugacin es
una tcnica de laboratorio til, pero no puede utilizarse convenientemente en
los procesos a gran escala.
La definicin de gran escala es un tema opinable, pero en el contexto de este
captulo se referir a los procesos que utilicen uno o ms Kg de pasta de
clulas hmeda. El termino extraccin se utilizara para definir los mtodos de
ruptura de los microorganismos y los trminos aislamiento y purificacin se
referirn a las otras tcnicas implicadas en la obtencin de un producto puro o
especifico.
2.2 EXTRACCIN POR MTODOS QUMICOS
2.2.1. lcalis
Este mtodo se ha utilizado con considerable xito en las extracciones tanto a
gran escala como a pequea escala de diversas bacterias. El xito del
tratamiento alcalino depende de la estabilidad del enzima en cuestin a pH
elevado, este mtodo inactiva las proteasas que pudieran existir, a la vez
reduce la posibilidad de contaminacin por pirgenos de las preparaciones de
enzimas para usos teraputicos. Tales mtodos tienen posibles aplicaciones
para la inactivacin y lisis rpida de los microorganismos por ingeniera
gentica.
2.2.2. Lisozima y EDTA
La lisozima es una enzima producida comercialmente a partir de la clara de
huevo de gallina que cataliza especficamente la hidrolisis de los enlaces -1-1glocosidicos de los mucopptidos de las paredes de las clulas bacterianas. Las
bacterias Gram positivas, en las que el mucopptido est ms extendido por la
pared dndole ms rigidez que a las bacterias Gram negativas, son ms
susceptibles a la lisozima que estas ltimas. Sin embargo la ruptura final de la
envoltura celular depende de la presin osmtica del medio de suspensin una
vez rota la pared celular. En las Gram negativas la ruptura de la pared celular
rara vez se logra con la lisozima, sino que hace falta aadir EDTA para producir
la liberacin de lipopolisacridos de la envoltura de la pared. El EDTA acta
quelando los cationes divalentes esenciales para la estabilidad de la pared lo
que hace que la lisozima pueda acceder y actuar en la capa del mucopptido.
Esta tcnica rara vez se utiliza para la extraccin a gran escala de las enzimas
bacterianas, dado el costo relativamente elevado de la lisozima, aunque este
sea comparativamente pequeo frente al calor de una enzima purificada. La
lisis de la clula con lisozima es un mtodo suave, y puede ser el mejor cuando
la enzima a purificar es sensible a las elevaciones de temperatura que se
producen durante los procedimientos fsicos de lisis.

2.2.3. Detergentes
Los detergentes pueden ser compuestos inicos, se combinan con las
lipoprotenas formando micelas. Por tanto, los constituyentes lipoproteicos de
las membranas biolgicas pueden solubilizarse o las membranas hacerse
permeables.
Aun
no
se
conoce
el
mecanismo
del
complejo
detergente/lipoprotenas pero se cree que en el intervienen fuerzas
electrostticas y fuerzas de van der Waals. La formacin de estos se debe a su
pH y a la temperatura.
Los detergentes inicos son ms reactivos que los no inicos y puedes dar
lugar a la disociacin de las lipoprotenas, lo que a su vez conduce
posteriormente a las desnaturalizacin, precipitacin y a la hidrolisis de los
enlaces peptdicos de la protenas. Por esta razn los detergentes no son
ideales para la extraccin de enzimas.
Con todo, los detergentes se utilizan considerablemente en algunos procesos
de extraccin. Morris y Darlow indicaron su utilidad en el fraccionamiento de
partculas vricas; el Tritn-X 100 que es para la liberacin a gran escala del
colesterol oxidas a partir de Nocardia Sp.
2.2.4. Shock por Enfriamiento
El efecto del shock por enfriamiento (una reduccin rpida de temperaturas
desde la normal de crecimiento a 0C). La bibliografa al respecto indica que las
bacterias Gram negativas son ms sensibles a este proceso que las Gram
positivas. El efecto que tiene lugar solamente en condiciones especiales da
lugar a una prdida de viabilidad y libera al medio ambiente un material que
adsorbe a 260 nm, aminocidos y ATP.
Sin embargo para la ruptura celular a gran escala el shock por enfriamiento es
una tcnica difcil de emplear. Los dos limitaciones son en primer lugar el
choque frio tiene un efecto muy pequeo o nulo en las suspensiones celulares
con una densidad superior a 108/ml, y en segundo lugar que las bacterias son
considerablemente ms susceptibles al shock por enfriamiento cuando se
encuentran en la fase de crecimiento exponencial. En el proceso a gran escala,
el tamao del recipiente y los sofisticados equipos necesarios para asegurar el
xito de este tamao lo hacen inviable.
2.2.5. Shock Osmtico
El shock osmtico se ha utilizado en la extraccin de enzimas hidroliticas y
protena ligadoras a partir de bacterias Gran negativas entre las que se
incluyen la salmonella typhimurium y E. col, y en la liberacin del DNA de
bacterifagos
T
mediante
la
ruptura
de
la
capa
proteica.
El mtodo incluye el lavado de las bacterias con una solucin tamponada, para

liberarlas de medio de cultivo y posteriormente su introduccin en una solucin

tamponada de sacarosa al 20% en la que se deja las clulas alcance el
equilibrio, perdiendo parte de su agua interna, que se elimina de la suspensin
por centrifugacin. La pasta de clulas obtenida se dispersa rpidamente en a
agua a unos 4Caproximandenete. El sbito aumento de la presin osmtica
del interior de las clulas hace que se produzca la liberacin de algunos
constituyentes celulares. Este mtodo en algunos aspectos similar al del shock
por enfriamiento.
Mediante el shock osmtico solo se liberan de un 4 a un 7% de las protenas
bacterianas totales, aunque en muchos casos se ve drsticamente reducida la
viabilidad. Si la enzima que se requiere obtener se localiza en la regin
periplasmica, el shock osmtico y el shock por enfriamiento son equivalentes,
teniendo en cuenta que se puede obtener un aumento en la purificacin de 14
a 20 veces, comparado con otras tcnicas de ruptura.
Este shock es til en la extraccin de enzimas que inactivan los
aminoglicosidicos periplasmicos, tambin es una tcnica vlida para la
liberacin de enzimas a partir de bacterias que viven en aguas marinas, solo es
necesario resuspender las clulas en una disolucin tamponada hasta alcanzar
la lisis ya que el medio de cultivo contiene 30 g/l de NaCl. El shock osmtico no
es apropiado para la liberacin de enzimas de las bacterias Gram positivas
debido a que los coco puedan tener presiones osmticas internas del orden de
20 atm, mientras que en las Gram negativas no ocurre esto.
2.3 EXTRACCIN POR MTODOS FISICOS
2.3.1. Sonicacin
El trmino ultrasnico se utiliza para designar a los sonidos con frecuencias
situadas por encima del nivel del odo humano, es decir, a partir de 20 kHz,
que expresado en longitudes de onda, en los lquidos los sita en una rango de
6 a 2.4 x 10-4 cm, rdenes de magnitud similares a los de la luz visible.
El choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios de presin de miles
de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para
bacterias y levaduras y a veces, para determinados tejidos animales como el
bazo, rin o eritrocitos. La sonicacin puede causar efectos en la estabilidad
enzimtica cuando las clulas se rompen por este mtodo, dicho cambio vara
dependiendo de factores asociados como el pH, temperatura, la fuerza inica
del medio de suspensin y el tiempo de exposicin. La seleccin de una serie
de condiciones es esencialmente emprica, variando en funcin del organismo
en particular y del producto a obtener.
Aunque se ha demostrado que el tratamiento con ultrasonidos es un mtodo
til y verstil para trabajar a gran escala de laboratorio, su aplicacin para la

disrupcin de cantidades elevadas de bacterias se ve limitada por la dificultad

de transmitir suficiente potencia a grandes volmenes de suspensin.
2.3.2. Congelacin y Descongelacin
La congelacin y descongelacin provoca un valor menor al 10% de liberacin
de protenas solubles totales en una operacin, incluso en las bacterias Gram
negativas. Esta tcnica se utiliza generalmente con otros mtodos ya que las
pastas bacterianas son guardadas a 20C antes de la extraccin y
purificacin de las enzimas. La congelacin y descongelacin puede dar lugar a
una prdida de la actividad enzimtica. Requiere de periodos prolongados de
tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y descongelamiento.
2.3.3. Cizalla Slida
Paso de clulas congeladas (-20 C) a travs de orificio, en cuyo casos los
cristales de hielo formados actan como abrasivos, se coloca la pasta en el
hueco cilndrico de un bloque metlico y se inserta un embolo de metal muy
ajustado, aplicndose unas 10-15 toneladas por pulgada cuadrada en el
extremos del embolo. Con este mtodo se rompe un gran porcentaje de las
clulas contenidas en una suspensin.
2.3.4. Trituracin o Agitacin con abrasivos
Para la trituracin se puede utilizar un molino para conseguir la disrupcin de
las bacterias pero requiere dos horas de funcionamiento. Para esta tcnica
tambin se puede utilizar agitacin con perlas de vidrio las cuales son de 0,13
a 0,26 mm, a una velocidad de 300 a 500 sacudidas por minuto y 6 cm de
amplitud. Se emplea la prensa francesa, consiste en el paso de las clulas a
gran presin por un pequeo orificio a una cmara con presin baja, lo cual
ocasiona la ruptura de las clulas por descompresin. La filtracin al pasar las
clulas a travs de orificios a presin de dimetros reducidos que provocan la
rotura de las membranas celulares.
2.3.5. Cizalla Liquida
Utilizaron un sistema de cizalla liquida para la disrupcin de los cloroplastos, en
el que la suspensin se hace pasar a travs de una vlvula de aguja a
presiones de hasta 20.000 psi con un flujo de unos 10 ml/min
Ms recientemente se ha utilizado el homogenizador APV Manton Gaulin para
la disrupcin de bacterias en continuo. Este aparato consiste en una bomba de
desplazamiento positivo y una vlvula ajustable con orificio muy pequeo. Las
clulas se hacen pasar a travs del homogenizador en suspensin en un lquido
y a presiones de hasta 55 MPa. Parece que son tres los mecanismos por los
que se produce la ruptura de las clulas en estos aparatos. Las clulas se
bombean a travs de una vlvula sin retorno produciendo en la vlvula

homogenizante la presin seleccionada. Seguidamente pasa a travs de un

estrecho canal limitado por una vlvula homogenizante y un anillo de impacto,
momento en que la fuerza de cizalla ejercida es mxima. Despus se reduce la
presin hasta la atmosfrica cuando la suspensin alcanza la salida. Esta
subida de reduccin de presin es la tercera fuerza ejercida en la suspensin y
tiene un efecto disruptor. Charm y Matteo indicaron que los homogenizadores
podran utilizarse en distintas formas, de paso simple, con recirculacin
discontinua, etc. Tambin obtuvieron ecuaciones para determinar el nmero de
clulas que quedan, y la velocidad global del proceso:
Log (Rm/Rm -R) = KNP2.9
Dnde:
R = la cantidad de protena soluble liberada en g por gm de clulas.
Rm = la cantidad mxima de protena soluble liberada
K = la constante de velocidad dependiente de la temperatura
N = El nmero de veces que la suspensin pasa a travs del aparato
P = presin
2.9 = Es el coeficiente de eficacia
La liberacin de protena coincide con la disrupcin celular, aunque algunas
enzimas se liberen ms lentamente y otras ms rpidamente que la velocidad
media de liberacin de protenas. Aunque estas ecuaciones puedan usarse
para describir la liberacin de protenas en condiciones muy determinadas, en
la prctica su valor es limitado y las condiciones necesarias para un caso dado
deben ser determinadas empricamente.
En general, las bacterias Gram negativas se rompen ms fcilmente que las
Gram positivas, y las condiciones de crecimiento, congelacin y descongelacin
influyen en la velocidad de liberacin de la protena.
2.4 AISLAMIENTO Y PURIFICACION
2.4.1. Separacin de los cidos nucleicos
Los cidos nucleicos se consideran como contaminantes, por lo que interesa
eliminarlos del extracto manteniendo intactos las enzimas. La fuerza de cizalla,
el pH elevado, la fuerza inica baja y la presencia de nucleasas dan lugar a la
desnaturalizacin de los cidos nucleicos, y aunque en su purificacin deben
evitarse estas condiciones, en la purificacin de enzimas tales factores pueden
representar una ayuda.
Otra forma para eliminar cidos nucleicos se basa en la precipitacin formando
complejos entre los residuos fosfato con carga negativa de las molculas de
cido nucleico y los grupos cargados positivamente del agente precipitante. El
complejo resultante puede eliminarse mediante centrifugacin.

La precipitacin de los cidos nucleicos depende de la concentracin de sal, del

pH.
Bromuro de cetiltrimetil amonio separacin de cidos nucleicos de
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium phlei y Sarcina.
Sulfato de estreptomicina separacin de cidos nucleicos en extractos
de bacterias.
Polietilenoimina polmero catinico de cadena larga agente precipitante
de cidos nucleicos muy eficaz como extracto de E. coli EM 20031 y de
Micrococcus lysodiekticus (catalasa).
Tratamiento con nucleasas elimina cidos nucleicos de las suspensiones
bacterianas como la ribonucleasa y la desoxirribonucleasa.
2.4.2. Concentracin por precipitacin
Sulfato de amonio, durante muchos aos se ha utilizado el mtodo de salado
de las protenas con objeto de lograr el doble propsito de purificar y
concentrar algunas protenas especficas. La sal utilizada con frecuencia es el
sulfato de amonio, por su gran solubilidad, ausencia de efectos perjudiciales
para la mayora de las enzimas, no ser cara y, en algunos casos, por du efecto
estabilizante de ciertas enzimas.
La teora del fraccionamiento enzimtico mediante salado ha sido discutida por
Green y Hughes y Dixon y Webb. En soluciones concentradas los electrolitos el
logaritmo de la solubilidad de las protenas es una funcin lineal del aumento
de concentracin de sal. La ecuacin que describe el proceso de salado es:

log s=B1k1 s

r
2

Dnde:
S = la solubilidad de la protena en g/l de solucin.
B1 = es una constante
k-1s = pendiente de la lnea es la constante de salado
r = la fuerza inica en moles/litro.
El valor de B1 depende de la sal usada, y puede variar con el pH, la
temperatura y la naturaleza de la protena en solucin. Por otro lado k-1 es
independiente al pH y la temperatura pero varia con la protena y la sal usada.
Una solucin proteica de concentracin usada puede precipitar a una fuerza
inica segn la ecuacin:
1

r B log s
=
1
2
k s

Como apuntan Charm y Matteo solo se puede obtener resultados cuando el pH,
la temperatura y la concentracin de protena son constantes y estas
condiciones la concentracin de sal requerida para precipitar una enzima varia
con la concentracin del enzima.
El uso de sulfato de amonio en la purificacin de enzimas ha sido descrito por
muchos autores por ejemplo la extraccin de penicilinasa de E. coli. La
precipitacin de sulfato de amonio de protenas no deseadas mejora la
actividad especfica cuatro veces y el aumento de la concentracin de sulfato
de amonio hasta el 56% para precipitar la penicilinasa da lugar a la purificacin
global cinco veces superior, a la vez que reduce el volumen desde unos 60
litros a un peso de pasta de 2.4 Kg.
Solventes orgnicos la adicin en soluciones acuosas de protenas reduce la
solubilidad de estas al reducir la constante dielctrica del medio. Para
precipitar las protenas se pueden usar varios solventes orgnicos, como el
metanol, etanol y 2-propanol, que son los ms usados, aunque tambin se
utiliza la acetona o el ter etlico estos tienen la grave desventaja de su gran
inflamabilidad.
Para trabajar a gran escala la precipitacin, y concentracin de enzimas con
solventes orgnicos no se utiliza ampliamente porque aunque el grado de
precipitacin sea alto, la naturaleza inflamable de los materiales junto con su
costo elevado hacen de este mtodo menos atractivo que otros.
Polmeros de peso molecular elevado para el fraccionamiento de las protenas
pueden usarse otros precipitantes orgnicos, como los polmeros solubles en
agua entre los que destaca el polietilenglicol por ser ms usado, que tiene las
ventaja de no ser txicos, ni inflamable y que no desnaturaliza a las protenas.
2.4.3. Concentracin por ultrafiltracin
Se considera como un sistema valido de purificacin de algunas protenas
usando diferentes existentes entre los pesos moleculares de la protena
deseada y de las no deseada.
Se puede considerar como una de las tcnicas de filtracin que incluyen
osmosis inversa, ultrafiltracin, filtracin de micropartculas y filtracin de
partculas, con un cierto solapamiento entre la ultrafiltracin y la filtracin de
micropartculas.
Hay dos tipos de membranas una de ultrafiltro microporoso de membrana
rgida con una serie de orificios al azar pequeo, debido a que la partculas
pequeas atraviesan la membrana mientras que las grandes quedan retenidas,
las partculas de tamao medio pueden quedar bloqueados siendo el resultado
final el bloqueo del filtro para la mayora de molculas excepto las muy

pequeas formndose un filtro de poro ms fino. Para minimizar el bloqueo del

filtro se puede usar una membrana con tamao de poro medio claramente
inferior al tamao de las partculas de soluto a retener.
El ultrafiltro de difusin es una esencia de membrana de gel hidrfilo
homognea a travs de la cual los solventes y solutos son transportados por
difusin molecular bajo la accin de un gradiente de concentracin o de
actividad.
Las membranas de ultrafiltracin se han convertido en una herramienta muy
til para aislar y purificar enzimas a gran escala debido en gran mediad a esos
avances.
La membrana anistropa consiste en una capa muy fina, muy compacta,
soportada por una subestructura porosa relativamente gruesa que acta como
soporte. La ventaja de este tipo de membrana es que no tiene poros en el
sentido tradicional por lo que la permeabilidad del solvente a presin constante
no se reduce.
El transporte de soluto dentro de la membrana est controlado por la ley de
fick, lo que significa que al aumentar el flujo del solvente por un incremento de
la presin el flujo se soluto solo varia poco, de forma que la eficacia de las
membranas aumenta.
El diseo del equipo de ultrafiltracin se hace de tal forma que la capa de
polarizacin sea mnima, en equipos de gran escala se emplean velocidades de
flujo altas a travs de fibras huecas. Las caractersticas de ultrafiltracin de
una protena pueden variar en funcin de ciertos factores.
La concentracin de sal, su naturaleza, el pH influyen en la retencin de
enzimas, manipulando estos factores se puede incrementar considerablemente
la purificacin por ejemplo 7 veces la penicilinasa de la E. coli. En vista de esto
y teniendo en cuenta la relativa facilidad para aumentar la escala a partir de
procesos de laboratorio, la ultrafiltracin parece ser una potente para trabajar
a gran escala en la purificacin y concentracin de enzimas
2.4.4. Concentracin por liofilizacin
La liofilizacin se puede utilizar para la concentracin de protenas, su empleo
es limitado, ya que al menos la concentracin de sal sea baja, se pueden
formar mezclas eutcticas, lo que dara lugar a un secado incompleto o la
formacin de gran cantidad de espuma y desnaturalizacin de las protenas.
Estos problemas pueden evitarse controlando cuidadosamente la temperatura
de la masa congelada para mantener una temperatura por debajo de ms bajo
de los puntos eutcticos. Tambin puede ser necesario reducir la concentracin
de sal antes de la liofilizacin.

Puesto que se dispone de otro mtodo de concentracin de protenas, este

procedimiento se reserva para la preparacin que deben ser almacenados o
transportados.
Se han liofilizado muchas protenas diferentes sin que se haya observado
desnaturalizacin o prdida de actividad.
Sin embargo no es raro encontrar que algunas protenas se desnaturalizan y
pierden totalmente su actividad biolgica. Esto parece especialmente cierto en
aquellas protenas compuestas por subunidades, y los estudios con catalasa y
miosina proporciona informacin til.

2.4.5. Cromatografa en gel

Su inters radica en su capacidad para fraccionar y purificar enzimas y desde
este punto de vista se har las consideraciones oportunas acerca de las
estructuras de geles, y sobre la teora general que controla la separacin de los
compuestos biolgicamente activos en funcin de su peso molecular y su
forma.
En 1959 Porath y Flodin lograron separar protenas utilizando dextrano
entrecruzado en un proceso cromatografico.
El grado de entrecruzamiento est controlado por la cantidad de epiclorhidrina
utilizada, que a su vez controla el grado de hidratacin (agua atrapada dentro
de la matriz del gel) y por tanto la porosidad. Cuanto mayor sea la cantidad de
agua atrapada por unidad de peso del gel seco, mayores sern las especies
moleculares fraccionadas e inversamente, cuanto mayor cantidad de matriz de
dextrano haya por unidad de peso de gel seco, ms pequeas sern las
molculas que se fraccionaran.
As, si se coloca en la cabeza de la columna de un gel con poca agua atrapada,
es decir, con alto grado de entrecruzamiento, una mezcla de sustancias de alto
y bajo peso molecular, las especies con peso molecular alto pasaran por la
columna en la fase mvil, y sern las primeras en salir, mientras que las

especies con peso molecular menor se retardaran debido a su paso a travs

de su fase estacionaria situada dentro del gel.
El proceso de cromatografa en gel consiste en el reparto de las molculas de
soluto entre la fase mvil de solvente y la fase estacionaria, construida por los
espacios existentes entre las partculas porosas del gel. El mecanismo de esta
tcnica es ms fcil de comprender si se considera que el gel tiene una
estructura porosa similar a la del pan. La fase mvil es el lquido que circula por
el interior de las partculas del interior de las partculas del gel, y se conoce
como volumen vaco (Vo), mientras que la fase estacionaria es el lquido que
ocupa el interior de las partculas de gel (Vi). El soluto se distribuye por difusin
entre la fase estacionaria y la mvil. El volumen ocupado por la matriz del gel
(Vg) tambin contribuye al volumen total de la columna (Vt), que es:
Vt = Vo + Vi + Vg

2.4.6. Cromatografa de intercambio inico

Existen tres tipos de intercambiadores de iones, las resinas, las celulosas y los
geles de agarosa y dextrano cambiadores de iones; los ltimos son los ms
utilizados, aunque las resinas son vlidas en una escala ms limitada.
Resinas cambiadoras de iones: Generalmente se pueden describir como
polmeros insolubles en agua que contienes grupos catinicos o aninicos. La
naturaleza del grupo funcional varia, aunque en general son , en el caso de los
cambiadores catinicos, RH+ y en los cambiadores aninicos ROH- , donde R
representa la resina polmero. El cambio de los iones H+ u OH- puede
producirse por iones combinados por un cido o base ms dbiles, en este caso
las protenas, y por tanto las molculas de protena se unirn reversiblemente
a la resina.
Las resinas tienen la ventaja de ser estables a los esfuerzos mecnicos
encontrados usualmente, adems tienen una gran capacidad para adsorber

protenas y sedimentan rpidamente y cuando estn

empaquetadas
en
columnas
permiten
altas
velocidades de flujo.
La gran capacidad de estos materiales es
frecuentemente una desventaja cuando se utilizada
para la purificacin de protenas, puesto que la
protena no puede resistir las duras condiciones
necesarias para la elucin de estas resinas. No
obstante, las resinas cambiadoras de iones se han
usado con xito en la purificacin de algunas
protenas.
Celulosas cambiadoras de iones: dentro de la
celulosa pueden introducirse una gran variedad de
grupos cargados, bien catinicos o aninicos, por
varios procedimientos qumicos .Sin embargo, el nivel de sustitucin es
usualmente muy bajo, y la capacidad de estas celulosas es la dcima parte de
las resinas. Esto hace que la elucin de los poli electrolitos se pueda llevar a
cabo en condiciones suaves. Adems sustituciones de 1 meq/g pueden llevar a
la solubilizacin de la celulosa, claramente indeseable.
Otros geles cambiadores de iones: la celulosa ha sido el medio tradicional
de llevar a cabo la cromatografa de cambio de iones para las protenas. Sin
embargo, en los ltimos aos se han introducido otros intercambiadores de
iones, que generalmente tienen unas propiedades de flujo superiores.
La cromatografa de intercambio inico puede diferenciar entre los
componentes de una mezcla polielectroltica en base a la carga transportada
por cada electrolito individual. Sin embargo, la carga neta, densidad de carga y
tamao molecular de una protena as como el pH y la fuerza inica de la
solucin son parmetros que influyen en el proceso. El coeficiente de particin
es una expresin que relaciona el nmero de molculas existente de un
electrolito particular con el solvente unidas a la fase estacionaria en equilibrio.
Por tanto cuanto mayor sea el nmero de equilibrios al que se ve sometida una
mezcla polielectroltica, mayor ser la resolucin. La eficacia de la resolucin
tambin est relacionada con la capacidad de los cambiadores; cuanto mayor
sea la capacidad mayor ser el nmero de equilibrios, lo que a su vez reduce
las diferencias en el coeficiente de reparto requeridas para separar diferentes
electrolitos.
En el aislamiento a gran escala de enzimas, la cromatografa en columna se
reserva a las etapas finales de purificacin, debido a los grandes volmenes
que hay que manejar en las iniciales. Sin embargo, los cambiadores de iones se
usan ya en las primeras etapas de la separacin cuando se emplean tcnicas

discontinuas en bao. En este caso el polielectrolito se une al cambiador de

tal forma que en cualquier momento la mayor parte este asociado a la matriz,
pudindose hablar de que esta inmovilizado. Generalmente las condiciones
requeridas para que se produzca la inmovilizacin de enzimas se obtiene
cuando los enlaces electrostticos formados son fuertes, lo que exige que la
carga del polielectrolito sea alta y opuesta al cambiador. Normalmente los
polielectrolitos bsicos (punto isoelctrico por encima de pH= 7,0) son
adsorbidos por cambiadores catinicos (por ejemplo, CM celulosa) a un pH
inferior a la del punto isoelctrico, y los polielectrolitos cidos (punto
isoelctrico por debajo del pH = 7,0) son absorbidos por cambiadores aninicos
(por ejemplo, DEAD celulosa) a un pH por encima del punto isoelctrico. Por
tanto, es importante conocer el punto isoelctrico del polielectrolito particular.
Despus de haber elegido el cambiador a usar, son importantes la eleccin del
pH y la fuerza inica.
El pH debe ser tal que las cargas del cambiador y del polielectrlito sean altas,
mientras que la fuerza inica debe elegirse de tal forma que la sal ayude a
preservar la actividad y solubilidad del enzima, pero sin que sea
suficientemente alta para que compita selectivamente con el enzima por los
puntos activos del cambiador. Si las condiciones se eligen correctamente, el
enzima se adsorbe en el cambiador, se lava con una solucin para liberarlo de
todas las protenas no unidas y despus se eluye del cambiador.
Los mtodos de elucin usados comnmente son el cambio del pH, el aumento
de la fuerza inica o una combinacin de ambos. Cambiando el pH de una
suspensin de un cambiador catinico de cido a alcalino, con un enzima
bsico adsorbido, se reduce la carga tanto del cambiador como del enzima, por
lo que los enlaces electrostticos se rompen y el enzima se libera. Cuando
aumenta la fuerza inica, aumenta la competicin por los sitios ocupados por el
enzima, hasta que se alcanza un punto en el que el enzima es liberado. Cuando
el enzima es especialmente sensible a los cambios de fuerza inica o de pH se
combinan ambos procesos. La desorcin fraccionada puede ser ventajosa
cuando se hayan adsorbido varios polielectrlitos en un mismo cambiador,
proceso controlado a menudo variando tanto el pH como la fuerza inica. Los
enzimas de punto isoelctrico alejado de la neutralidad se pueden purificar en
general ms fcilmente utilizando la cromatografa de cambiadores de iones en
un proceso discontinuo. En el caso de la L-asparraginasa, que tiene un punto
isoelctrico de 8,6, se puede obtener una purificacin 100 veces mayor usando
CM celulosa en un proceso discontinuo.
Tambin se utilizan las tcnicas discontinuas para eliminar contaminantes tales
como los cidos nucleicos. El aumento en la purificacin de la protena puede
ser marginal, pero las etapas posteriores con frecuencia mejoran por la
eliminacin de estos electrlitos, grandes y con carga alta.

La adsorcin discontinua y subsecuente

elucin puede parecer algo burda por no
explotar la capacidad de fraccionamiento de
la tcnica de cambiadores de iones en su
totalidad; sin embargo, ha demostrado ser
una
tcnica
til
que
permite
simultneamente
una
purificacin
y
concentracin previas a la utilizacin de
mtodos ms sofisticados.
2.4.7. Cromatografa de afinidad
La cromatografa de afinidad quizs sea la
forma ms elegante de purificar, protenas
individuales a partir de una mezcla compleja.
Sin embargo, aunque se emplea con
frecuencia a escala de laboratorio rara vez se
utiliza en la purificacin de protenas a gran
escala. La cromatografa de afinidad se basa en la interaccin ms o menos
especfica entre una protena y un ligando inmovilizado, que est incluido en
uno de estos dos grupos principales:
(a) Aquellos que sean especficos para la protena deseada, en cuyo caso el
ligando es generalmente un anticuerpo, un substrato, un substrato anlogo o
un inhibidor.
(b) Aquellos que interaccionan con varias protenas, y que pueden ser
especficos para las diferentes clases de enzimas, como el 5' AMP, 2',5' ADP o
NAD+, o que interaccionan con un amplio rango de protenas tales corno las
cadenas hidrocarbonadas o algunos colorantes. Es esencial que la interaccin
sea reversible. Se pueden emplear una gran variedad de eluyentes para
desorber una protena de un ligando de afinidad, que van desde mtodos no
especficos como el incremento de la fuerza inica o la alteracin del pH hasta
mtodos especficos que usan el cofactor o ligando libre. La matriz a la que el
ligando se una debe tener las siguientes propiedades: (a) Baja reactividad con
las protenas en general, para evitar las adsorciones no especficas.
(b) Buenas velocidades de flujo de solvente despus de acoplarse el ligando.
(c) Debe tener grupos qumicos que puedan modificarse de tal forma que la
matriz no se dae.
(d) Estos grupos qumicos deben ser abundantes, permitiendo lograr una gran
capacidad despus del acoplamiento.

(e) Deben ser estables mecnica y qumicamente dentro de las diversas

condiciones requeridas para el acoplamiento y la elucin.
(f) Deben ser porosos y formar redes hidrofilicas que permitan el paso libre de
las molculas grandes, y preferiblemente deben ser partculas uniformes,
esfricas y rgidas.
Aunque se han introducido otros agentes acoplantes, el mtodo del bromuro de
ciangeno es el ms usado, a pesar de la toxicidad de este producto, ya que es
relativamente simple y da un buen rendimiento, Este mtodo puede tambin
utilizarse para introducir grupos espaciadores hidrofbicos en la matriz
acoplando 1,6-diamino hexano o cido 6-amino hexanoico a una matriz
activada con bromuro de ciangeno.
Estas tcnicas de acoplamiento se pueden usar para unir pequeas molculas,
como cofactores o substratos, o molculas grandes como anticuerpos, a un
soporte slido. Las condiciones necesarias para la absorcin y elucin de una
protena de una matriz de afinidad son extremadamente variables y han sido
extensamente revisadas.
En trminos generales la absorcin tiene lugar en un medio de fuerza inica
baja y pH neutro. La elucin no especfica puede llevarse a cabo por un cambio
del pH, la fuerza inica o la temperatura. La elucin bioespecfica, que con
frecuencia permite obtener un alto grado de purificacin, se puede llevar a
cabo mediante el substrato o un anlogo del substrato.
A pesar de la gran cantidad de bibliografa existente respecto a la
cromatografa de afinidad y su indudable impacto en la purificacin de
enzimas, es raro su uso a gran escala. Se pueden encontrar referencias del
empleo de la cromatografa de afinidad a gran escala para purificar enzimas.
Las principales razones para esta falta de aceptacin son quizs el elevado
precio de la matriz, la inestabilidad de muchos ligandos biolgicos, la
complejidad de la qumica implicada en el acoplamiento a la matriz y la baja
capacidad de muchos ligandos. Sin embargo, en determinadas circunstancias
la cromatografa de afinidad puede dar excelentes resultados. Robinson et al.
(1974) han descrito la purificacin automtica a gran escala de la betagalactosidasa del E. coli utilizando como ligando el p-aminofenil-betagalactopiransido.
Un tipo de cromatografa de afinidad que no tiene las desventajas comentadas
antes es la cromatografa de afinidad con colorantes, que utiliza colorantes
reactivos inmovilizados. El uso de estos colorantes ha sido revisado por Dean y
Watson (1919). La cromatografa de afinidad con colorantes ha sido empleada
recientemente para purificaciones a gran escala de enzimas tan diversos como
el alcohol deshidrogenasa del hgado de caballo.

Los colorantes actan corno ligandos de pseudoafinidad y se unen a un amplio

rango de protenas, frecuentemente con un grado de especificidad
sorprendente. Las protenas unidas pueden eluirse no especficamente
incrementando la fuerza inica o bioespecficamente utilizando un substrato o
cofactor. Desde el punto de vista prctico los colorantes reactivos tienen
numerosas ventajas, ya que se pueden conseguir fcilmente y en gran
cantidad, no son caros, y pueden acoplarse a un soporte en condiciones
alcalinas suaves, sin necesidad de emplear compuestos txicos. Una vez
acoplados, el enlace resultante es estable y la capacidad del conjugado es alta.
Adems la capacidad de un colorante puede ser unas 20 veces mayor que la
de un ligando nucletido en el caso, por ejemplo, de la malato deshidrogenasa
bacteriana.
2.4.8. Adsorbentes no especficos
Hidroxilapatito. El hidroxilapatito (HA) se ha usado durante mucho tiempo en
tcnicas discontinuas para la purificacin de enzimas, se desarrollaron una
columna cromatografica de HA. El mtodo ha ido ganando aceptacin
lentamente entre los qumicos de las protenas, debido segn Rernardi (1971) a
las razones siguientes:
(a) La laboriosa preparacin del hidroxilapatito.
(b) El desconocimiento de los mecanismos de interaccin entre las protenas y
esta substancia.
(c) La introduccin en 1956 por Petersen y Saber de intercambiadores inicos
basados en la celulosa.
La preparacin a escala de laboratorio del hidroxilapatito cristalino ha sido
descrita por varios
Atkinson et al. (1973) publicaron un mtodo sencillo y barato para producir
hidroxilapatito a gran escala, con un tamao de cristal uniforme y que tena
buenas velocidades de flujo y gran capacidad de adsorcin. Estos ltimos
autores han comentado que el hidroxilapatito comercial es caro y
frecuentemente poco fiable en lo que respecta a la estructura de sus cristales,
la velocidad de flujo y la capacidad de adsorcin.
Bernardi y Kawasaki propusieron un mecanismo de interaccin entre las
protenas y el hidroxilapatito en 1968, en el que se relaciona la influencia de las
estructuras secundaria y terciaria de las protenas con su comportamiento
cromatogrfico. En Kawasaki y Bernardi (1970a,b) y Kawasaki (1970a,b) se
discuten los parmetros que determinan la resolucin de las columnas de
hidroxilapatito y las bases tericas de la cromatografa de macromolculas con
estructura rgida. Bernardi (1971) considera que la cromatografa en

hidroxilapatito debera usarse como una herramienta en la purificacin de

protenas, puesto que la base de la separacin es diferente de la de los
cambiadores de iones o de la la filtracin en gel.