Licenciatura em Biotecnologia 2 ano

Engenharia Gentica
Prof. Kiril Bahcevanfziev

Electroforese da protena GFP

Elaborado por:
20110351 Ana Martins
20110213 Ndia Correia
20120217 Tiago Lima
20110239 Tiago Pinho

ndice
Introduo .......................................................................................................... 3
Procedimento ..................................................................................................... 5
Protocolo 1 ...................................................................................................... 5
Protocolo 2 ...................................................................................................... 7
Resultados e discusso.................................................................................... 13
Protocolo 1 .................................................................................................... 13
Protocolo 2 .................................................................................................... 14
Concluso ........................................................................................................ 16
Bibliografia........................................................................................................ 17

ntroduo
GFP uma protena presente em alforrecas fluorescentes. Esta protena
foi originalmente purificada bioquimicamente da alforreca como parte do
complexo proteico, mas a sua versatilidade e utilidade para escolas e para a
indstria biotecnolgica foi determinada na clonagem e na expresso desta
protena recombinada em E. coli, como j foi feito em experincias anteriores.
Na vertente da electroforese, colnias de bactrias em placas de
controlo (no induzidas) e em placas com colnias induzidas so isoladas e
examinada para determinar a presena ou ausncia da protena GFP.
A protenas, ao contrrio do DNA que quantificado em termos de
tamanho ou pares de base, so quantificadas em termos do seu peso
molecular relativo a um tomo de hidrognio, em daltons.
Para as quantificar, a tcnica de electroforese em gel de poliacrilamida
contendo dodecilsulfato de sdio (SDS-PAGE) das mais utilizadas. Na SDSPAGE, as protenas em soluo so sujeitas aco da corrente elctrica,
migrando numa direco a uma velocidade que reflecte a sua massa molecular
e carga global.

Protenas

Electroforese
Direco da
electroforese

Gel

Ilustrao 1 Mecanismo da electroforese de protenas em gel de poliacrilamida. (A) Electroforese.

(B) Migrao das protenas atravs do gel.

As protenas so previamente desnaturadas pelo calor na presena de

reagentes desnaturantes, os quais destroem as ligaes dissulfeto das
protenas, e pelo detergente SDS. O SDS, carregado negativamente, rodeia as
cadeias proteicas, desnaturando-as e cobrindo as protenas com cargas
negativas. Assim, as protenas carregadas negativamente so separadas,
migrando em direco ao elctrodo positivo.
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Dependendo do seu tamanho, cada protena migra de forma

diferenciada ao longo do gel: protenas de menor tamanho molecular migraro
mais rapidamente, enquanto as de maior tamanho tero mais dificuldade em se
movimentar pelos poros do gel e, assim, movem-se mais lentamente.

Procedimento
Protocolo 1
Purificao da Protena Verde Fluorescente (GFP)

Preparao de Meio LB Lquido

1. Reidratar a ampicilina e a arabinose, adicionando 3 mL de tampo TE a cada

um dos frascos.
2. Adicionar 55 mL de gua destilada a um Erlenmeyer e deixar ferver no micro-

ondas.
3. Adicionar a cpsula de LB ao Erlenmeyer e deixar a embeber durante

aproximadamente 20 minutos.
4. Ferver novamente a soluo no micro-ondas e agitar. Repetir este passo at

estar completamente dissolvido.

5. Deixar arrefecer o meio at aproximadamente 50C.
6. Pipetar 0.5 mL de arabinose e 0.5 mL de ampicilina no meio e agitar.
7. Em 2 tubos de cultura aliquotar em cada, 2 mL do meio LB/Amp/Ara lquido.

Os tubos podero ser guardados a 4C.

Inoculao e Crescimento das Culturas Celulares

1. Diferenciar os dois tubos de cultura com meio LB/Amp/Ara liquido com + e

-.
2. Inocular as bactrias transformadas com o plasmdeo pGLO cultivadas em

meio LB/Amp (bactrias sem fluorescncia/produo da protena GFP) no tubo

- e as bactrias transformadas com o plasmdeo Pglo em meio LB/Amp/Ara
(bactrias com fluorescncia/produo da protena GFP) no tubo +.

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3. Fechar os tubos, agitar vigorosamente as culturas bacterianas durante

30 segundos e incubar horizontalmente na estufa a 32C durante 48 horas.

Fase de Purificao Concentrao Bacteriana e Lise

1. Retirar as culturas da estufa e com uma luz UV verificar se existem

diferenas entre elas.

2. Etiquetar um eppendorf com + e pipetar para o mesmo 2 mL da cultura que

incubou no tubo +. Centrifugar o eppendorf durante 5 minutos velocidade

mxima e descartar o sobrenadante.
3. Ressuspender o pellet em 250 L de soluo TE.
4. Adicionar 1 gota de lisozima soluo bacteriana para iniciar a digesto

enzimtica da parede celular das bactrias. Misturar o contedo invertendo o

eppendorf.
5. Guardar o eppendorf a -20C durante a noite, o que ir causar a ruptura total

das bactrias.

Fase de Purificao LiseBacteriana

1. Retirar o eppendorf do congelador e deixar descongelar.

2. Centrifugar 10 minutos velocidade mxima, reservar o sobrenadante e

descartar o pellet (constitudo por detritos celulares insolveis).

3. Aquando da centrifugao, preparar a coluna de cromatografia removendo a

tampa, retirar a parte inferior e deixar o tampo drenar.

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4. Adicionar 2 mL, no total, de Equilibration Buffer desde o topo da coluna de

cromatografia, aliquotando 1 mL de cada vez. Drenar o tampo at 1 mL de

volume. Fechar a coluna de cromatografia pelo topo e pela parte inferior e
guardar temperatura ambiente.
5. Finda a centrifugao, transferir 250 L do sobrenadante para um novo

eppendorf tambm etiquetado como +.

6. Adicionar 250 L de tampo de ligao ao sobrenadante + e guardar a

soluo a 4C.

Fase de Purificao Cromatografia de Protenas

1. Etiquetar 3 tubos colectores de 1 a 3 e coloc-los no suporte de esponja.

2. Remover a tampa e a parte inferior da coluna de cromatografia e inseri-la no

tubo colector 1, deixar o Equilibration Bufffer escorrer at superfcie da matriz

HIC.
3. Pipetar cuidadosamente 250 L do sobrenadante + para a coluna de

cromatografia, encostando a ponta parede do tubo, acima da matriz HIC.

4. Aps a drenagem transferir a coluna de cromatografia para o tubo colector 2.

Adicionar 250 L de Wash Buffer e deixar escorrer atravs da coluna de

cromatografia.
5. Transferir a coluna de cromatografia para o tubo colector 3. Adicionar 750 L

de tampo TE e deixar o volume escoar atravs da coluna.

6. Examinar os 3 tubos colectores e anotar as diferenas. Selar os tubos com

parafilme e guard-los a 4C.

Protocolo 2
Electroforese das GFP
1. Laemmli sample buffer: adcionar 0.3 g de DTT a 30 ml de tampo Laemmli.

Ressuspender. A concentrao final do DTT ser de 50 mM. A soluo

restante dever ser armazenada a -20C. Antes de cada utilizao, aquecer a
soluo temperatura ambiente para dissolver o precipitado de SDS que se
forma aquando da congelao.
2. Precision Plus Protein Kaleidoscope standards: Antes de cada utilizao,

aquecer a soluo temperatura ambiente para dissolver o precipitado de SDS

que se forma aquando da congelao.
3. TGS Running Buffer: Misturar 100 ml de 10x Tris-glycine-SDS running buffer

com 900 ml de gua destilada. 1x TGS pode ser armazenado por 6 meses.

Preparao
1. Marcar 4 eppendorffs
Branco, (-) calor Verde, (-) calor
Branco, (+) calor Verde, (+) calor

2. Adicionar 300 l de Laemmli sample buffer aos dois tubos (-) calor.
3. Usando uma ansa de inoculao, recolher colnias saudveis (20100) de

uma placa
LB/amp (colnias brancas) e transferir para o tubo Branco, (-) calor. Misture
bem, invertendo o tubo entre o polegar e o indicador. Certifique-se de que no
h nenhum aglomerado de colnias visvel no tubo. Se necessrio, os
aglomerados podem ser dispersos com a ajuda de uma micropipeta de 100 l.
4. Repetir o processo isolando e misturando bem colnias saudveis (20100)

de uma placa LB/amp/ara (colnias verdes) e transferir para o tubo verde, (-)
calor.

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5. Transferir 150 l da mistura do tubo branco (-) calor para o tubo branco (+)

calor. Transferir 150 l da mistura do tubo verde (-) calor para o tubo verde (+)
calor.
6. Aquecer os tubos marcados (+) calor, a 95C por 5 min, num banho-maria.

Arrefecer at temperatura ambiente.

Electroforese

1. Preparar o gel (420%).

2. Carregar o gel de acordo com a ordem da tabela 1 para que metade do gel

seja posteriormente corada com Coomassie (para se ver a complexidade das

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protenas da E. coli e a expresso da GFP) e a outra metade no (para se ver a

fluorescncia verde).
Nota: as amostras no aquecidas so muito mais viscosas do que as sujeitas a
aquecimento pelo que pode ser mais moroso conseguir deposit-las nos poos
do gel. Uma vez que as amostras no atingem a ebulio, o ADN genmico
no desnatura a amostra fica com um aspecto mais espesso. As amostras
devem ser carregadas lentamente e a ponta da micropipeta puxada
rapidamente para cima e para fora do poo; as amostras devem ficar no fundo
do poo.

3. Deixar correr por 30 min a 200 V em tampo 1X TGS. Usando a lmpada de

UV, examinar o gel durante a electroforese e observar as pistas que mostram

fluorescncia. Aps 5 min, a banda correspondente GFP ter migrado
suficientemente para ser visvel.
4. Aps o tempo de corrida, remover o gel e cort-lo em duas partes iguais,

aps a linha 5 (siga o marcador de peso molecular para guiar a linha de corte).
5. Lavar as duas partes do gel em gua: 3 x 5 min por lavagem (15 min total) e

proceda conforme a tabela 2:

6. Examinar as duas peas do gel com luz UV e registe as observaes.

Mantenha a primeira pea (linhas 15) em gua durante a noite e core a 2

pea (linhas 610) com Coomassie.

Colorao do Gel

1. Deite fora a gua da 2 pea de gel (linhas 610) e adicione 50 ml de Bio-

Safe Coomassie stain.

2. Deixar corar durante 1 hora ou durante a noite, mas tape o recipiente para

evitar a evaporao do lquido.

3. Aps a colorao, substitua o corante por gua (bastante). Mude a gua 23

x, seguida de uma incubao durante a noite.

4. Seque os dois pedaos de gel, conforme descrito abaixo.
5. Visualize as bandas GFP. O que se espera observar mostrado na figura 2.

Secagem do gel

1. Colocar duas folhas de papel celofane em gua por 1520 seg.

2. Centrar um das folhas de celofane sobre um quadrado de secagem de

plstico.
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3. Cuidadosamente, coloque o gel sobre o celofane. Se houver bolhas entre o

gel e o celofane, empurre-as suavemente para fora com o dedo.

4. Cobrir o gel com gua e colocar a segunda folha de papel celofane por cima.

Se houver bolhas, empurre-as delicadamente para fora com o dedo.

5. Cobrir com um quadrado de secagem de plstico. Prenda a sanduche assim

formada com 8 molas distribudas uniformemente pela sanduche. Deixar por

1236 horas numa rea bem ventilada.

Determinao do Peso
conformaes da GFP

Molecular

das

diferentes

1. Medir e anotar as distncias percorridas pelas 10 bandas do Precision Plus

Kaleidoscope standard. Um exemplo mostrado na tabela abaixo.

2. Medir e anotar as distncias percorridas pelas duas conformaes da GFP

observadas na linha 8 da figura 7.

3. Com recurso ao software Excel traar um grfico do log PM (eixo do y) pela

distncia percorrida (eixo do x).

4. Obter a recta (linha de tendncia) que melhor se ajusta aos pontos obtidos.
5. Determinar o peso molecular (PM) das duas conformaes da GFP. Um

grfico com os resultados esperados mostrado na figura 3.

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Resultdos e discuss o
Protocolo 1
Tubo 1: No se verificou fluorescncia
Tubo 2: No se verificou fluorescncia
Tubo 3: Verificou-se fluorescncia

Ilustrao 2 Tubos de ensaio sem fluorescncia (1 e 2) e com colnias fluorescentes (3)

As propriedades hidrofbicas da protena GFP permitem que ela possa

ser separada com sucesso das outras protenas menos hidrofbicas.
Isto acontece porque ao adicionar um tampo com uma concentrao
salina elevada ao lisado que est colocado na coluna, as protenas hidrofbicas
vo ligar-se s esferas enquanto que todas as outras protenas escoam pela
coluna. Posteriormente, ao adicionar a esse lisado um tampo com uma
concentrao salina mais baixa, as protenas hidrofbicas vo desligar-se das
esferas s quais se tinham ligado quando expostas a uma concentrao salina
elevada. Ao desligarem-se das esferas, as protenas hidrofbicas conseguem
eluir pela coluna j em estado purificado.

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Assim, sendo a GFP uma protena hidrofbica, quando foi adicionado

um tampo com uma concentrao salina elevada, ela ligou-se s esferas,
enquanto que as outras protenas, sem interesse para a realizao deste
protocolo, escoaram pela coluna, separando-as assim das GFP. Por este
motivo, no se verificou fluorescncia no tubo 1, bem como no tubo 2, uma vez
que o filtrado apenas continha as protenas no hidrofbicas.
No tubo 3, ao adicionar ao lisado um tampo com uma concentrao
salina baixa, as protenas hidrofbicas (GFP) voltaram a desligar-se das
esferas, eluindo pela coluna. Uma vez que a coluna j no continha outras
protenas para alm das GFP, pelos motivos acima referidos, o filtrado apenas
continha as GFP (protenas fluorescentes), na forma purificada. Por este
motivo, apenas o tubo 3 apresenta fluorescncia, como era esperado.

Resultados esperados

Protocolo 2

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Resultados Obtidos:

Ao visualizar a fotografia que a Professora Sandra Gamboa tirou logo

aps o trmino da electroforese, verificou-se que os resultados obtidos eram os
esperados, sendo possvel visualizar as bandas assinaladas na figura acima.
No entanto, ao visualizar o gel aps o processo de colorao com BioSafe Coomassie stain e de incubao durante a noite, no foi possvel verificar
a existncia de bandas.
A explicao mais provvel ao desaparecimento das bandas o facto do
gel utilizado entrar em fuso a temperatura ambiente e, como ficou a incubar
durante a noite nessas condies, provvel que a camada mais superficial se
tenha fundido, sendo eliminada na lavagem do gel com gua, arrastando
consigo as protenas que nela se encontravam fixadas.

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Concluso
O cromossoma para GFP, reside na estrutura terciria da protena e
responsvel pelas propriedades fluorescentes. Como o cromossoma consiste
em trs aminocidos adjacentes (estrutura tridimensional) as propriedades
fluorescentes continuam presentes, mesmo sob condies desnaturantes
adversas.
Quando neste procedimento, o sal removido, a estrutura tridimensional
da protena novamente rearranjada para que as regies hidrofbicas da
protena sejam movidas para o interior onde esto mais protegidas e as regies
hidroflicas mais expostas no exterior, e assim verifica-se fluorescncia (tubo
3), enquanto que nos outros tubos no houve essa proteco das propriedades
fluorescentes e no houve fluorescncia.
A sequncia de cDNA permite que se estime o peso molecular da
protena. Para GFP, os 239 aminocidos codificam uma protena de 26870
dalton. O mtodo de electroforese quando realizado com sucesso permite
confirmar o peso molecular previsto da protena, pois a composio e a posio
dos aminocidos podem afectar a migrao no gel de poliacrilamida.
Como o gel, por ter ficado exposto temperatura ambiente ficou com
poros mais dilatados o que durante a lavagem do gel poder ter lavado
remoo das protenas, ou seja no se obtiveram bandas de protenas, como
referido na discusso de resultados, e assim, no foi possvel proceder
determinao do peso molecular das diferentes conformaes da GFP.

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Bibliogrfi

Biotechnology Explorer Protein Electrophoresis of GFP: pGLO

Transformation Kit Extension. Application note. Bio-Rad Laboratories, Inc.

GAMBOA, Sandra; QUARESMA, Andreia; BAHCEVANDZIEV, Kiril. Biotechnology

Explorer Protein Electrophoresis of GFP: A pGLO Bacterial Transformation Kit
Extension.

Bacterial

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