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Ano letivo 2014/2015

Bioqumica Experimental I
Professor Francisco Pinto

Separao e Anlise de Componentes


Celulares por Centrifugao
Diferencial

Grupo: 3

Turma: PL 13

Ana Rita Garcia, n 44769


Carolina Sousa, n 45662
Guilherme Gil Moreira, n 45219
Joana Catarina Andrade, n 44798
Data de Entrega: 21 de Outubro de 2014
2 Ano 1 Semestre

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

ndice
Resumo.......................................................................................3
Tratamento e Discusso de Resultados..........................................4
Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato4
Determinao da concentrao proteica do homogenato de fgado
e de cada uma das fraes isoladas..................................................5
Frao mitocondrial Determinao da atividade do sucinato:
citocromo c oxidoreductase.......................................................................7
Frao lisossomal Determinao da atividade do fosfatase cido...9
Distribuio dos Marcadores Enzimticos Estudados.........................11
Anlise da Frao Nuclear isolamento do DNA..................................13
Determinao da concentrao de DNA na preparao final......13
Determinao da percentagem de DNA obtido por grama de fgado
............................................................................................................... 14
Bibliografia
16

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Resumo
Este trabalho teve como objetivo isolar vrias fraes subcelulares a partir de um
homogenato de fgado de porco por centrifugao diferencial e proceder sua
caracterizao bioqumica, efetuando a extrao de DNA da frao nuclear e a anlise da
distribuio do succinato citocromo c oxidorredutase e o fosfatase cido nas diferentes
fraes isoladas, de modo a que fosse possvel determinar o grau de pureza do DNA
extrado.
Da anlise da distribuio do succinato citocromo c oxidorredutase nas vrias
fraes, conclui-se que este enzima existe em maior concentrao no pellet 2, uma vez que
este especfico da frao mitocondrial. Quanto ao fosfatase cido, podemos afirmar que a
maior concentrao do enzima se encontra no pellet 3, como era esperado visto que este
especfico da frao lisossomal. De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir
que o fracionamento celular foi realizado com sucesso.
Aps a extrao de DNA, foi possvel calcular a sua concentrao na preparao
final, obtendo-se o valor de 33,65 g/mL e ainda a percentagem de DNA por grama de
fgado, em que se obteve o valor de 0,2048%. Em relao ao grau de pureza, o valor obtido
foi de 1,66 que, em comparao com o valor tabelado 1,8 nos permite afirmar que o
DNA extrado ainda continha impurezas, nomeadamente as histonas.

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Tratamento e Discusso de Resultados


Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com
desoxicolato
Quadro 1 Dados necessrios para traar a curva de calibrao

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Volume (mL)

Massa (mg)

0,05

0,25

0,10

0,50

0,20

1,00

0,30

1,50

0,40

2,00

0,50

2,50

0,60

3,00

0,80

4,00

1,00

5,00

1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio

Absorvncia (540 nm)


0,053
0,053
0,053
0,073
0,076
0,070
0,095
0,093
0,093
0,129
0,101
0,105
0,179
0,175
0,175
0,189
0,188
0,196
0,258
0,261
0,264
0,302
0,294
0,283
0,390
0,381
0,380
0,456
0,457
0,466

Dado que a concentrao de BSA 5mg/mL, necessrio multiplicar o volume (em


mL) por 5, de modo a obter a massa (em mg). Esta massa ento utilizada para traar a
curva de calibrao.

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Figura 1 Relao entre a Absorvncia e a Massa de Protena mtodo do Biureto

Curva de Calibrao - Mtodo do Biureto


0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
Absorvncia (540 nm) 0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

f(x) = 0.08x + 0.05


R = 0.99

Massa de protena (mg)

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Determinao da concentrao proteica do homogenato de


fgado e de cada uma das fraes isoladas
Quadro 2 Dados necessrios para determinar a concentrao proteica no homogenato e em
cada uma das fraes
Amostras

P1

P2

P3

S3

Abs540
0,201
0,078
0,177
0,133
0,137
0,111
0,176
0,197
0,214
0,271
0,285
0,185
0,274
0,264
0,101

Mediana

Massa de Protena por


mL de Soluo Suspensa
(mg)

Massa de Protena
num volume de 4 mL
de H2O (mg)

0,177

1,5799

6,3196

0,5

12,6392

0,133

1,0472

4,1889

0,5

8,3778

0,197

1,8220

7,2881

0,75

9,7175

0,271

2,7179

10,8717

0,75

14,4960

0,264

2,6332

10,5327

0,75

14,0436

Volume
(mL)

Amostra

Concentrao
(mg/mL)

Para esta determinao, registaram-se os valores da absorvncia de cada uma das


amostras. Em seguida, utilizou-se a mediana destes valores para calcular a massa de
protena por mL de soluo suspensa. No se utilizou a mdia dos 3 valores, uma vez que o
valor obtido no seria um valor real, mas sim uma aproximao.
A partir da reta de calibrao y = 0,0826x + 0,0465, onde y representa a
absorvncia e x a massa da protena em mg, calculou-se a massa de protena por mL de
soluo suspensa. Apresentemos ento um exemplo do clculo para o valor do
homogenato:
y=0,0826 x +0,0465 0,177=0,0826 x +0,0465 0,1305=0,0826 x

x=1,5799 mg
Visto que se adicionaram 4 mL de gua de modo a suspender o pellet e que se
utilizou apenas 1 mL da suspenso resultante no mtodo do biureto, necessrio
6

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

multiplicar o valor calculado anteriormente por 4, de modo a obter a massa de protena


nesse volume.
1,5799 x 4=6,3196 mg
Sabendo ainda que o volume retirado de alquota foi de 0,75 mL de cada frao
(exceto para o homogenato e P1, em que se retiraram 0,5 mL), necessrio dividir a massa
calculada acima pelo volume retirado de alquota.
No caso do homogenato, tem-se ento:
C=

6,3196
=12,6392mg/mL
0,5
Os valores das restantes fraes foram calculados do mesmo modo.

Frao mitocondrial Determinao da atividade do


succinato: citocromo c oxidoreductase
Quadro 3 Determinao da atividade do succinato citocromo c oxidoreductase no
homogenato inicial e em cada frao isolada
Amostra

Homogenato
Pellet 1

Declive
(s)
0,0013
0,0010
0,0012
0,0013

Mediana
do
Declive
(s)

Abs550/t
(min-1)

Velocidade
(M/min)

0,0012

0,072

3,4286x10

3428,57

7,46571

0,0013

0,078

3,7143x10

3714,29

8,08786

Unidade
Velocidade enzimtica Atividad
(nM/min) (nmole/min e (U/mL)
)

Volume
(mL)

Atividade
total (U)

149,314

89

13289

161,757

20

3235,14

total

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Pellet 2

Pellet 3

Sobrenadante 3

0,0012
0,0013
0,0020
0,0019
0,0019
0,0017
0,0016
0,0017
0,0003
0,0002
0,0003

0,0019

0,114

5,4286x10

5428,57

11,8207

236,414

2127,73

0,0017

0,102

4,8571x10

4857,14

10,5764

211,529

1903,76

0,0003

0,018

8,5714x10

857,143

1,86643

37,3286

89

3322,24

Para esta determinao, registaram-se os valores da absorvncia durante um minuto


com intervalos de 0,5 segundos, de modo a traar as curvas de calibrao para o
homogenato e cada uma das fraes. Destas curvas, retiraram-se os declives das retas para
que fosse possvel calcular a atividade (U/mL) do succinato citocromo c oxidorreductase.
O declive corresponde ento a Abs550/t, sendo que necessrio multiplicar o
valor do declive por 60, uma vez que queremos passar de segundos para minutos, ou seja,
(para o caso do homogenato):
0,0012 x 60=0,072min

Em seguida, para calcular a velocidade (M/min), sabendo que = 2,1x10 M

||

cm, temos:

C 0,072
C
=
=3,42857 106 M /min
t 21000 t
C
=
t

Sabendo que a atividade enzimtica definida como a quantidade de enzima que


catalisa a reduo do citocromo c a uma velocidade de 1nmole/min, necessrio converter
o valor anterior para nM por minuto. Assim sendo, temos:
6

3,42857 10 10 =3428,57 nM /min


Em seguida, necessrio ainda voltar a converter este valor para nmoles/min, ou
seja,

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

U=3428,57 2,1775 0,001 U=7,46571 nmoles /min


Observao: O valor de 2,1775 corresponde ao volume total, ou seja, 2 mL de tampo de
fosfatos, 0,08 mL de soluo de citocromo c, 0,05 mL de cada frao, 0,0075 mL de KCN
e 0,04 mL de soluo de succinato.
A atividade (U/mL) calculada tendo em conta a unidade enzimtica (calculada
acima) e o volume de cada frao. Como exemplo, tem-se para o homogenato:
U 7,46571
=
=149,314 U /mL
mL
0,05

Por fim, de modo a calcular a atividade total, necessrio fazer a multiplicao


entre o valor acima calculado, isto , a atividade (U/mL), e o volume do meio de
isolamento:
U=149,314 89=13289U

Frao lisossomal Determinao da atividade do


fosfatase cido

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Quadro 4 Determinao da atividade do fosfatase cido no homogenato inicial e em cada


frao isolada
Abs400
dos
Tubos B

Amostra

Homogenato

Pellet 1

Pellet 2

Pellet 3

Sobrenadante 3

0.48
0.292
0.435
0.244
0.167
0.204
0.246
0.209
0.275
0.391
0.324
0.338
0.283
0.235
0.303

Unidade
Velocidade enzimtica Atividad
(M/min) (mole/min e (U/mL)
)

Mediana

Abs400

Concentra
o (M)

Volume Atividade
(mL)
total (U)

0.435

0.291

1.38571x10-5

1.385714

0.005543

0.554286

89

49.3314

0.204

0.060

2.85714x10-6

0.285714

0.001143

0.114286

20

2.2857

0.246

0.102

4.85714x10-6

0.485714

0.001943

0.194286

1.7486

0.338

0.194

9.23810x10-6

0.923810

0.003695

0.369524

3.3257

0.283

0.139

6.61905x10-6

0.661905

0.002648

0.264762

89

23.5638

total

Em primeiro lugar, de salientar que foram utilizados os tubos B, uma vez que os
valores de absorvncia obtidos para os tubos A eram demasiado elevados.
Para determinar a atividade do fosfatase cido, registaram-se os valores de
absorvncia a 400 nm. Foi ainda necessrio calcular a mediana dos 3 valores de
absorvncia medidos para cada frao. Sabendo que o valor de absorvncia do branco
corresponde a 0,144 e que os valores da mediana correspondem aos valores da 3 coluna,
para calcular Abs400, necessrio subtrair a cada mediana de absorvncia o valor do
branco. Assim sendo, para o caso do homogenato, temos:
Abs 400=0,4350,144=0,0291

Em seguida, pretendeu-se calcular a concentrao (M). Para isso, necessrio


indicar que (pNP) = 2,1x10 M cm. Deste modo, podemos calcular a concentrao da
seguinte forma:
Concentrao=

Abs
0,291
Concentrao=
Concentrao =1,3857110 M

21000

10

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Aps este clculo, necessrio calcular a velocidade (em M/min). Sabendo que a
leitura das absorvncias foi feita durante 10 minutos e os valores de concentrao para
cada frao (calculados da forma indicada acima), podemos calcular a velocidade da
seguinte forma:
Velocidade=

Concentrao
1,38571 10
Velocidade=
Velocidade=1,38571106 M /min
t
10

Uma vez que o valor da unidade enzimtica dado em mole/min, necessrio


converter a velocidade para M/min. Assim sendo:
6

Velocidade=1,3857110 10 =1,38571 M /min


Deste modo, podemos prosseguir ao clculo da unidade enzimtica:
U=velocidade volume adicionado U=1,38571 0,004 U=0,005543 mole /min
O volume de 0,004 L, ou seja, 4 mL, corresponde soma dos 0,2 mL de
desoxicolato de sdio, 0,2 mL de tampo acetato de sdio, 0,5 mL de pNPP, 3 mL de
NaOH e 0,1 mL da frao diluda 10 vezes em H2O.
A atividade (U/mL) calculada, tendo em conta a unidade enzimtica (calculada
acima) e o volume de cada frao. Como exemplo, tem-se:
U 0,005543
=
=0,554286 U /mL
mL
0,01
Por fim, de modo a calcular a atividade total, necessrio fazer a multiplicao
entre o valor acima calculado, isto , a atividade (U/mL), e o volume do meio de
isolamento:
U=0,554286 89=49,3314 U

Distribuio dos Marcadores Enzimticos Estudados

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Quadro 5 Determinao da atividade especfica do succinato citocromo c e do fosfatase


cido

Amostra

V total
(mL)

Homogenato
Pellet 1
Pellet 2
Pellet 3
Sobrenadante 3

89
20
9
9
89

Succinato:citocromo c
oxidoreductase
Atividade
Atividade
especfica
(U/mL)
(U/mg)
149,314
11,81356
161,757
19,30801
236,414
24,32868
211,529
14,59264
37,3286
2,658052

[Protena]
(mg/mL)
12,6392
8,37772
9,71751
14,4956
14,0436

Atividade do fosfatase cido


Atividade
Atividade
(U/mL) especfica (U/mg)
0,554286
0,114286
0,194286
0,369524
0,264762

0,043854
0,013642
0,019993
0,025492
0,018803

Para a determinao da atividade especfica (U/mg de protena) dos enzimas


estudados nas diferentes fraes, necessrio, tanto para o succinato citocromo c
oxidorreductase como para o fosfatase cido, ter em conta as suas atividades (U/mL) e a
concentrao de protena (mg/mL).
Sendo assim, demonstraremos como calcular a atividade especfica do succinato
citocromo c oxidoreductase no homogenato, como exemplo. A atividade especfica pode
ento ser calculada atravs da diviso do valor da atividade (U/mL) pela concentrao
proteica:
Atividade especfica=

atividade 149,314
=
=11,81356 U / mg
[ protena] 12,6392

No caso do fosfatase cido, temos como exemplo, para o homogenato:


Atividade especfica=

actividade 0,55429
=
=0,043854 U /mg
[ protena] 12,6392

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Succinato:citocrmo c oxidoreductase
250
200
150
100
50
0

P1

P2

P3

S3

Fraes
Actividade (U/mL)

Actividade especfica (U/mg)

Figura 2 Grfico relativo atividade do succinato citocromo c oxidoreductase

Fosfatase cido
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

P1

P2

P3

S3

Fraes
Actividade (U/mL)

Actividade especfica (U/mg)

Figura 3 Grfico relativo atividade do fosfatase cido

Os grficos apresentados acima, juntamente com o Quadro 5 pretendem ilustrar os


resultados obtidos relativamente distribuio dos marcadores enzimticos estudados, de
modo a que se possa avaliar o sucesso do fracionamento celular realizado. Dito isto, era de
esperar que a maior concentrao proteica se encontrasse no sobrenadante 3, uma vez que
as protenas tm uma elevada solubilidade no meio de isolamento. No entanto, no foi esse
o resultado observado, sendo que a maior concentrao proteica se encontra sedimentada

13

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

no pellet 3, o que se pode dever ao facto das protenas terem sido arrastadas por
organitos celulares mais pesados ou macroestruturas.
Para analisar a presena de atividades enzimticas caractersticas da frao
mitocondrial, recorre-se determinao da atividade do succinato citocromo c. Analisando
a Figura 2, podemos afirmar que a maior frao mitocondrial se encontra no pellet 2, tal
como se esperava, uma vez que o enzima especfico da frao mitocondrial, pelo que se
pode concluir que existe nesta frao a maior concentrao de mitocndrios.
Em relao ao fosfatase cido, ou seja, o enzima especfico da frao lisossomal e
analisando a Figura 3, podemos afirmar que a maior frao lisossomal se encontra no
pellet 3, tal como seria de esperar. No entanto, atravs da anlise da mesma figura,
podemos ainda afirmar que a concentrao de lisossomas no sobrenadante 3 tambm
elevada. A explicao para este facto pode dever-se ao facto de estes organitos serem
bastante heterogneos no seu tamanho.

Anlise da Frao Nuclear isolamento do DNA


Para comear, necessrio indicar que o valor de absorvncia utilizado foi o
valor medido a 260 nm, uma vez que a medio de absorvncias acima deste valor leva
desnaturao do DNA.
A massa do fgado inicial corresponde a 8,8730 g.
Determinao da concentrao de DNA na preparao final
O valor de absorvncia a 260 nm da frao nuclear foi de 0,673. Sabe-se que 1
U.A260 corresponde a uma concentrao de DNA de 50 g/mL. Assim, podemos calcular a
concentrao de DNA na preparao final.

[ DNA ]=

||50 g/mL
0,673 50
[ DNA ] =
[ DNA ] =33,65 g/mL
1 U . A 260 nm
1

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Determinao da percentagem de DNA obtido por grama de


fgado
Em primeiro lugar, necessrio converter a concentrao de DNA de g para
grama. Assim sendo, tem-se:
33,65 g /mL=33,65 106 g /mL
Sabendo que o fator de diluio foi de 27 vezes, necessrio multiplicar o valor
acima por 27. Assim sendo, temos:
33,65 106 27=9,0855 104 g /mL
Visto que o volume de meio de isolamento utilizado corresponde a 20 mL, temos
ento de calcular a massa de DNA presente nesse volume, ou seja,
m ( DNA )=

[ DNA ] volume meio de isolamento


1 mL

m ( DNA )=

9,0855 10 20
m ( DNA )=1,8171 10
1

Uma vez que queremos determinar qual a percentagem de DNA por grama de
fgado, necessrio calcular o quociente entre a massa de DNA e a massa de fgado
inicialmente pesada. Sabemos ainda que a massa de fgado inicial correspondia a 8,8730 g
pelo que se obtm:

( m/m )=

1,8171 10
100 ( m/m )=0,2048
8,8730

Desta forma, podemos concluir que em cada grama de fgado de porco, esto
presentes 0,002 gramas de DNA (corresponde a %(m/m) = 0,2048%).

Anlise do grau de pureza do DNA


Quadro 6 Apresentao dos valores necessrios para determinar o grau de pureza do DNA
Frao

Abs260

Abs280

Nuclear

0,673

0,405

Pureza
de DNA
1.66

O grau de pureza do DNA extrado calculado atravs da razo entre o valor de


absorvncia a 260nm e valor de absorvncia a 280nm.
15

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

A razo da absorvncia a 260 nm e 280 nm usada para determinar o grau de


pureza do DNA. A razo de 1,8 aceitvel para que se possa considerar o DNA puro. Caso
o valor desta razo seja inferior a 1,8, podemos afirmar que estamos na presena de
protenas, fenol ou outros contaminantes que absorvem fortemente a 280 nm ou perto deste
comprimento de onda.
|260| 0,673
Purezade DNA =
=
1,66
|280| 0,405
Uma vez que o grau de pureza de DNA corresponde a 1,66, o que pode ser
considerado como sendo inferior ao valor para o qual podemos admitir que o DNA puro,
-nos ento possvel afirmar que o DNA extrado se encontra contaminado por algum dos
fatores anteriormente referidos, sendo a contaminao por parte das histonas o fator mais
contribuinte.

16

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Bibliografia
Boyer, R.F. (1986) Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley: Reading,
MA
http://www.bio.davidson.edu/GCAt/protocols/NanoDrop_tip.pdf (consultado no dia

14 de Outubro de 2014, s 15h)

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