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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA

DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIA
LABORATRIO DE BACTERIOLOGIA DE PLANTAS

36.571-000 VIOSA - MG BRASIL

ESTRATGIA PARA DETERMINAO DO GNERO NO CASO


DE FITOBACTRIAS NO-FASTIDIOSAS MAIS COMUNS

Reginaldo da Silva Romeiro


Professor Titular da UFV

TELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: rromeiro@mail.ufv.br

CONSIDERAES INICIAIS
Existem muitos gneros de organismos procariotas capazes de incitar enfermidades em
plantas, todos considerados genericamente como bactrias, para efeitos prticos, tais como
bactrias propriamente ditas, rickettsias, espiroplasmas, micoplasmas, clamidias, estreptomicetos
etc (ROMEIRO, 1995). Habitualmente eles so divididos em fastidiosos e no-fastidiosos
(SCHAAD, 1988) e diferenados conforme explicitado na Figura 1. Os procariotas
fitopatognicos fastidiosos (parasitas obrigatrios ou que demandam meios de cultura
extremamente complexos para serem cultivados "in vitro") no so objeto de estudo nesta
disciplina, mas podem ser distinguidos um dos outros com base em caractersticas como as
mostradas na Figura 2.

PROCARIOTAS
FITOPATOGNICOS
FASTIDIOSOS

PAREDE CELULAR
PRESENTE

PAREDE CELULAR
AUSENTE

RICKETTSIAS

CLULAS HELICOIDAIS

CLULAS TIPO COCDE,


BASTONETE ETC.

Bortonela

ESPIROPLASMAS

MICOPLASMAS

Spiroplasma

Micoplasma

Figura 2 - Algumas caractersticas fundamentais que permitem diferenar os principais grupos de


procariotas fitopatognicos fastidiosos. Adaptado de SCHAAD (1988)

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PROCARIOTAS FITOPATOGNICOS
NO FASTIDIOSOS

FASTIDIOSOS
GRAM-POSITIVOS
ESPOROGNICOS

GRAM-NEGATIVOS

NO-ESPOROGNICOS
PLEOMRFICOS

NO INDUZEM TUMORES

INDUZEM
TUMORES

NO - PLEOMRFICOS

ANAERBICOS
FACULTATIVOS
GRUPO CORINEFORME

Rickettsias,
Micoplasmas,
etc

Bacillus sp.
Clostridium sp.

Clavibacter sp.
Rhodococcus sp.
Arthrobacter sp
Corynebacterium sp.

Agrobacterium sp.

AERBICOS ESTRITOS

ASPARAGINASE (+)
ASPARAGINASE (-)
FAT. DE CRESCIMENTO (-)
FAT. DE CRESCIMENTO (+)
XANTOMONADINAS (-)
XANTHOMONADINAS (+)

Erwinia sp.

Pseudomonas sp.

Figura 1: Caractersticas bsicas para diferenciao de procariotas fitopatognicos

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Xanthomonas sp.

Os procariotas no-fastidiosos, ou seja, aqueles que podem ser facilmente cultivveis em


meios de cultura rotineiros, englobam estreptomicetos, alguns gneros de importncia secundria
e os gneros tradicionalmente estudados por bacteriologistas de plantas.
No que tange aos gneros de importncia secundria, menciona-se, por exemplo, Bacillus
e Clostridium que abrigam algumas poucas espcies incitadoras de enfermidades em plantas,
principalmente apodrecimento de rgos de reserva (SCHAAD, 1988). Essas espcies ainda no
foram relatadas no Brasil, e os problemas fitopatolgicos por elas incitadas no se revestem de
grande importncia. H tambm relatos, mais de interesse acadmico que prtico, de outros
gneros de bactrias no-fastidiosas incitando espordicas enfermidades em plantas, tais como
Acetobacter sp. (leses e frutos de ma), Actinomyces sp. (sarna da batatinha), Bacillus sp.
(leses em sementes de soja), Serratia (apodrecimento de razes de alfafa) e inmeros outros
(BRADBURY, 1986; LELLIOT & STEAD, 1987; YOUNG et alii, 1977). Desses gneros de
ocorrncia pouco comum tambm no trataremos ao nvel da presente disciplina.
Adicionalmente, Streptomyces scabies, agente etiolgico da sarna da batatinha, tambm um
procariota fitopatognico no-fastidioso. Contudo, apesar de possuir grande importncia
econmica e fitopatolgica, mais estudado por micologistas, por formar pseudomiclio e por
uma questo de tradio.
Assim, apenas os gneros clssicos de fitobactrias, cujas espcies so no-fastidiosas e
incitantes de importantes enfermidades de plantas no Brasil, sero objetos de estudo nesta
disciplina, a saber: Agrobacterium, espcies do "Grupo Corineforme" (antigo gnero
Corynebacterium), Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas.
Esses podem ser diferenciados com base em algumas caractersticas simples como as
explicitadas no Quadro 1.
QUADRO 1 - Principais caractersticas utilizveis para a diferenciao de gneros de
fitobactrias, em conformidade com FAHY & PERSLEY (1983), KRIEG &
HOLT (1984), SNEATH et alii, 1984; LELLIOTT & STEAD ( 1987), SCHAAD
(1988), KLEMENT et alii (1990) & ROMEIRO (1995)
CARACTERSTICA DIFERENCIAL

GNERO

GRUPO

GNERO

GNERO

GNERO

CONSIDERADA

Agrobacterium

Corineforme

Erwinia

Pseudomonas

Xanthomonas

+
-

Crescimento em meios de rotina


Forma de bastonete
Reao de Gram
Utilizao de asparagina
Produo de xantomonadinas
Anaerobiose facultativa
Aerobiose
Induo de tumores

(1) = Algumas espcies apresentam pleomorfismo, variando de bastonetes tpicos a cocides (KRIEG & HOLT,
1984)
(2) = H relato de algumas espcies capazes de utilizar asparagina (STARR & WEISS, 1941; DYE, 1978 e
SIQUEIRA, 1988)
(3) = Uma espcie (Pseudomonas syringae pv. savastanoi) induz ndulos areos em oliveira (KRIEG & HOLT,
1984) embora a gnese da proliferao de tecido seja de origem hormonal e no neoplsmica.

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ESTRATGIA PARA DETERMINAO DO GNERO


FITOPATOGNICO
De acordo com o raciocnio sumarizado na Figura 3, primeiro preciso primeiro
determinar com segurana se as alteraes mrbidas constatadas na planta tm uma origem
bitica e so de etiologia bacteriana, o que se consegue atravs do teste de exsudao em gota.

PLANTA
DOENTE
TESTE DE
EXSUDAO

ISOLAMENTO

INOCULAO

DETERMINAO
DA
ESPCIE

DETERMINAO
DO
GNERO
CONFIRMAO DE
PATOGENICIDADE

Figura 3: Sequncia lgica de eventos para se determinar gnero e espcie de uma bactria
fitopatognica
Confirmada a etiologia bacteriana, necessrio realizar tentativas para isolar o patgeno
e confirmar que as culturas surgidas em placa de isolamento realmente so fitopatognicas, o que
se consegue com testes de fitopatogenicidade (HR e Inoculao artificial).
Concludas essas trs etapas, crticas e absolutamente essenciais, realizam-se os testes
bioqumicos, tintoriais e biolgicos mostrados no Quadro 1, chegando-se ao gnero
fitopatognico. Numa outra etapa, testes adicionais, mais complexos e em maior nmero so
implementados para a determinao da espcie.
Ao trmino de nossa determinao do gnero, se encontrarmos resultados diferentes dos
explicitados no Quadro 1, aps exaustivas repeties no tempo e no espao, devemos suspeitar de
um novo gnero ou de um gnero fitopatognico pouco comum de bactria fitopatognica no
fastidiosa, como os dos quais se mencionou inicialmente.
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01.CRESCIMENTO EM MEIOS DE ROTINA


Meios de rotina so aqueles de uso no dia a dia de um laboratrio de bacteriologia de plantas,
fceis de preparar, no muito complexos nem muito completos sob o ponto de vista nutricional.
Cada laboratrio costuma adotar um meio como padro. Se a bactria cujo gnero procura-se
determinar cresce nesses meios ou em outros de composio semelhante, com certeza ela no
fastidiosa. Exemplos de 3 meios bacteriolgicos comuns e de largo uso:
a) Meio 523 de KADO & HESKETT (1970)
Esse o meio de rotina utilizado para isolamento, cultivo e manuteno de bactrias
fitopatognicas no Laboratrio de Bacteriologia de Plantas da Universidade Federal de Viosa e
no da Universidade da Califrnia - Davis e tem a seguinte composio:
COMPONENTE
Sacarose
Casena cida hidrolisada
Extrato de levedura
K2HPO4 (anidro)
MgS04.7H20
Agar
gua destilada

QUANTIDADE
10,0 g
8,0 g
4,0 g
2,0 g
0,3 g
15,0 g
l.000 ml

b) GYCA ("Glucose-yeast extract-Calcium carbonate-Agar)


COMPONENTE
Glucose
Extrato de levedura
CaCO3 (P)
Agar
gua destilada

QUANTIDADE
5,0 g
5,0 g
40,0 g
15,0 g
l.000,0 ml

c) Agar-nutriente ou Nutriente-gar
COMPONENTE
Extrato de carne
Extrato de levedura
Peptona
Cloreto de sdio
Agar
gua destilada

QUANTIDADE
1,0 g
2,0 g
5,0 g
5,0 g
15,0 g
l.000 ml

Esse meio, muito usado tambm em para bactrias no-fitopatognicas, pode ser
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encontrado no comrcio, liofilizado.

FORMA DE BASTONETE
Existem inmeras maneiras de corar a clula bacteriana de modo a visualiz-la ao
microscpio tico comum. Vamos utilizar o mtodo de colorao simples com tinta nanquins, um
mtodo negativo de colorao.
a)Preparo do esfregao
Deposite na extremidade de uma lmina uma gota de tinta Nanquim e misture nela, por
meio de ala de repicagem, pequena quantidade de crescimento bacteriano (ACKERMANBROWN, 1977). A seguir, com auxlio de outra lmina, promova o espalhamento do esfregao,
conforme mostrado na Figura 4a.
b) Fixao
No feita fixao, nem qumica nem fsica.
c) Reagentes e seu preparo
O nico reagente a tinta Nanquim, de boa qualidade e no muito velha pois com o
tempo a suspenso tende a perder suas propriedades de colide.
d) Procedimento para observao
1. Aguarde o completo secamento, ao ar, do esfregao
2. Observe com objetiva de imerso
3. Clulas bacterianas so visualizadas de cor branca num fundo amarronzado (Fig. 4b)

Figura 4: Mtodo de colorao com tinta Nanquim para visualizao e estudo de forma e
arranjamento de clulas bacterianas. (a) - Preparo do esfregao, (b) - Aspecto visual de
um campo microscpico
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REAO DE GRAM : MTODOS TINTORIAIS E ALTERNATIVOS

Saber realizar o teste de Gram est para o bacteriologista assim como saber tomar a
presso arterial est para o mdico cardiologista!
Essa tcnica, de largo emprego em Microbiologia, foi idealizada por Christian Gram, em
1848. Roux, em 1866, verificou que espcies bacterianas se comportavam diferentemente quanto
colorao de Gram e dividiu as bactrias em Gram-positivas e Gram-negativas (BROCK, 1974 ;
GERHARDT, 1994; STANIER et alii, 1986). O mtodo de Gram possui importncia na
identificao, pois, das bactrias fitopatognicas no-fastidiosas , apenas as do grupo
Corineforme possuem espcies Gram-positivas. Simplificadamente, o procedimento consiste em
colorir a clula bacteriana com corantes bsicos e descolori-la com solventes neutros (LOURES
& GUIMARES, 1974).
Conforme explicita de modo esquemtico a Figura 5, quando o esfregao coberto com a
soluo de cristal violeta, tanto as clulas Gram-positivas como as Gram-negativas absorvem o
corante e tornam-se roxas. O tratamento seguinte, que a cobertura do esfregao com lugol
(soluo de iodo), faz com que ambos os tipos de clula tambm absorvam o iodo e continuem de
colorao roxa. No interior das clulas, o iodo reage com o cristal-violeta formando complexos de
pesos moleculares elevados e a partir deste ponto comea a diferena entre clulas Gram-positiva
e Gram-negativas. As clulas Gram-negativas tm sua parede celular mais permevel e o solvente
neutro (etanol, por exemplo) consegue remover de seu interior o complexo iodo/cristal-violeta com isto as clulas se descolorem e o esfregao, antes roxo, fica incolor. Em contraposio, as
clulas Gram-positivas, de parede celular bem mais impermevel, o solvente no consegue
remover de seu interior o complexo iodo/cristal-violeta. Por uma questo de visualizao, o
corante final safranina (contraste) - as clulas Gram-positivas no o absorvem pois j esto
coradas de roxo e assim permanecem e as Gram-negativas, descoloridas pelo solvente, o
absorvem e tornam-se vermelhas.

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Incolor

G+

G- Incolor

ou

Roxo

G+

G+ CV ou CV G-

ou

CV

G- Incolor

+
CRISTAL VIOLETA

Roxo

CV-I 2

SAFRANINA

Roxo

Roxo

G+

ou

CV

G-

Vermelho

+
IODO

Roxo

G+

CV-I2

CV-I G
ou CV
2

Roxo

GRAMPOSITIVA

GRAMNEGATIVA

+
ETANOL

CV-I2
Figura 5: Esquema explicativo do mtodo de colorao de Gram

PROCEDIMENTO
Existe um multiplicidade de variaes de tcnicas para a colorao de Gram, ainda que
todas se fundamentem nos mesmos princpios fundamentais. O mtodo de Burke, que se segue,
tem proporcionado excelentes resultados.
a)Preparo e fixao do esfregao
GERHARDT (1994) afirma que a fixao qumica com formalina ideal para o teste de
Gram. Prepare suspenso aquosa de clulas bacterianas que seja nitidamente turva e a ela
adicione formalina para ter uma concentrao final de 5% (v/v). Aguardar alguns minutos, e
proceder lavagem das clulas por centrifugao (15.000g/20 minutos, com descarte do
sobrenadante e ressuspenso do precipitado em pequeno volume de formalina a 5%). Preparar o
esfregao com "cotonete", aguardar secagem completa ao ar e proceder a nova fixao pelo calor.
b) Reagentes e seu preparo
Soluo A:
Cristal violeta (p.a., 90% ou mais do corante)...................................................
Etanol................................................................................................................

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2,0 g
20 ml

Soluo B:
Oxalato de amneo..........................................................................................
gua destilada..................................................................................................

0,8 g
20 ml

Misturar as solues (A) e (B) e deixar em repouso por 24 horas e, aps, filtrar.
Mordente
Iodo metlico...................................................................................................
Iodeto de potssio...........................................................................................
gua destilada................................................................................................

1,0 g
2,0 g
300 ml

Moer o iodo e o iodeto de potssio em almofariz e ir adicionado gua lentamente. Aps o


preparo, a soluo deve ser mantida ao abrigo da luz, em frascos escuros ou envoltos em papel
aluminizado.
Corante de contraste
Safranina a 2,5% em etanol............................................................................
gua destilada................................................................................................

10 ml
100 ml

c) Procedimento de colorao
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Cobrir o esfregao com soluo de cristal-violeta por 1 minuto


Lavar com gua de torneira
Cobrir o esfregao com o mordente por 1 minuto
Lavar novamente com gua de torneira
Secar com papel de filtro
Lavar o esfregao com etanol absoluto, com piseta, at que o solvente escorra sem
colorao
7. Voltar a secar com papel de filtro
8. Cobrir com safranina por 10-20 segundos
9. Lavar sob gua de torneira. Secar com papel de filtro e depois ao ar.
10. Examinar com objetiva de imerso. Clulas Gram-positivas apresentam-se roxas e
Gram-negativas, vermelhas.

d) Recomendaes adicionais importantes


a) No usar reagentes preparados h mais de 6 meses.
b) Manter reagentes que contenham iodo ao abrigo da luz.
c) Usar culturas jovens (18 - 24 h). Bactrias podem variar quanto reao de Gram em funo
da idade.
d) O preparo do esfregao crtico. Se muito espesso ou desuniforme, pode, inclusive, haver
inverso de resultados.
e) Uma colorao de Gram bem feita, realizada por operador experiente e cuidadoso, dispensa o
uso de microscpio. As alteraes visuais sofridas pelo esfregao durante a execuo do

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mtodo so suficientes para se determinar se o isolamento em estudo Gram-positivo ou


Gram-negativo.
f) Quando se deseja determinar a reao de Gram para um isolamento desconhecido
absolutamente essencial que se preparem, na mesma lmina, trs esfregaos: de um controle
Gram-positivo, de um controle Gram-negativo e do isolamento em investigao.

TESTE DE SOLUBILIDADE EM KOH


O teste de solubilidade em KOH reveste-se de carter alternativo, confirmatrios e, ou,
complementares da colorao de Gram. No deve ser empregado isoladamente mas ajuda a tirar
dvidas.
Mesmo o pesquisador mais experiente pode ter eventuais dvidas sobre a
interpretao dos resultados da colorao de Gram uma vez que o sucesso na execuo da tcnica
funo de inmeros fatores.
Este teste foi idealizado por RYU (1938, 1940) para diferenciar bactrias Gram-positiva e
Gram-negativas sem uso de colorao. SUSLOW et alii (1982), citado por FAHY & PERSLEY
(1983) comparou este mtodo com a colorao tradicional de Gram e encontrou resultados
consistentes para um grande nmero de fitobactrias.
O teste simples. Deposita-se 1 gota de KOH a 2% numa lmina comum de microscopia
e para esta gota transfere-se crescimento bacteriano da cultura em meio slido. Homogeneiza-se
bem por 5 a 10 segundos, com a prpria ala de repicagem. Se a preparao fica viscosa a ponto
de, levantando-se a ala, o material a ela aderir e a massa viscosa ficar pendente, considera-se a
bactria como Gram-negativa. Se, em contraposio, a preparao, ao invs de ficar viscosa, ficar
aquosa e no aderir ala, considera-se a bactria como Gram-positiva.
Segundo FAHY & PERSLEY (1983) o aumento de viscosidade seria devido dissoluo
da parede celular das bactrias Gram-negativas com liberao de DNA bacteriano, o que no
acontece com as Gram-positivas processadas nas mesma condies.

RELAES COM O OXIGNIO LIVRE


Dos gneros fitopatognicos objeto deste curso, somente o gnero Erwinia possui espcies
anaerbicas facultativas. Assim, saber se um isolamento fitopatognico ou no capaz de crescer
na ausncia de oxignio assume conspcua importncia para determinao do gnero. Existem
vrios mtodos de se testar isso, todos com suas naturais limitaes
1.MTODO DA PLACA DE PETRI
Esse mtodo bastante limitado por sua prpria natureza, mas pode ser tentado quando
no se dispem de reagentes e equipamentos mais adequados.
a) Preparar meio de rotina. Fundir. Quando ainda fundente (48-50oC), adicionar a ele algumas
gotas de suspenso bacteriana (24 h de idade).
b) Homogeneizar bem, sem permitir a formao de bolhas de ar. Verter em placas e aguardar
solidificao.
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c) Depositar na superfcie do meio lamnulas estreis. Com basto de vidro estril, pressionar as
lamnulas de modo a garantir um perfeito contato das mesmas com a superfcie. Incubar por
24-48 h.
d) Bactrias anaerbicas estritas crescem apenas de baixo da lamnula e distantes dos bordos.
Microaerfilas crescem apenas debaixo da lamnula, mas prximas dos bordos. Aerbicas
facultativas crescem em toda a superfcie do meio, inclusive debaixo da lamnula (Fig. 6).

Figura 6: Padro de crescimento, em funo da tcnica, respectivamente, de: (A) = Aerbica


estrita, (B) = Anaerbica estrita, (C) = Anaerbica facultativa e (D) = Microaerfila

2.MTODO DE HUGH & LEIFSON (1953)


Essa tcnica consiste em proceder ao semeio da bactria num meio adequado que contem
um acar utilizvel pela bactria e um indicador de pH (azul de bromotimol). Estando o pH em
torno de 7,0, o meio azul. Dois tubos so utilizados, colocando-se um deles em condio de
anaerobiose. Para crescer, a bactria utiliza o acar com produo de acido, o que ocasiona
abaixamento do pH e mudana da cor do meio de azul para amarelo.
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s vezes, ocorrem problemas com essa tcnica. A bactria pode no crescer por no ser
capaz de utilizar o acar. Algumas bactrias basificam o meio ao utilizarem a peptona e ao invs
de ficar amarelo, o meio fica azul intenso. Por fim, segundo BRADBURY (1968), produtos de
metabolizao da peptona podem neutralizar o cido produzido. De qualquer forma, mesmo com
essas limitaes, uma tcnica que tem sido extensivamente utilizada.

PROCEDIMENTO
a) Meio de cultura (HUGH & LEIFSON, 1953)
COMPONENTES
Peptona
NaCl
K2HPO4
Agar
Azul de bromotimol (1%)
gua destilada q.s.p.

QUANTIDADES
2,0 g
5,0 g
0,3 g
3,0 g
3,0 ml
1.000 ml

Dissolver todos os ingredientes menos a glucose, ajustar o pH para 7,1 e distribuir


alquotas de 5 ml em tubos que no devem ser inclinados aps a autoclavagem usual. Esterilizar,
por filtrao, soluo a 10% de glucose e adicionar 0,5 ml, asseticamente, a cada tubo.
Homogeneizar sem fazer bolhas de ar e deixar solidificar em p. Proceder ao semeio da bactria
com ala de repicagem reta, mergulhando-a at o fundo dos tubos, pelo centro da coluna de meio.
Utilizar dois tubos. Aps o semeio, adicionar a um dos tubos vaselina lquida, parafina lquida ou
leo "Nujol" (autoclavados) ou agar-gua fundente, at um altura de 0,5 cm. Incubar os 2 tubos,
na posio vertical, por at 7 dias. Aerbicas estritas s crescem no tubo sem leo e somente ele
fica amarelo. Anaerbicas facultativas crescem nos dois tubos e ambos ficam amarelos (Figura 7).

Figura 7: Alteraes de cor no meio de Hugh & Leifson, a saber: (A) - Bactria aerbica estrita,
(B) - Anaerbica facultativa e (C) - Anaerbica estrita.

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3. MTODO DA JARRA DE ANAEROBIOSE

VOLUME RELATIVO (%)

O mtodo fundamenta-se em criar condies de anaerobiose no interior de um recipiente


passvel de ser vedado de modo hermtico. No interior, so colocadas placas de Petri recmsemeadas com os isolamentos em estudo. A condio de ausncia de oxignio criada por meio
de uma reao qumica durante a qual o oxignio existente consumido e igual tenso de CO2
liberada. Existe no mercado "Anaerocult A" (Merk), que so bandejas de plstico contendo
substncias que, quando em contato com gua, reagem consumindo O2 e liberando CO2 (Fig. 8).

CO2

A
O2

TEMPO EM MINUTOS

Figura 8: Mtodo da jarra de anaerobiose, com testagem simultnea de trs bactrias, sendo (A) e
(B) anaerbicas facultativas e (C) aerbica estrita, em que 1 = Modo de semeio na
mesma placa, 2 = Variaes de tenses O2/CO2 pelo efeito do Anaerocult e 3 =
Aspecto da placa aps incubao

Procedimento
a) Providencie uma jarra de "Gas-Pak" ou um dessecador bem vedado com mistura em partes
iguais de lanolina e vaselina. Acomode em seu interior a bandeja de Anaerocult deixando
espao para as placas.
b) Proceda ao semeio dos isolamentos em estudo em placas de Petri. Trabalhe com duplicatas.
c) Imediatamente, transfira as placas para o interior da jarra, adicione gua ao reagente e vede
hermeticamente. Aps 1 h todo oxignio ter sido consumido. Incube.
d) A proporo de 35 ml de gua/bandeja/2,5 l de volume interno da jarra.
e) Incube as duplicatas das placas em condies de aerobiose para comparao. Observe os
resultados aps 24-48 h
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UTILIZAO DE ASPARAGINA
Em conformidade com o Manual de Bergey (KRIEG & HOLT, 1984) caracterstico do
gnero Xanthomonas a no utilizao de asparagina como nica fonte de carbono e nitrognio.
Repica--se, pois, o isolamento para o meio onde o aminacido asparagina a nica fonte de C e
N e observa-se se h crescimento ou no, o que indicado pela ocorrncia ou no de turvamento
do meio.
H que se atentar para alguns detalhes. Quando o Manual de Bergey diz ser uma
determinada prova bioqumica positiva ou negativa, est implcito ser isso verdade para 90% das
espcies. No caso de Xanthomonas sp., h relatos de espcies (raros) capazes de utilizar
asparagina. Alm disso, se os componentes do meio no so combinados de forma adequada,
pode ocorrer a formao de um precipitado que por sua vez pode ser confundido com turbidez.
Alm do mais, se a cultura de Xanthomonas estiver impura, o contaminante pode utilizar
asparagina e ocasionar turbidez. Se se transferir a cultura de Xanthomonas de meio slido e se se
repicar uma grande quantidade de clulas, algumas clulas podem vir a utilizar a cpsula de
outras como fonte de carbono e se multiplicarem, gerando turbidez.
a) Meio de cultura (STARR E WEISS, 1943)
COMPONENTES
KH2PO4
KCl
MgSO4.7H2O
Asparagina
gua destilada

QUANTIDADES
1,0 g
0,2 g
0,2 g
5,0 g
1000,0 ml

b)Procedimento:
1) Cultivar o organismo em estudo em meio lquido por 24 h.
2) Repicar para o meio de asparagina
3) Incubar a 28oC e observar, por at 7 dias, se ocorre turbidez.

INDUO DE TUMORES E, OU, CRESCIMENTO HIPERTRFICO OU


HIPERPLSTICO
O operador que realiza o isolamento presumivelmente sabe se o rgo vegetal utilizado
exibia ou no sintomas de hipertrofia e, ou, hiperplasia (tumores, galhas, etc.). Geralmente
espcies de Agrobacterium incitam hipertrofias e hiperplasias (ROMEIRO, 1995). importante,
pois, observar exatamente o tipo de sintoma incitado pelo patgeno (Fig.9).
No comum, mas algumas espcies fora do gnero Agrobacterium podem tambm
incitar tumores, embora por mecanismos diferentes. Por exemplo, Pseudomonas syringae pv.
savastanoi incida tumores em galhos de oliveira (SCORTICHINI, 1995). Em casos como esse,
que so raros, testes adicionais se tornam necessrios para diferenciar esses espcies das do
gnero Agrobacterium.
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Figura 9: Tumores em caule de Datura sp. incitados por Agrobacterium tumefaciens


(SCORTICHINI, 1995)

PRODUO DE XANTOMONADINAS
Xantomonadinas so aril-polienos brominados, um grupo de pigmentos amarelos, nohidrossolveis, presentes na parede da clula bacteriana, que conferem a tpica colorao
amarelada s colnias da maioria das espcies do gnero Xanthomonas (KRIEG & HOLT, 1984).
A presena desses pigmentos parece ser uma caracterstica tpica do gnero Xanthomonas e
somente dele, revestindo-se, consequentemente, de enorme importncia no que tange a taxonomia
e sistemtica.
Xantomonadinas, quando extradas da clula bacteriana e submetidas anlise
espectrofotomtrica para determinao do espectro de absoro, apresentam um pico em torno de
443 nm, com dois ombros, respectivamente a 420 e 467 nm (STARR & STEPHENS, 1964),
conforme mostrado na Figura 10.
No se poderia menos de ressaltar que existem espcies apigmentadas de Xanthomonas
sp. como X. campestris pv. manihotis, X. campestris pv. ricini, X. albilineans etc., que no
produzem Xantomonadinas, sendo suas colnias so brancas e no amarelas.

PROCEDIMENTO
a) Proceda ao cultivo da bactria em meio de caldo nutriente ("Nutrient broth"). O crescimento
nesse meio costuma ser lento e h que esperar vrios dias. Use Erlenmeyers de 250 ml para o
cultivo sob agitao contnua.
b) Colete as clulas por centrifugao (10.000 g / 15 minutos), ressuspenda-as em H20 destilada
e centrifugue novamente, descartando o sobrenadante.
c) Ressuspenda as clulas em metanol (grau de pureza analtico) de modo a formar uma
suspenso bem concentrada.
d) Transfira a suspenso para tubos e proceda extrao em banho-maria, a 90oC por 10
minutos.
e) Centrifugue a, pelo menos, 10.000 g/15 minutos, para remover detritos celulares.
f) Concentre o sobrenadante em rotavapor, caso esteja muito diludo (caso a cor amarela no
esteja bem ntida).
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g) Determine o espectro de absoro ao espectrofotmetro, pelo menos de 5 em 5 nm, desde 400


nm at 500 nm.
h) Xantomonadinas tipicamente do um pico de absoro mxima a 443 nm e dois ombros, um a
420 nm e outro a 467 nm (Fig. 10).
i) Como controle, para efeito de comparao, recomendvel utilizar uma cultura de X.
campestris e uma de Pseudomonas sp, por exemplo.

467nm

0,5

0,24
0,22

443nm

0,4

0,20
0,18

0,3

0,16

X. campestris
P. solanacearum

0,14

COMPRIMENTO DE ONDA (nm)

0,2
4OO

450

0,12
0,10

ABSORBNCIA
Xanthomonas campestris

0,26

500

ABSORBNCIA
(Pseudomonas solanacearum)

420 nm

Figura 10 : Tpico espectro de absoro de xantomonadinas, com 1 pico e 2 ombros.

CONFIRMAO DO GNERO

As caractersticas diferenciadoras para os 5 gneros fitopatognicos objeto deste roteiro


permitem-nos determinar com razovel segurana a qual gnero pertence o isolamento com o
qual se trabalha. Caso nosso isolamento no se enquadre em nenhum dos 5 gneros clssicos, os
testes devem ser repetidos, pois, devemos ter
em conta no s a possibilidade de erro humano como tambm a quase infinita diversidade
bioqumica e fisiolgica das bactrias. Contudo, em persistindo dvidas, testes para confirmao
do gnero devem ser realizados para maior segurana antes de se pensar na possibilidade de se
estar trabalhando com um novo gnero diferente dos 5 clssicos anteriormente mencionados.
O Manual de Bergey (KRIEG & HOLT, 1984) ressalta, em negrito, as caractersticas
principais dos 5 gneros fitopatognicos, como se segue. Essas caractersticas habitualmente so
verdadeiras para 90% das espcies do gnero

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1. Gnero Agrobacterium, Conn, 1942


a) Forma de bastonete, no esporognica
b) Gram negativa, mvel
c) Aerbica estrita, quimiorganotrofca
d) Catalase positiva
e) Usualmente oxidase e urease positivas
f) Induo de tumores ou rizognese em plantas.
2. Grupo Corineforme
a) Bastonetes curtos, retos ou curvos, pleomrfico
b) No cido-resistentes, habitualmente no-mveis
c) Aerbicas estritas, Gram-positivas, no-esporognicas
d) Catalase positiva
e) Negativos para indol, oxidase, tirosinase e urease
f) No utilizam benzoato, malonato, galacturonato, oxalato ou tartarato
g) No reduzem nitrato nem nitrito
h) Produo de H2S a partir de cisteina
3. Gnero Erwinia, Wilson, Broadhurst, Buchanan, Kaumwiede, Rogers & Smith, 1920
a) Bastonetes retos, no-esporognicas
b) Anaerbicos facultativos
c) Oxidase negativa, catalase positiva
d) No utiliza benzoato, oxalato ou propionato como fonte de C para a produo de
energia.
4. Gnero Pseudomonas, Migula, 1894
a) Bastonetes retos ou curvos, mveis
b) Gram-negativos, no-esporognicas
c) Aerbicos estritos
d) Catalase positivos
e) Grande diversidade bioqumica e fisiolgica.
5. Gnero Xanthomonas, Dowson, 1939
a) Bastonetes
b) Aerbicos estritos, Gram-negativos
c) Mveis por meio de 1 flagelo polar
d) No reduo de nitrato, nem denitrificao
e) Produo do pigmentos denominados Xantomonadinas
f) Oxidase fraca ou negativa, catalase positiva
g) Asparagina no 'e usada como 'nica fonte de carbono e nitrognio
h) Ausncia de produo de cido a partir de ramnose inulina, adonitol, dulcitol,
sorbitol, meso-inositol.
i) No acidificam o leite de litmus.

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