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DIVISIN DE BIOTECNOLOGA

ESTANDARIZACIN DE LA TCNICA DE
PCR PARA LA DETECCIN DE
Mycobacterium bovis EN MUESTRAS DE
QUESO DISTRIBUIDO EN EL MUNICIPIO
DE TECMAC.
TESIS
PARA OBTENER EL TTULO DE

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
PRESENTA
BLANCA ESTELA SOTO MEDRANO
ASESORES INSTITUCIONALES:
DR. ORBELN SOBERANIS RAMOS
M.V.Z. M.S.P. JORGE CRDENAS LARA

ASESORES ACADMICOS:
BIOL. CRISTIAN GILBERTO ALVAREZ CRDENAS,
M. EN C. LETICIA FLORES ALATORRE HERNNDEZ
M. EN E. MARA EUSTOLIA LLANILLO FLORES.
INSTITUCIN: FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DE LA UNAM

GENERACIN: MAYO 2012-DICIEMBRE 2013

DEDICATORIAS
I dedicate this degree to the poet, because he made me come back from the darkness
many times and I kept his promise until my soul felt it was time to walk in a different
direction, here is what he said to give me strength to overcome everything I went through:

Shadow
Take me where I can tell you that I love
you,
no matter if our trail is made of rock or
mud,
and no matter how many times I have to
go around it to reach you,
I will be happy and joyful to hold your
hand,
and I will not fear even during the darkest
night.
We will eat almond bread and we will drink
dew,
we will make from life our happiness,
and we will never have a gray nor grueling
winter,
we will be what we desire without looking
backwards.
And if one day a shadow does not let me
see you,
and the oblivion monster is against our
love,
4

I will fire the floambeau that guides our


haul,
and you, you will make sure the wind does
blow the fire out later.
ARSO April 18th 2002

Para mis ms grandes amores esperando dar una respuesta parcial a sus innumerables
preguntas.

Lazos de Sangre
Angelito, mi cielo, cario, mi vida, corazn,
mi amor, son un repertorio de palabras que
no formaban parte de mi vocabulario
cotidiano hasta el nacimiento de mis hijos.
Crecer no significa ser ms alto, ni
acumular experiencia a travs del tiempo,
significa terminar con el enemigo ms
grade el
Cuando desconocemos el amor interno
pensamos que la felicidad la obtendremos
de fuentes externas: personas, animales,
logros u objetos inanimados. Al final del
camino, cuando el vaco de lo externo no
logra llenar el vaco interno, nos damos
cuenta que no hay nada que dar, que para
generar amor hay que llenar los vacos y
eso es lo que en realidad significa crecer.
Nunca nada, ni nadie me at o sent
ausencia o presencia alguna, nadie me
hizo sentir la inmensa necesidad de
regresar, ni extra ningunos brazos, con
la misma intensidad que ahora siento por
besar, abrazar, ver, or y sentir a mis dos
ngeles.

Esa inmensa necesidad de amar me obligo


a buscar respuestas a mi propia existencia.
Descubr que no bastaba desear la
felicidad de ellos para lograrlo, y entonces,
despus de volar sobre el atlntico por
sexta vez, percib que nunca haba abierto
mis alas, que viva prisionera en mi pasado
y en mi propio cuerpo.
Necesitaba nacer de nuevo, a pesar de lo
acumulado y lo no obtenido durante las
batallas externas, mi espejo estaba roto,
mi imagen se fraccionaba y repeta de
maneras distintas, no era posible ver mi
interior, y entonces me di a la tarea de
hacerme feliz a m misma, en el sentido
menos egosta pero ms eglatra.
Puede ser que no haya llegado a la meta,
que no sea la mejor madre para mis hijos,
que no les haya dado todo lo que
necesitan, pero lo que ms deseo es
amarlos, y eso slo es posible encontrando
ese sentimiento en m. Deseo que sean
muy felices y encuentren su verdadero
camino. Yo no estar siempre, pero cuando
as sea, espero estar completa.
Cuando le dije a Aisha que le escribira una poesa me pregunt que qu era eso y a
menos de un mes del sptimo ao de su nacimiento aspiro a llenar la definicin: algo
hermoso hija. Espero que cuando me leas as lo percibas.
7

Mam quiero ir a ver tus experimentos


Aisha, durante las tardes de octubre.
Mam todava no es da
Khalil Rahman, abriendo la cortina y reprochando mi partida al trabajo, antes del
amanecer.
Traduccin de Aisha a los tres aos:
Todava no es de sol.

Tal vez cuando tengan el tiempo y nimo de leer no amen la ciencia tanto como yo, pero
sabrn lo que hice durante mis ausencias, sabrn que estaba tratando de encontrarme a
m misma y que a veces la bsqueda es un laberinto con una sola salida y el encontrarla
puede requerir mucho tiempo.

To the one

Flesh and Bones


What I do not like about people is lack of
humanity. To me it is composed of three
elements, from now on: flesh, mind
and soul. Men are commonly seduced by
flesh while women are commonly
seduced by mind.
Soul men are sweet, charming, lovely,
kind, and gentlemen and they are
attracted by other souls but an easy prey
for mind women.
Mind men know what to say and how to
say it, what to do, where to go and they
have their own explanation for everything;
they can lie with such self confidence that
you will easily believe them. They are
attracted to flesh, they do not feel
comfortable with souls and they will never
agree with mind women.
Flesh men care about appearance and
beauty, they do exercise, take care of their
body, their clothes, their properties and
whatever they have that can impress
others; they are particularly attracted by
flesh, and it has to be the best kind
because they love showing off.

Soul women are attracted to other souls,


but they are easily seduced and confused
by minds, they are sweet and do
everything to please others, they love
sacrifice for the happiness of others.
Mind women care about money, status,
they use men for their purposes, they do
not care about feelings, and they use their
intelligence to catch minds and souls
because they are profitable.
Flesh women care about beauty, make
up, dressing, exercise and fitness; they
care about fashion and feel attracted to
Flesh men; they are an easy prey for
minds but usually rejected by souls.
Flesh and mind men are dangerous
because they use other people to benefit
from them, and since they are irresistible
to all kinds of women, they use their
charms to get what they want, but they do
not like Mind women because they
threaten their intelligence, so their
common preys are: flesh, soul and a
combination of flesh and soul.
Flesh and soul women are the weakest,
because they care about their beauty, they
want to look pretty to charm others, to
seduce others, to please others; they do
10

not pay attention to themselves and do not


own their lives.
Norwood and Sanders are psychologists
who treat love as a women disease and
men with no feelings; to me the real
problems are lack of interest in developing
mind attributes in women and lack of
connection with soul in most men. I have
tried to understand love, but only Greeks
gave a good definition of it in its different
sorts. Although I thought I had an issue
with loving certain kind of men, I just found
out that what really makes me fall in love is
finding complete humans, they care about
everything, they look for perfection beyond
time, beyond knowledge and beyond deity.
Their soul is inspiring, their beauty is in
their eyes, and their intelligence can be
observed in their taste for culture. Now I
understand my way of loving.
I wish I were a complete human and I wish
we all were, but unfortunately what we
mostly find in this world is: Flesh and
Bones.

11

El presente trabajo sienta las bases para la


continuacin del proyecto PAPIME 201713
"Aplicacin

de

la

biologa

molecular en la inocuidad de los productos


y

subproductos

lcteos

para

el

fortalecimiento de la enseanza de la
Medicina Veterinaria y Zootecnia" dirigido
por el Dr. Orbeln Soberanis Ramos y el
M.V.Z. M.S.P. Jorge Crdenas Lara.

12

AGRADECIMIENTOS
Este proyecto fue resultado de los esfuerzos conjuntos de diversas instituciones; la
colaboracin de muchas personas y el apoyo incondicional de aquellos a quienes
considero compaeros de profesin y de vida.
Por secuencia temporal, deseo agradecer a Productora Nacional de Biolgicos
Veterinarios, a todos sus integrantes y particularmente al MVZ. Len Fernando Gual
Ntera y QFB. Luis Bojrquez Narvez, por las atenciones prestadas y porque de manera
directa o indirecta todos aportaron en el financiamiento del proyecto y me motivaron a
continuar por este camino.
Agradezco a la UNAM por la aceptacin de mi estada, a mis asesores institucionales
pertenecientes al Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pblica de la Facultad
de Medicina Veterinaria y Zootecnia, y a la Q.A. Luz del Carmen Sierra por la gestin
para la realizacin de este proyecto. Tambin agradezco las facilidades otorgadas para el
uso del equipo de espectrofotometra NanoDrop del Departamento de Microbiologa e
Inmunologa a cargo de los Doctores Jos Angel Gutirrez Pabello y Edgar Alfonseca
Silva.
Considero fundamental el gran apoyo de la doctora Rosalinda Acosta Salinas del Instituto
de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo para la
ejecucin de los trabajos experimentales.
Gracias a la Divisin de Biotecnologa por las facilidades para el uso de las instalaciones
y equipos de los laboratorios de Biologa Molecular, de Nanobioingeniera y Biotecnologa
Ambiental; a todos sus encargados y un reconocimiento especial a sus laboratoristas, ya
que de ellos depende el completo aprovechamiento de los recursos con los que cuenta la
Universidad.
Predicar con el ejemplo, cuando alguien me pregunta si tomo, mi respuesta es: ni
consejos. Algunos podran decir que no escucho, pero el eco ms fuerte en mi vida lo
han tenido aquellos cuya pasin por su trabajo me ha inspirado y dado aliento para
continuar por este camino. Gracias a todos y cada uno de mis maestros por amar su
trabajo.
Agradezco al Centro de Salud de Tecmac y al CENASA por la donacin de las cepas de
BCG, y de forma particular al Dr. Juan Antonio Montao Hirose por su hospitalidad,
sencillez y siempre grato recibimiento.
13

Mi ms sincero agradecimiento a mi querida profesora Edith Hortencia Ramrez


Hernndez por sus valiosas aportaciones e informacin que facilitaron el formato y la
edicin, no slo del presente trabajo, sino tambin de trabajos previos realizados durante
la ingeniera.
A once aos de iniciada la travesa, aqu concluye el camino recorrido de una etapa llena
de esperanza, aventuras, logros y tambin de tropiezos. Hoy veo la vida desde un ngulo
distinto, creo que inicio una nueva etapa de vida, ya nada es de fantasa, la realidad me
ha atrapado en sus redes, ahora busco la cristalizacin de mis sueos a corto plazo. En
este punto tambin merecen mi reconocimiento quienes voluntaria o involuntariamente
me pusieron piedras en el camino, porque gracias a ellos mis logros fueron mayores y
mis lecciones ms significativas.
Erika Torres, Eustolia Llanillo, Leticia Flores, Luciano Hernndez, Florencia del Carmen
Salinas, Socorro Ruz, Elizabeth Silva y Jess Alarcn, agradezco infinitamente la
invaluable confianza que depositaron en m a pesar de todo y de todos.
Agradezco a mis amigos y compaeros de generacin: Sharon Maricela, Aldo Ayala,
Aldo, Roberto, Aline, Jaime y Jocelin, llevo en mi corazn las enseanzas de todos y
cada uno de ustedes.
A Genaro Cern, Cesar Aguilar y a Antonio Almazn, porque su genio innegablemente es
inspirador, los considero pilares en mi formacin profesional, aspiro a copiar aunque sea
un poco de su talento, y quiz no menos importante, es mi deseo superar los defectos
compartidos. Le doy gracias al universo por ponerlos en mi camino.
Gracias a Roberto Ramrez Hernndez, Cristian lvarez, Nelson Infante y Rubn Chvez,
por su amistad y apoyo incondicional tanto en la academia como en la vida.
Gracias madre, porque me pusiste el ltimo escaln y aunque sigas lejos cada da ests
ms cerca de mi corazn.

14

NDICE DE CONTENIDO
PG.
AUTORIZACIN DE IMPRESIN

ii

DEDICATORIAS

iii

AGRADECIMIENTOS

ix

NDICE DE CONTENIDO

xi

NDICE DE FIGURAS

xiii

NDICE DE TABLAS

xvii

ABREVIATURAS

xvii

RESUMEN........................................................................................................... 1
ABSTRACT.......................................................................................................... 3
I. INTRODUCCIN................................................................................................ 5
1.1. OBJETIVO GENERAL..................................................................................6
1.2. OBJETIVOS ESPECFICOS..........................................................................6
1.3. JUSTIFICACIN.......................................................................................... 6
1.4. HIPTESIS................................................................................................. 7
II. CRONOGRAMA................................................................................................ 8
III. MARCO TERICO............................................................................................ 9
3.1. Leche......................................................................................................... 9
3.1.1. Pasteurizacin de la Leche.........................................................................9
3.1.2. Efecto de la pasteurizacin en la leche y la produccin de queso................10
3.2. Variedades de queso artesanal y su importancia en Mxico.............................11
3.3. Ventajas y desventajas de la pasteurizacin de la leche en la produccin de queso.
...................................................................................................................... 12
3.4. Tuberculosis.............................................................................................. 13
3.4.1. Etiologa y virulencia del agente causal de la tuberculosis..........................13
3.4.2. Signos y sntomas................................................................................ 16
3.4.3. Epidemiologa..................................................................................... 18
15

3.4.4. Tcnicas de diagnstico de tuberculosis en animales................................21


3.5. La doble hlice.......................................................................................... 26
3.5.1. Replicacin del cido desoxirribonucleico (ADN) in vivo.............................27
3.5.2. Amplificacin del ADN in vitro (PCR).......................................................29
3.6. Estandarizacin de la tcnica de PCR...........................................................31
3.6.1. Lisis celular......................................................................................... 31
3.6.2. Extraccin y purificacin........................................................................32
3.6.4. Determinacin de pureza y concentracin................................................33
3.6.5. Amplificacin de los fragmentos de ADN blanco a partir de la cadena molde. 35
3.7. PCR Multiplex............................................................................................ 36
IV. METODOLOGA............................................................................................. 39
4.1. Tratamiento del queso................................................................................. 39
4.2. Lisis celular............................................................................................... 42
4.3. Purificacin de ADN....................................................................................44
4.4. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)................................................45
4.4. Electroforesis............................................................................................. 46
V. ANLISIS DE RESULTADOS............................................................................ 48
5.1. Tratamiento de Queso................................................................................. 48
5.2. Purificacin............................................................................................... 50
VI. CONCLUSIONES........................................................................................... 56
VII. BIBLIOGRAFA............................................................................................. 57
GLOSARIO DE TRMINOS..................................................................................65
Intradrmica: situado o que se practica en el espesor de la piel...........................71

16

NDICE DE FIGURAS
PG.
Figura 1. Tipos de queso y toneladas vendidas en 2013 (19).....................................12
Figura 2. Esquema de la estructura de la pared celular de las micobacterias. (26)........14
Figura 3. Esquema de las etapas de infeccin en la infeccin pulmonar por M.
tuberculosis. (27)................................................................................................. 15
Figura 4.Principales componentes de un granuloma tuberculoso (27).........................16
Figura 5. Agrandamiento de los ganglios linfticos del cuello (30)..............................17
Figura 6. Localizacin anatmica de los ganglios bronquiales, mediastnicos y portales
(de izquierda a derecha) (32)................................................................................ 18
Figura 7. ndices de tuberculosis en Londres () entre 1982 y 1987 comparados con los
presentados en Nueva York () entre 1972 y1994 (36)..............................................20
Figura 8. Estimado de ndices de tuberculosis por regin de la OMS, 1990-2012.
Tendencias regionales en casos de incidencia de Tuberculosis (verde), e ndices
estimados de coinfeccin VIH-TB (morado), las sombras representan la incertidumbre. 21
Figura 9. Timbre postal alemn homenajeando el centenario del premio nobel de Robert
Koch, pionero en los estudios de tuberculosis y respuesta inmune a la aplicacin de la
tuberculina. (38)................................................................................................. 22
Figura 10. Proceso de preparacin de la tincin de Ziehl Neelsen...............................23
Figura 11. Colonias caractersticas de M. tuberculosis aislado por mtodo Petroff en
medio de Cultivo Lowestein-Jensen (LJ) y Middlebrook 7H10)...................................23
Figura 12. Corte histolgico de granuloma tuberculoso con necrosis central rodeada de
clulas epiteloides en empalizada y clulas gigantes multinucleadas (39)....................24
Figura 13. Genoma completo de M. bovis. (41)........................................................25
Figura 14. Composicin qumica de la doble hlice, enlaces, purinas, pirimidinas, uniones
de los pares de bases y conformacin espacial de la desoxirribosa (47).....................26

17

Figura 15. Replicacin de ADN in vivo. Principales enzimas que participan en el proceso
(50)................................................................................................................... 28
Figura 16. Enzimas y reacciones en la horquilla de replicacin. Primer (iniciador), leading
strand (cadena lder), lagging strand (cadena rezagada), primase (primasa), helicase
(helicasa) (49)..................................................................................................... 29
Figura 17. Habitat natural de la bacteria Thermus aquaticus a partir de la cual se obtiene
la Taq polimerasa (54).......................................................................................... 31
Figura 18. Espectro tpico del ADN en cuantificado en el Nanodrop (55)......................34
Figura 19. Espectro de muestra de ADN con alto contenido de EDTA (55)...................34
Figura 20. Desnaturalizacin de ADN de dsADN a ssADN (51)..................................35
Figura 21. Hibridacin de los iniciadores en la cadena molde (51)..............................36
Figura 22. Extensin de la cadena de ADN a partir de los iniciadores (51)...................36
Figura 23. Diseo de PCR Multiplex . (56)...............................................................37
Figura 24. Gel de Agarosa al 3%, secuencias con tamaos de 150 pb para las cepas
silvestres y 200pb para las cepas vacunales tanto francesa como rusa. (56)................38
Figura 25. Megacentrfuga Thermo Scientific modelo Megafuge 40 y rotor utilizados
durante el tratamiento de queso para el aislamiento de bacterias...............................40
Figura 26. Agitador magntico con control de temperatura utilizado para digerir el queso
en matraz de 50 mL con solucin de citrato.............................................................41
Figura 27. Microcentrfuga Hemle Z23MK-2 con control de temperatura y velocidad de
centrifugacin en gravedades y rpm.......................................................................43
Figura 28. Espectrofotmetros NanoDrop 1000 Thermoscientific y Jenway 6715 uv/vis
con cubetas de cuarzo, utilizado para la determinacin de pureza de ADN mediante la
tcnica de barrido................................................................................................ 44
Figura 29. Termociclador TECHNE modelo TC-312, empleado para la amplificacin de
ADN.................................................................................................................. 46

18

Figura 30. Vista area de cmara electroforesis Class II Continental de Lab Products Inc
con gel de agarosa y muestras teidas azul de bromofenol de corrimiento y escalera
molecular del fago phi utilizada para determinar la integridad y tamao de los fragmentos
de ADN de las muestras tanto purificadas como amplificadas....................................46
Figura 31. Fuente de Power Station 300 de Labnet International Inc. Utilizada para la
electroforesis y transiluminador utilizado para la lectura del gel de agarosa con bromuro
de etidio como agente revelador de la presencia de ADN..........................................47
Figura 32. Barrido espectrofotomtrico de la solucin queso en citrato de sodio sometida
a calentamiento (A), y misma muestra leda despus de centrifugacin y eliminacin de
sobrenadante (B)................................................................................................. 48
Figura 33. Barrido espectral de las curvas mostradas por aminocidos aromticos:
triptfano (azul), tirosina (rosa) y fenilalanina (verde)................................................49
Figura 34. Barrido espectrofotomtrico de la composicin de la muestra con lisis alcalina
y Proteinasa K (A) y la muestra de impurezas atrapadas en cloroformo (B)..................50
Figura 35. Espectros caractersticos de las muestras purificadas ledas tipo durante las
distintas series de experimentos............................................................................50
Figura 36. De izquierda a derecha, experimentos F, B y E , el cuarto y quito carril
corresponden a muestras purificadas directamente de PPD Bive y el sexto carril
corresponde al marcador molecular del fago phi......................................................51
Figura 37. Experimento gamma de la SERIE D (duplicado) y marcador molecular phi. En
gel de agarosa al 3 % corrido con pulsaciones de 100 volts por 10, 60 volts por 50, 100
volts por 10 y 60 volts por 60................................................................................ 52
Figura 38. Espectro Alfa, SERIE C (A), Espectro gamma SERIE D (B)........................52
Figura 39. Corrimiento electrofortico en gel de agarosa al 5% con voltaje continuo a 80
volts. De derecha a izquierda, el control negativo (neg), el marcador molecular (M) y los
duplicados de alfa amplificado (T), BCG1 amplificado (B1T), gamma purificado (P) y
gamma amplificado (T)....................................................................................... 53

19

Figura 40. Gel de Agarosa al 1.5% corrido a 60 volts durante 2 horas. De izquierda a
derecha: amplificacin PPD Cepa AN5 con polimerasa hot start (A5hs), amplificacin de
la cepa BCG1 con Taq polimerasa (B1T), amplificacin de la cepa BCG2 con Taq
polimerasa (B2T) y con hot start (B2hs), cepa purificada AN5 (A5p), cepa amplificada AN5
(A5a), cepa purificada alfa (p), cepa amplificada alfa (a), cepa BCG1 amplificada (B1a),
cepa gamma amplificada (a), cepa gamma purificada (p), control negativo (neg) y
marcador molecular (M)........................................................................................ 54
Figura 41. Gel de Agarosa al 2%, corrimiento por pulsaciones en lapsos iniciales de 10
min a 100 volts y 30 minutos a 60 volts durante 2 horas para la amplificacin del control
positivo con la cepa BCG1 (B1), la muestra testigo purificada (p) y amplificada con
polimerasa hot start y Taq (hs y T) y la muestra problema amplificada con hot start y
Taq (hs y T)..................................................................................................... 55

20

NDICE DE TABLAS
PG.
Tabla 1. SERIE A de ensayos para estandarizacin de tratamiento de queso de aro
obtenido en el tianguis del centro de Tecmac.........................................................39
Tabla 2. SERIE B de ensayos para estandarizacin de tratamiento de queso...............40
Tabla 3. SERIE C de ensayos para tratamiento de queso ranchero obtenido en el tianguis
de Sierra Hermosa............................................................................................... 41
Tabla 4. SERIE D, tratamiento para la muestra problema..........................................41
Tabla 5. Cepas puras utilizadas durante la experimentacin......................................42
Tabla 6. Tratamientos de Lisis y tratamientos de queso para aislamiento de bacterias.. .42
Tabla 7. Extraccin por lisis alcalina en microcentrfuga............................................43
Tabla 8. Resultados de concentracin y purificacin obtenidos en el NanoDrop............51

21

ABREVIATURAS
ADNasa: Enzima (endonucleasa) digestiva del cido desoxirribonucleico
ADN-DNA: cido desoxirribonucleico
dsDNA: Cadena de ADN bicatenaria (double stranded)
ssDNA: Cadena de ADN monocatenaria (single stranded)
RNA: Ribonucleica cid (cido ribonucleico)
ARNasa: Enzima (ribonucleasa) que cataliza la hidrolisis del ARN en fragmentos
ms pequeos
BCG: Bacillus Calmette-Gurin
BPM: Buenas Prcticas de Manufactura
CDC: Center of Desease Control (Centro para el Control y Prevencin de
Enfermedades en Estados Unidos)
Codex Standard: es reconocido internacionalmente en relacin a medidas
sanitarias y fitosanitarias, y barreras tcnicas para el intercambio comercial con el
objetivo de proteger la salud de los consumidores y asegurar prcticas justas en
el intercambio comercial de alimentos.
EDTA: cido etilen-diamino-tetra-actico, agente quelante o anticoagulante.
ELISA: Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Ensayo por Inmunoabsorcin
Ligado a Enzimas)
HACCP: Hazard analysis and critical control points (Anlisis de riesgos y puntos
crticos de control)
INF-: Interfern gamma
NanoDrop: Espectrofotmetro que permite calcular con elevada precisin
concentraciones de ADN (doble cadena o cadena sencilla), ARN y protenas en
las muestras a partir de cantidades muy pequeas de muestra (2 l).
NOM: Norma Oficial Mexicana
OIE: Office International des Epizooties (Organizacin Mundial de Salud Animal)
22

OMS-WHO: Organizacin Mundial de la Salud


PAHO: Pan American Health Organization (Organizacin Panamericana de la
Salud)
PCR: Polimerase Chain Reaction (Reaccin en Cadena de la Polimerasa)
PPD: Purified protein derivative (Derivado protico purificado de Mycobacterium)
SDS: sodium dodecyl sulfate (Sulfto duodecil sdico)
SIDA-AIDS: Sndrome de inmunodeficiencia adquirida
SINAVE/DGE/SALUD:

Sistema

de

Notificacin

Semanal

de

Casos

Nuevos/Direccin General de Epidemiologa/Secretara de Salud


TB: Tuberculosis
TE: Amortiguador TRIS-EDTA
TRIS: tris (hidroximetil) aminometano, de frmula (HOCH2)3CNH2
UV: Ultravioleta
VIH-HIV: Virus de Inmunodeficiencia humana
xg: gravedades

RESUMEN
La tuberculosis contina siendo un problema de salud pblica alrededor del
mundo, ya que cada ao cobra millones de vidas y representa cuantiosas
prdidas econmicas. A pesar de que el aislamiento en medio cultivo de la
bacteria se considera la tcnica estndar de oro para detectar el complejo
Mycobacterium tuberculsis, una de sus grandes limitantes sigue siendo su largo
periodo de incubacin, por esta razn, la prueba intradrmica haba sido una de
las prcticas ms comunes hasta finales del siglo pasado, no obstante la
necesidad de tcnicos altamente calificados y que su sensibilidad y especificidad
que pueden resultar variables, la rapidez y bajo costo la convirtieron en la solucin
23

a corto plazo de la problemtica que representaba la tuberculosis, sta prueba es


utilizada como mecanismo de control de la enfermedad en ganado bovino, y en
algunos pases donde la vacuna no es obligatoria tambin es empleada como
mtodo de diagnstico en humanos.
En pases dnde la BCG est incluida en el cuadro de vacunacin, la incidencia
de tuberculosis ha disminuido de manera importante, pero debido a que no
protege todas las variantes de la enfermedad, y al mismo tiempo interfiere con la
prueba intradrmica, es necesario buscar ms alternativas que incluyan tanto el
diagnstico como el tratamiento y su prevencin.
El descubrimiento de la PCR y su diversificacin en muchos campos de
investigacin ofrecen nuevas alternativas para detectar tuberculosis en muestras
de distintos tipos; no obstante, se requiere mayor investigacin para validar la
tcnica, la estandarizacin de la metodologa se hace necesaria para garantizar
resultados acertados y confiables.
La incidencia de tuberculosis relacionada con el consumo de lcteos se redujo
gracias a la pasteurizacin de la leche, y aunque su prctica ha sido comn en la
industria por muchas dcadas, el gusto de los consumidores por productos
artesanales ha despertado la preocupacin de las autoridades de salud pblica
debido al latente riesgo que ello representa.
El propsito de este trabajo fue estandarizar la tcnica de PCR para permitir la
deteccin rpida y precisa de Mycobacterium bovis en queso fresco vendido en el
municipio de Tecmac, Estado de Mxico. Con el fin de establecer esta tcnica,
se hicieron varias pruebas, se establecieron los respectivos pasos para el
aislamiento de bacterias, as como la extraccin y purificacin del material

24

gentico, su posterior evaluacin de integridad, concentracin y pureza.


Finalmente se llev a cabo la amplificacin de la secuencia blanco
correspondiente a Mycobacterium bovis.
El calentamiento y agitacin mostraron mejores resultados en el aislamiento. La
extraccin con componentes altamente alcalinos mostraron buenos resultados en
concentracin pero efectos negativos sobre la integridad; la purificacin se
alcanz solamente al implementar un segundo paso de purificacin con
Cloroformo:Octanol.
La espectrofotometra permiti hacer la evaluacin de los compuestos utilizados
para todo el procesamiento de la muestra. La amplificacin de la PCR se
estableci adecuadamente a travs de los clculos pertinentes y la tcnica de
purificacin result satisfactoria en la tercera y cuarta series de experimentos, ya
que fue posible amplificar la secuencia blanco de 200 pb esperada al utilizar los
cebadores para BCG.

ABSTRACT
Tuberculosis remains to be a worldwide public health issue, costing millions of lives and
lots of money every year. Although isolation and culture of the bacteria is considered the
gold standard technique for detecting Mycobacterium tuberculosis complex, time is one of
the main drawbacks of such technique, that is one of the reasons Manteaux skin test had
been the most common practice until the end of the last century, in spite of its need for
highly qualified technicians and variable sensibility and specificity, quickness and low cost
made it become solution to the problem tuberculosis represented. This test is used as a

25

disease control mechanism in cattle, and in some countries where vaccination is not
mandatory it is also used in humans.
In countries where BCG is included in the immunization report card, incidence has
reduced meaningfully, however, since it does not protect against all types of TB and
because it interferes with the skin testing, it is necessary to search further suitable
diagnosis, treatment and prevention alternatives.
The discovery of PCR and its spreading in many fields of research offer new choices to
detect TB in different kinds of samples; however, more research is required to validate the
technique, standardization of the methodology is necessary to warrantee that the results
are certain and reliable.
The incidence of TB related to dairy products reduced thanks to pasteurization in milk,
and although it has been a common industrial practice for decades, the taste for artisanal
products in consumers has awaken public health interest due to the latent risk it means.
The aim of this project was to standardize a PCR technique to allow a quick and accurate
detection of Mycobacterium bovis in fresh cheese sold in the county of Tecmac, State of
Mexico. In order to establish the technique several trials were made, establishing the
necessary steps for bacteria isolation, DNA extraction and purification, later integrity,
concentration and purification evaluation. Finally the Mycobacterium bovis target
sequence amplification was carried out.
Heating and spinning showed the best isolation results. Highly Alcaline extraction
demonstrated having good results regarding concentration but bad results regarding
integrity. Purification was reached only after a second purification step was tried out with
Chloroforme:Octanol.
Spectrophotometry allowed the evaluation of the different processing compounds. PCR
amplification was set appropriately through calculations and the purification technique was

26

satisfactory in the third and fourth series of experiments because it was possible to
amplify the target sequence of 200pb corresponding BCG primers.

27

I. INTRODUCCIN
La leche y sus derivados han sido catalogados como importantes reservorios de
microorganismos benficos para la salud de los seres humanos y otros mamferos, no
obstante, como consecuencia de su alto contenido de nutrientes, tambin resultan
excelentes medios de cultivo para diversos microorganismos patgenos contenidos en la
leche cuando el animal est enfermo, tal es el caso de: Mycobacterium bovis, Brucella
spp., Salmonella spp., Listeria monocitogenes, Campylobacter jejuni y Yersinia
pseudotuberculosis, por mencionar algunas (1).
A mediados del siglo XIX Pasteur hace las primeras investigaciones sobre el papel que
juegan los microorganismos en la modificacin de los alimentos y cmo stos se eliminan
por accin del calor, y pese a que a finales del lustro anterior al actual, el Doctor Frank
Bryan desarroll modelos HACCP (anlisis de riesgos y puntos crticos de control) para
produccin artesanal y expendio callejero de alimentos (2), son pocos los productores
que hacen uso de tan valiosa herramienta en los establecimientos donde se elabora
queso artesanal en Mxico.
Por otra parte, y derivado de la falta de apoyos gubernamentales, existe poca inversin
en tecnologas y sistemas de calidad para pequeos productores de queso artesanal, por
lo que hay una preocupacin inminente sobre el riesgo de salud pblica. En el pas se
producen, en promedio, 38 tipos de queso, de los cuales 88.0% es fresco y, en su
mayora, de tipo artesanal, elaborado a partir de leche no pasteurizada (3).
El principal reservorio de M. bovis, agente causal de tuberculosis es el ganado bovino,
que puede transmitirlo a muchos otros mamferos, incluyendo al hombre, quin contrae la
infeccin principalmente por ingestin de leche no tratada trmicamente y derivados
provenientes de la misma (4). La tuberculosis representa un problema de salud pblica a
nivel mundial, cerca de una tercera parte de la poblacin humana tiene tuberculosis
latente, lo que significa que son portadores, pero slo el 10% desarrolla la enfermedad;

28

para 2012 la OMS (Organizacin Mundial de la Salud) report 8.6 millones de casos de
los cuales hubo 1.3 millones de decesos, siendo la segunda causa de muerte por un solo
agente infeccioso despus del VIH (virus de inmunodeficiencia humana) (5).
En Mxico la tasa de morbilidad debida a tuberculosis se ha mantenido entre 16 y 18
habitantes por cada 100,000, lo que represent 18,011 casos y 2,225 defunciones en
2009 (6). No es clara la cifra correspondiente a tuberculosis zoontica, pero se calcula
que el 3.1% del total de casos de tuberculosis en humanos son atribuibles a este agente
(7).

1.1. OBJETIVO GENERAL


Estandarizar la tcnica de PCR para la deteccin de M. bovis en muestras de queso
fresco artesanal obtenidas en expendios localizados en el municipio de Tecmac.

1.2. OBJETIVOS ESPECFICOS


Establecer la metodologa idnea de extraccin de ADN bacteriano en muestras de queso
fresco para la deteccin de M. bovis por PCR multiplex
Evaluar la calidad del ADN proveniente de microorganismos aislados de la muestra
mediante electroforesis y espectrofotometra
Optimizar la tcnica de PCR para la deteccin de M. bovis evaluando los resultados
obtenidos por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1%, 1.5%, 2%, 3% y 5%.

1.3. JUSTIFICACIN
Desde 1917 la prueba de tuberculina ha sido utilizada para deteccin de tuberculosis
bovina en animales vivos, la sensibilidad y especificidad de la prueba son variables,
dependiendo la forma en la que se aplique (caudal, cervical simple y/o doble
comparativa), siendo ampliamente utilizada porque requiere poco tiempo y es econmica,
29

en cambio el aislamiento del agente causal, que es altamente especfico, tiene baja
sensibilidad y necesita mucho tiempo y cuidados; los mtodos de cultivo tradicionales
requieren entre 4-8 semanas (8), por ello estas tcnicas se han ido sustituyendo
progresivamente por otras que se sirven del ADN, como la PCR utilizada ampliamente
para el diagnstico de tuberculosis en esputo, orina y tejidos, tanto en humanos (9,10)
como en animales (11,12,13); no obstante, son pocos los estudios relacionados con
anlisis directo de muestras de leche y sus derivados (8,14,15).
Considerando el elevado consumo de queso producido a partir de leche no pasteurizada,
resulta fundamental desarrollar pruebas de diagnstico que permitan la oportuna y rpida
deteccin M. bovis en quesos artesanales. La estandarizacin de la tcnica de PCR
resulta fundamental para garantizar la certeza de los resultados obtenidos.

1.4. HIPTESIS
La estandarizacin de una tcnica de extraccin de ADN purificado permite su
amplificacin por medio de PCR multiplex y la oportuna deteccin de M. bovis presente
en queso fresco.

30

II. CRONOGRAMA

31

III. MARCO TERICO


3.1. Leche
La leche es el producto de la secrecin de las glndulas mamarias exento de calostro,
cuya composicin vara dependiendo de la especie y raza del mamfero del que proviene;
es un lquido blanco, opaco, ms viscoso que el agua, de sabor ligeramente azucarado y
de olor acentuado, contiene la mayora de los elementos necesarios para la construccin
de los tejidos animales. Posee cidos grasos poliinsaturados que son esenciales en la
nutricin del los mamferos; casena, lactoglobulinas, inmunoglobulinas, lactoalbmina y
albmina como las protenas ms importantes; su principal carbohidrato es la lactosa;
entre los minerales ms importantes presentes estn: el calcio, fsforo, sodio, potasio y
cloro, en pequeas cantidades hierro, yodo, cobre, manganeso y zinc; adems contiene
vitaminas liposolubles A, D, E y K, as como el complejo B y la vitamina C en menor
concentracin y adicionalmente enzimas como: la fosfatasa, lipasa, catalasa, galactasa y
reductasa (16).

3.1.1. Pasteurizacin de la Leche


Para garantizar la inocuidad de la leche es necesario tener al animal en buenas
condiciones de salud. La contaminacin microbiana de la leche puede provenir tanto de la
ubre como del medio ambiente y equipo de ordeo; adems, una vez ordeada la vaca,
los microorganismos se multiplican dependiendo del recipiente donde se almacene, la
temperatura y el tiempo de almacenamiento (16).
En 1865 Luis Pasteur descubri que los microorganismos se eliminaban por accin de
calor; casi cien aos ms tarde, Sir G. Wilson dijo que los productos alimenticios eran
inocuos si: se prevena la accin microbiana mediante la descontaminacin de materias
primas, la prevencin de la re-contaminacin y el mantenimiento de alimentos en
condiciones controladas de tiempo y temperatura (2).

32

El investigador Dewes observ que si la leche era calentada hasta su punto de ebullicin
y enfriada rpidamente, se evitaba su degradacin, pero hasta cuarenta aos despus se
reconoci la destruccin bacteriana por efecto de la temperatura. El primer pasteurizador
comercial se hizo en Alemania en 1882. Las investigaciones de North y Park, en torno a
los tiempos y temperaturas requeridas para matar al M. tuberculosis permitieron
establecer los tiempos de pasteurizacin, que se defini como el proceso de
calentamiento de no menos de 61.1 C por 30 minutos en 1924 (17).
3.1.2. Efecto de la pasteurizacin en la leche y la produccin de queso
El queso, producto muy aceptado por el consumidor por sus propiedades organolpticas
y fcil digestin, es la consecuencia de la precipitacin de las casenas, que deja como
residuo el suero de la leche, adems es una forma de conservacin de los componentes
insolubles de la leche (casena, materia grasa, sales, partculas coloidales y parte de la
humedad); es un alimento altamente nutritivo porque contiene protenas con gran valor
nutrimental y el complejo fsforo-calcio-vitamina D.
Para la produccin de queso se emplean dos mtodos: a) la acidificacin acompaada
del uso de la renina o cuajo, o bien, b) la acidificacin hasta llegar al punto isoelctrico en
las casenas; siendo el primero el ms usado. Las caractersticas iniciales de la leche, y
los detalles del procesamiento (cortado, agitado, calentado, drenado del suero, prensado
y madurado) cambian las caractersticas de sabor, cuerpo y textura para cada tipo de
queso (18).
La leche, materia prima bsica del queso, constituye un sistema qumico y fisicoqumico
muy complejo; su calentamiento provoca la desnaturalizacin de la lactoalbmina y la
lactoglobulina, la liberacin de grupos sulfhidrilo y la formacin de sustancias reductoras
a partir de los aminocidos azufrados; un calentamiento enrgico, rompe el equilibrio en
el enlace de fsforo y calcio de la leche, el fenmeno se traduce en un empobrecimiento
del lquido en sales clcicas solubles y, por lo tanto, en dificultades de la coagulacin; por

33

otro lado la cuajada de leche tratada trmicamente expulsa el suero ms lentamente que
la cuajada de leche sin tratamiento trmico (18).

3.2. Variedades de queso artesanal y su importancia en Mxico


En Mxico, la produccin de quesos se encuentra regulada por la Secretaria de Salud,
mediante la Norma Oficial Mexicana NOM-121-SSA1-2010. Productos y servicios.
Leche, frmula lctea, producto lcteo combinado y derivados lcteos. Disposiciones y
especificaciones sanitarias. Mtodos de prueba.
Esta norma define al queso, como un producto elaborado de la cuajada de leche
estandarizada y pasteurizada de vaca o de otras especies animales, con o sin adicin de
crema, obtenida de la coagulacin de la casena con cuajo, grmenes lcticos, enzimas
apropiadas, cidos orgnicos comestibles y con, o sin, tratamiento ulterior, por
calentamiento, drenada, prensada o no, con o sin adicin de fermentos de maduracin,
mohos especiales, sales fundentes e ingredientes comestibles opcionales.
La norma general del Codex Alimentarios (Codex Stardard 283-1978), de reconocimiento
internacional para el queso, lo define como: el producto blando, semiduro, duro y extra
duro, madurado o no madurado, y que puede estar recubierto, en el que la proporcin
entre las protenas de suero y la casena no sea superior a la de la leche.
La produccin de queso en Mxico data de la poca del Virreinato, tras la introduccin de
los primeros hatos bovinos y rebaos caprinos y ovinos; actualmente la mayora los
productores medianos y pequeos tienen problemas comunes en cuanto al abasto y
control de la materia prima, tecnologa de elaboracin, calidad y comercializacin,
principalmente; pese a estas circunstancias adversas, Mxico ocup el noveno lugar en
el mundo como productor de queso en 2010, cubriendo nicamente el 76.5% de su
demanda interna (3). Para 2011 la produccin de queso fue de 275,411 toneladas y se
estima que en 2012 alcanz las 290,715 toneladas. Como se muestra en la Figura 1 el
queso panela, queso fresco, queso doble crema y queso amarillo representaron la mayor

34

parte de la produccin (19). Cabe sealar que la definicin de queso fresco es muy
amplia, y aunque segn la NOM-121, antes mencionada, depende del contenido de
humedad, para efecto del presente trabajo se considerar al queso producido a partir de
leche no pasteurizada.

Otros
Panela
Oaxaca
Manchego
Fresco
Doble crema
Crema
Chihuahua
Amarillo
0

20000 40000
60000
Figura 1. Tipos de queso y toneladas vendidas en 2013 (19)

3.3. Ventajas y desventajas de la pasteurizacin de la leche en la


produccin de queso.
En algunos pases persiste la costumbre de ingerir leche sin hervir, lo que expone a los
consumidores

enfermedades

ocasionadas

por

microorganismos

comnmente

presentes en la leche, adicionalmente, los derivados lcteos se continan produciendo


con leche no pasteurizada; la mayora de los casos de tuberculosis bovina en humanos
ocurren por ingestin o manejo de leche no pasteurizada, principalmente en pases
donde no existe un programa de vacunacin obligatoria (7).
La produccin industrial de leche y sus derivados contribuyeron de manera importante la
diseminacin de M. bovis en el ganado. Entre 1912 y 1937 se reportaron 65, 000 muertes
por tuberculosis bovina en Gran Bretaa, en tanto, entre 1951 y 1980 nicamente hubo
tres decesos, esto, gracias a las medidas de erradicacin de tuberculosis en animales y
la pasteurizacin de la leche (20).
La pasteurizacin de la leche afecta de manera importante las caractersticas
organolpticas del queso, ya que eliminan la flora bacteriana que da las caractersticas
35

nicas de cada regin del mundo (21), por lo que en muchos pases se siguen
produciendo quesos con leche no pasteurizada.
Existen ms de treinta variedades de quesos mexicanos artesanales entre los que se
encuentran: asadero, aejo, botanero, canasta, cabra tipo poblano, cotija, de aro, sierra,
adobera, crema tropical, de cincho, de guaje, de hoja, bola de Ocosingo, de morral, criollo
y de rueda (22).

3.4. Tuberculosis
El bacilo de la tuberculosis, o bacilo de Koch, fue nombrado Bacterium tuberculosis por
Zopf en 1883 y el gnero Mycobacterium asignado por Lehman y Neumann; inicialmente
se diferenci entre Mycobacterium tuberculosis hominis y Mycobacterium tuberculosis
bovis, pero actualmente comprende 50 especies, entre ellas patgenos primarios,
oportunistas y saprofitas. Tras el primer hallazgo de tuberculosis pulmonar bovina en
1909 se determin que entre el 1 y el 3% de los casos de tuberculosis pulmonar en el
hombre eran causados por M. bovis, nombre oficialmente asignado en 1970 por Karlson y
Lessel (23). Algunas especies del "complejo tuberculosis", son: M. tuberculosis, la
principal causa de tuberculosis en humanos, M. bovis, M. africanum y M. microti (el
"bacilo de ratn") que es un micro-organismo difcil de encontrar.

3.4.1. Etiologa y virulencia del agente causal de la tuberculosis


El gnero Mycobacterium est integrado por bacilos largos y delgados, a veces
ramificados, inmviles, no esporulados, con abundantes grnulos citoplasmticos, que
poseen una resistencia mayor a la tincin por los colorantes comunes, pero una vez
teidos son resistentes a la decoloracin con una mezcla de alcohol cido, algunos son
aerobios y otros microaerfilos, algunas especies son de crecimiento rpido y otras lento,
da lugar a colonias muy plegadas y secas con apariencia de micelio areo, lo que dio
origen a su nombre (Mycobacterium hongo y bacteria). El tiempo de generacin
de estos microorganismos es muy lento; tarda hasta 20 horas en reproducirse, debido a
36

que son exigentes en sus requerimientos nutritivos, su desarrollo en medios de cultivo


demora hasta ocho semanas (24).
El bacilo de la tuberculosis es un patgeno intracelular capaz de generar infecciones que
transcurren de por vida. Es muy resistente a la desecacin, al cloro, a los cidos, a los
lcalis y a los amonios cuaternarios; es sensible al calor, al alcohol, al formol y al cido
fnico al 5% (24).
Su pared celular est compuesta por dos capas (Figura 2). La externa contiene lpidos
libres combinados con protenas, mansidos fosfatidil-inositol, ftiocerol, lipomananas y
lipoarabinomananas,

en

tanto

la

interna

la

integran

peptidoglicanos

unidos

covalentemente a arabinogalactano que a su vez est enlazado a cidos miclicos.


Cuando se rompe la pared celular con solventes, se solubiliza la capa externa, mientras
que la interna se mantiene intacta (25).

Figura 2. Esquema de la estructura de la pared celular de las micobacterias. (26)

En el caso de la infeccin respiratoria (Figura 3), los bacilos viajan en gotas expulsadas
por tos de un individuo infectado, al ser inhalados e ingresados al cuerpo, los bacilos se
37

transportan a los alveolos pulmonares en donde encuentran macrfagos que estn


relativamente inactivos, por lo que no los matan de manera eficiente ni retardan su
crecimiento. Inicialmente los bacilos se alojan en compartimentos fagosmicos donde se
pueden multiplicar.

Figura 3. Esquema de las etapas de infeccin en la infeccin pulmonar por M. tuberculosis. (27)

Cuando se activa el sistema inmune, los macrfagos son estimulados por el interfern
gamma (INF-), incrementando su eficiencia con la produccin de oxgeno reactivo y
condiciones cida; como respuesta, las micobacterias inmersas en los macrfagos, los
inducen a aumentar el metabolismo de lpidos, con el que ayudan a la expresin de los
genes de resistencia (28).
Cuando las clulas T llegan al lugar de la infeccin, se desarrollan los granulomas
(Figura 4), que en condiciones ptimas del sistema inmune controlan la infeccin, pero si
por el contrario, est inmunodeprimido o es dbil, las micobacterias se continuarn
reproduciendo en macrfagos que no estn completamente activados, y para resistir al
granuloma lo necrosan formando un centro de clulas muertas donde el hospedero es
inducido a elevar su metabolismo de lpidos que convierten a los macrfagos en clulas
esponjosas.

38

Figura 4.Principales componentes de un granuloma tuberculoso (27).

En el momento en el que los granulomas o tubrculos son caseinados (necrosados), los


macrfagos muertos liberan enzimas lticas y productos bacterianos que daan los tejidos
del hospedero licuefactndolos, de esta forma el Mycobacterium puede crecer de forma
libre en el lquido, para posteriormente ser expulsado a travs de la tos en grandes
cantidades acompaados de lpidos que le ayudan a sobrevivir hasta encontrar un nuevo
hospedero (28).

3.4.2. Signos y sntomas


La tuberculosis se puede desarrollar de manera distinta en cada individuo dependiendo
de su sistema inmune, sus sntomas varan segn la distribucin de los tubrculos en el
cuerpo. Las etapas incluyen: latencia, infeccin primaria, enfermedad primaria progresiva
e infeccin extrapulmonar (29).
La tuberculosis latente no tiene signos o sntomas, empero los bacilos viables pueden
mantenerse en material necrosado por aos o durante toda la vida, pero si el individuo se
ve inmunocomprometido, la enfermedad se reactiva (29).
39

La infeccin pulmonar primaria es normalmente asintomtica, a pesar de ello se


pueden hacer hallazgos asociados con linfoadenopatas paratraqueales debido a que los
bacilos se trasladan de los pulmones al sistema linftico, algunos sntomas son: fatiga,
prdida de peso, fiebres, sudores nocturnos, tos y esputo que puede estar acompaado
de sangre. La hemoptosis se puede deber a la destruccin de los vasos localizados en la
pared de la cavidad. La disnea y otros sntomas de neumona de grado bajo tambin
evidencian la disfuncin pulmonar (29).
La infeccin extrapulmonar ocurre en ms del 20% de los pacientes. En casos
avanzados, los ganglios linfticos a menudo estn muy dilatados y pueden obstruir las
vas respiratorias, el tracto alimentario y los vasos sanguneos. Los ganglios linfticos de
la cabeza y del cuello (Figura 5) pueden llegar a estar afectados a simple vista y a veces
se rompen y drenan (29).

Figura 5. Agrandamiento de los ganglios linfticos del cuello (30).

La implicacin del tracto digestivo se manifiesta por la presencia de diarreas intermitentes


y, en algunos casos, por estreimiento. En las fases terminales de la tuberculosis puede
presentarse una extenuacin extrema y dolor respiratorio agudo. Pueden observarse
lesiones en el aparato reproductor femenino, pero los genitales masculinos raramente
estn implicados (29).

40

En las necropsias, los tubrculos se ven con ms frecuencia en los ganglios linfticos
bronquiales, mediastnicos, craneales y portales, que pueden ser el nico tejido infectado.
Adems se suelen ver afectados los pulmones, el hgado, el bazo y las superficies de las
cavidades del cuerpo. Un granuloma tuberculoso suele presentar un aspecto amarillento
y consistencia caseosa, caseo-calcrea o calcificada. Los tejidos fijados de un tubrculo
no se extraen intactos con facilidad, como ocurre con algunos granulomas no
tuberculosos. El tamao de las lesiones vara, desde tan pequeas que pueden pasar
desapercibidas a simple vista, hasta ocupar gran parte de un rgano. El corte seriado de
rganos y tejidos resulta vital para detectar las lesiones contenidas en un tejido (31).

Figura 6. Localizacin anatmica de los ganglios bronquiales, mediastnicos y portales (de izquierda a derecha)
(32).

3.4.3. Epidemiologa
M. bovis es un microorganismo zoonsico y debe ser tratado como un microorganismo
del grupo III de riesgo/peligro, para evitar que se produzca infeccin en humanos.
Aunque se considera que el ganado vacuno es el verdadero hospedero de M. bovis, se
ha descrito la enfermedad en muchos animales domsticos y no domsticos. El
microorganismo se ha aislado en: bfalos, bisontes, ovejas, cabras, quidos, camellos,
palomas, cerdos, jabales, ciervos, antlopes, perros, gatos, zorras, visones, tejones,
hurones, ratas, primates, llamas, kudus, elands, tapires, alces, elefantes, sitatungas,
orixes, addaxes, rinocerontes, didlfidos, ardillas, nutrias, focas, liebres, topos,
mapaches, coyotes y varios depredadores felinos como leones, tigres, leopardos y linces
(31).
41

En pases desarrollados hasta el 40% de la tuberculosis pulmonar y meningitis en


humanos solan ser debidos a infeccin por ganado antes de los sesentas. Las razas
blancas europeas parecen haber adquirido una resistencia heredada, o inmunidad
cruzada debido a que entre 1750 y 1900 la mayora se infect con tuberculosis y en
algunos lugares slo una cuarta parte muri, en tanto las razas esquimales y negras son
ms susceptibles (33).
El Bacilo Calmette-Gurin (BCG) fue aislado de una cepa de M. bovis proveniente de
buey que mut inesperadamente y se convirti en una cepa no virulenta capaz de
proteger animales de las cepas desafo, por lo que en 1921 se convirti en la primera
vacuna anti-tuberculosa (34).
Actualmente las cepas de vacuna ms utilizadas son la BCG Pasteur, BCG Glaxo, BCG
Copenhagen y BCG Japn (35); en los pases en los que forma parte del programa
nacional de inmunizacin infantil, se administra a ms del 80% de los neonatos y
lactantes. Se ha documentado el efecto protector de la vacuna BCG contra la meningitis
tuberculosa y la tuberculosis diseminada en nios, sin embargo, no evita la infeccin
primaria y, lo que es ms importante, tampoco evita la reactivacin de la infeccin
pulmonar latente que es la principal fuente de propagacin del bacilo.
Debido a que la tuberculosis fue considerada por muchos aos como enfermedad de
pobres, en los pases denominados en vas de desarrollo o tercermundistas, como
Mxico, existen programas obligatorios de vacunacin que han reducido de manera
significativa la incidencia de tuberculosis, pero en pases industrializados como Estados
Unidos. A finales de los ochenta y principios de los noventa, Nueva York tuvo una
epidemia de tuberculosis que se triplic en quince aos (Figura 7), la incidencia de cepas
multirresistentes fue del 91%. Durante el mismo periodo y hasta 1987 en la ciudad de
Londres se tuvo un comportamiento similar (36).

42

Figura 7. ndices de tuberculosis en Londres () entre 1982 y 1987 comparados con los presentados en Nueva
York () entre 1972 y1994 (36).

Las estrategias existentes de control de tuberculosis no estn funcionando debido al


creciente nmero de casos de tuberculosis que se producen en paralelo con la pandemia
de VIH/SIDA y la aparicin de cepas multirresistentes de Mycobacterium. En 2012 de los
8.6 millones de casos de tuberculosis el 13% fueron pacientes con VIH, con los ndices
ms altos de coinfeccin en frica (5).
La mayor incidencia de tuberculosis se present en Asia y frica, donde las cifras van de
1 a ms de 5 habitantes por cada 1000, en Amrica la ms alta incidencia la tienen
Bolivia y Groenlandia con un estimado de 1 a 3 individuos por cada mil. La tendencia de
las diferentes regiones durante los ltimos veinte aos (Figura 8) demuestra que tanto en
Amrica como en las Islas del Pacfico ha habido una disminucin en el ndice de
incidencia, en tanto en Europa y frica se presentan las variaciones ms importantes (5),
por un lado, en Europa no se aplica la vacuna y en el caso de frica el acceso a los
servicios de salud y el VIH tienen una relacin directa con stas variaciones.

43

frica

Europa

Amrica

Medio Oriente

Sureste de Asia

Islas del Pacfico

Adaptacin (5)
Figura 8. Estimado de ndices de tuberculosis por regin de la OMS, 1990-2012. Tendencias regionales en casos de
incidencia de Tuberculosis (verde), e ndices estimados de coinfeccin VIH-TB (morado), las sombras representan
la incertidumbre.

3.4.4. Tcnicas de diagnstico de tuberculosis en animales


La tuberculina fue desarrollada por Robert Koch en 1890, pero la tcnica intradrmica
actualmente utilizada fue descrita en 1912 por Charles Mantoux y fue el primer mtodo de
deteccin de tuberculosis conocido y, hasta ahora, rutinariamente utilizado. La vieja
tuberculina era un concentrado estril de filtrados de cultivo del bacilo tuberculoso que
fue cultivado inicialmente en caldo de carne con glicerina. Actualmente se prepara un
producto denominado PPD-S, de acuerdo al mtodo descrito por Siebert (37).
La reaccin a la tuberculina inyectada intradrmicamente (Figura 9) es un ejemplo
clsico de hipersensibilidad celular retardada. Las clulas T sensibilizadas por una
infeccin previa se dirigen al sitio de la piel donde se suministr la tuberculina y liberan
linfocinas que inducen la vasodilatacin o edema y la llegada de otras clulas
inflamatorias (37).
A esta prueba se suelen usar varias pruebas diagnsticas sanguneas para confirmar o
negar los resultados de la prueba intradrmica. Las pruebas de proliferacin de
linfocitos y del interfern gamma corresponden a la inmunidad celular, mientras que el
enzimoinmunoensayo (ELISA) corresponde a la inmunidad humoral (31,37).

44

Figu
ra 9. Timbre postal alemn homenajeando el centenario del premio nobel de Robert Koch, pionero en los estudios
de tuberculosis y respuesta inmune a la aplicacin de la tuberculina. (38)

En la proliferacin de linfocitos compara la reactividad in vitro de los linfocitos de la


sangre perifrica a la tuberculina (PPD-B) y a una tuberculina de M. avium (PPD-A) que
aumentando la especificidad y sensibilidad de la prueba. El ensayo tiene valor cientfico,
pero no se emplea para diagnstico rutinario porque requiere tiempos de incubacin
largos y el uso de nucletidos radioactivos (31).
En la prueba de INF- se mide su liberacin en un sistema de cultivo de sangre completa.
El ensayo se basa en la liberacin de interfern gamma por linfocitos sensibilizados
durante un perodo de incubacin de 16-24 horas con antgeno especfico (tuberculina
PPD). La cuantificacin del interfern gamma se realiza por un ELISA que utiliza dos
anticuerpos monoclonales contra el interfern gamma bovino, la prueba posee una
sensibilidad elevada pero parece menos especfica en varios casos (31).
La sensibilidad de un ELISA comparativo, puede ser de hasta el 85%. Es posible obtener
mejores resultados utilizando diferentes antgenos, y esperando entre 2 y 8 semanas
despus de una prueba normal de tuberculina cutnea.

45

Figura 10. Proceso de preparacin de la tincin de Ziehl Neelsen.

M. bovis se puede detectar microscpicamente en frotis directos de muestras clnicas y


en materiales tisulares preparados con la tincin clsica de Ziehl-Neelsen (Figura 10),
aunque tambin puede utilizarse una tincin fluorescente de resistencia al cido o la de
inmunoperoxidasa.
El microorganismo se puede aislar en varios medios slidos con huevo como el de
Lowestein-Jensen (Figura 11), el medio base de Coletsos, el medio de Stonebrinks y
tambin se ha utilizado agar Middlebrook 7H10 7H11.

Figura 11. Colonias caractersticas de M. tuberculosis aislado por mtodo Petroff en medio de Cultivo LowesteinJensen (LJ) y Middlebrook 7H10).

Los cultivos se incuban durante 8 semanas a 37C con y sin CO 2. Los modelos
caractersticos de crecimiento y de morfologa de las colonias pueden suministrar un
diagnstico preliminar de M. bovis; con todo, cada aislamiento necesita confirmarse por

46

evaluacin bioqumica (niacina y nitrato) o con la sonda de ADN Gen Probe TB


complex. (31).
El diagnstico preliminar de micobacteriosis se puede hacer si el tejido muestra lesiones
histolgicas caractersticas: necrosis caseosa, mineralizacin, clulas epiteloides,
clulas gigantes multinucleadas y macrfagos similares a las mostradas en la Figura 12.
M. tuberculosis puede sensibilizar al ganado para la tuberculina bovina sin causar
lesiones tuberculosas, y a veces se puede aislar M. avium de lesiones del ganado bovino
similares a las de la tuberculosis; en tales casos se necesita una cuidadosa identificacin
y se debera excluir la posibilidad de una infeccin mixta con M. bovis (31).

Figura 12. Corte histolgico de granuloma tuberculoso con necrosis central rodeada de clulas epiteloides en
empalizada y clulas gigantes multinucleadas (39).

No existen diferencias clnicas evidentes entre la tuberculosis causada por M. bovis y M.


tuberculosis en humanos (7). Aunque la cantidad de pacientes en los que se encuentra
M. bovis es muy inferior a la cifra por M. tuberculosis, resulta ms letal el primero ya que
presenta ms resistencia a tratamientos con pyrazinamida (40).
La secuencia gentica completa del ADN de M. bovis de la Figura 13 fue descubierta
gracias a herramientas moleculares como los secuenciadores y los bancos genmicos
(41), que tambin permitieron establecer la relacin filogentica de las especies de
Mycobacterium (42) y los genes que confieren resistencia y virulencia a las distintas
cepas (43).

47

Figura 13. Genoma completo de M. bovis. (41)

La PCR, se ha evaluado ampliamente para la deteccin del complejo de M. tuberculosis


en muestras clnicas de pacientes humanos (9,10,31), el diagnstico de la tuberculosis en
tejidos frescos y secreciones de animales (11,12,13), y en algunos estudios relacionados
con anlisis directo en alimentos (8,14,15).
Se han utilizado varios cebadores, incluyendo los que amplifican secuencias del ARNr
16S-23S (11), de las secuencias de insercin IS6110 e IS1081 (13,44), y de los genes
que codifican las protenas especficas del complejo de M. tuberculosis, como la MPB 70
y el antgeno b de 38 kDa.
Se han analizado los productos amplificados por hibridacin con sondas o por
electroforesis en gel. Las preparaciones comerciales y los procedimientos rutinarios han
mostrado resultados variables y poco satisfactorios en comparaciones entre laboratorios
con tejidos frescos, congelados o conservados en cido brico (45).
La PCR se utiliza para detectar el grupo M. tuberculosis y distinguirlo de M. avium en
tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina. Los mejores resultados se obtienen

48

cuando se emplean tanto la PCR como los mtodos de aislamiento. Para diferenciar M.
bovis de otros miembros del complejo de M. tuberculosis, las tcnicas de anlisis de ADN
pueden ser ms rpidas y fiables que los mtodos bioqumicos (31).

3.5. La doble hlice


Los compuestos fosfatados contenidos en el ncleo fueron denominados originalmente
nuclena, posteriormente cromatina, y finalmente se demostr que estaban constituidos
por cido desoxirribonucleico (ADN) y protenas. A pesar de que haba motivos
suficientes para creer que el ADN era el material gentico, haba ms razones para darle
el rol de protenas debido a que cada molcula era representada como un polmero con
cuatro unidades denominadas nucletidos, en cambio, las protenas estaban constituidas
por veinte aminocidos, y se crea que era ms posible que tuvieran la funcin gentica
(46).
El 25 de abril de 1953 fue publicado el descubrimiento de la estructura de la doble hlice
del ADN, hecho por Francis Crick y James Watson, usando datos de Rosalind Franklin de
difraccin de rayos X sobre fibras de ADN.

Figura 14. Composicin qumica de la doble hlice, enlaces, purinas, pirimidinas, uniones de los pares de bases y
conformacin espacial de la desoxirribosa (47).

La doble hlice consiste en dos esqueletos helicoidales de azcar-fosfato entrelazados,


con bases heterocclicas de ADN proyectndose hacia el interior de cada una de las

49

cadenas, las dos cadenas son antiparalelas y se relacionan mediante un eje de simetra
doble perpendicular al eje de la doble hlice (Figura 14).
Los nucletidos se ordenan en pares purina-pirimidina, adenina con timina y guanina con
citocina, unidos por enlaces de hidrgeno. Los nmeros 3 y 5 terminales de cada cadena
son los nmeros asignados a los tomos de carbono en la desoxirribosa

3.5.1. Replicacin del cido desoxirribonucleico (ADN) in vivo.


A diferencia del ADN eucariota, en el procariota existe como un molcula circular nica
inmersa en el citoplasma de la bacteria, las bases nitrogenadas son lneas cortas que
unen a las cadenas externa e interna. Las dos cadenas mantienen una relacin de
complementariedad mutua, cuando ambas cadenas se separan durante la replicacin del
ADN, cada una puede ser utilizada como molde para construir un duplicado de la primera
cadena que la acompaaba (46).
En 1968 Okazaki y colaboradores publicaron que no exista evidencia de un mecanismo
enzimtico para la sntesis de los desoxipolinuclotidos en direccin 3 a 5 y propusieron
que haba una sntesis discontinua de DNA en la cadena que estaba en esa cadena en
direccin 5 a 3, que despus eran conectados con enlaces fosfodiester por una enzima
que denominaron ligasa. La idea de los fragmentos tambin fue sugerida por Kornberg.
(48).
La replicacin del ADN in vivo requiere de muchas enzimas (Figura 15). Las AND
helicasas fueron descubiertas en 1976 y son una clase de enzimas que participan de
manera integral durante la reparacin, recombinacin y transcripcin del ADN. Estos
procesos requieren la formacin de intermediarios en los que la doble hlice es
desenrollada y se convierte parcialmente en una sola cadena (ssDNA) (49).
Las enzimas copian ADN simultneamente en cientos de sitios denominados origen de
replicacin. La replicacin de la cadena lder la lleva a cabo la Polimerasa I, a partir de un
solo origen de replicacin, la cadena rezagada la inicia una primasa (tetrapolmero de

50

ARN polimerasa y ADN polimerasa ) que sintetiza los iniciadores y pequeos


fragmentos de ADN que son extendidos por la Polimerasa en series de fragmentos de
Okazaki. En la cadena lder la polimerasa es desplazada por la accin combinada del
factor C (RFC), el antgeno de proliferacin celular nuclear y la Polimerasa I. Los
iniciadores son eliminados

y los fragmentos de Okazaki unidos por accin de las

nucleasas (FEN1 y ADN2) (49).

51

Figura 15. Replicacin de ADN in vivo. Principales enzimas que participan en el proceso (50).

52

En la Figura 16 se representan las principales protenas presentes en una replicacin


tpica, stas incluyen: las protenas de mantenimiento del minicromosoma (MCM) que
contienen seis homo subunidades y son helicasas tiles en la apertura de la doble
cadena, las lneas negras representan la muestra de maternal gentico, y las rosas
representan el nuevo ADN sintetizado, las rosas claras son los iniciadores (49).

Figura 16. Enzimas y reacciones en la horquilla de replicacin. Primer (iniciador), leading strand (cadena lder),
lagging strand (cadena rezagada), primase (primasa), helicase (helicasa) (49)

La RPA es una protena de unin a la cadena sencilla de ADN (ssDNA) que protege al
ADN de la muestra del dao de las nucleasas; la primasa (un complejo de polimerasa
ARN y Pol ) sintetiza los iniciadores de ARN y las cadenas cortas de inicio de los
fragmentos de Okazaki; la polimerasa es responsable de sintetizar la mayor parte de
los fragmentos de Okazaki; la Polimerasa , se encarga de la sntesis de la cadena lder;
la PCNA, es el sitio de unin del ADN para que la polimerasa lleve a cabo el proceso de
sntesis y unin de los fragmentos de Okazaki; la RFC es el sitio de carga de unin para
la PCNA sobre la cadena de ADN doble; las nucleasas, incluyendo a ARNasa H, DNA2 y
FEN1 que sirven para la remocin de iniciadores; y la DNA Lig 1 une los fragmentos de
Okazaki en la cadena secundaria (49).

3.5.2. Amplificacin del ADN in vitro (PCR)


En la dcada de los setenta hubo muchos descubrimientos que revolucionaron la biologa
molecular: la clonacin de genes en plsmidos y fagos, las tcnicas de hibridacin en
53

filtro para ADN y ARN conocidas como Suthern y Northern Blot, las invenciones de las
tcnicas de secuenciacin qumica y enzimtica para el ADN y finalmente la tcnica que
permiti la amplificacin de grandes cantidades de ADN sin necesidad de clonacin, la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), considerada la ms revolucionaria de finales
del siglo XX (51).
La PCR fue desarrollada en 1983 por el bioqumico americano Kari Mullis, quien recibi el
premio Nobel y el premio de Japn por desarrollar la PCR en 1993, pero el principio de
replicacin de ADN utilizando dos iniciadores haba sido previamente descrito por Gobind
Khorana en 1971 (52).
Como su nombre lo indica el principio bsico de la PCR, es una reaccin en cadena con
la que se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia
predeterminada dentro de una mezcla de ADN, de la cual la secuencia de inters
representa tan slo una diezmillonsima parte. La duplicacin se obtiene mediante la
polimerasa, que es capaz de unir nucletidos para formar largas cadenas, para ello la
polimerasa requiere de los cuatro desoxinucletidos (A, T, G y C) y un pequeo
fragmento conocido como iniciador, que se une a la cadena molde permitiendo la adicin
de nucletidos para construir la nueva cadena (52,51).
El producto de la PCR puede ser digerido con enzimas de restriccin, secuenciado o
clonado. En el experimento de Mullis

la doble hlice se separ en dos cadenas

individuales calentando a 96 C, pero a esta temperatura la polimerasa de la E. coli fue


destruida, por lo que se suministr enzima despus del calentamiento de cada ciclo, lo
que implicaba un proceso lento y la utilizacin de grandes cantidades de enzima. (52).
Esta situacin fue resuelta con el uso de la Taq, polimerasa, previamente aislada en 1976
por Chien y colaboradores, purificada de una bacteria extremotermfila denominada
Thermus aquaticus, descrita como una enzima cuya temperatura ptima era de 80 C,
libre de actividad enzimtica de fosfomonoesterasa, fosfodiesterasa y exonucleasa para
cadenas sencilla. En los primeros experimentos, la enzima se activ con ADN de timo de
54

ternera, un catin divalente de Magnesio (Mg2+) como cofactor, y el pH 8 result ser el


ptimo (53).

Figura 17. Habitat natural de la bacteria Thermus aquaticus a partir de la cual se obtiene la Taq polimerasa (54).

3.6. Estandarizacin de la tcnica de PCR


El ADN fue aislado por primera vez por Friedrich Miescher cuando era estudiante en la
Universidad de Tbingen en Alemania. Actualmente existen muchos mtodos para el
aislamiento del ADN genmico y juegos de reactivos comerciales. La gran ventaja de la
PCR es que puede funcionar con pequeos fragmentos de tejidos, bacterias, virus y otros
parsitos, pero irnicamente su sensibilidad puede resultar contraproducente si no se es
meticuloso, ya que una muestra contaminada con ADN de una corrida previa puede
provocar resultados falsos.
La estandarizacin de la tcnica involucra cuatro pasos: a) rompimiento celular, b)
extraccin y purificacin, c) determinacin de pureza y cuantificacin y d) amplificacin de
los fragmentos blanco.

55

3.6.1. Lisis celular


El aislamiento del ADN puede representar dificultades dependiendo de la fuente de la que
se obtenga; las paredes celulares, por ejemplo, requieren tratamientos especiales debido
a su compleja estructura, adems de otros componentes en los que puede estar inmersa
la muestra. El propsito de este paso, particularmente para las bacterias gram positivas y
micobacterias, es el rompimiento de la pared celular y membrana celular. Esto se logra
con una combinacin adecuada de enzimas como la lisozima o proteinasa K y
detergentes como el Sulfato Dodecil Sdico (SDS) que rompen las membranas. Tambin
se utilizan rompimientos alcalinos con Hidrxido de Sodio. Es importante realizarlo de
manera rpida para evitar la degradacin del ADN.
En cuanto a la integridad del material gentico, es importante mencionar que los
fragmentos de ADN muy largos son ms frgiles y pueden ser cortados en pequeos
fragmentos o degradados por estrs hidrodinmico o por accin de las ADNasas, esto se
puede evitar no agitando o pipeteando la muestra en repetidas ocasiones, hay
micropipetas con orificios ms grandes que permiten disminuir el dao.
Las ADNasas liberadas de las clulas lisadas son inactivadas por la desnaturalizacin de
las protenas en el procedimiento del ADN, pero pueden ser accidentalmente introducidas
con ARNasa, por ello se recomienda utilizar reactivos grado Biologa Molecular
certificados como libres de ADNasas.

3.6.2. Extraccin y purificacin


La tcnica ms comn de extraccin involucra la desnaturalizacin y extraccin en una
fase orgnica con fenol:cloroformo, doblemente peligrosa, debido a que, por un lado, el
fenol causa quemaduras severas y el cloroformo es carcinognico, adems de resultar
caro debido a la disposicin de residuos txicos.
Existen

tambin

combinaciones

fenol:cloroformo:alcohol

isoamlico

(u

octanol),

cloroformo:alcohol isoamlico (u octanol). Despus de la centrifugacin, y en caso de

56

utilizar fenol, ste estar en la parte inferior y la mezcla cloroformo: alcohol formar parte
de la seccin intermedia, sta combinacin es la fase con mayor afinidad a las protenas
y polisacridos que quedarn atrapados en una nube blanquecina. La fase acuosa
superior contendr el material gentico.
Las paredes celulares de las micobacterias contienen mucho ms polisacridos que los
tejidos animales o que las bacterias Gram negativas. Si no se eliminan los polisacridos,
stos pueden interferir con la reaccin enzimtica de la polimerasa.
La ultrafiltracin por gradiente de densidad con CsCl es un excelente medio de
purificacin, pero el equipamiento resulta sumamente caro y el tiempo que se requiere
para la centrifugacin es extenso.

3.6.4. Determinacin de pureza y concentracin.


La concentracin de ADN se encuentra midiendo la absorbancia de la muestra a 260 nm
del espectrofotmetro. Las bases nitrogenadas absorben la luz a esta longitud de onda,
pero este proceso no se puede hacer en vidrio, ni plstico por lo que se utilizan cubetas
de cuarzo que no absorben la luz en esta longitud de onda. Se puede utilizar el
espectrofotmetro para UV con cubetas de cuarzo o tambin un equipo especializado
llamado NanoDrop que no requiere cubetas y slo utiliza una pequea cantidad de
muestra (1-3l), adems hace el clculo de concentracin de manera automtica con
base en la Ley de Beer (55).
Debido a que los nucletidos, ARN, ssADN y dsADN absorben a 260 nm, ellos
contribuyen a la absorbancia total de la muestra, para asegurar la precisin en los
resultados del NanoDropTM

las muestras de cidos nuclicos requieren purificacin

previa a la lectura (55).


La relacin de absorbancia a 260 nm y 280 nm es utilizada para evaluar la pureza del
ADN. Cuando la relacin es

1.8

se considera que la muestra de ADN es pura. La

57

relacin para cada nucletido de manera independiente es: Guanina

4.50 , Citocina

1.51 y Timina

1.15 , Adenina

1.47 . El cociente final es el promedio de los

cuatro nucletidos presentes, tambin es importante considerar que depende de la


composicin del cido nuclico. Si la relacin es ms baja, puede indicar la presencia de
protenas, fenol u otros contaminantes que absorben cerca de 280nm. Cabe mencionar
que los resultados pueden verse afectados por pequeos cambios en el pH de la
solucin, la acidez disminuye la relacin de 0.2 a 0.3, en tanto alcalinidad la aumenta en
la misma proporcin (55).

Figura 18. Espectro tpico del ADN en cuantificado en el Nanodrop (55).

La purificacin del ADN para PCR tolera cierta cantidad de contaminantes, siempre y
cuando no inhiban la accin de la ADN polimerasa. El EDTA, los carbohidratos y el fenol
absorben a 230 nm. En la Figura 18 se muestra un barrido tpico de NanoDrop para el
ADN puro y en la Figura 19 una meustra con EDTA.

58

Figura 19. Espectro de muestra de ADN con alto contenido de EDTA (55).

3.6.5. Amplificacin de los fragmentos de ADN blanco a partir de la cadena


molde.
La tcnica de PCR incluye tres pasos: desnaturalizacin, acoplamiento y extensin.
Cuando se utiliza ADN genmico se agrega una etapa previa de desnaturalizacin a 94
C por un periodo de 5 min, para facilitar la separacin del material gentico, despus de
este paso se repiten ciclos completos. El sustrato de la polimerasa es una cadena
sencilla de ADN (ssDNA) que sirve como molde para la sntesis de su nueva cadena
complementaria. La separacin de la doble cadena se logra con un calentamiento a 94
C, denominado desnaturalizacin (Figura 20). Si la muestra tiene alto contenido de
G+C se recomienda aumentar el tiempo, pero se debe tomar en cuenta que la actividad
de la polimerasa disminuye a partir de los 95 C.

Figura 20. Desnaturalizacin de ADN de dsADN a ssADN (51).

59

Despus cada una de las cadenas se utiliza para crear nuevas copias. La fase de
acoplamiento o hibridacin (Figura 21) ocurre a temperaturas ms bajas (50-60 grados
centgrados), ello permite la unin de los iniciadores con su cadena complementaria. La
enzima ADN polimerasa necesita un grupo OH libre en el extremo 3 del cebador
apareado para poder iniciar la sntesis (51).

Figura 21. Hibridacin de los iniciadores en la cadena molde (51).

La extensin (Figura 22) de la cadena por la Taq polimerasa ocurre a aproximadamente


72 C durante 2-3 minutos. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) produce miles
de copias de la secuencia de ADN de inters en un microtubo. La amplificacin ocurre
en un dispositivo automatizado denominado termociclador que controla la temperatura
clave para la reaccin. El nmero de fragmentos de ADN se duplica en cada ciclo de PCR
de tal modo que con slo 20 ciclos cada cadena dar origen a ms de un milln de copias
del fragmento (220) (52).

Figura 22. Extensin de la cadena de ADN a partir de los iniciadores (51).

60

3.7. PCR Multiplex


La PCR multiplex es una variante de la PCR con dos o ms secuencias blanco
amplificadas

simultneamente

durante

la

misma

reaccin.

Ha

sido

utilizada

satisfactoriamente en muchas pruebas, incluyendo el diagnstico de enfermedades


infecciosas. La BCG es gentica y fenotpicamente similar a otras cepas de M. bovis y
otras especies del complejo M. tuberculosis. Mahairas y sus colegas utilizaron
hibridizacin genmica sustractiva para identificar las diferencias entre cepas virulentas
de M. bovis y cepas del complejo tuberculoso. Debido a que la regin RD1 es un
marcador potencial para BCG Talbot y colaboradores (56) desarrollaron la PCR Multiplex
cuya seccin blanco era la regin RD1 incluyendo los iniciadores:
ET1, 59-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-39;
ET2, 59-CTGGCTATATTCCTGGGCCCGG-39;
ET3, 59-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-39.
Los cebadores ET2 y ET3 dan un producto de 150pb ET1 y ET3 dan como producto un
fragmento de 200pb, esto se puede observar en la Figura 23. El ADN de las cepas
silvestres del complejo M. tuberculosis est representado por lneas paralelas en la parte
superior del diagrama, la regin sombreada contiene 9.5 kp de la secuencia RD1.

ADN de cepas
silvestres

ADN de cepa
BCG M. bovis

Figura 23. Diseo de PCR Multiplex . (56).

61

La regin RD1 est eliminada en el ADN de la cepa BCG M. bovis y est representada
por lneas punteadas en el diagrama. Los iniciadores ET1, ET2 y ET3 se muestran con
flechas orientadas hacia la regin de amplificacin (56).

Figura 24. Gel de Agarosa al 3%, secuencias con tamaos de 150 pb para las cepas silvestres y 200pb para las
cepas vacunales tanto francesa como rusa. (56)

En la Figura 24 se observa la regin RD1 del las cepas silvestres del complejo
tuberculosis cuyo producto es de 150pb en tanto se observa un producto de 200pb en el
caso de las cepas vacunales.

62

IV. METODOLOGA
4.1. Tratamiento del queso
Se adapt la metodologa descrita previamente (57,58), haciendo varias pruebas con
distintos tiempos de incubacin, volumen, velocidad de sedimentacin en una
megacentrfuga (Figura 25) con tubos para de 45 mL de capacidad, como se muestra en
la Tabla 1. Las concentraciones del citrato y digestor fueron las utilizadas por Harris y
otros (57)
Tabla 1. SERIE A de ensayos para estandarizacin de tratamiento de queso de aro obtenido
en el tianguis del centro de Tecmac.
Tx

Relacin
en

(g/mL)

tiempo

p/v
y
de

Velocidad
tiempo

Observaciones

de

sedimentacin

incubacin
A

1:5 30

8 000 xg 10

En citrato y bao mara a 37 C.

1:5 30

8 000 xg 10

En digestor alcalino y bao mara a 37 C.

1:5 15

8000 xg 30

En citrato 50% y digestor alcalino 50% y bao


mara a 37 C, resuspendido en 20 mL de citrato

1:1 60

1:5 30

1000 xg 10

durante 15.
En solucin salina, citrato, y digestor alcalino y

2500 xg 5

bao mara a 37 C, se resuspendi la pastilla en

3000xg 5

20 mL de Citrato las dos veces posteriores para

2500 xg 5

su subsecuente centrifugacin.
En digestor alcalino y citrato y bao mara a 37

3000 xg 5

C, resuspendido en 20mL de citrato para

1:10 60

2739 xg 10

posterior centrifugacin
En digestor y bao mara a 37 C.

1:10 30

10 mL
2739 xg 10

Adicionado con TE no eliminado


Queso de aro centro B con digestor.

1:10 30

2739 xg 10

Queso de aro centro con digestor

63

Los tiempos de incubacin dependieron de la digestin de la muestra, se tom como


parmetro la transformacin del estado slido al estado lquido, mientras que los
volmenes variaron dependiendo de la facilidad del manejo de la muestra.

Figura 25. Megacentrfuga Thermo Scientific modelo Megafuge 40 y rotor utilizados durante el tratamiento de
queso para el aislamiento de bacterias.

Para la segunda serie de experimentos se modificaron los reactivos de tratamiento del


queso, los volmenes de trabajo y el tipo de queso (Tabla 2). Los cambios de tratamiento
se basaron en la visualizacin de la precipitacin del ADN y el corrimiento en gel de
agarosa.
Tabla 2. SERIE B de ensayos para estandarizacin de tratamiento de queso.
Tx

Relacin p/v en

Observaciones

g/mL y tiempo
J-P*

de incubacin
1:5 30

Queso Panela en citrato de sodio y proteinasa K

1:5 30

Queso de aro obtenido en el tianguis del centro de

A-2

1:5 6 hrs

Tecmac en solucin de citrato.


Queso de aro obtenido en el tianguis del centro de

B-2

1:5 6hrs

Tecmac en solucin de citrato.


Queso de aro obtenido en el tianguis del centro de
Tecmac en digestor alcalino neutralizado con PBS con
dos repeticiones, la pastilla se resuspendio en 20 mL de

C-2

1:2 12 hrs

PBS
Queso panela en citrato, no digerido completamente del

D-2

1:2 12 hrs

que se utiliz fase lquida.


Queso panela en solucin de citrato, no digerido

64

completamente, se utiliz fase lquida.

Para la SERIE C de experimentos se utiliz un agitador magntico con control de


temperatur (Figura 26), se disolvi la muestra en un matraz y se someti a calentamiento
a 37 C, homogenizando la muestra y eliminando grasa por diferencia de densidad a
11000 xg durante 10 min en la megacentrfuga (Tabla 3), el proceso fue repetido hasta
que la solucin se tornaba ligeramente transparente.

Tabla 3. SERIE C de ensayos para tratamiento de queso ranchero obtenido en el tianguis de


Sierra Hermosa.
Tx

Relacin

p/v

en

Observaciones

g/mL

L de Mycobacterium bovis cepa BCG-1.

1:5

Adicionado con 100

2:5

Un solo tratamiento

2:5

Se resuspendi tres veces en citrato y elimin en cada ocasin el

1
2
3

sobrenadante.
2:5

Se resuspendi diez veces en citrato y elimin en cada ocasin el


sobrenadante.

Figura 26. Agitador magntico con control de temperatura utilizado para digerir el queso en matraz de 50 mL con
solucin de citrato.

Para la SERIE D de experimentos se modificaron las condiciones de purificacin y se


consideraron en esta serie, tanto la muestra problema como todas las cepas puras de M.
65

bovis. La cepa etiquetada como BCG-1 fue donada el Centro de Salud de Tecmac, la
BCG-2 por SENASA-SENASICA de Tecmac, y la cepa AN5 se adquir en PRONABIVE
en forma de PPD-bovino para diez dosis. Las muestras fueron sometidas a purificacin
directa, y se inocul la cepa BCG-1 en queso para ser utilizada testigo.
Tabla 4. SERIE D, tratamiento para la muestra problema
Tx

Relacin de g de queso
en

/mL

de

solucin

Observaciones

de

citrato.

2:5

Queso

ranchero,

eliminacin

de

Sierra

grasa

Hermosa

con,

clarificacin

por

centrifugacin. Repeticin del proceso diez


veces.
Tabla 5. Cepas puras utilizadas durante la experimentacin
BCG-1

100 L de la vacuna

Vial liofilizado de cepa vacunal BCG-Tokio diez dosis,


donado por el centro de salud de Tecmac.

BCG-2

100 L de medio

Vial de cepa inactivada en medio lquido BCGPasteur donada por SENASA.

AN5

100 L de solucin

Vial de cepa inactivada y purificada como PPD


bovino de diez dosis marca BIVE utilizado para
prueba de tuberculina.

4.2. Lisis celular


Se hizo una lisis alcalina modificando las cantidades de buffers y concentraciones de
SDS como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6. Tratamientos de Lisis y tratamientos de queso para aislamiento de bacterias.
Lisis Alcalina 1
GTE

Lisis Alcalina 2 (1hr a 37 C)


GTE

NaOH 0.2 N

NaOH 0.2 N

SDS1%

SDS1%

66

Acetato de Potasio 5M

Proteinasa K

cido actico glacial

Acetato de Potasio 5M

Lisis Alcalina 10
GTE

cido actico glacial


Lisis Alcalina 12 (1hr a 37 C)
GTE

NaOH 0.2 N

NaOH 0.2 N

SDS10%

SDS10%

Acetato de Potasio 5M

Proteinasa K 1hr

cido actico glacial


Lisis Alcalina 13 8hrs a 37 C
TE

Tratamientos de queso
Citrato: Tricitrato de sodio al 2%

NaOH 0.2 N

Digestor alcalino: Tricitrato de sodio 0.05 M

SDS10%

Hidrxido de Sodio: 0.5% p/v

Proteinasa K

Los tratamientos se realizaron adicionando soluciones de lisis adicionadas al sedimento


obtenido de las muestras de queso en el tubo de 45 mL, con excepcin de los
experimentos A y K cuyos tratamientos de lisis fueron hechos en tubos de polipropileno
de 2 mL. Posterior a la lisis se transfiri el contenido de los tubos de 45 a tubos de 2 mL
para su posterior centrifugacin en una microcentrfuga Hemle Z23MK-2 (Figura 27) a 18
000 xg durante 10 minutos a 4 C; despus de la centrifugacin se recuper 1 mL de
sobrenadante en cada tubo nuevo para subsecuentemente purificarlo.

67

Figura 27. Microcentrfuga Hemle Z23MK-2 con control de temperatura y velocidad de centrifugacin en
gravedades y rpm.

El volumen de los tratamientos de lisis se modific de acuerdo a la cantidad de ADN


recuperado y la cantidad de la muestra. Se verific la extraccin material gentico por
electroforesis con gel de agarosa al (1% y 2%).
Tabla 7. Extraccin por lisis alcalina en microcentrfuga
Tx

Lisis a 22 mil

Tx

Lisis a 18 mil xg 10

Tx

Lisis a 18 mil

xg 10
LISIS

LISIS ALCALINA 2 con 5 L

-2

xg 10
LISIS

ALCALINA 1
B

LISIS

de proteinasa K por 1hr


K

ALCALINA 1

LISIS ALCALINA 2 con 5 L

ALCALINA 13
-3

de proteinasa K por 1hr

LISIS
ALCALINA 13

LISIS

A-2

LISIS ALCALINA 10

LISIS

ALCALINA
LISIS

B-2

LISIS ALCALINA 10

C-2

LISIS ALCALINA 10

AN5

NO LISIS

D-2

LISIS ALCALINA 10

BCG-

LISIS

ALCALINA 13

ALCALINA 13

ALCALINA 1
E

LISIS
ALCALINA 1

LISIS
ALCALINA 1

68

LISIS

ALCALINA 1
H

LISIS

L de proteinasa K
-1

ALCALINA 1
I

LISIS ALCALINA 12 con 50

LISIS

BCG-

ALCALINA 1

LISIS ALCALINA 12 con 50

BCG-

LISIS

L de proteinasa K

ALCALINA 13

LISIS ALCALINA 12

4.3. Purificacin de ADN


Se hicieron pruebas de purificacin de ADN con combinaciones Fenol:Cloroformo,
Fenol:Cloroformo:Octanol, Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamlico y Cloroformo:Octanol, y
precipitacin con Etanol y Metanol. Se modific la cantidad de lavados, verificando la
pureza del ADN por barrido espectrofotomtrico a 230, 260 y 280 nm y la integridad a esa
misma longitud de onda con los equipos mostrados en la Figura 28 (NanoDrop y
Jenway).
Para la SERIE A de tratamientos (Tabla 1) la eliminacin de protenas se hizo con
Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamlico (25:24:1), y la precipitacin se hizo con Etanol al
100%, en tanto para la SERIE B (Tabla 2) se eliminaron las protenas con
Fenol:Cloroformo:Octanol (25:24:1) y se precipit el ADN con Metanol al 100%. Se dej
actuar durante 10 a -20 C para su posterior centrifugacin.

Figura 28. Espectrofotmetros NanoDrop 1000 Thermoscientific y Jenway 6715 uv/vis con cubetas de cuarzo,
utilizado para la determinacin de pureza de ADN mediante la tcnica de barrido.

69

La SERIE A (Tabla 1) se centrifug a 22 000 x g 18 000 xg durante 10, en las SERIES


B y C (Tabla 2 y Tabla 3) se disminuy la velocidad de sedimentacin a 9000 xg en los
ensayos A-1, B-1, C-1, D-1 y , durante 5 a 4 C. Para la SERIE D (Tabla 4) se
centrifug a 18, 000 xg.
El almacenamiento de las muestras de ADN se hizo inicialmente en amortiguador TE,
pero en los experimentos posteriores a A-1 se hicieron con agua bidestilada debido a que
el amortiguador causaba interferencia en las lecturas del espectrofotmetro.

4.4. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)


Para la amplificacin se utilizaron iniciadores de la regin RD1 (ET1, ET2 y ET3)
previamente probados para deteccin de M. bovis. Se calcul la temperatura de
acoplamiento de los oligonucletidos con la frmula:
Tm= 2(A+T)+4(G+C)-5
Como resultado se determinaron las temperaturas de acoplamiento (ET1:59 C, ET2: 52
C y ET3: 77 C). Para las cepas BCG se utilizaron los iniciadores ET1 y ET3, para la
cepa AN5 se utilizaron el ET2 y ET3, al ADN de un queso testigo se le adicionaron los
tres oligonucletidos. La cepa utilizada como testigo para el tratamiento del queso fue la
BCG-1.
Se hicieron duplicados de muestras para la amplificacin. Una de las muestras se corri
con Hot Start Taq Master Mix y la otra con Taq master Mix de QIAGEN.
Los tubos para PCR con dos iniciadores se prepararon con 12.5 L de Master Mix, 2.5 L
de cada iniciador, 5 L de AN5, BCG-2, BCG-1 o, ALFA y 2.5 L de Agua grado Biologa
molecular libre de ADNasas y ARNasas. En el caso del experimento GAMMA se
adicionaron 2 L de cada uno de los tres iniciadores y 1.5 L de agua destilada
nicamente.
Para su corrimiento el termociclador Techne TC-300X (Figura 29) se program de la
siguiente manera:
70

La desnaturalizacin inicial se llev a cabo a 95 C por 5, y la desnaturalizacin de cada


ciclo a la misma temperatura pero por 30, el acoplamiento de los iniciadores se
program en forma decreciente: 77 C por 30, 59 C por 30 y a 52 C por 30, la
polimerizacin se program a 72 C por 1 y el ciclo final se prolong por 5 a 72 C.

Figura 29. Termociclador TECHNE modelo TC-312, empleado para la amplificacin de ADN.

4.4. Electroforesis
Se prepararon 40 mL de gel de agarosa al 1, 1.5, 2, 3 y 5 % en solucin amortiguadora
TBE 1X. Se cargaron 5 L de muestra, y 3 L de buffer de carga con azul de bromofenol
en la cmara de electroforesis horizontal Class II Continental de Lab Products Inc,
modelo 75:710. Se corri a distintos voltajes, de manera continua a 100, 80 y 60 volts y
por pulsaciones a 100v durante 10 min, 60 voltios 90 min y alternando voltajes de
100volts 10 min y 60 volts 10 min en tres ocasiones. Una vez terminado el corrimiento, se
observaron los geles a travs del transiluminador.

71

Figura 30. Vista area de cmara electroforesis Class II Continental de Lab Products Inc con gel de agarosa y
muestras teidas azul de bromofenol de corrimiento y escalera molecular del fago phi utilizada para determinar la
integridad y tamao de los fragmentos de ADN de las muestras tanto purificadas como amplificadas.

Figura 31. Fuente de Power Station 300 de Labnet International Inc. Utilizada para la electroforesis y
transiluminador utilizado para la lectura del gel de agarosa con bromuro de etidio como agente revelador de la
presencia de ADN.

72

V. ANLISIS DE RESULTADOS
5.1. Tratamiento de Queso
En la SERIE A se lograron altas concentraciones de ADN, no obstante, la integridad y
pureza se vieron afectadas por la alta alcalinidad del hidrxido de sodio y la adicin de
acetato de sodio. En la SERIE B se utiliz citrato de sodio en la mayora de los
experimentos, nicamente el experimento B-2 fue tratado con digestor alcalino utilizando
PBS como neutralizador, lo que disminuy ligeramente las concentraciones, en
comparacin con el tratamiento de la SERIE A; sin embargo, el anlisis de pureza
indicaba que existan elementos ledos a 230 nm que alcanzaban valores superiores a las
lecturas a 260 nm. Para determinar qu compuestos afectaban la pureza, se hizo una
lectura con el espectrofotmetro tomando muestras de toda la secuencia del tratamiento
de purificacin de ADN.

Figura 32. Barrido espectrofotomtrico de la solucin queso en citrato de sodio sometida a calentamiento (A), y
misma muestra leda despus de centrifugacin y eliminacin de sobrenadante (B).

En la Figura 33 A se puede observar una elevada cantidad de protenas y aminocidos,


por ello la lectura a 230 nm y 260 nm muestra valores muy elevados, por encima del
lmite de deteccin que es 3.000 , tanto protenas, como aminocidos y lpidos
disminuyeron gracias a los mtodos de separacin que mejoraron con el calentamiento,
la agitacin magntica y la repeticin de centrifugaciones, en la Figura 33 B se puede ver
que las concentraciones a las longitudes de onda en cuestin disminuyeron de tal forma
que ya se encontraban dentro del rango de la lectura del espectrofotmetro.
73

Inicialmente la falta de pureza de ADN se atribuy a la cantidad de sales contenidas en el


queso y a compuestos fenlicos, por ello se modific el procedimiento de tratamiento
para centrifugacin y la purificacin, los lavados de la SERIE C permitieron eliminar las
sales excedentes y disminuir los tiempos de tratamiento de queso.
En el experimento -1 se prob la purificacin con cloroformo:octanol nicamente, con
ello se descart que las altas concentraciones ledas a 230 nm se debieran a altos
contenidos de fenol, posterior al monitoreo de las muestras durante las distintas fases de
tratamiento se determin que la presencia de aminocidos aromticos contenidos en la
casena eran la causa de dichas lecturas. Como se muestra en la Figura 14 el espectro
de los aminocidos aromticos tiene valores ms altos a 230 nm, explicando el motivo
por el que la relacin de pureza de de ADN tenia valores inferiores a la unidad.

Figura 33. Barrido espectral de las curvas mostradas por aminocidos aromticos: triptfano (azul), tirosina (rosa)
y fenilalanina (verde).

Para eliminar los aminocidos se propuso una doble purificacin, inicialmente se duplic
el volumen de TE para evitar facilitar la separacin de los compuestos fenlicos y
protenas durante la transferencia de sobrenadante con ADN. La primera purificacin se
hizo con Fenol:Cloroformo y la segunda con Cloroformo:Octanol; esta combinacin
tambin hizo posible disminuir el dao al ADN y obtener fragmentos ms largos.

74

5.2. Purificacin

Figura 34. Barrido espectrofotomtrico de la composicin de la muestra con lisis alcalina y Proteinasa K (A) y la
muestra de impurezas atrapadas en cloroformo (B).

Al utilizar proteinasa K para la lisis se encontr que se elevaban los valores a 280nm,
esto debido a que es una enzima. El tratamiento de purificacin de la SERIE D y la
inactivacin de la proteinasa K por calor a 60 C durante 10 min resultaron satisfactorias
debido a que disminuyeron de manera importante las concentraciones tanto a 230nm
como a 280 nm.

SERIE A

SERIE B

SERIE C

SERIE D

Figura 35. Espectros caractersticos de las muestras purificadas ledas tipo durante las distintas series de
experimentos.

En la Figura 36 se muestran patrones tpicos de espectros obtenidos en las distintas


series de experimentos. La SERIE A muestra una concentracin muy elevada de
compuestos a 230 nm, que redujo durante la SERIE B. Para el caso de la SERIE C los
valores mostrados en la figura reflejan una menor cantidad de ADN presente en la
75

muestra, pero al mismo tiempo empieza a aumentar la relacin 260/230. Finalmente en la


SERIE D se observan cantidades superiores de ADN en comparacin a los aminocidos
y protenas.
Tabla 8. Resultados de concentracin y purificacin obtenidos en el NanoDrop.
Tx

Concentracin

Relacin 260/280

Relacin 260/230

A-2

de ADN ng/l
1160

1.57

0.74

B-2

864

1.41

0.56

AN5

816
11.51

1.53
1.20

0.53
0.40

El tratamiento con lisis alcalina admiti la extraccin de grades cantidades de material


gentico como se observa en la Tabla 6, pero la relacin de pureza indicaba la presencia
de contaminantes que estaban en el rango de los 230nm, por otro lado, la concentracin
de la muestra de la cepa AN5 era muy pequea, y posiblemente ese fue el motivo por el
que su amplificacin fue muy inferior al resto de las muestras.

Figura 36. De izquierda a derecha, experimentos F, B y E , el cuarto y quito carril corresponden a muestras
purificadas directamente de PPD Bive y el sexto carril corresponde al marcador molecular del fago phi.

Al analizar la presencia de ADN en las muestras de queso estudiadas se determin que


los tratamientos de la SERIE A (Figura 36) ocasionaba la degradacin del ADN, las
lneas se encuentran cercanas al primer escaln del marcador molecular con 1353 pb,
ello indica que a pesar de haber obtenido gran cantidad de ADN, ste se fragment y que
el material gentico contenido en el PPD ya haba sufrido una degradacin debido a que
76

el proceso para inactivacin de la bacteria incluye el someterla a 100 grados centgrados


y la adicin de una pequea cantidad de fenol.
En la Figura 37 por otro lado se observa que el ltimo tratamiento provoc menor dao,
siendo el tamao de los fragmentos superior al tamao del primer escaln del marcador
molecular.

Figura 37. Experimento gamma de la SERIE D (duplicado) y marcador molecular phi. En gel de agarosa al 3 %
corrido con pulsaciones de 100 volts por 10, 60 volts por 50, 100 volts por 10 y 60 volts por 60.

EL espectro del tratamiento se observa una elevada concentracin de


aminocidos aromticos y baja de protenas. La curva en 260 se puede observar
ligeramente en la Figura 38 A, pero es perfectamente clara en la Figura 38B.

Figura 38. Espectro Alfa, SERIE C (A), Espectro gamma SERIE D (B)

La muestra sometida al calentamiento para el aislamiento de bacterias con


doble purificacin resulta evidentemente satisfactorias al obtener un espectro
caracterstico de ADN.

77

B1 T B1T T T

M neg

Figura 39. Corrimiento electrofortico en gel de agarosa al 5% con voltaje continuo a 80 volts. De derecha a
izquierda, el control negativo (neg), el marcador molecular (M) y los duplicados de alfa amplificado (T), BCG1
amplificado (B1T), gamma purificado (P) y gamma amplificado (T).

En la Figura 40 se determin que en efecto hubo amplificacin en todas las muestras


somentidas a PCR, ya que en el caso de las muestras purificadas el corrimiento fue
mucho menor, la electroforesis present algunas fallas debido a que no se utiliz el buffer
de corrimiento y en su lugar se utiliz agua destilada para la preparacin del gel.
La Figura 41 en el gel de la izquierda se muestra la amplificacin de la muestra testigo
(alfa) y de los controles positivos, (BCG1 y BCG2), tambin es visible la amplificacin de
la cepa AN5, el corrimiento fue repetido debido a que la imagen no era muy clara, para el
segundo corrimiento (imagen de la derecha) se utilizaron las muestras provenientes de
la purificacin (p) de la cepa testigo (alfa) y de la cepa problema (gamma), para el caso
de la amplificacin de todas las muestras se observa un fragmento de aproximadamente
50pb, que es el inferior, y un fragmento igual en la cepa testigo y el control positivo de
BCG. La cepa AN5 hay una amplificacin con un producto intermedio entre 200pb y 50pb,
sin embargo la cantidad de material obtenido no permite hacer tal aseveracin pero como

78

lo indican Talbot y colaboradores (56) en estudios previos, esta amplificacin podra ser
de 150pb.

Figura 40. Gel de Agarosa al 1.5% corrido a 60 volts durante 2 horas. De izquierda a derecha: amplificacin PPD
Cepa AN5 con polimerasa hot start (A5hs), amplificacin de la cepa BCG1 con Taq polimerasa (B1T), amplificacin
de la cepa BCG2 con Taq polimerasa (B2T) y con hot start (B2hs), cepa purificada AN5 (A5p), cepa amplificada AN5
(A5a), cepa purificada alfa (p), cepa amplificada alfa (a), cepa BCG1 amplificada (B1a), cepa gamma amplificada
(a), cepa gamma purificada (p), control negativo (neg) y marcador molecular (M).

En la Figura 42 se observa que la cepa BCG1 y el testigo del tratamiento (tratamiento


alfa) dieron como resultado un corrimiento a 200 pb, lo que implica que el tratamiento
utilizado en el queso no afecta la purificacin del ADN en el Mycobacterium, de igual
manera se observa una amplificacin a 50pb en todas las muestras de queso, misma que
no es observable en las muestras de la cepa pura del vial de vacuna.
En la Figura 43 se advierte un ligero corrimiento al inicio de los carriles en la muestra
purificada, en tanto para la amplificacin de los controles positivos tienen un
comportamiento similar con ambas polimersas; finalmente la muestra problema presenta
una pequea banda menor a los 50pb similar a las dos muestras de la muestra testigo.
Para el caso de ambas polimerasas es posible obtener resultados satisfactorios y
equiparables, adems se corrobora el hecho de que el Mycobacterium puede ser
detectado en el queso con el tratamiento propuesto en esta investigacin.

79

Figura 41. Gel de Agarosa al 2%, corrimiento por pulsaciones en lapsos iniciales de 10 min a 100 volts y 30
minutos a 60 volts durante 2 horas para la amplificacin del control positivo con la cepa BCG1 (B1), la muestra
testigo purificada (p) y amplificada con polimerasa hot start y Taq (hs y T) y la muestra problema amplificada
con hot start y Taq (hs y T).

80

VI. CONCLUSIONES
Los distintos ensayos hicieron posible determinar las condiciones ptimas de separacin
para el aislamiento de las bacterias contenidas en el queso, resultando la ms adecuada,
aquella consistente en el calentamiento y agitacin magntica en solucin de citrato,
seguida de centrifugaciones repetidas. Para el caso de la lisis alcalina complementada
con proteinasa K, result adecuada la desnaturalizacin de la protena seguida de la
doble purificacin que demostr ser idnea para atrapar la gran cantidad de protenas y
aminocidos contenidos en las muestras de queso fresco.
Se determin que las altas concentraciones de aminocidos pueden confundirse con
compuestos que podran interferir con la amplificacin de ADN, se pudo disernir que
estos aminocidos no afectan la actividad de la Taq polimerasa ya que tanto las muestras
de la SERIE C como las muestras de la SERIE D fueron amplificadas, no obstante y para
efectos de mejor control de la purificacin el tratamiento cloroformo:octanol da la certeza
de la purificacin del material gentico y su posterior amplificacin,
La concentracin de agarosa al 3% con corrimiento de electroforesis por pulsaciones a 60
voltios y 10 voltios permitieron un mejor corrimiento de las muestras.
El marcador molecular utilizado sirvi como gua para la realizacin del presente trabajo,
pero sera conveniente el uso de dos marcadores moleculares; para determinar la
integridad del ADN se sugiere uno con fragmentos de mayor tamao y para el material
amplificado uno de menor tamao.
La estandarizacin de la tcnica sirve como herramienta para la purificacin, con todo, es
necesario seleccionar iniciadores especficos para la diferenciacin de M. bovis silvestre
de otras cepas del complejo tuberculoso, ya que los empleados en este trabajo sirven
para diferenciar la cepa BCG de otras cepas del complejo.

81

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88

GLOSARIO DE TRMINOS
Absorbancia: Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y
el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y
menor cantidad de luz ser transmitida por dicho cuerpo.
Acidificacin (fermentacin lctica): es una ruta metablica anaerobia en la cual se oxida parcialmente la glucosa para
obtener energa y donde el producto de desecho es el cido lctico. La coagulacin de la leche resulta de la precipitacin
de las protenas de la leche, y ocurre por el descenso de pH debido a la presencia de cido lctico.
cidos grasos: compuestos orgnicos que responden a la frmula general: C NH2N+1COOH. Componentes principales de
las grasas y de los aceites.
cidos nucleicos: se clasifican en ribonucleico y desoxirribonucleico. El primero participa en la sntesis de protenas y el
segundo representa al material gentico. Los cidos nuclicos se desdoblan en nucletidos cuya molcula contiene cido
fosfrico, el cual esterifica al azcar correspondiente.
Acoplamiento (cebador o iniciador): fusin de la cadena de ADN con un cebador, iniciador o primer.
Acuoso: que se encuentra disuelto en agua, o contiene agua.
Addaxes: El adax es una especie de mamfero artiodctilo de la familia Bovidae de 1 m de altura y unos 120 kg de peso,
parecido a la cabra pero con largos cuernos en forma espiral y que habita el desierto del Sahara.
ADNasas: enzimas que hidrolizan o rompen las cadenas de ADN.
Aerbios: que requieren oxgeno en su metabolismo
Afinidad: fuerza con que se une un elemento. Es la compatibilidad entre dos clases de componentes.
Agar: Sustancia proveniente de la pared celular de las lgas rodofceas, soluble en agua caliente compuesta
esencialmente de D-galactosa y de 3,6 anhidro-L-galactosa; forma finas estras coloreables o redes que se disuelven en
agua por ebullicin.
Agarosa: derivado del agar. En alta pureza es recomendada para separar cidos nucleicos de gran peso molecular (>1000
pb), incluidos cromosomas, y partculas de gran tamao como virus y ribosomas. Muy recomendable para diversas
tcnicas de electroforesis por su alta fuerza de gel y movilidad, mayor que la de las agarosas estndar.
Agitador magntico: Un agitador magntico consiste de una pequea barra magntica (llamada barra de agitacin) la cual
est normalmente cubierta por una capa de plstico y una placa debajo de la cual se tiene un magneto rotatorio o una serie
de electromagnetos dispuestos en forma circular a fin de crear un campo magntico rotatorio. Es muy frecuente que tal
placa tenga un arreglo de resistencias elctricas con la finalidad de dotarle de calor necesario para calentar algunas
soluciones qumicas.
Agudo (dolor): aquel causado por estmulos nocivos desencadenados por heridas o enfermedades de la piel, estructuras
somticas profundas o vceras..
Aislar: Dejar algo slo o separado de otras cosas.
Alcalinos: son sustancias custicas que se disuelven en agua formando soluciones con un pH bastante superior a 7 (al
neutro): amoniaco hidrxido amnico, hidrxido y xido clcicos, hidrxido de potasio, hidrxido y carbonato potsico ,
hidrxido de sodio , carbonato, hidrxido, perxido y silicatos sdicos y fosfato trisdico.
lcalis: (ver Alcalinos)
Alveolos: l os alvolos pulmonares son los divertculos terminales del rbol bronquial, en los que tiene lugar el intercambio
gaseoso entre el aire inspirado y la sangre.
Aminocido: es una molcula orgnica con un grupo amino(-NH 2) y un grupo carboxilo (-COOH). Los aminocidos ms
frecuentes y de mayor inters son aquellos que forman parte de las protenas.
Amplificacin: multiplicar un pequeo fragmento de ADN mediante sntesis logrando obtener millones de copias visibles
en geles electroforticos.
Anticuerpo: son protenas glicosiladas que se encuentran en forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los
vertebrados, son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraos tales como
bacterias, virus o parsitos.
Antgeno: Un antgeno ("anti", del griego - que significa 'opuesto' o 'con propiedades contrarias' y "geno", de la raz
griega , generar, producir; que genera o crea oposicin) es una sustancia que desencadena la formacin de anticuerpos
y puede causar una respuesta inmunitaria.

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Antlopes: son mamferos pertenecientes a la familia de los bvidos en la que se incluyen tambin ovejas, toros y cabras
entre otros, generalmente de gran tamao. Una caracterstica de esta familia es que los machos poseen cuernos, aunque
en algunas especies tambin las hembras tienen cuernos. Su alimentacin es exclusivamente herbvora, y a diferencia de
los ciervos cuyas astas (cornamentas) son macizas, los antlopes poseen cuernos huecos.
Antiparalelo: Dicho de dos cosas paralelas que se orientan o discurren en sentidos opuestos.
ARNasas: enzimas que hidrolizan o rompen enlaces contenidos en el ARN.
Asintomtico: carente de sntomas
Bacilo: La palabra bacilo se usa para describir cualquier bacteria con forma de barra, vara o bastn.
Bacteria: as bacterias son seres vivos de tamao microscpico (por lo general entre 0,5 y 5 mde longitud) y diversas
formas incluyendo filamentos, esferas (cocos), barras (bacilos), sacacorchos (vibrios) y hlices (espirilos).
Banco genmico: base de datos donde se almacenan todos los hallazgos relacionados con la informacin gentica de
bacterias, hongos, animales, protozoarios, plantas, priones y virus.
Bases nitrogenadas: compuestos orgnicos cclicos, que incluyen dos o ms tomos de nitrgeno. Son parte fundamental
de los nuclesidos, nucletidos, nucletidos cclicos (mensajeros intracelulares), dinucletidos (poderes reductores) y
cidos nucleicos
Bidestilada: Es agua de un alto nivel de pureza; de baja conductividad elctrica y alta constante dielctrica. El agua
bidestilada como su nombre lo indica ha sido sometida a un doble proceso de destilacin: se han eliminado iones (cloruros,
magnesio, calcio y fluoruros), adems de otros lquidos de diferentes puntos de ebullicin, metales, amonio, sales de
amonio, materia oxidable y cido carbnico.
Blanco (diana): objetivo, persona o cosa a la que se dirige una accin
Bovino: Los bovinos son mamferos herbvoros domesticados que tienen gran importancia para el hombre, ya que de ellos
se obtiene de ellos carne, leche, cuero, gelatina y otros productos comerciales.
Bronquiales (ganglios): ganglios ubicados en la entrada a los pulmones
Buffer (tampn, solucin amortiguadora, solucin reguladora): es la mezcla en concentraciones relativamente elevadas de
un cido dbil y su base conjugada, es decir, sales hidrolticamente activas.Tienen la propiedad de mantener estable el pH
de una solucin frente a la adicin de cantidades relativamente pequeas de cidos o bases fuertes.
Caprinos: los cpridos (Capra) son un gnero de mamferos artiodctilos de la familia Bovidae que suelen conocerse
comnmente como cabras. Hace unos 9000 aos, aparecieron en Mesopotamia las primeras cabras domsticas.
Carbohidratos: Los glcidos, carbohidratos, hidratos de carbono o sacridos (del griego "azcar") son
biomolculas compuestas de Carbono, hidrgeno y oxgeno, cuyas principales funciones en los seres vivos son el prestar
energa inmediata y estructural.
Carcinognico: son aquellas sustancias y preparados que a consecuencia de una exposicin inhalatoria (respiracin), oral
(ingestin), o cutnea (piel) pueden producir o aumentar las posibilidades de contraer cncer.
Caseoso (aspecto): la necrosis caseosa es la destruccin o muerte coagulativa y colicuativa de las clulas, en la que los
tejidos destruidos se transforman en una masa amorfa, granular y friable, de consistencia y aspecto semejantes al
requesn, envuelta por una superficie inflamatoria (reaccin granulomatosa).La masa con blanquecino-amarillenta que
forma se denomina cseum.
Caudal (regin extremo posterior): est definido por la regin de la cola o polo opuesto a la cabeza.
Cavidad: espacio o lugar hueco en el cuerpo o dentro de uno de sus rganos.
Cebador (partidor, cebador, iniciador o primer): es una cadena de cido nucleico o de una molcula relacionada que sirve
como punto de partida para la replicacin del ADN. Es una secuencia corta de cido nucleico que contiene un grupo
3'hidroxilo libre que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y acta como punto de inicio para la adicin
de nucletidos con el fin de copiar la hebra molde.
Centrifugacin: es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una
fuerza giratoria. La fuerza centrfuga es provista por una mquina llamada centrfuga, la cual imprime a la mezcla un
movimiento de rotacin que origina una fuerza que produce la sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor
densidad.
Cepa: Es un cultivo donde se ha aislado un grupo de bacterias con caractersticas genticas tan similares al grado que
puede establecerse como un grupo homogneo y asignarle una clave de identidad especial y particular.
Cepa desafo: cepa virulenta capaz de causar la muerte a un individuo, la vacuna debe ser capaz de protegerlo de dicha
cepa. .
Cervical: concerniente o relativo al cuello.

90

Ciclo: repeticin de cualquier fenmeno peridico, en el que, transcurrido cierto tiempo, el estado del sistema o algunas de
sus magnitudes vuelven a una configuracin anterior.
Citoplasma: se divide en una regin externa gelatinosa, cercana a la membrana, e implicada en el movimiento celular, que
se denomina ectoplasma; y una parte interna ms fluida que recibe el nombre de endoplasma y donde se encuentran la
mayora de los orgnulos. El citoplasma se encuentra en las clulas procariotas as como en las eucariotas y en l se
encuentran varios nutrientes que lograron atravesar la membrana plasmtica, llegando de esta forma a los orgnulos de la
clula.
Clonar: hacer una copia idntica de un organismo a partir de su ADN
Coagulacin: conversin de un lquido en una masa blanda por el hecho de modificaciones isomricas sin alteracin en la
cantidad de agua contenida.
Codificar (protenas) transformar de tripletes de nucletidos en aminocidos de protenas.
Coloide: es un sistema formado por dos o ms fases, principalmente: una continua, normalmente fluida, y otra dispersa en
forma de partculas; por lo general slidas.
Contaminacin (microbiolgica):
Corrimiento: migracin de las partculas coloidales en el seno de un campo elctrico.
Cortado (leche): separacin del suero y el contenido proteico de la leche, generalmente por la intervencin de un cido
(adicin de jugo de limn o vinagre). La leche se corta por la presencia de microorganismos infecciosos que degradan la
lactosa, producen cido lctico, y es ste cido el que corta la leche.
Craneales (ganglios): ndulos linfticos localizados en la cabeza.
Cromatina: es el conjunto de ADN, histonas y protenas no histnicas que se encuentran en el ncleo de las clulas
eucariotas y que constituye el genoma de dichas clulas.
Cuajada: se obtiene mediante la adicin de cuajo (renina) a la leche de vaca u oveja pasteurizada, a una temperatura de
de aproximadamente 37C, dejndola en reposo durante 30 minutos. Contiene una parte del suero, crema y tambin es
rica en casenas y calcio.
Cuarzo: es el mineral ms abundante y frecuente de la corteza terrestre, conformado por anhdrido silcico cristalizado, de
brillo vtreo, blanco o muy diversamente coloreado por la presencia de impurezas. El cuarzo es una fusin de agua y arena
convertida en cristales despus de miles de aos.
Cubeta: pequeo tubo de seccin circular o cuadrada, sellado en un extremo, fabricado en plstico, vidrio o cuarzo
(transparente a la luz ultravioleta) y diseado para mantener las muestras durante los experimentos de espectroscopia.
Cutneo: relativo a la piel.
Decoloracin: El cristal violeta penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a
travs de la pared bacteriana..La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin. Los
organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.
Degradacin: Por degradacin de ADN se entiende la destruccin de su cadena, obteniendo los nucletidos
constituyentes.
Densidad: la densidad (smbolo ) es una magnitud escalar referida a la cantidad de masa en un determinado volumen de
una sustancia
Desecacin: prdida de lquidos. La cpsula le sirve a las bacterias de cubierta protectora. Tambin se utiliza como
depsito de alimentos y como lugar de eliminacin de sustancias de desecho. Protege de la desecacin, ya que contiene
una gran cantidad de agua disponible en condiciones adversas.
Desnaturalizacin (protenas, ADN): Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden
superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin
ninguna estructura tridimensional fija.
Desoxirribosa: En solucin acuosa, la desoxirribosa consiste primariamente de una mezcla de tres estructuras: la forma
linear H-(C=O)-(CH2)-(CHOH)3-H y dos formas cclicas variables, desoxirribofuranosa, con un anillo de cinco tomos de
carbono, y desoxirribopiranosa de un anillo de seis. La molcula de ADN (cido desoxirribonucleico), que es la principal
fuente de informacin gentica en la vida, consiste de una larga cadena de unidades que contienen a la dexosirribosa
llamados nucletidos, unidos a travs de grupos fosfato.
Destilada: ver bidestilada

91

Detergente: es una sustancia tensoactiva y anfiptica que tiene la propiedad qumica de disolver la suciedad o las
impurezas de un objeto sin corroerlo
Diagnstico: alude, en general, al anlisis que se realiza para determinar cualquier situacin y cules son las tendencias.
Esta determinacin se realiza sobre la base de datos y hechos recogidos y ordenados sistemticamente, que permiten
juzgar mejor qu es lo que est pasando.
Didlfidos: son una familia de mamferos marsupiales. Se distinguen por su largo hocico, su crneo oblongo, poseen un
dedo oponible en las patas traseras provisto de una ua. Tienen cola prensil, que las ayuda a desplazarse en las ramas, y
es utilizada por los ejemplares juveniles para aferrarse del cuerpo de la madre.
Difraccin: es un fenmeno caracterstico de las ondas que se basa en la desviacin de estas al encontrar un obstculo o
al atravesar una rendija.
Digestor: compuesto con pH alcalino que desintegra material orgnico por hidrlisis.
Dilatar: extender, alargar y hacer mayor algo, o que ocupe ms lugar o tiempo.
Diseminar: esparcir
Disfuncin: dis significa separacin en diversas direcciones, no tener la funcin normal.
Drenar: hacer salir un lquido o facilitar su salida de lugares por donde no lo nace en condiciones normales.
Ebullir: es el proceso fsico en el que la materia pasa a estado gaseoso. Se realiza cuando la temperatura de la totalidad
del lquido iguala al punto de ebullicin del lquido a esa presin.
Edema: hinchazn, acumulacin excesiva de lquido subcutneo y espacio intersticial en el tejido celular.
Elands: son los antlopes ms grandes que existen. Taurotragus es un gnero de mamferos artiodctilos de la familia
Bovidae, conocidos vulgarmente como elands.
Electroforesis: Es la tcnica que permite la separacin de protenas u otros componentes qumicos y biolgicos con
diferente peso molecular y/o carga elctrica.
Enzimas: protenas complejas que producen un cambio qumico especfico en todas las partes del cuerpo.
Enzimoinmunoensayo (ELISA): es un mtodo empleado habitualmente para la deteccin y/o cuantificacin de sustancias,
generalmente protenas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El mtodo combina la especificidad de unin
de los anticuerpos con la amplificacin de "seal" que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. Se utiliza para
cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antgenos microbianos y
para la determinacin cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algn antgeno en particular.
Epiteloide: se aplica a clulas semejantes al epitelio en producciones patplogicas y que algunos consideran como
leucocitos modificados.
Epidemia: enfermedad accidental transitoria, generalmente infecciosa, que ataca al mismo tiempo y en el mismo pas o
regin a gran nmero de personas.
quidos: comprende todos los perisodctilos que tienen un nico dedo (el tercero) en cada pata. Pertenecen a este grupo
los caballos, cebras asnos y hemiones. Actualmente, tan solo existen una decena de especies de esta familia, pero en otro
tiempo fue muy numerosa
Erradicar: proviene verbo latino eradicare cuyo significado es desarraigar, arrancar, destruir, exterminar
Especie: miembros de poblaciones que se reproducen o pueden reproducirse entre s en la naturaleza y no de acuerdo a
una apariencia similar. Aunque la apariencia es til para la identificacin de especies, no define una especie.
Especificidad (prueba): es la probabilidad de que un sujeto sano tenga un resultado negativo en la prueba. La
especificidad es el porcentaje de verdaderos negativos o la probabilidad de que la prueba sea negativa si la enfermedad no
est
presente.
Los
falsos
positivos
son
sujetos
sanos
diagnosticados
como
enfermos.

Especificidad=

VN
VN + FP

, donde VN seran los verdaderos negativos y FP, los falsos positivos.

Espectrofotmetro: es un dispositivo utilizado para medir la luz a una longitud de onda determinada. Est compuesto por
dos partes: un espectrmetro y un fotmetro. El espectrmetro proporciona luz a una longitud de onda especfica. El
fotmetro mide la intensidad de la luz. Mediante el clculo de la cantidad de luz que una solucin es capaz de absorber y la
aplicacin de la ley de Beer, el espectrofotmetro puede determinar la concentracin de una solucin con color.
Esporular: este proceso de reproduccin consiste en la divisin de un ncleo en diferentes partes, las cuales se rodean
por citoplasma y de esta forma se produce la conformacin de esporas. Este proceso de reproduccin se produce

92

asexualmente por medio de mitosporas y en la culminacin del proceso de reproduccin sexual por medio de esporulacin
meinica. Es un proceso de diferenciacin celular con el fin de generacin de esporas y su expulsin al ambiente
comnmente esporulan los hongos, algunas bacterias, protozoos esporofitos y frecuentemente vegetales
Esputo: materia procedente de las vas respiratorias inferiores que llega a la boca por esfuerzos de expectoracin y que es
escupida o tragada.
Estandarizacin: significa realizar una determinada operacin siempre de la misma manera y en el mismo tiempo, bajo
unas pautas establecidas, de modo que se obtiene resultados repetitivos.
Estril: material o sustancia libre de microorganismos vivos, eliminados a propsito.
Estreimiento: alteracin del intestino que consiste en una excesiva retencin de agua en el intestino grueso y el
consiguiente endurecimiento de las heces, por lo cual se hace muy difcil su expulsin.
Etiologa: del latn stringre, apretar, comprimir, es una condicin que consiste en la falta de movimiento regular de los
intestinos, lo que produce una defecacin infrecuente o con esfuerzo, generalmente de heces escasas y duras
Exponencial: eniendo en cuenta lo anterior, se puede sacar la conclusin de que si una magnitud M posee la variacin en
el tiempo de forma proporcional a su valor, estar implicando un crecimiento vertiginoso en el tiempo.
Extensin: prolongacin, el efecto de extender o extenderse (hacerse extenso)
Extenuacin: enflaquecimiento, debilitacin de fuerzas materiales.
Extraer: sacar una cosa que est incrustada, hundida, contenida o sepultada en otra, generalmente venciendo una
dificultad
Fagosoma: vescula endoctica que puede contener molculas o estructuras demasiado grandes para cruzar la membrana
por transporte activo o por difusin
Fijar(bacterias): sujetar, hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio
Filogentico: estudio de las relaciones evolutivas entre diferentes grupos de organismos, utilizando matrices de
informacin de molculas de ADN y de morfologa.
Filtrado: La filtracin es el proceso unitario de separacin de slidos en suspensin en un lquido mediante un medio
poroso, que retiene los slidos y permite el pasaje del lquido denominado filtrado.
Ganglios: son agregados celulares que forman un rgano pequeo con una morfologa ovoide o esfrica
Gel (agarosa): La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no txica que supone una herramienta
indispensable en gran cantidad de tcnicas de biologa molecular, bioqumica y biologa celular. Su uso ms extendido es
para construir geles que permitan separar molculas de ADN mediante electroforesis, adems de ser utilizada para fijar
molculas a su estructura como anticuerpos, antgenos y enzimas. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y
microbiologa. Otros usos menos extendidos son la utilizacin de estos geles como matrices en la reparacin de tejidos
daados.
Gen: segmento corto de ADN, una estructura a cargo del traspaso de rasgos hereditarios. Es una serie de nucletidos
que almacena la informacin que se requiere para sintetizar a una macromolcula que posee un rol celular especfico. Se
encarga de transmitir la herencia a los descendientes.
Gentica: ciencia que lo analiza al genoma y los genes.
Genoma: conjunto de genes pertenecientes a una misma especie se define como genoma,
Genitales: es el conjunto de rganos cuyo funcionamiento est relacionado con la reproduccin sexual, con la sexualidad,
con la sntesis de hormonas sexuales y con la miccin.
Gradiente: relacin de cambio. Mide la rapidez de variacin de una magnitud fsica al desplazarse una cierta distancia. Un
gradiente alto significa que de un punto a otro cercano la magnitud puede presentar variaciones importantes (aqu se
entiende por gradiente alto o grande uno tal que su mdulo es grande). Un gradiente de una magnitud pequeo o nulo
implica que dicha magnitud apenas vara de un punto a otro.
Gram (tincin): es un tipo de tincin diferencial. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la
tcnica en1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, considerndose bacterias Gram (+)
a las bacterias que se visualizan de color morado, y bacteria Gram (-) a las que se visualizan de color rosa o rojo o
grosella.
Granuloma: es una masa ms o menos esfrica de clulas inmunes que se forma cuando el sistema inmunolgico intenta
aislar sustancias extraas que ha sido incapaz de eliminar

93

Helicasa: enzima de desplegamiento del cido desoxirribonucleico que cataliza el desenrollamiento de la doble hlice
dependiente de energa durante la replicacin del ADN. La helicasa es una enzima vital en los seres vivos ya que participa
en los procesos de duplicacin y reproduccin celular de este, transcripcin, recombinacin y reparacin del ADN, y de
biognesis de ribosomas
Helicoidal: es el nombre que recibe toda lnea curva cuyas tangentes forman un ngulo constante (), siguiendo una
direccin fija en el espacio.
Hemoptosis: hemorragia.
Heterocclico: se refiere a los cuerpos de cadena cerrada que presentan, aparte de carbono, tomos de azufre, nitrgeno
y oxgeno
Hibridacin: es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de
bases complementarias en una nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las bases
nitrogenadas quedan ocultas en el interior.
Hidrodinmico (estrs): movimiento de los lquidos.
Hipersensibilidad: clsicamente se refiere a una reaccin inmunitaria exacerbada que produce un cuadro patolgico
causando trastornos, incomodidad y a veces, la muerte sbita
Histolgico: del griego hists "tejido" y loga "tratado, estudio, ciencia", es la ciencia que estudia todo lo
relacionado con los tejidos orgnicos
Homogenizar: hacer uniforme una mezcla o el conjunto de elementos que la conforman.
Horquilla de replicacin: Una horquilla de replicacin es la coyuntura entre dos cadenas de ADN cuando ste se est
autoduplicando. En cada una de ellas (hablando de las hebras homlogas) se realiza la cadena contraria para contar con la
doble informacin gentica al aproximarse la divisin celular.
Hospedero: organismo que alberga a otro en su interior o lo porta sobre s.
Implicacin: (del latn in plicare) se refiere al hecho de que hay algo plegado o doblado en el interior de algo que
oculta lo que hay en su interior, de forma que lo interior no es visible o perceptible aunque est ah.
In vitro: (latn: dentro del vidrio) se refiere a una tcnica para realizar un determinado experimento en un tubo de ensaye, o
generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo.
Inactivada (enzima): que ha perdido su actividad
Inactivado (vacuna): las vacunas muertas o inactivadas estn formadas por el o los microorganismos completos pero
inactivado por algn mtodo fsico o qumico, los ms utilizados hoy da son: el formaldehdo y los agentes quelantes tales
como: xido de etileno, propiolactona, etilenoimina, etc.
Incertidumbre: falta de conocimiento seguro o fiable sobre una cosa
Incidencia: es el nmero de casos nuevos de una enfermedad en una poblacin determinada y en un periodo
determinado.
Incubacin: es el tiempo comprendido entre la exposicin a un organismo, qumico o radiacin, y cuando los signos y
sntomas aparecen por primera vez. El periodo puede ser tan corto como algunos minutos, o tan largo como treinta aos
Inducir: ocasionar, ser causa.
Infeccin: implantacin y desarrollo en el organismo de seres vivientes patgenos, y enfermedad de los mismos y reaccin
orgnica consecutiva.
Inflamacin: reaccin del organismo contra un agente irritante o infectivo que se caracteriza por os cuatro sntomas
cardinales: rubor, tumor, calor y dolor.
Ingestin: acto de introducir slidos y lquidos en las vas digestivas por la boca.
Iniciador: ver cebador
Inmerso: introduccin de una parte en un lquido. Interposicin entre el objetivo del microscopio y el vidrio cubreobjeto de
una gota de lquido de ndice de refraccin casi igual al del vidrio.
Inmune: dcese de la persona o animal que, tras el contacto con un antgeno, ha desarrollado la capacidad de rpoducir
anticuerpos especficos para aqul.
Inmunidad celular: es una forma de respuesta inmunitaria de seleccin natural mediada por linfocitos T. Acta como
mecanismo de ataque en contra de los microorganismos intracelulares, como virus y algunas bacterias, capaces de
sobrevivir y proliferar en el interior de los fagocitos y otras clulas del husped, lugar al que no tienen acceso los

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anticuerpos circulantes. La defensa frente a este tipo de infecciones depende de la inmunidad celular, que induce la
destruccin del microorganismo residentes en los fagocitos o de las clulas infectadas.
Inmunidad cruzada: produccin de anticuerpos contra elementos dainos muy semejantes unos con otros.Como ejemplo,
el dengue puede generar anticuerpos que combatirn a otros virus de la misma familia a la que pertenece el productor del
dengue (arbovirus). Estos anticuerpos solo durarn poco tiempo, pero pueden evitar que la enfermedad se propague mas o
ataque con mayor virulencia.
Inmunidad humoral: las clulas no atacan directamente a los antgenos, sino los anticuerpos liberados por las clulas
plasmticas, este tipo de respuesta se produce cuanto aparecen patgenos extracelulares o toxinas bacterianas.
Inmunocomprometido: describe a un enfermo que tiene uno o ms defectos de los mecanismos de defensa natural,
defectos suficientemente significativos como para que este predispuesto a sufrir infecciones graves y, a menudo,
potencialmente letales. Por tanto, uno de los mayores retos en el tratamiento del enfermo inmunodeprimido (ID) es la
reduccin y control de las complicaciones infecciosas.Inmunodeprimido: ver inmunocomprometido.
Inmunoperoxidasa: las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar
de color un sustrato incoloro
Inocuo: no es capaz de causar dao; inofensivo e indoloro , seguro, suave , inobjetable.
Insoluble: sustancia es insoluble en un determinado disolvente cuando no es disuelta por ste
Intacto: en latn intactus significa no tocado, sin heridas, nuevo, por lo tanto lo intacto es lo que njo se ha tocado y, en
sentido figurado, lo puro o sin mezcla.
Integridad: que significa intacto, entero, no tocado o no alcanzado por un mal.
Intermitente: que se interrumpe o cesa y prosigue o se repite
Intracelular: dentro de una o ms clulas.
Intradrmica: situado o que se practica en el espesor de la piel.
Kudus: especie de antlope africano, son caf grisceo con rayas blancas, son muy rpidos y se conocen como fantasmas
grises. Los machos tienen cuernos retorcidos y las hembras generalmente no poseen cuernos. .
Lactante: perodo inicial de la vida extrauterina durante la cual un mamfero se alimenta de leche materna.
Latencia: este adjetivo sirve para describir el estado de algo que se encuentra oculto, no est a la vista o que, en
apariencia, no est activo. El concepto se usa en especial para hacer foco en el periodo que abarca desde contrada una
enfermedad y la manifestacin de las primeras seales o sntomas.
Lesin: del latn laesin(em), "herida" es un cambio anormal en la morfologa o estructura de una parte del cuerpo
producida por un dao externo o interno.
Letal: mortal
Ley de Beer: a ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la
concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.
Licuefactar: es el paso de un componente u objeto, de un estado slido o gaseoso a un estado lquido.
Linftico (sistema): la linfa es un lquido claro, transparente, alcalino, amarillo plido u palescente, de sabor salado que
llena los vasos linfticos. Contiene leucocitos y en particular linfocitos, corpsculos de grasa y accidentalmente glbulos
rojos. El sistema linftico es una amplia red de drenaje que ayuda a mantener los niveles de lquido corporal en equilibrio y
defiende al cuerpo de las infecciones.
Linfoadenopata: trmino comn para las afecciones o enfermedades de los ganglios o del tejido linftico.
Linfocinas: son una familia de molculas del tipo de las citocinas o mensajeros qumicos, que son producidas y liberadas
por las clulas llamadas linfocitos T. Su funcin es atraer a los macrfagos al lugar en que se ha producido una infeccin o
inflamacin, adems de preparalos para el ataque a los posibles invasores extraos que estn produciendo dicha infeccin.
Linfocitos: Los linfocitos son glbulos blancos, los cuales forman parte del sistema inmunitario. Las clulas T son un tipo
de linfocito que ayudan al cuerpo a combatir enfermedades o sustancias dainas.
Liofilizado: es un proceso en el que se congela el producto y posteriormente se introduce en una cmara de vaco para
realizar la separacin del agua por sublimacin (estado slido al gaseoso sin pasar por el estado lquido). Para acelerar el
proceso se utilizan ciclos de congelacin-sublimacin con los que se consigue eliminar prcticamente la totalidad del agua
libre contenida en el producto original, pero preservando la estructura molecular de la sustancia liofilizada.
Lipoarabinomananas: (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmtica. El LAM es
considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacrido de las Gram negativas debido a que provoca una
importante respuesta antimicrobiana en macrfagos. En las cepas de Mycobacterias ms virulentas la arabinosa terminal

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del LAM est recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no estn recubiertas
(AraLAM)
Lisis: es el proceso de ruptura de la membrana celular que produce la salida del material intracelular
Lisozima: Adems de encontrarse en la saliva y en las lgrimas, la lisozima est presente en el bazo, los pulmones, los
leucocitos, el plasma, la leche y el cartlago. La lisozima es una enzima que rompe las paredes celulares de las bacterias,
lo hace hidrolizando enlaces glucosdicos (1 4) de cido N-acetilmurnico (NAM).
Lticas (enzimas): ver lisozimas.
Longitud de onda: describe cun larga es la onda, la distancia existnte entre dos crestas o valles consecutivos es lo que
llamamos longitud de onda.
Macrfagos: "gran comedor" son clulas del sistema inmunitario que se localizan en los tejidos.
Madurar (queso): La maduracin del queso implica cambios en las propiedades de la cuajada, acompaados por el
desarrollo de sus caractersticas tpicas. La proteolisis que ocurre durante la maduracin del queso proporciona pptidos de
bajo peso molecular y aminocidos libres que intervienen en el sabor bsico del mismo y son precursores de compuestos
voltiles responsables del aroma.
Mediastnicos (gangios). El mediastino es el espacio comprendido entre los pulmones en la lnea media de la caja
torcica.
Membrana celular: es el medio que separa la parte interna del exterior. Es una finsima envoltura continua que rodea y
confiere individualidad a la clula, regula el paso de sustancias, est compuesta de lpidos y protenas, es semipermeable
ya que selecciona lo que debe entrar y salir de la clula.
Meningitis: inflamacin de las meninges que son las membranas que envuelven el encfalo y la mdula espinal.
Micelio: es la masa de hifas que constituye el cuerpo vegetativo de un hongo, es un bloque similar a la hierba, pero slo se
encuentra de forma nativa en la Isla de los hongos.
Microarfilos: es un microorganismo que requiere oxgeno para sobrevivir, pero requiere entornos que contienen niveles
ms bajos de oxgeno que estn presentes en la atmsfera.
Microorganismos: son aquellos seres vivos ms diminutos que nicamente pueden ser apreciados a travs de un
microscopio
Micropipeta: es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeos volmenes de lquidos y
permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas. Los volmenes captables por estos instrumentos varan segn el
modelo: los ms habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un mximo de 20, 200 y 1000 l, respectivamente.
Microscpico: es un objeto que por su tamao, es imposible verlo a simple vista, se necesitan aparatos como
microscopios electrnicos para poder verlo
Microsoma: elemento granuloso muy pequeo del protoplasma celular.
Microtubo: tubos cnico utilizado para procesar pequeas muestras de menos de dos mL.
Monoclonal: son anticuerpos idnticos porque son producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune, es decir,
todos los clones proceden de una sola clula madre. Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan
especficamente con cualquier molcula con carcter antignico. El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales es
complejo. Primero se disgrega el bazo del ratn inmunizado, donde se acumulan los linfocitos B que tienen una escasa
viabilidad en cultivo, y se fusionan con clulas de mieloma deficientes en enzimas implicados en la sntesis del nuevo ADN.
Los productos de la fusin celular (hibridomas) son cultivados en medio HAT (de hipoxantina, aminopterina y timidina)
donde las clulas mielmicas son eliminadas. Solamente pueden crecer en el medio de cultivo HAT las clulas que son
producto de la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma. Las clulas hbridas obtenidas tras el proceso de fusin
contienen un nmero elevado de cromosomas que en las sucesivas divisiones celulares se irn perdiendo hasta oscilar
entre los 70 y los 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas clulas pierden la capacidad de
secrecin de anticuerpos o bien funciones bsicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como
positivo un pocillo se somete a un proceso de clonacin para evitar el crecimiento de clulas no productoras que al ser
metablicamente ms eficientes acabaran por dominar el cultivo. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en
cultivos celulares o en animales. Cuando las clulas de un hibridoma son inyectadas en cultivos de tejidos como el
peritoneo (cavidad peritoneal), produce tumores que sintetizan un fluido rico en anticuerpos.
Morbilidad: es la proporcin de personas que se enferman en un sitio y tiempo determinado
Multinucleado: con varios ncleos.
Multirresistente: las bacterias multirresistentesson aquellas que son capaces de sobrevivir a la presencia de ms de un
antibitico

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Mutar: cambiar, es una alteracin o cambio en la informacin gentica de un ser vivo que se presenta sbita y
espontneamente, y que se puede heredar o transmitir a la descendencia.
Necropsia: significa examen de un cadver
Necrosar: es la expresin de la muerte patolgica de un conjunto de clulas o de cualquier tejido, provocada por un agente
nocivo que causa una lesin tan grave que no se puede reparar o curar.
Neonato: recin nacido es un beb que tiene 27 das o menos desde su nacimiento, bien sea por parto o por cesrea
Neumona: es una afeccin respiratoria en la cual hay una infeccin del pulmn
Nucleasa: hidrolasa del tipo esterasa que degrada cidos nucleicos
Nuclena: producto de la desintegracin de las nucleoprotenas constituido por un cido nucleico y bases nitrogenadas
Nucletido: molculas orgnicas formadas por la unin covalente de un monosacrido de cinco carbonos (pentosa), una
base nitrogenada y un grupo fosfato. El nuclesido es la parte del nucletido formada nicamente por la base nitrogenada y
la pentosa.
Obstruir: estorbar el paso, cerrar un conducto o camino
Oligonuclotido: es una secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares de bases o menos
Orgnico (cido): son aquellos compuestos que resultan de la oxidacin potente de los alcoholes primarios o de la
oxidacin moderada de los aldehdos.
Organolpticas (propiedades): son todas aquellas descripciones de las caractersticas fsicas que tiene la materia en
general, segn las pueden percibir los sentidos, por ejemplo su sabor, textura, olor, color. Su estudio es importante en las
ramas de la ciencia en que es habitual evaluar inicialmente las caractersticas de la materia sin la ayuda de instrumentos
cientficos.
Origen de replicacin: es el lugar del cromosoma donde se inicia la replicacin de la cadena de ADN
Oryx: es un gnero de mamferos artiodctilos de la subfamilia Hippotraginae, o antlopes con aspecto de caballo,
compuesto por cuatro especies. La denominacin vulgar del gnero alterna entre rix, rice, antlope rice o gacela rice.
Ovinos: se refiere a lo relativo al ganado que tiene lana
Pandemia: propagacin mundial de una nueva enfermedad.
Paralelo: dos lneas son paralelas si siempre estn a la misma distancia (se llaman "equidistantes"), y no se van a
encontrar nunca. (Tambin apuntan en la misma direccin).
Parsito: es un organismo que vive a costa de otra especie.
Paratraqueal: junto a la trquea
Pared celular: es una capa rgida que se localiza en el exterior de la membrana plasmtica en las clulas de plantas,
hongos, algas, bacterias y arqueas.
Patgeno: se refiere a los agentes infecciosos microscpicos que son capaces de generar un dao o enfermedad en otro
organismo de cualquier tipo.
Patolgico: el proceso patolgico est compuesto de cuatro aspectos: patologa, patogenia, cambios morfolgicos y
manifestaciones clnicas. La etiologa se refiere a las causas de la enfermedad, la patogenia es la secuencia de
acontecimientos que constituyen la respuesta de las clulas o tejidos ante un agente etiolgico, los cambios morfolgicos
son las alteraciones estructurales de tejidos o clulas que caracterizan a una enfermedad o permiten diagnosticar un
proceso etiolgico, y las manifestaciones clnicas son la expresin de las alteraciones genticas, bioqumicas y
estructurales de las clulas y tejidos y que condicionan su evolucin.
Pptidoglicano: tambin conocido como murena, es un polmero que consiste en azcares y aminocidos que forma una
capa de malla-como fuera de la membrana plasmtica de las bacterias. El componente de azcar consiste en los residuos
de alterna - enlaces N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico. Se adjunta a la cido N-acetilmurmico es una cadena
peptdica de entre tres y cinco aminocidos.
Perpendicular: plano o lnea que con otro plano o lnea forma un ngulo de noventa grados.
Pirimidina: es un compuesto orgnico, similar al benceno, y a la piridina pero con dos tomos de nitrgeno que sustituyen
al carbono en las posiciones 1 y 3, forma parte de los cidos nucleicos: timina, citosina y el uracilo; las tres tienen un grupo
carbonilo (=O) en el carbono 2.
Plegado: se aplica tanto para doblar como para llegar.

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Polimerasa: es la enzima encargada de la transcripcin.


Polimerizacin: proceso mediante el cual las molculas simples, iguales o diferentes, reaccionan entre s por adicin o
condensacin y forman otras molculas de peso doble, triple, etc.
Polmero: sustancia qumica que resulta de un proceso de polimerizacin.
Polipropileno: fibra sinttica obtenida por polimerizacin del propileno que es un gas incoloro que se obtiene del petrleo y
que se emplea en la produccin de plsticos.
Polisacridos: son biomolculas formadas por la unin de una gran cantidad de monosacridos. Se encuentran entre los
glcidos, y cumplen funciones diversas, sobre todo de reservas energticas y estructurales.
Portales (ganglios): ganglios localizados cerca del hgado donde se encuentra la vena portal.
Potencial: fuerza o poder del que se dispone para lograr un fin.
Precipitacin (protenas): la alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que
estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin o agrupamiento en la parte inferior del recipiente que
las contiene.
Preliminar: que se hace con anterioridad a una cosa y sirve como preparacin
Primasa: es una enzima que sintetiza pequeos fragmentos de ARN, de unos 10 nucletidos, conocidos como cebadores.
Proliferacin: incremento de la cantidad o el nmero de algo de forma rpida. Reproduccin o multiplicacin de algn
organismo vivo, especialmente de las clulas.
Propagar: hacer llegar una cosa desde un punto a muchos lugares y en todas las direcciones.
Proteinasa K: es una enzima que degrada las protenas, por ello se le utiliza en los mtodos de extraccin de cidos
nucleicos de bacterias o clulas humanas, porque rompe las membranas.
Pulsaciones (electroforesis de campo pulsante): corrimiento electrofortico en el que el voltaje se modifica para facilitar la
separacin de molculas de gran tamao y pequeos fragmentos.
Purificacin: eliminacin de las impurezas o imperfecciones de una cosa material o inmaterial
Purificar: es un concepto que deriva de purificato, un vocablo de la lengua latina. El trmino refiere al proceso y las
consecuencias de purificar (eliminar las imperfecciones o lo extrao de algo para que recupere su esencia.
Purina: La estructura de la purina est compuesta por dos anillos fusionados, uno de seis tomos y el otro de cinco. En
total estos anillos presentan cuatro nitrgenos, tres de estos son bsicos, ya que tienen el par de electrones sin compartir
en orbitales sp2 en el plano del anillo, el nitrgeno restante no tiene carcter bsico ya que el par de electrones no
compartidos que posee, es parte del sistema de electrones del sistema aromtico, por lo cual se encuentran
deslocalizados e incapaces de captar un protn.
Radioactivo: material que contiene tomos inestables (radiactivos) que emiten radiacin (ionizante) a medida que se
desintegran.
Recombinacin: intercambio de material gentico producido por sobrecruzamiento durante la meiosis y, en ocasiones,
durante la mitosis.
Replicacin: Proceso por el cual el ADN de una clula se duplica antes de la divisin celular para que, despus de esta,
cada clula tenga la misma informacin gentica.
Reservorio: Organismo que aloja virus, bacterias u otros microorganismos que pueden causar una enfermedad contagiosa
y que puede propagarse hasta producir una epidemia.
Resistencia heredada:
Restriccin (enzimas): es aquella que puede reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una
molcula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy lejano
a este.
Resuspender: cuando se tiene un sedimento posterior a una centrifugacin diferencial, se descarta el lquido
sobrenadante y al sedimento se le agrega un volumen solucin, por lo general ms pequeo que el primero. Se agita y el
sedimento queda disuelto nuevamente, a eso se le llama resuspender.
Secrecin: elaboracin y expulsin de una sustancia especfica por actividad de una glndula.
Secuencia gentica: es una sucesin de letras representando la estructura primaria de una molcula real o hipottica de
ADN o banda, con la capacidad de transportar informacin.
Secuenciador: la posibilidad de secuenciar el genoma humano estimul la imaginacin de ingenieros, qumicos, y
bilogos, y a finales de la dcada de 1980 aparecen los primeros secuenciadores automticos de DNA. La firma Applied
Biosystems pone en el mercado en 1987 el secuenciador automtico ABI 370A que tres aos ms tarde se convertira en el

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ABI 377. Estos secuenciadores utilizaban la electroforesis en placas de poliacrilamida para la separacin de los fragmentos
de DNA y permitan la secuenciacin en unas pocas horas de hasta 96 muestras de DNA al mismo tiempo con longitudes
de secuencia de ms de 500 pb. Los nuclotidos se lean y registraban automticamente gracias a un sistema de deteccin
lser y a un complejo programa de anlisis informtico. El uso de cuatro fluorocromos diferentes para marcar los
terminadores de secuencia, permita utilizar el mismo canal para separar los fragmentos generados en las cuatro
reacciones de terminacin de polimerizacin que utiliza el mtodo de Sanger. Con estos instrumentos las lecturas de
secuencia de DNA se transforman en cromatogramas de picos de cuatro colores (Figura 1). Pronto la electroforesis en
placa se sustituye por las nuevas tecnologas de electroforesis capilar y aparecen en el mercado, a mediados de la dcada
de 1990, los secuenciadores capilares como el ABI3700 que posteriormente sufrirn otra evolucin para dar origen a los
actuales ABI3730. En este tiempo se desarrollan otros secuenciadores automticos como el Li-Cor4300, el MegaBace4000
y el CEQ8800, basados en el mtodo de Sanger ofreciendo pequeas variaciones en soluciones qumicas y tecnolgicas.
Secuenciar: establecer una serie o sucesin de cosas que guardan entre s cierta relacin.
Sedimentacin: es una operacin unitaria consistente en la separacin por la accin de la gravedad de las fases slida y
lquida de una suspensin diluida para obtener una suspensin concentrada y un lquido claro.
Sedimento: conjunto de partculas slidas que queda depositado en el fondo del recipiente que contiene un lquido
Sensibilidad (epidemiolgica): es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la
probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en una prueba diagnstica un resultado positivo, es el porcentaje
de verdaderos positivos o la probabilidad de que la prueba sea positiva si la enfermedad est presente; los falsos negativos
son sujetos enfermos diagnosticados como sanos y se puede calcular con la frmula

donde

VP

son los verdaderos positivos y

FN

Sensibilidad=

VP
VP+FN

son los falsos negativos.

Sensibilizar: hacer a un ser vivo, rgano o tejido capaz de reaccionar (alergia) al contacto con un agente qumico, fsico o
biolgico.
Seriado (corte histolgico): A la hora de observar los cortes histolgicos al microscopio y si queremos llevar a cabo una
interpretacin adecuada de las imgenes hay que tener en cuenta que lo que vemos es una seccin fina, y en principio
bidimensional de un objeto tridimensional. Cortes del mismo objeto pueden presenta una apariencia totalmente diferente.
As, las estructuras histolgicas con forma de tubo pueden presentar apariencias muy diferentes. Para determinar la forma
tridimensional correcta de un rgano o estructura grande suele emplearse en corte seriado, por lo que se realizan cortes
consecutivos de toda la estructura o del rgano. Un anlisis cuidadoso de las relaciones entre corte y corte en toda la serie
no dar un esquema de la configuracin espacial (eventualmente construyendo un modelo basado en la serie de cortes:
reconstruccin tridimensional).
Signo: son las manifestaciones objetivas, clnicamente fiables, y observadas en la exploracin mdica.
Silvestre: que crece en el campo o la selva de manera natural, sin intervencin humana.
Sntesis (protenas): es un proceso que comienza con el paso de la informacin gentica del ADN al ARN mensajero
(ARNm). Tras el proceso de maduracin del ARNm, ste sale del ncleo de la clula y ya en el citoplasma se une a un
ribosoma donde dirige la traduccin, proceso en el que la informacin codificada en nucletidos determina la secuencia de
aminocidos de la protena. Esta secuencia de aminocidos es la que en ltimo extremo determina la estructura
tridimensional y por tanto la funcin de la protena.
Sntoma: es la referencia subjetiva que da un enfermo por la percepcin o cambio que reconoce como anmalo, o causado
por un estado patolgico o enfermedad.
Sobrenadante: es la fase lquida superior que aparece cuando uno centrfuga una muestra, de modo que cuando uno lo
saca de la centrfuga queda el sobrenadante arriba y un precipitado o sedimento abajo.
Sonda: es un fragmento de ADN de pequeo tamao (normalmente entre 100 y 1000 bases) usado en biologa molecular
como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual. En su uso, la
sonda se une a la secuencia diana monocatenaria (ADN 1c ARN) mediante un mecanismo de hibridacin que forma una
estructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unin se establece
porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formndose pares de
bases complementarias.
Subunidad (ribosomal): los ribosomas son partculas muy pequeas que estn en el citoplasma de todas las clulas. No
son visibles al microscopio ptico, pero s se ven al microscopio electrnico y miden alrededor de 32 nanometros (32
milmillonsimas de metro). Los ribosomas se forman por la interaccin estrecha de dos tipos de molculas relativamente
grandes: el primer tipo es el de los cidos ribonuclicos (rRNA's) y el segundo tipo es un conjunto particular de protenas
conocido con el nombre de protenas ribosomales (PR). Distinguimos dos tipos de ribosomas atendiendo a su coeficiente
de sedimentacin. Ribosomas 70 S y Ribosomas 80 S. Los ribosomas 70 S son tpicos del grupo archea, cloroplastos y

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mitrocondrias. Los ribosomas 80 S son tpicas de las clulas eukaria. Los ribosomas estn formados por dos subunidades
de tamao desigual y distinto coeficiente de sedimentacin. Una es la subunidad mayor y la otra es la subunidad menor.
Los ribosomas 70 S tienen una subunidad mayor con un coeficiente de sedimentacin de 50 S y una menor de 30 S. Los
ribosomas 80 S tienen la subunidad mayor con coeficiente 60 S y la otra 40 S.
Suministrar: proporcionar o poner al alcance de una persona o cosa algo que necesita.
Susceptible: que tiene las condiciones necesarias para que suceda o se realice aquello que se indica.
Trmico: que tiene relacin con el calor.
Termociclador: el modelo ms comn es un bloque de resistencia elctrica que distribuye a travs de una placa una
temperatura homognea durante tiempos que pueden ser programables, normalmente con rangos de temperatura de 4 C
a 96 C. Dado que las reacciones incubadas en el aparato son en soluciones acuosas, suelen incluir una placa de tapa
calentada constantemente a 103 C para evitar la condensacin de agua en las tapas de los tubos donde ocurre la
reaccin, y as evitar que los solutos se concentren, lo que modificara las condiciones ptimas para la enzima
polimerizante; existen otras tecnologas menos populares utilizando distribucin de aire caliente en tubos suspendidos,
logrando el mismo objetivo de transferir calor eficientemente a la reaccin para que cambien los ciclos de temperaturas
Tincin: efecto de teir o dar color.
Tisular: relacionado con los tejidos.
Transcripcin: es un proceso en el que la informacin gentica del ADN pasa al ARN mensajero (ARNm).
Transiluminador: es un equipo necesario que usa en principio luz UV con diferentes longitudes de onda como recurso
para observar, analizar y tomar fotografas de protenas, aminocidos, pptidos, cidos nucleicos en geles de agarosa con
colorantes como el bromuro de etidio.
Tratamiento: procesamiento de una muestra que conlleva transformaciones fsicas, qumicas y biolgicas. Conjunto de
medios de toda clase, higinicos, farmacolgicos y quirrgicos, que se ponen en prctica para la curacin o alivio de las
enfermedades.
Tuberculina: Preparacin hecha con protenas de la bacteria de la turberculosis, que se emplea en el tratamiento y
diagnstico de enfermedades tuberculosas.
Tubrculo: ver granuloma.
Tuberculosis: (abreviada TB), llamada antiguamente tisis (del griego , a travs del latn phthisis) es una infeccin
bacteriana contagiosa que compromete principalmente a los pulmones, pero puede propagarse a otros rganos. La
especie de bacterias ms importante y representativa causante de tuberculosis es Mycobacterium tuberculosis o bacilo de
Koch, perteneciente al complejo Mycobacterium tuberculosis. La TB es posiblemente la enfermedad infecciosa ms
prevalente en el mundo. Otras micobacterias, comoMycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium
canetti y Mycobacterium microti pueden causar tambin la tuberculosis, pero todas estas especies no lo suelen hacer en el
individuo sano. Aunque la tuberculosis es una enfermedad predominantemente de los pulmones, puede afectar tambin el
sistema nervioso central, el sistema linftico, el sistema circulatorio, el sistema genitourinario, el aparato digestivo, los
huesos, las articulaciones e incluso la piel.
Ultrafiltracin: es una tcnica de separacin con membranas que permite concentrar y separar diversos productos y
subproductos de soluciones concentradas a temperatura ambiente. La separacin de los componentes se hace mediante el
paso forzado de sta a travs de una membrana porosa, la cual permite o impide el paso de sustancias de acuerdo a su
tamao o peso molecular, siendo la fuerza motora del proceso la diferencia de presin a ambos lados del medio filtrante.
Urbe: ciudad.
Vacuna: son productos biolgicos que estimulan el sistema inmunitario, generando una respuesta y una memoria
inmunitaria.
Vacunal: referente a la vacuna.
Vasodilatacion: es la capacidad de los vasos sanguneos (arterias y venas) de dilatarse (hacerse ms grande) frente a
estmulos qumicos secretados por clulas inflamatorias,
Viable: segn su significado tiene dos orgenes diferentes. Uno que proviene del francs vie (vida) proveniente del latn
vita, vitae (vida, existencia) y sta de la raz indoeuropea *gwei- (vivir) ms el sufijo -bilis (posibilidad pasiva). De esta
manera puede decirse que su concepto aqu es apto para durar una vida o que puede durar una vida. El otro, proviene
directamente del latn viabilis derivado de via, viae cuyo significado es camino, va, ruta. En este caso, se refiere a la
calificacin de lugares reales o figurados por donde se puede hacer camino. Por tanto, el concepto es que puede ser
transitado.
Virulencia: El carcter nocivo y patognico de un microorganismo, ya sea un virus, una bacteria o un hongo, determina su
virulencia, est vinculado al grado de patogenicidad de un microorganismo, es decir, a su capacidad de causar dao. La
resistencia de los microorganismos a los antibiticos implica su mayor o menor virulencia. Cuando la virulencia logra ser

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inhibida, se habla de organismos atenuados. La vacunacin (que produce anticuerpos) est relacionada a la anulacin de
la virulencia.
Virulento: que es maligno y se presenta con una gran intensidad.
Virus: es un agente infeccioso microscpico que solo puede multiplicarse dentro de las clulas de otros organismos
proviene del latn virus, toxina o veneno.
Vitaminas: es un trmino compuesto formado por el vocablo latino vita (vida) y por el concepto qumico amina. Las
vitaminas son las sustancias orgnicas que estn presentes en los alimentos y que resultan necesarias para el equilibrio de
las funciones vitales.
Zoonosis: es cualquier enfermedad que puede transmitirse de animales a seres humanos
Zoontico: referente a la zoonosis.

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