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ESTUDO INTERLABORATORIAL PARA O ESTABELECIMENTO DO

VENENO BOTRPICO E DO SORO ANTIBOTRPICO DE REFERNCIA


NACIONAL

ELIZABETH PORTO REIS LUCAS

Mestrado Profissional
Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade
Fundao Oswaldo Cruz

Orientador: Dr. Antonio Eugenio Castro Cardoso de Almeida

Rio de Janeiro
2009

FOLHA DE APROVAO
Estudo interlaboratorial para o estabelecimento do veneno botrpico e do soro
antibotrpico de referncia nacional

Elizabeth Porto Reis Lucas

Dissertao submetida Comisso Examinadora composta pelo corpo docente


do Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria do Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Sade da Fundao Oswaldo Cruz e por professores
convidados de outras instituies, como parte dos requisitos necessrios obteno do
grau de Mestre.

Aprovado:
Prof. _______________________________________ (INCQS/FIOCRUZ)
Dr. Helena Pereira Zamith

Prof. _______________________________________ (UFF)


Dr. Andr Lopes Fuly

Prof. _______________________________________ (INCQS/FIOCRUZ)


Dr. Humberto Pinheiro de Arajo

Orientador: __________________________________ (INCQS)


Dr. Antnio Eugnio Castro Cardoso de Almeida

Rio de Janeiro
2009

ii

FICHA CATALOGRFICA

Lucas, Elizabeth Porto Reis


Estudo interlaboratorial para o estabelecimento do veneno
botrpico e do soro antibotrpico de referncia nacional /
Elizabeth Porto Reis Lucas. Rio de Janeiro: INCQS/FIOCRUZ,
2009.
xiii, 91 p., il., graf., quad.
Dissertao (Mestrado Profissional) Fundao Oswaldo Cruz,
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade, Programa
de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria, Rio de janeiro, 2009.
Orientador: Antonio Eugenio Castro Cardoso de Almeida.

1. Soro antibotrpico 2. Veneno botrpico 3.


interlaboratorial. I. Ttulo

Estudo

iii

Dedico este trabalho in memoriam de meus pais, a


quem devo pela vida, pelo exemplo, pelo esforo e
por sempre terem me apoiado e acreditado nos meus
objetivos e incentivado nesta trajetria do meu
trabalho.
iv

Tudo o que um sonho precisa para ser realizado


algum que acredite que ele possa ser realizado.

Roberto Shinyashiki
v

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por ter me concebida mais esta realizao.


Ao meu marido Jos Augusto e aos meus filhos Diogo, Fabio e Rafaela pela fora,
ajuda e compreenso da ausncia de mulher e me durante a realizao deste trabalho.
Ao INCQS pelo suporte dado realizao deste estudo.
A Coordenao de Ps-Graduao pela oportunidade de desenvolvimento pessoal e
profissional oferecida.
A Dra. Isabella Fernandes Delgado, pelo apoio para freqentar o curso de mestrado.
Ao Dr. Antnio Eugnio Castro Cardoso de Almeida, meu orientador pelo seu esprito
inovador, pelo seu conhecimento, pela sua pacincia e incentivo que me proporcionou
durante este trabalho.
A Dr Helena Pereira Zamith, por ter me ajudado na reviso deste trabalho com sua
sabedoria, dedicao e presteza.
Ao colega Humberto Pinheiro de Arajo pela participao no trabalho e por ter aceitado
fazer parte da banca.
A colega Maria Aparecida Affonso Boller pela pacincia, ateno, participao no
trabalho e tambm no auxlio da formatao do mesmo.
Aos colegas do Departamento de Imunologia pelo carinho e fora recebidos,
principalmente a minha comadre Ivani Ctis dos Santos e Wlamir Correa de Moura pela
ajuda na parte estatstica do presente trabalho.
Ao Dr. Andr Lopes Fuly por ter aceitado fazer parte da minha banca.
A Dr Ana Cristina Nogueira pela fora e incentivo.
Aos meus familiares: irm, sobrinho, tias e sogros pela ateno a mim dedicada.

vi

RESUMO
A segurana e a eficcia da imunoterapia antienvenenamento ofdico esto
intimamente relacionadas pureza e a uma cuidadosa determinao da potncia do soro
(atividade biolgica). A metodologia atualmente utilizada apresenta importantes
limitaes, as quais este trabalho objetiva contribuir. A mesma adotada como oficial
pela Farmacopia Brasileira, tendo sido preconizada em 1996 pela Portaria n 174/MS.
Observaes preliminares deste estudo identificaram, principalmente, um alto ndice de
invalidao de ensaios e uma baixa repetibilidade e reprodutibilidade, representado por
diferenas significativas no ensaio de potncia nos resultados obtidos pelo INCQS e
pelos laboratrios produtores, enfatizando a necessidade de aperfeioar a metodologia
analtica para a determinao da potncia do soro antibotrpico. De acordo com as
recomendaes do Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms,
coordenado pela Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit da OMS em 2001,
o estabelecimento de venenos e antivenenos de referncia essencial para a
padronizao destes ensaios e para permitir a comparao lote a lote, assim como a
comparao entre laboratrios.
Neste trabalho, apresentamos os resultados de um estudo interlaboratorial para
o estabelecimento de veneno e antiveneno botrpico de referncia, visando o
aperfeioamento do controle da qualidade dos soros antibotrpicos, com nfase na
metodologia analtica para a determinao da potncia, com a participao de todos os
laboratrios brasileiros produtores de soro antibotrpico. Este estudo foi realizado em
duas etapas. A primeira compreendeu a reavaliao da potncia do lote n 05 do Veneno
Botrpico de Referncia BRA/BOT/05, a avaliao da potncia do candidato a Soro
Antibotrpico de Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01, e a avaliao da
aplicabilidade de um controle da dose desafio de veneno referente a cinco vezes o valor
de dose letal mdia (5 DL50). A segunda etapa compreender a comparao da
metodologia de determinao da potncia do Soro Antibotrpico pela determinao da
Dose Efetiva Mdia DE50 (Potncia Absoluta) com a metodologia da Potncia
Relativa frente ao Soro Antibotrpico de Referncia, atravs da determinao da
potncia de amostras codificadas. Esta monografia, entretanto ir tratar apenas do
estabelecimento do veneno e antiveneno de referncia.
Os resultados obtidos permitiram a avaliao das precises intraensaios,
interensaios e interlaboratorial, a freqncia de ensaios invlidos assim como as
diferentes interpretaes dos laboratrios, INCQS e produtores nacionais monografia
do Soro Antibotrpico da Farmacopia Brasileira.
vii

ABSTRACT
Safety and efficacy of antivenom immunotherapy are closely related with
purity and an accurate potency determination (biological activity) of the antivenom. The
murine lethality assay, still in use, present several limitations and is not a fully validated
methodology. Preliminary data shows a high incidence of invalid assays and a low
repeatability and reproducibility of potency assays, evidenced by significant differences
between INCQS and manufacturers, indicating the need for improvement of the
analytical methodology. According to the recommendations of the Workshop on the
Standardization and Control of Antivenoms, sponsored by the Quality Assurance and
Safety of Biologicals Unit of WHO at 2001, the establishment of local venom reference
preparations and standard antivenom preparations are essential to standardize these
assays and to allow batch to batch comparisons as well as comparisons between
different laboratories.
In this work, we present the results of an interlaboratorial study - with the
participation of all Brazilian manufacturers - for the establishment of the lot 05 of the
Brazilian Bothropic Reference Venom and lot 01 of the Brazilian Reference Antivenom,
looking forward the improvement of quality control of Bothrops antivenom.
This study was done in two steps. The first one consisted in the potency
evaluation of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom, the potency
evaluation of the lot 01 of the Brazilian Bothropic Reference Antivenom and the
evaluation of the use of a control of the challenge dose of five times the median lethal
dose (5 LD50). The second step consisted on the comparison between the absolute and
the relative (parallel line assay) potency evaluation of commercial Bothrops antivenom,
using the Brazilian Bothropic Reference Antivenom, in a blind assay. This monograph
will focus only in the establishment of Brazilian Reference Bothropic Venom and
Antivenom.
These results allowed us to evaluate the intra-assay; inter-assay and interlaboratorial precision, the incidence of invalid assays, and showed that each laboratory
interpret differently the Bothrops Antivenom monograph of Brazilian Pharmacopoeia.

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

BRA/ANTIBOT/01 Soro Antibotrpico de Referncia Nacional lote 01


BRA/BOT/05

Veneno Botrpico de Referncia Nacional lote 05

CECAL

Centro de Criao de Animais de Laboratrio

CENEPI

Centro Nacional de Epidemiologia

CEUA

Comisso de tica no Uso de Animais

CGPNI

Coordenao Geral do Programa Nacional de Imunizaes

CPPI

Centro de Pesquisa e Produo de Imunobiolgicos

CV

Coeficiente de Variao

DE50

Dose Efetiva Mdia

DL50

Dose Letal Mdia

DP

Desvio Padro

EMBRAPA

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

FUNED

Fundao Ezequiel Dias

GTPB

Grupo Tcnico de Produtos Biolgicos

NR

No realizado

IB

Instituto Butantan

INCQS

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade

INV

Invlido

IP

Intraperitoneal

IVB

Instituto Vital Brazil

POP

Procedimento Operacional Padro

SAL

Servio de Animais de Laboratrio

SES-RJ

Secretaria de Sade do Estado do Rio de Janeiro

SGA

Sistema Gerenciador de Amostra

SINITOX

Sistema Nacional de Informaes Txico-Farmacolgicas

WHO

Word Health Organization

ix

LISTA DE QUADROS

Quadro 1
Quadro 2
Quadro 3
Quadro 4
Quadro 5
Quadro 6
Quadro 7
Quadro 8
Quadro 9
Quadro 10
Quadro 11
Quadro 12
Quadro 13
Quadro 14
Quadro 15
Quadro 16
Quadro 17
Quadro 18
Quadro 19

Casos e bitos registrados em acidentes por animais peonhentos


/serpentes por regio do Brasil no ano de 2007
Casos de intoxicao humana em 2007 - Sinitox
Acidentes por animais peonhentos/serpentes no Brasil (1999 2007)
Serpentes do gnero Bothrops de importncia mdica no Brasil
Acidente botrpico: Classificao quanto gravidade e quantidade
aproximada de veneno a ser neutralizada
Nmero de ampolas de soro para tratamento de acidentes ofdicos
Fases do processo de produo e controle de soros
Relao dos lotes do pool candidato a Soro Antibotrpico de
Referncia
Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro
Antibotrpico candidato Referncia - combinao de 8 ensaios
DE50 do Soro Antibotrpico de Referncia - BRA/ANTIBOT/01
Protocolo de diluio para determinao da DL50
Protocolo de diluio para o ensaio de soroneutralizao (DE50)
Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia
BRA/BOT/05, realizada pelo INCQS e pelos laboratrios produtores
Determinao do valor mdio da DL50 do Veneno Botrpico de
Referncia BRA/BOT/05 (INCQS)
Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia combinao de 10 ensaios
Determinao da potncia do Soro Antibotrpico de Referncia
BRA/ANTIBOT/01 realizada pelo INCQS e pelos produtores
Mdia dos resultados da potncia do Soro Antibotrpico candidato
Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01
Preciso do ensaio da potncia do Soro Antibotrpico de Referncia
Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro
Antibotrpico de Referncia - combinao de 15 ensaios

06
06
07
10
17
18
20
26
28
29
30
31
43
44
45
65
66
66
67

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1
Grfico 2
Grfico 3
Grfico 4
Grfico 5

Casos de intoxicao humana em 2007 - SINITOX


Acidentes por animais peonhentos/serpentes no Brasil (1999- 2007)
Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico
candidato Referncia - combinao de 8 ensaios
Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia combinao de 10 ensaios
Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico
de Referncia - combinao de 15 ensaios

07
08
28
45
67

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9

Bothrops alternatus
Bothrops atrox
Bothrops erytromelas
Bothrops jararaca
Bothrops jararacussu
Bothrops moojeni
Bothrops neuwiedi
Processamento do plasma para obteno de soro
Perfil eletrofortico do Veneno Botrpico de Referncia lote 05
BRA/BOT/05.

xii

10
11
11
11
12
12
12
19
24

NDICE

1
1.1
1.2
1.2.1
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.4
1.4.1
1.5
1.6
1.6.1
1.7
1.7.1
1.8
1.8.1
1.9
2
2.1
2.2
3
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.3.1
3.2.4
3.2.4.1
3.2.4.2
3.2.5
3.2.5.1
3.2.6
3.2.6.1
4
4.1
4.2
5
6
7

Introduo
Histrico
Epidemiologia
Distribuio geogrfica
Mecanismo de ao do veneno
Atividade inflamatria aguda
Atividade de coagulao
Atividade hemorrgica
Acidente botrpico
Gravidade do acidente
Soroterapia
Produo de soros antipeonhentos no Brasil
Etapas da Produo
Controle de qualidade de soros antipeonhentos
Testes de controle da qualidade do produto final
Relevncia do estudo
A insero do INCQS neste estudo
Estudo colaborativo
Objetivos
Objetivo geral
Objetivos especficos
Material e Mtodos
Material
Veneno Botrpico de Referncia (BRA/BOT/05)
Soro Antibotrpico de Referncia (BRA/ANTIBOT/01)
Animais utilizados
Mtodos
Soroneutralizao
Obteno do pool de soro antibotrpico e determinao da potncia do
soro candidato referncia
Determinao da Dose Letal Mdia (DL50) do veneno de referncia
Critrios para aceitao do ensaio
Determinao da potncia do soro antibotrpico
Critrios de validao do ensaio
Valores Aberrantes
Protocolo do Estudo Colaborativo utilizado (conforme enviado aos
produtores)
Material
Coleta e anlise dos dados
Critrios de aceitao
Resultados e Discusso
Resultados
Discusso
Concluso
Referncias
Anexo I

xiii

01
01
04
09
13
13
14
14
14
15
16
18
18
20
21
21
22
22
23
23
23
24
24
24
25
25
27
27
27
29
30
30
31
32
32
33
33
34
35
35
68
71
72
76

1. INTRODUO

1.1 HISTRICO

Desde a antiguidade o homem sempre sofreu envenenamentos causados por picadas


de animais peonhentos, que so aqueles que produzem substncias txicas e apresentam
aparelho especializado para inoculao do veneno, atravs de glndulas que se comunicam
com dentes ocos, ferres, ou agulhes, por onde o veneno passa ativamente (INSTITUTO
BUTANTAN, 2006).
Joo Batista Lacerda foi um dos pioneiros no estudo do ofidismo na Amrica
Latina. Ingressou na dcada de 1870, no Museu Nacional do Rio de Janeiro - RJ, onde
produziu extensa obra, fundando o primeiro laboratrio de fisiologia em nosso pas.
Realizou trabalhos sobre toxicologia dos venenos e sistemtica ofdica, identificando novas
espcies na fauna brasileira, como B. jararacussu e B. urutu (DIAS, 1966).
Sewall em 1887 demonstrou em pombos que a inoculao repetida, com doses
altamente diludas de venenos de Sistrurus (um tipo de cascavel norte-americana), induzia
um estado de resistncia contra os efeitos da peonha, sem aparente influncia sobre o
estado de sade dos animais.
Em 1890, Emil Behring trabalhando com toxina diftrica em Berlim e Shibasaburo
Kitasato em Tkio, trabalhando com toxina tetnica, relataram que coelhos e camundongos
poderiam ser imunizados contra difteria e ttano. Eles tambm afirmaram que usando o
soro imune podiam curar animais infectados, assim como prevenir animais saudveis
inoculados com as respectivas toxinas (WEN, 2003).
Em 1894, Albert Calmette aps vrias tentativas infrutferas, conseguiu imunizar
coelhos contra o veneno de cobra (Naja) aps sucessivas inoculaes subcutneas com
doses crescentes de veneno misturado com doses decrescentes de uma soluo de
hipoclorito de clcio ou de sdio. Aps oito meses alguns dos coelhos eram capazes de
sobreviver a doses de 30 a 35 mg de veneno/animal. Alm disso, o soro dos animais
imunizados era capaz de neutralizar a atividade txica do veneno in vitro, assim como
tinha efeito preventivo e teraputico contra a intoxicao in vivo. Ao inocular coelhos com
o dobro da dose letal (o que mata um coelho em aproximadamente 3 horas) e aplicar o soro
imune por via intraperitoneal ou subcutnea aps o aparecimento dos sintomas
(regurgitaes, taquicardia, dispnia, paresia dos membros), os animais permaneceram
gravemente envenenados por um perodo de tempo relativamente longo, porm
gradualmente retornaram ao normal (HAWGOOD, 1999).

Em 1901, o Doutor Vital Brazil, mdico sanitarista, consciente do grande nmero


de acidentes com serpentes peonhentas no Estado de So Paulo, passou a realizar
experimentos com os venenos ofdicos. Baseando-se nos primeiros trabalhos com
soroterapia realizada pelo francs Albert Calmette em 1894, desenvolveu estudos sobre
soros contra o veneno de serpentes, descobrindo sua especificidade, ou seja, cada tipo de
veneno ofdico requer um soro especfico, preparado com o veneno do mesmo gnero de
serpente que causou o acidente (INSTITUTO BUTANTAN, 2006).
Entre as dcadas de 1950 e 1980, as informaes disponveis sobre ofidismo eram
provenientes de estudos pontuais, realizados principalmente na regio Sudeste, com
publicaes em So Paulo e escorpionismo em Minas Gerais. (CARDOSO, 2003).
Em 1983, a indstria farmacutica privada Syntex do Brasil, diferentemente da
inteno manifestada opinio pblica e s autoridades sanitrias resolveu desativar a rea
de produo de imunobiolgicos no pas. Em conseqncia, a produo de antivenenos
entrou em crise, ficando o atendimento restrito aos trs laboratrios oficiais: Instituto
Butantan - IB (SP), Instituto Vital Brazil - IVB (RJ) e Fundao Ezequiel Dias - FUNED
(MG), que no apresentavam naquele momento, condies tcnico-operacionais para
atender demanda nacional de soros antipeonhentos. A falta destes produtos deu origem a
uma situao gravssima, evidenciada no incio de 1985, quando o produto efetivamente
desapareceu dos servios de sade do pas e a imprensa comeou a acompanhar o quadro,
relatando, para espanto da populao, a amputao de pernas e braos de trabalhadores
rurais e a ocorrncia de bitos decorrentes da inexistncia de soros nos hospitais e postos
de sade procurados pelas vtimas de acidentes com animais peonhentos (FRANA,
2003). Em 1986 foi criado o Programa de Autossuficincia Nacional em Imunobiolgicos,
pelo Ministrio da Sade que para atender demanda nacional deste produto e dos outros
imunobiolgicos, utilizados no pas, objetivando-se diminuir gradativamente, a
necessidade de importao, sendo relevante a participao dos laboratrios oficiais
(CARDOSO, 2003).
Os soros antiofdicos so disponibilizados gratuitamente populao atravs do
Sistema nico de Sade SUS, no sendo comercializados nem disponveis na rede de
hospitais privados.
Os soros antibotrpicos atualmente utilizados no Brasil so produzidos pelo
Instituto Butantan IB (SP), Instituto Vital Brasil IVB (RJ), Fundao Ezequiel Dias
FUNED (MG), atravs da imunizao de cavalos com venenos provenientes das cinco
espcies do gnero Bothrops mais prevalentes no Brasil: B. jararaca 50%, B. alternatus,
B. moojeni, B. jararacussu e B. neuwiedi 12,5% cada (Secretaria de Vigilncia Sanitria
2

Ministrio da Sade, 1996), e so distribudos pelo Ministrio da Sade, atravs da


Fundao Nacional de Sade (FUNASA).
Os mtodos de dosagem da potncia do soro eram realizados sem qualquer
padronizao. Somente avaliando a atividade do veneno sobre o sistema de coagulao
sangunea (SILES VILLARROEl, 1979). A avaliao da potncia do soro era realizada
com a incubao da mistura soro-veneno a 37 C, durante 30 minutos e inoculao por via
endovenosa em pombos. O perodo de observao de 20 a 30 minutos, no possibilitava a
quantificao da atividade dos diversos anticorpos antitxicos. Como o nmero de resposta
para cada nvel de diluio era pequeno, a anlise estatstica ficava prejudicada,
influenciando assim a preciso das estimativas de potncia. Aps diversas avaliaes
experimentais foi padronizada a metodologia de titulao da potncia do soro
antibotrpico, atravs da inoculao de camundongos pela via intraperitoneal
(DALMORA, 1992). Apesar de ser a metodologia oficial vigente, preconizada pela 4
Edio da Farmacopia Brasileira - parte II 2004, no foi formalmente validada.
Mesmo com este longo caminho ressalta-se a necessidade de aperfeioar a
metodologia analtica para a determinao da potncia do soro antibotrpico,
estabelecendo um antiveneno de referncia essencial para a padronizao dos ensaios de
modo a permitir a comparao lote a lote, assim como a comparao entre laboratrios,
conforme as recomendaes da Organizao Mundial de Sade OMS (THEAKSTON,
2003).
Como demonstrado, a pesquisa de mtodos ideais para o doseamento dos
antivenenos ofdicos tem sido uma constante desde o advento da soroterapia antiofdica.
Em 1954, Schttler j afirmou que por mais laboriosa e custosa que esta tarefa possa
parecer, ela deveria ser atacada com o objetivo de transformar o atual mistrio que cerca a
titulao dos soros antipeonhentos em mtodo prtico, accessvel e cientificamente
fundado. Theakston e colaboradores, em 2003 chamam ateno, que os testes de rotina
utilizados para liberao de lotes de soros antipeonhentos devem ser novamente
estabelecidos e padronizados utilizando ensaios validados. Deste modo nosso projeto est
buscando a metodologia mais sensvel para o grave problema da proteo dos acidentes
antiofdicos no Brasil.
Por isso o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade - INCQS achou
necessrio realizar uma reunio de trabalho (maio 2002), intitulada: Situao atual
perspectivas para a produo e controle de soros antipeonhentos utilizados no Brasil.
Dentre os diversos temas abordados, podemos destacar a discusso sobre o
aperfeioamento do controle da qualidade dos soros antiofdicos, com nfase na
3

metodologia analtica para a determinao da potncia. Este encontro contou com a


participao de todas as entidades relacionadas com a produo, controle e distribuio dos
soros antipeonhentos no Brasil, que foram:

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade INCQS/FIOCRUZ

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA

Fundao Nacional de Sade FUNASA

Centro de Produo e Pesquisa de Imunobiolgicos CPPI

Fundao Ezequiel Dias FUNED

Indstria Qumica do Estado de Gois IQUEGO

Instituto de Biologia do Exrcito IBEx

Instituto Butantan IB

Instituto Vital Brazil IVB

Dentre as vrias deliberaes resultantes desta reunio, podemos destacar a


disposio de todos os participantes em trabalhar conjuntamente na avaliao e
implementao de melhorias nas metodologias analticas para o controle da qualidade dos
soros antipeonhentos assim como a necessidade de se produzir novos lotes de venenos de
referncia botrpico e crotlico, e que o ttulo destes venenos fossem estabelecidos atravs
de um estudo colaborativo interlaboratorial. Foi ponto consensual que o desenvolvimento e
validao de uma metodologia de avaliao da potncia relativa dos soros antibotrpico
e anticrotlico frente a um soro padro de referncia nacional, possivelmente seria a
estratgia mais adequada no sentido de se obter resultados mais confiveis e precisos, em
curto ou mdio prazo. Isto reforou ainda mais nosso interesse em desenvolver este estudo
que agora apresentamos.

1.2

EPIDEMIOLOGIA

Mundialmente, existem aproximadamente 3.000 espcies de serpentes, sendo cerca


de 600 venenosas. Estas serpentes so mais freqentemente encontradas nas regies
tropical e equatorial, mas podem ser encontradas em todas as regies do planeta com
exceo da Antrtida (WHO, 2007). No Brasil foram descritas 326 espcies de serpentes,
sendo 49 peonhentas, 22 espcies da famlia Elapidae e 27 espcies da famlia Viperidae
(SBH, 2005).
Apesar do grande nmero de espcies venenosas e da ampla distribuio geogrfica
destas serpentes, tanto a incidncia global dos envenenamentos ofdicos quanto a sua
4

severidade permanecem muito pouco conhecidas, com exceo de poucos pases onde
estes acidentes so corretamente notificados. Desde os estudos realizados por Swaroop &
Grab em 1954, nenhum levantamento global sobre a epidemiologia dos envenenamentos
ofdicos foi realizado.
No Brasil os acidentes ofdicos so um importante agravo sade desde o perodo
pr-colonial. Em 1560, Jos de Anchieta fez o primeiro registro sobre serpentes
peonhentas no Brasil com interessantes observaes clnico-epidemiolgicas, na clebre e
sempre citada carta de So Vicente:
[...] At aqui tenho falado dos animais que vivem na gua; tratarei agora dos
terrestres, h os que so desconhecidos nesta nessa parte do mundo. Primeiramente direi
das diversas espcies de cobras venenosas. Algumas, chamadas jararacas abundam nos
campos, nos matos e at mesmo nas casas, onde no raro as encontramos e cuja mordedura
mata no espao de vinte e quatro horas, ainda que s vezes aplicando-se-lhe remdio se
escapa morte, mordidos da por diante, no s no corre risco de vida, como at sentem
menos dor, como mais de uma vez experimentamos.
Outro gnero se chama boicininga, isto , cobra que tine que tem na cauda um
cascavel, que soa quando ataca algum. Vivem nos campos, em cavidades debaixo da
terra. No tempo da procriao atacam os homens, e rastejam pela erva com saltos to
rpidos que os ndios dizem que voam. Quando mordem acabou-se: paralisam o ouvido, a
vista, o andar e todos os movimentos, s fica a dor e o sentimento do veneno difundido por
todo o corpo, at que no espao de vinte e quatro se expira.
H outras admiravelmente pintadas de diversas cores, negras, brancas e vermelhas,
semelhante ao coral, que se chama ibiboboca, que quer dizer terra cavada, por que
rojando furam a terra como toupeiras. Estas so as mais peonhentas de todas e, portanto
as mais raras [...](CARDOSO & WEN, 2003).
As notificaes de acidentes ofdicos no Brasil sempre foram feitas de maneira
espordicas e no sistemtica. Em 1901, Vital Brazil ao iniciar a produo do soro
antiofdico no Brasil e visando a coleta de informaes sobre os acidentes ofdicos,
introduziu os Boletins para observao de accidentes ophidicos que enviados juntamente
com as ampolas de soro, deveriam ser preenchidos pelo usurio e devolvidos ao laboratrio
produtor. Esta estratgia foi adotada pelo Instituto Serumtherapico (hoje Butantan) e
posteriormente pelo Instituto Vital Brazil. Os dados originados por estas notificaes
possibilitaram inmeras publicaes sobre ofididismo no Brasil (CARDOSO & WEN,
2003).

Atualmente, no Brasil os envenenamentos por animais peonhentos so a segunda


principal causa de intoxicaes em humanos, com 19,9% dos casos notificados pelo
sistema Nacional de Informaes Txico-Farmacolgicas (Quadro 2 e Grfico 1) s
sendo superados pelas intoxicaes provocadas por medicamentos com 30,9% dos casos
notificados em 2007 (SINITOX, 2009). Entre os acidentes por animais peonhentos, o
ofdico o principal deles, por sua freqncia e gravidade (Quadro 1, 2 e Grfico 1).

Quadro 1 Casos e bitos registrados em acidentes por animais peonhentos/serpentes por


regio do Brasil no ano de 2007
CENTRO
OESTE
Casos registrados
com animais
555
peonhentos
(serpentes)
bitos registrados
com animais
3
peonhentos
(serpentes)
Fonte: MS/Fiocruz/Sinitox

NORDESTE

NORTE

SUDESTE

SUL

1232

101

503

1155

Quadro 2 - Casos de intoxicao humana em 2007 Sinitox


TOTAL

AGENTE
Medicamentos
Agrotxicos/Uso Agrcola
Agrotxicos/Uso Domstico
Produtos Veterinrios
Raticidas
Domissanitrios
Cosmticos
Produtos Qumicos Industriais
Metais
Drogas de Abuso
Plantas
Alimentos
Animais Peonhentos
Animais no Peonhentos
Desconhecido
Outro
TOTAL
Fonte: MS/Fiocruz/Sinitox

NMERO

33445
5690
3433
1218
4371
12441
1439
6524
599
3835
1641
1423
21606
4533
4441
1766
108405

30,9
5,3
3,2
1,1
4
11,5
1,3
6
0,6
3,5
1,5
1,3
19,9
4,2
4,1
1,6
100
6

Grfico 1 Casos de intoxicao humana em 2007 Sinitox


CASOS DE INTOXICAO HUMANA EM 2007 - SINITOX

M edicamento s
A nimais P eo nhento s
Do missanitrio s
P ro duto s Qumico s Industriais
A gro t xico s/Uso Agrco la
A nimais no P eo nhento s

AGENTE

Desco nhecido
Raticidas
Dro gas de A buso
A gro t xico s/Uso Do mstico
Outro
P lantas
Co smtico s
Alimento s
Pro duto s Veterinrio s
M etais

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

NMERO DE ACIDENTES

Os acidentes ofdicos tm grande importncia mdica e conseqentemente tornam-se


um problema de Sade Pblica em virtude de sua freqncia, gravidade e o despreparo do
profissional de sade da rea. A padronizao atualizada de condutas de diagnstico e
tratamento dos acidentados imprescindvel. Porm as equipes de sade, raramente
recebem informaes desta natureza durante o curso de graduao ou no decorrer da
atividade profissional (Brasil, 2001).
Esto demonstradas no (Quadro 3 e Grfico 2), no Brasil, a incidncia dos acidentes
ofdicos.
Quadro 3 - Acidentes por animais peonhentos/serpentes no Brasil (1999-2007)
ANO
NMERO DE CASOS
1999
4584
2000
4292
2001
4731
2002
5344
2003
6266
2004
6123
2005
5288
2006
5209
2007
4972
TOTAL
46809
Fonte: MS/Fiocruz/Sinitox
7

Grfico 2 - Acidentes por animais peonhentos/serpentes no Brasil (1999-2007)


Acidentes por animais peonhentos/serpentes no
Brasil (1999/2007)

Nmero de Casos

7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

Ano

A maioria das notificaes dos acidentes ofdicos procedentes das regies


meridionais do pas est relacionada ao aumento da atividade humana nos trabalhos do
campo (preparo da terra, plantio e colheita) nas regies Sul, Sudeste e Centro-Oeste, cerca
de 75% dos casos notificados so atribudos a serpentes do gnero Bothrops, sendo a
maioria dos pacientes do sexo masculino (70%), o que justificado pelo fato do homem
desempenhar com mais freqncia atividades de trabalho fora da moradia, onde os
acidentes ofdicos habitualmente ocorrem. Em aproximadamente 53% das notificaes, a
faixa etria acometida situou-se entre 15-49 anos, que corresponde ao grupo de idade onde
se concentra a fora de trabalho. O acometimento dos segmentos p/perna em 70%, e
mo/antebrao, em 13% dos casos notificados, decorre da no utilizao de equipamentos
mnimos de proteo individual, tais como sapatos, botas, calas, luvas de couro e outros
(BRASIL, 2002).
Uma vez que a identificao da serpente causadora do acidente nem sempre
possvel, o diagnstico baseado em critrios clnicos e epidemiolgicos. O acidente
botrpico predominante com 90% dos casos notificados.

1.2.1 DISTRIBUIO GEOGRFICA

As serpentes do gnero Bothrops pertencem famlia Viperidae que compreende


cerca de 30 espcies, esto distribudas por todo o territrio nacional. So responsveis por
uma morbidade maior que qualquer outro grupo de serpentes venenosas no Novo Mundo.
As espcies mais importantes so Bothrops asper na Amrica Central e Bothrops atrox e
Bothrops jararaca na Amrica do Sul. No Brasil, as espcies de Bothrops so responsveis
por 90% dos acidentes ofdicos notificados. Estas serpentes habitam principalmente zonas
rurais e perifricas de grandes cidades, preferindo ambientes midos como matas e reas
cultivadas e locais onde haja facilidade para proliferao de roedores (paiis, celeiros,
depsitos de lenha). Tm hbitos predominantemente noturnos ou crepusculares. Podem
apresentar comportamento agressivo quando se sentem ameaadas, desferindo botes sem
produzirem rudos (BRASIL, 2001).
So muitas as espcies de Bothrops consideradas de interesse para a Sade Pblica,
com uma ampla distribuio geogrfica, e populaes importantes nas diversas regies do
pas. Dentre elas destacam-se: Bothrops alternatus, Bothrops atrox, Bothrops
erythromelas, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, Bothrops moojeni, Bothrops
neuwiedi (FUNDACENTRO, 2001), como mostrado no Quadro 4 e nas Figuras 1, 2, 3, 4,
5, 6 e 7.

Quadro 4 Serpentes do gnero Bothrops de importncia mdica no Brasil


NOME CIENTFICO
Bothrops alternatus (1)

Bothrops atrox (2)

NOMES POPULARES
Urutu
Urutu-cruzeiro
Cruzeira
Surucucurama
Jararaca-do-norte
Combia
Jararaca-do-rabo-branco

DISTRIBUIO GEOGRFICA
RS, SC, PR, SP, MS e MG

AC, AM, RR, PA, AP, MA, RO,


TO, CE e MT (reas de floresta)
PI, CE, RN, PB, PE, AL, SE, BA e
MG (reas xerfitas/caatinga)

Bothrops erytromelas (3)

Jararaca-da-seca

Bothrops jararaca (4)

Jararaca
BA, MG, ES, RJ, SP, PR, SC e RS
Jararaca-do-rabo-branco

Bothrops jararacussu (5)

Jararacuu

BA, ES, RJ, SP, PR, MG, MT e SC

Bothrops moojeni (6)

Jararaco
Jararaca
Caiara

PI, TO, DF, GO, MG, SP, MT, MS


e PR

Bothrops neuwiedi (7)

Jararaca-pintada

Em todo pas, exceto Amaznia

1.Poucos relatos de casos. Acidentes graves; 2. Responsvel pela maioria dos registros de acidentes na
regio Amaznica; 3. Distrbios de coagulao so manifestaes mais comumente registradas. Acidentes
com poucas alteraes locais, geralmente benignos; 4. Principal agente em MG, ES, RJ e SP. Casos graves
ou bitos pouco freqentes; 5. Acidentes relatados, principalmente em SC. Acidentes graves ou casos fatais;
6. Responsvel pela maioria dos registros de acidentes no oeste de SP e de MG e dos atendimentos em
Goinia/GO; 7. Distribudas pelo territrio nacional, com exceo da Amaznia. Siglas: RS-Rio Grande do
Sul, SC-Santa Catarina, PR-Paran, SP-So Paulo, MS-Mato Grosso do Sul, MG-Minas Gerais, AC-Acre,
AM-Amazonas, RR-Roraima, PA-Par, AP-Amap, MA-Maranho, RO-Rondnia, TO-Tocantins, CECear, MT-Mato Grosso, PI-Piau, RN-Rio Grande do Norte, PB-Paraba, PE-Pernabuco, AL-Alagoas, SESergipe, BA-Bahia, ES-Esprito Santo, RJ-Rio de Janeiro, DF-Distrito Federal, GO-Gias.
Fonte: CENEPI, 1998

Figura 1- Bothrops alternatus

10

Figura 2 - Bothrops atrox

Figura 3 - Bothrops erythromelas

Figura 4 - Bothrops jararaca

11

Figura 5 - Bothrops jararacussu

Figura 6 - Bothrops moojeni

Figura 7 - Bothrops neuwiedi

12

1.3 MECANISMO DE AO DO VENENO


As peonhas das serpentes do gnero Bothrops so as mais estudadas de todos os
venenos. Mais de 90% do peso seco do veneno constitudo por uma mistura de variados
peptdeos e protenas farmacologicamente ativas que induzem uma grande diversidade de
sintomas nos pacientes acidentados. Tambm esto presentes nos venenos, protenas no
txicas. A frao no protica composta por carbodratos, lipdios, metais
(freqentemente associados glicoprotenas e metaloprotenases), aminas biognicas,
nucleotdeos e aminocidos livres. A funo de cada componente, assim como sua
interao no envenenamento humano ainda no est totalmente esclarecida. (WARRELL,
1989; CARDOSO, 2003; BOURGUIGNON, 2001).
O estudo dos venenos de serpentes de grande importncia cientfica para a
elucidao de diversos mecanismos farmacolgicos, destacando-se a neurotransmisso na
juno neuromuscular, a estrutura e a funo dos receptores nicotnicos, a cascata da
coagulao, a fibrinlise, o sistema complemento, o processo inflamatrio e a atividade
hemorrgica e miotxica.
O veneno das serpentes do gnero Bothrops caracterizado por provocar
importantes leses teciduais locais, como hemorragias, necrose e edema, assim como
alteraes no sistema de coagulao sangunea. Esses fenmenos fisiopatolgicos so
devidos a efeitos sinrgicos de enzimas ativas e toxinas presentes nos venenos (OWNBY,
1990; BJARNASON & FOX, 1994 e GUTIERREZ, 1995).
As atividades fisiopatolgicas do veneno botrpico so: proteoltica, mais bem
definida como inflamatria aguda, coagulante e hemorrgica. Essas atividades so
extremamente complexas e podem, usualmente, ser atribudas a componentes especficos.
No entanto, diferentes toxinas podem atuar sinergicamente para induzir um efeito e uma
dada toxina pode ter vrias atividades (ROSENFELD, 1971).

1.3.1 ATIVIDADE INFLAMATRIA AGUDA


causada por um conjunto de toxinas do veneno botrpico, responsveis pelos
efeitos locais. Esto envolvidos nesta ao, aminas biognicas prformadas do tipo
histamina, peptdeos de baixo peso molecular e protenas como a fosfolipase A, esterases,
proteases, enzimas liberadoras de cininas (calicrenas, cininogenases) e lectinas. Diversas
toxinas do veneno tm atividade indireta, induzindo ou liberando potentes autacides,
como a bradicinina, prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclinas que atuam de modo
13

bastante complexo e interdependente. Freqentemente, uma nica toxina do veneno


capaz de induzir a liberao de vrias substncias com atividade inflamatria.
As toxinas com atividade procoagulante tambm participam na induo do processo
inflamatrio com a formao de trombos na corrente microcirculatria, provocando
hipxia, agravamento do edema e necrose tecidual. Os fenmenos hemorrgicos,
determinados pelas hemorraginas, podem agravar o quadro inflamatrio, atravs da
ativao do Fator de Necrose Tumoral (TNF).
A atividade inflamatria aguda ocorre muito provavelmente devida interao da
ao de diversas toxinas, o que pode explicar a grande variao nos sintomas observados,
tanto em estudos experimentais quanto em relatos clnicos (FRANCISCHETTI, e col.,
1998; GUTIRREZ, 1998; CASTRO, 1999; CAMEY, 2002; FRANA & MLAQUE,
2003).

1.3.2 ATIVIDADE DE COAGULAO


O veneno botrpico tambm possui capacidade de ativar fatores de coagulao
sangunea, ocasionando consumo de fibrinognio e formao de fibrina intravascular,
induzindo freqentemente a incoagulabilidade sangunea. A grande maioria das serpentes
do gnero Bothrops possui toxinas capazes de ativar fibrinognio, protrombina e fator X
(NAHAS, 1979). So tambm descritos fatores com atividade inibitria sobre a agregao
plaquetria. Pode ocorrer trombocitopenia nas primeiras horas, persistindo por at alguns
dias (FRANA & MLAQUE, 2003).
1.3.3 ATIVIDADE HEMORRGICA
Hemorragia sistmica uma das manifestaes mais srias dos envenenamentos
por serpentes do gnero Bothrops em humanos. A hemorragia ocorre em vrios rgos e
responsvel por hipovolemia, hipotenso, hipoperfuso tissular, choque cardiovascular e
severos acidentes crebro-vasculares (GUTIRREZ, e col., 2009).

1.4 ACIDENTE BOTRPICO

Desde a implantao do Programa Nacional de Controle dos Acidentes por Animais


Peonhentos, em 1986, toda a produo dos soros antipeonhentos produzidos no Brasil
adquirida pelo Ministrio da Sade e distribuda s secretarias estaduais de sade que, por
14

sua vez, definem os pontos estratgicos para atendimento dos acidentes e utilizao dos
antivenenos. Assim garante-se o acesso gratuito e universal ao tratamento soroterpico.
Todavia, faz-se necessrio o controle da distribuio e dos estoques nos Estados, de
modo a garantir a racionalidade na utilizao dos imunobiolgicos (BRASIL, 2007).
O quadro clnico local, no acidente botrpico se caracteriza por uma picada que se
constitui, na maioria dos casos, em uma inoculao subcutnea ou intramuscular de veneno
na vtima. O sangramento no stio de inoculao freqentemente observado, porm sua
presena nem sempre indica comprometimento sistmico. O edema ocorre precocemente,
sendo caracteristicamente tenso (ou firme), apresentando muitas vezes tonalidade violcea
em decorrncia do sangramento subcutneo. A equimose no local da picada pode acometer
poro extensa do membro. O edema inicialmente circunscrito pode em at 24 horas
estender-se a todo o membro. Em poucas horas desenvolve-se linfadenomegalia regional,
com gnglios aumentados e dolorosos, podendo apresentar equimose no trajeto dos vasos
que drenam a regio. Algumas horas aps o acidente podem aparecer bolhas em
quantidade e propores variveis, com contedo seroso, hemorrgico ou necrtico
(FRANA & MLAQUE, 2003).

1.4.1. GRAVIDADE DO ACIDENTE


As

principais

complicaes

locais

so:

abscesso,

necrose

sndrome

compartimental.
Abscesso, celulite e erisipela podem ser observadas no local da inoculao. Estas
infeces so freqentes, devido s condies propcias ao crescimento bacteriano
provocado pela reao inflamatria aguda, assim como pela presena de abundante flora
bucal nas serpentes (bactrias anaerbicas e gram-negativas). A incidncia de abscessos
pode variar de 1 a 17,2% dos casos. Os fenmenos inflamatrios inerentes ao acidente
botrpico dificultam a avaliao clnica da presena de infeco. O edema, o eritema, a dor
e o calor local podem tanto ser provocados pela ao do veneno, quanto pela infeco
local.
A incidncia de necrose bastante varivel (de 1 a 20,6%) geralmente limitada ao
tecido subcutneo, podendo comprometer estruturas mais profundas como tendes,
msculos e ossos. A intensidade e a extenso da necrose esto intimamente ligadas
utilizao de torniquetes e demora entre o acidente e a administrao da soroterapia. Em
casos extremos pode ser necessria a amputao de parte do membro acometido
(FRANA & MLAQUE, 2003).

15

Alm do quadro de envenenamento local, o quadro sistmico extremamente


importante. Pequenos sangramentos como gengivorragias, microhematria, prpuras
(equimoses em locais longe das picadas, devido a injees intramusculares ou pequenos
traumatismos) e sangramentos em feridas recentes podem ocorrer nos casos leves e
moderados. Com menor freqncia pode ocorrer hematria macroscpica, hemoptise,
epistaxe, sangramento conjuntival, hipermenorragia e hematmese (KAMIGUTI & SANOMARTINS, 1995). Em casos graves so observadas hemorragias intensas podendo
acometer rgos vitais, choque e insuficincia renal. So relatadas como causas de bito,
hemorragia digestiva e do sistema nervoso central. A principal complicao sistmica do
acidente botrpico so as insuficincias renais agudas, que podem ser provocadas por
coagulao intravascular disseminada e hipotenso.

1.5 SOROTERAPIA

O nico tratamento especfico, atualmente disponvel para o acidente por animais


peonhentos, a soroterapia, que consiste na aplicao nos pacientes de um soro
constitudo por um concentrado de anticorpos. A soroterapia tem a finalidade de combater
uma doena especfica (no caso de doenas infecciosas) ou um agente txico especfico
(venenos ou toxinas).
Com a descoberta do principio da imunizao ativa artificialmente induzida e que o
sangue dos animais imunizados continha anticorpos, que no s destruam os agentes
invasores, como apresentavam poder teraputico e profiltico, teve incio a soroterapia
antiofdica (INSTITUTO BUTANTAN, 2006).
Em 1901, Vital Brasil comeou a produzir antivenenos mono e poli especficos
(Soro Antibotrpico, Anticrotlico e Antiofdico) no Instituto Soroteraputico, localizado
na Fazenda Butantan (BRASIL, 1987). Em 1903 publica um trabalho onde resume suas
pesquisas na imunologia dos envenenamentos por serpentes (BRAZIL, 1903). Neste
trabalho, no somente demonstra exaustivamente a especificidade dos antivenenos, como
tambm da existncia, em certos casos, de uma ao paraespecfica, conferindo alguma
imunidade cruzada entre espcies filogeneticamente aproximadas. Tambm apresenta
observaes sobre vinte e um pacientes tratados com soros antipeonhentos produzidos no
Instituto Butantan.

16

Atualmente mais de um sculo depois, com algumas modificaes a soroterapia,


como proposta por Calmette e Vital Brasil em 1894, ainda o nico tratamento especfico
contra os acidentes ofdicos.
Desta forma a soroterapia constitui a principal ferramenta para o tratamento destes
acidentes. Sua indicao baseia-se nos critrios clnicos de gravidade (Quadro 5). O soro
utilizado constitudo de imunoglobulinas especficas purificadas, obtidas a partir de
plasma de eqinos hiperimunizados, com antgeno do gnero Bothrops, composto por
venenos das serpentes citadas anteriormente.
Cada ampola de soro antibotrpico contm 10 mL e neutraliza no mnimo 50 mg
de veneno-referncia de B. jararaca (soroneutralizao em camundongos).
Os soros antiofdicos so disponibilizados gratuitamente a populao atravs do
Sistema nico de Sade SUS, no sendo comercializados nem disponveis na rede de
hospitais privados.

Quadro 5 Acidente botrpico: Classificao quanto gravidade e quantidade aproximada


de veneno a ser neutralizada

Locais:
GRAVIDADE principalmente
edema
(avaliao inicial)

Leve (L)

Discreto

Moderada (M)

Evidente

Grave (G)

Intenso

MANIFESTAES E TRATAMENTO
Quantidade
Sistmicas:
aproximada
hemorragia
Tempo de
de veneno
grave,
Coagulao
a ser
choque,
(TC) *
neutralizada
anria
(mg)
Normal
Ausentes
ou
100
alterado
Ausentes
Normal
ou
ou
200
presentes
alterado
Normal
Evidentes
ou
300
alterado

Via de
administrao

IV **

IV

IV

(*) TC normal: at 10 minutos; TC prolongado: de 10 a 30 minutos; TC incoagulvel: > 30 minutos


(**) IV = intravenosa
Observao: a determinao do TC tem sido usada como parmetro da eficcia da dose de antiveneno. Se
aps 12 horas do incio do tratamento o sangue estiver incoagulvel, deve-se realizar uma soroterapia
adicional para neutralizar 100 mg de veneno.

A administrao do soro antiofdico deve ser feita o mais precocemente possvel,


por via intravenosa, em soluo diluda com soro fisiolgico (NaCl - 0,9%) ou glicosado
(glicose - 0,5%). importante, aps a soroterapia o acompanhamento contnuo de

17

alteraes locais e sistmicas para a deteco e tratamento precoce das complicaes e,


eventualmente, a administrao de doses adicionais de antiveneno (Quadro 6).
Por tratar-se de produto biolgico da mais alta relevncia para a Sade Pblica o
soro antiofdico ideal, deve ser seguro, eficaz e no provocar efeitos adversos quando
administrado por via sistmica.

Quadro 6 - Nmero de ampolas de soros para tratamento de acidentes ofdicos


GRAVIDADE
ACIDENTE

TIPO DE SORO
LEVE

Bothrops jararaca

2-4

MODERADO

4-8

GRAVE

12

Soro Antibotrpico
Soro Antibotrpico-crotlico
Soro Antibotrpico-laqutico

Fonte: CENEPI, 1998

1.6 A PRODUO DE SOROS ANTIPEONHENTOS NO BRASIL

Os soros antibotrpicos atualmente utilizados no Brasil so produzidos pelo


Instituto Butantan IB (SP), Instituto Vital Brasil IVB (RJ) e Fundao Ezequiel Dias
FUNED (MG), atravs da imunizao de cavalos com venenos provenientes das cinco
espcies do gnero Bothrops mais prevalentes no Brasil: B. jararaca 50%, B. alternatus,
B. moojeni, B. jararacussu e B. neuwiedi 12,5% cada (BRASIL, 1996), e so distribudos
pelo Ministrio da Sade, atravs da Fundao Nacional de Sade (FUNASA). Todos
seguem o mesmo processo de produo.

1.6.1 ETAPAS DA PRODUO

Extrao do veneno.

Liofilizao

Tratando-se do botrpico, o veneno proveniente das cinco espcies mais


prevalentes no Brasil: (B. jararaca: 50%; B. alternatus, B. moojeni, B. jararacussu
e B. neuwiedi: 12,5% cada) diludo e injetado em cavalos. Este processo leva 40
dias e chamado hiperimunizao.

Realizao de uma sangria exploratria, retirando uma amostra de sangue para


medir o teor de anticorpos produzidos em resposta s injees do antgeno.
18

Dosagem do teor de anticorpos. Ao atingir o nvel desejado, ento realizada a


sangria final retirando-se cerca de quinze litros de sangue de um cavalo de 500 kg
em trs etapas, com um intervalo de 48 horas.

O soro obtido a partir da purificao e concentrao do plasma, onde so


encontrados os anticorpos.
Observao: As hemcias so devolvidas ao animal, em um processo chamado
plasmaferese. Esta tcnica de reposio minimiza os efeitos colaterais provocados
pela sangria do animal.

O soro purificado concentrado atravs de ultrafiltrao molecular, submetido


filtrao clarificante e esterilizante (Figura 8).

O soro estocado entre 2 e 8 C e submetido aos testes de controle da qualidade.

Aps o controle da qualidade, o soro formulado: diludo para alcanar o ttulo


desejado (> 5,0 mg/mL), adicionando o conservante fenol (< 0,35%), isotonizado
((NaCl 0,7 a 0,9%), tendo o pH ajustado na faixa entre 6 e 7 (Quadro 7).

No final do processo, o soro terminado a granel (bulk) novamente submetido a


testes de controle da qualidade citados abaixo, para liberao do lote, conforme o
preconizado na Farmacopia Brasileira 4 edio, parte II, 5 fascculo.

Figura 8 Processamento do Plasma para obteno de Soro


19

Quadro 7 Fases do processo de produo e controle de soros


FASE
1
2

Tamponamento do
plasma
Purificao do
plasma

OBJETIVO
Melhorar a qualidade
Conservar e manter
estvel

MECANISMO
Adicionar tampo
cido ctrico pH 4,8
Adicionar fenol e
centrifugar

Precipitar e eliminar a Adicionar sulfato de


albumina e pigmentos amnia e centrifugar

CONTROLE
DA
QUALIDADE
Verificar o pH
Analisar teor de
fenol
Analisar teor de
sulfato de
amnia

Desnaturao das
protenas

Tamponamento e
salinizao da
suspenso de
protenas

Otimizar a digesto

Filtrao molecular

Eliminar
imunoglobulinas

Adicionar cido
clordrico ou fosfato
de clcio pH 3,2 e
cloreto de sdio e
centrifugar
Purificar por
cromatografia

Dilise

Eliminar resduos de
sulfato de amnia

Filtrar em tubos de
hemodilise

Clarificao

Eliminar a turbidez

Adicionar hidrxido
de alumnio gel

Esterilizao

Purificar o produto

Adicionar etanol

Estabilizao e
preservao

Estabelecer a validade
Adicionar timerosal
do produto

Verificar a
turbidez
Analisar teor
de sulfato de
amnia
Analisar teor
de hidrxido de
alumnio
Analisar teor
de etanol
Analisar teor de
timerosal

10

Padronizao do
produto final

Verificar parmetros
de qualidade

Analisar o
bulk final

Coletar amostras do
bulk final

Verificar o pH

Fonte: Instituto Butantan (2006)

1.7 CONTROLE DA QUALIDADE DE SOROS ANTIPEONHENTOS

Todas as metodologias analticas utilizadas para o controle da qualidade e


consequente liberao dos lotes de soros antiofdicos foram realizadas de acordo com as
Normas Oficiais Brasileiras, Imunosera ad usum humanum e Immunoserum
bothropicum, publicadas pela Farmacopia Brasileira (BRASIL, 2004), detalhadas na
Portaria n 174, que aprova as normas tcnicas de produo e controle da qualidade dos
Soros Antiofdicos, Antitxicos e Anti-rbicos (BRASIL, 1996).
Os protocolos de determinao da DL50 e da DE50 foram aprovados pela Comisso
de tica no Uso de Animais da Fiocruz (CEUA), atravs do protocolo n 0135/02.
20

1.7.1 TESTES DE CONTROLE DA QUALIDADE DO PRODUTO FINAL

TESTE DE SEGURANA BIOLGICA:

Esterilidade - para a deteco de eventuais contaminaes durante a produo.

Pirognio - para detectar a presena de substncia e contaminantes, que provocam


alteraes de temperatura nos pacientes (febre).

Inocuidade para avaliao de segurana quanto ao uso humano (realizada at


2001).

TESTES FSICO-QUMICOS (so utilizados para qualificar e quantificar os


componentes do soro):

Determinao do volume mdio, teor de fenol, teor de sulfato de amnia, pH, teor
de cloreto de sdio, protenas e nitrognio protico.

ATIVIDADE BIOLGICA:

Determinao da potncia (DE50) (para verificao da quantidade de anticorpos


produzidos).

Um soro ideal deve ser seguro e eficaz, portanto no deve provocar efeitos adversos
quando administrado por via sistmica, alm de ter baixo custo. Bioquimicamente, o
melhor soro deve apresentar uma alta pureza e potncia, com um mnimo de contedo de
protenas totais. Clinicamente, aquele que apresente a melhor eficincia teraputica com
a menor dose e sem efeitos colaterais, e economicamente falando, aquele que oferece o
melhor balano entre eficcia teraputica e custos.
A segurana e eficcia da imunoterapia antienvenenamento esto intimamente
relacionadas pureza e a uma cuidadosa determinao da potncia do soro (WHO, 1969).

1.8 RELEVNCIA DO ESTUDO

Pelo exposto, com o objetivo de aperfeioar o ensaio de potncia do soro


antibotrpico, torna-se necessrio o estabelecimento do Veneno Botrpico de Referncia
(lote 05) e do Soro Antibotrpico de Referncia (lote 01) atravs de um estudo
interlaboratorial para a validao do ensaio de potencia relativa e da atividade biolgica do
Soro Antibotrpico de Referncia Nacional.
21

Com os resultados obtidos neste estudo, tambm ser possvel qualificar a


metodologia oficial, preconizada pela Farmacopia Brasileira (BRASIL, 2004) e pelo
Procedimento Operacional do INCQS (POP 65.3440.004).
Portanto, consideramos este estudo de relevncia para a Sade Pblica e
conseqentemente para a Vigilncia Sanitria do Brasil.

1.8.1 A INSERO DO INCQS NESTE ESTUDO


O Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade (INCQS), pertencente
Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) no Rio de Janeiro (RJ) tem como misso,
Contribuir para a promoo e recuperao da sade e preveno de doenas, atuando
como referncia nacional para as questes cientficas e tecnolgicas relativas ao controle
de qualidade de produtos, ambientes e servios vinculados Vigilncia Sanitria. Desta
forma se justifica realizar o presente estudo. Desde 1986, o INCQS tem como atividade o
Controle de Qualidade dos soros antipeonhentos, dentre eles o soro antibotrpico. No
parque industrial nacional de imunobiolgicos, temos o IB SP, IVB RJ e FUNED
MG responsveis pela produo. A utilizao e distribuio no pas esto sob a
Coordenao Geral do Programa Nacional de Imunizaes (CGPNI) do Ministrio da
Sade. importante ressaltar que todos os lotes produzidos so analisados, antes da
liberao, pelo INCQS.

1.9 ESTUDO COLABORATIVO

De acordo com as recomendaes de Workshop on the Standardization and


Control of Antivenoms, coordenado pela Quality Assurance and Safety of Biologicals
Unit da OMS (THEAKSTON, 2003) o estabelecimento de venenos e antivenenos de
referncia essencial para a padronizao destes ensaios de modo a permitir a comparao
lote a lote, assim como a comparao entre laboratrios. Idealmente as atividades dos
antivenenos devem ser expressas em unidades neutralizantes de toxina baseada em um
padro nacional e regional, certamente esta a principal recomendao deste Workshop.
Com este objetivo foi estabelecido no INCQS um soro antibotrpico de referncia,
parte importante deste estudo. Foi originrio de soros antibotrpicos de produo rotineira,
enviadas e analisadas pelos produtores nacionais e tambm pelo INCQS.

22

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL


Aperfeioar a metodologia analtica para a determinao da potncia do Soro
Antibotrpico de acordo com as recomendaes da Organizao Mundial de Sade (OMS).

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Coordenar o estudo colaborativo e definir o protocolo de trabalho.

Estabelecer o soro antibotrpico de referncia.

Estabelecer a DL50 do veneno botrpico de referncia.

23

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIAL
3.1.1 VENENO BOTRPICO DE REFERNCIA (BRA/BOT/05)
O lote n 05 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05, uma preparao
liofilizada com 4.398 frascos de veneno de Bothrops jararaca estocado a 20 C, contendo
30 mg/frasco, com uma DL50 de 47,8 g/0,5 mL, determinada pelo INCQS e uma DL50 de
33,1g/0,5 mL determinada pelo Instituto Butantan no momento de sua preparao.
Consiste em um pool obtido partir de 4.430 extraes de veneno de Bothrops jararaca
coletadas em diferentes regies do Brasil. Este pool foi obtido por 2.180 extraes de
serpentes coletadas no estado de So Paulo (49,2%); 1.073 coletadas no Esprito Santo
(24,2%); 691 em Santa Catarina (15,6%); 448 no Paran (10,1%); 34 em Minas Gerais
(0,77%) e 04 no Rio de Janeiro (0,09%). Possui 907,60 40,30 g de protena/mg de
veneno e um perfil eletrofortico em SDS-PAGE (gradiente de 7,5% a 17,5%, corado por
Azul de Coomassie), com 12 bandas de protenas, sendo cinco bandas predominantes, com
pesos moleculares de 62, 32, 28 e 14,4 kDa (Figura 9). Este lote foi preparado e
caracterizado em 2002 pelo Instituto Butantan e utilizado pelo INCQS e todos os
laboratrios produtores at a presente data.

Figura 9: Perfil eletrofortico do Veneno Botrpico de Referncia lote 05


BRA/BOT/05.

24

3.1.2 SORO ANTIBOTRPICO DE REFERNCIA (BRA/ANTIBOT/01)


O Soro Antibotrpico Candidato a Referncia foi obtido com um pool de
amostras de soros antibotrpicos (384 ampolas de 10 mL) dos laboratrios: IB, IVB,
FUNED e CPPI; (Quadro 8), aliquotado em frascos, constituindo um lote de 915 ampolas
com 3 mL, estocado entre 4 e 8 C no INCQS. Aps o pool das amostras de soros
antibotrpicos avaliou-se quanto esterilidade bacteriana e fngica, pelo mtodo de
filtrao por membrana (BRASIL, 2004).

3.1.3 ANIMAIS UTILIZADOS


Nos ensaios in vivo para o estabelecimento do Soro Antibotrpico de Referncia
Nacional foram utilizados camundongos suo-albinos de 18 a 22 gramas de ambos os
sexos, sadios, procedentes do CECAL da Fiocruz e aclimatados no SAL do INCQS
(temperatura de 23 C + 2 C, umidade aproximadamente de 70% e fotoperodo com ciclos
de oito horas), mantidos em gaiolas plsticas e tampa de ao inoxidvel, com maravalha
autoclavada.
Este ensaio foi aprovado pela Comisso de tica no Uso de Animais da Fiocruz
(CEUA), atravs do protocolo n 0135/02.

25

Quadro 8 - Relao dos lotes do pool do candidato a Soro Antibotrpico de Referncia.


AMOSTRA
1298/00
1299/00
1300/00
3762/98
3763/98
3764/98
3093/98
3094/98
3095/98
4277/98
4278/98
4279/98
1102/98
3483/98
3484/98
4828/98
5242/98
1986/00
3470/00
4254/00
4570/00
5166/00
3235/98
4980/98
5474/98
5476/98
2967/99
3492/99
4670/99
418/00

LOTE
0004052-A
0004052-B
0004052-C
9807070-A
9807070-B
9807070-C
980043-A
980043-B
980043-C
9808078-A
9808078-B
9808078-C
980201
980604-A
980604-B
980707
980909
991113
000801
000905
000902
001110
97070815
971015/20
980929/05-B
980929/05-C
990504-18
990517-22
990915-45
B02/99

PRODUTOR
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
CPPI

TOTAL

QUANTIDADE
10
10
10
15
15
15
10
15
15
15
15
15
18
14
14
21
26
19
03
03
02
03
10
15
15
23
21
16
19
21

TOTAL

160

123

119

21
423*

*Foram utilizadas 384 ampolas. Das 423, inicialmente propostas, 39 ampolas dos diferentes produtores, foram quebradas na confeco do pool.

26

3.2 MTODOS

3.2.1 SORONEUTRALIZAO
O mtodo utilizado teve como base a soroneutralizao in vitro e posterior
inoculao em camundongos, como preconizado pela Farmacopia Brasileira 4 edio,
parte II, 5 fascculo.

3.2.2

OBTENO

DO

POOL

DE

SORO

ANTIBOTRPICO

DETERMINAO DA POTNCIA DO SORO CANDIDATO REFERNCIA


O Setor de soros antipeonhentos do INCQS utilizou 384 ampolas contendo 10 mL
de soro antibotrpico dos diferentes produtores nacionais para fazer um pool do
candidato a Soro Antibotrpico de Referncia Nacional (Quadro 8).
Foram realizados pelo INCQS oito ensaios para o estabelecimento da DE50 do soro
antibotrpico de referncia. O resultado final expresso em valor mdio da DE50, seus
limites inferior e superior foram obtidos pelo mtodo de combinao dos resultados atravs
da mdia ponderada referendado pela Farmacopia Europia (Council of Europe, 2008)
(Quadro 9, Grfico 3). A homogeneidade dos resultados dos ensaios foi avaliada pelos
testes de Qui-quadrado e de Grubbs. A DE50 obtida foi 27,63 g/dose, com um limite
inferior de 26,22 g/dose e um limite superior de 29,1 g/dose (Quadro 10), que
corresponde a uma potncia de 6,92 mg/mL, com um limite inferior de 6,57 mg/mL e um
limite superior de 7,29 mg/mL.

27

Quadro 9 Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico


candidato Referncia - combinao de 8 ensaios.
DE50
27,66
26,82
27,61
33,48
26,75
24,94
25,93
32,25

LI
22,85
23,23
23,25
27,15
22,25
21,66
22,97
27,92

LS
33,48
30,96
32,78
41,29
32,18
28,71
29,28
37,24

Teste de Homogeneidade
p
X2 calc
X2 tab
12,479 0,0859
14,067
Dados homogneos
DE50
LI
LS

27,63
26,22
29,11

g/dose
g/dose
g/dose

6,92
6,57
7,29

Potncia
LI
LS

mg/mL
mg/mL
mg/mL

DE50: dose efetiva mdia; LI: limite inferior; LS: limite superior; Xcalc: qui-quadrado
calculado; Xtab: qui-quadrado tabelado e p: valor de probabilidade.
Grfico 3 Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico
candidato a Referncia - combinao de 8 ensaios.
Intervalos de confiana
45

Ttulo

40
35
30
25
20
1

4
Resultado n

LS

LI

Resultados

28

Quadro 10 DE50 do Soro Antibotrpico de Referncia - BRA/ANTIBOT/01


CLCULO DA DE50
LIMITE INFERIOR
g/dose

26,22

DE50
g/dose

27,63

LIMITE SUPERIOR
g/dose

29,11

Conforme descrito no POP 65.3440.005, a determinao da potncia do Soro


Antibotrpico feita seguindo a frmula:
Potncia = (TV-1) x DL50 do Veneno Botrpico de referncia , onde
DE50
TV = nmero de DL50 utilizadas por camundongo na dose teste de veneno.
Potncia = (4) x 47,85 = 6,92 mg/mL
27,63
3.2.3 DETERMINAO DA DOSE LETAL MDIA (DL50) DO VENENO DE REFERENCIA
Reconstituiu-se a preparao do veneno bruto liofilizado na concentrao de 1
mg/mL em NaCl 0,85%. Foram efetuadas diluies em progresso geomtrica, utilizando
fator de diluio constante, no superior a 1,5 e igualando os volumes finais (Quadro 11).
Foi inoculado com seringa de 1 mL, por via intraperitoneal, volume de 0,5 mL por
camundongo de cada diluio em grupos de, no mnimo, 10 camundongos suo-albinos de
18 a 22 gramas.

Os animais foram observados no perodo de 24 e 48 horas aps

inoculao e o nmero de mortos em cada diluio foi registrado. Os animais


sobreviventes foram sacrificados em cmara de CO2. A DL50 foi calculada, utilizando o
mtodo estatstico de probitos (FINNEY, 1971). A faixa de resposta (porcentagem de
mortes) deve estar compreendida entre 10% e 90%, obtendo a curva de regresso que deve
apresentar relao linear. Os limites de confiana no devem ser amplos, indicando melhor
preciso do ensaio. Expressar o resultado em microgramas de veneno por 0,5 mL.

29

Quadro 11 Protocolo de diluio para determinao da DL50


VENENO/CAMUNDONGO

SOLUO DE VENENO

SALINA

(1 mg/mL)

62,2 g

0.74 mL

5,26 mL

51,8 g

0,62 mL

5,38 mL

43,2 g

0,51 mL

5,49 mL

36,0 g

0,43 mL

5,57 mL

30,0 g

0.36 mL

5,64 mL

Fonte: Manual da Qualidade do INCQS, POP n 65.3440.006.


3.2.3.1 CRITRIOS PARA ACEITAO DO ENSAIO

A DL50 do veneno deve estar dentro dos limites de confiana compreendidos entre
50 e 200% do valor nominal do veneno de referncia. O clculo para a
determinao da DL50 foi feito atravs do mtodo estatstico de probitos (FINNEY,
1971) utilizando programa fornecido pela OMS (WHOPROG, 1997).

Os animais utilizados no ensaio devem morrer proporcionalmente quantidade do


veneno presente na diluio em pelo menos trs diluies consecutivas.

A faixa de resposta (porcentagem de mortos) deve estar compreendida entre 10 e


90%, obtendo a curva de regresso que deve apresentar relao linear, ou seja,
desvio de linearidade no significativo (p>0,05).

3.2.4 DETERMINAO DA POTNCIA DO SORO ANTIBOTRPICO


Foram efetuadas diluies progressivas do soro em soluo fisiolgica a 0,85 %,
utilizando fator de diluio constante, no superior a 1,5 de maneira que o volume final
aps a mistura com a dose desafio de veneno seja idntico em todos os tubos de ensaio. O
veneno de referncia foi reconstitudo e diludo para uma soluo contendo 1 mg/mL com
soluo de cloreto de sdio a 0,85 %. Foi adicionado em cada tubo um volume constante
de veneno, de modo que cada dose a ser inoculada por animal contenha 5 DL50 (Quadro
12). A mistura foi homogenizada e incubada a 37 C por 60 minutos. Foi inoculado com
seringa de 1 mL, por via intraperitoneal o volume de 0,5 mL por camundongo, de cada
mistura, em grupos de, no mnimo, 8 camundongos suo-albinos de 18 a 22 g. Os animais
foram observados no perodo de 24 e 48 horas aps inoculao o nmero de sobreviventes
de cada diluio foi registrado. A DE50 em microlitros, foi calculada utilizando mtodo
estatstico de probitos (FINNEY, 1971).

30

A potncia em miligramas por mililitro foi calculada, utilizando a equao:

Potncia (mg/mL) = TV-1x DL50 do veneno


DE50
TV = nmero de DL50 utilizadas por camundongo na dose teste de veneno.
O ttulo da potncia foi expresso em miligramas de veneno neutralizados/1 mL de soro.

Quadro 12 Protocolo de diluio para o ensaio de soroneutralizao (DE50)


VENENO (1mg/mL)

SORO

SALINA

2,8 mL

0,50 mL

2,70 mL

2,8 mL

0,38 mL

2,82 mL

2,8 mL

0,29 mL

2,91 mL

2,8 mL

0,22 mL

2,98 mL

Fonte: Manual da Qualidade do INCQS, POP n 65.3440.004.

3.2.4.1 CRITRIOS DE VALIDAO DO ENSAIO

O ensaio de determinao da atividade do veneno de referncia usando 5 DL50 do


veneno deve estar dentro dos limites de confiana (90 a 100% de mortes);

Os animais utilizados no ensaio de soroneutralizao devero sobreviver


proporcionalmente quantidade de soro presente na diluio;

No caso do ensaio da amostra se tornar invlido, pode-se repetir utilizando outra


faixa de diluio de acordo com a leitura observada;

Para o clculo da DE50 deve-se levar em conta: o limite de confiana deve estar
compreendido entre 50 e 200% da potncia estimada; a faixa de resposta
(porcentagem de sobrevivncia) deve estar compreendida entre 10 e 90%, obtendo
a curva de regresso que deve apresentar relao linear (p>0,05) utilizando-se o
resultado de, pelo menos, trs diluies consecutivas, sendo que a dose que protege
50% deve estar no intervalo compreendido entre a maior e a menor diluio do
ensaio.

O produto considerado satisfatrio se a potncia for, no mnimo, igual a 5 mg de


veneno/mL de soro.
31

3.2.4.2 VALORES ABERRANTES


Com o objetivo de avaliar a homogeneidade dos resultados identificando valores
aberrantes, os grupos de resultados foram submetidos aos testes de Grubbs e de Quiquadrado em planilha de Combinao Ponderada de Ensaios, desenvolvida e validada de
acordo com a Farmacopia Europia (Council of Europe, 2008), os valores identificados
como aberrantes foram eliminados dos clculos.

3.2.5 PROTOCOLO DO ESTUDO COLABORATIVO UTILIZADO (conforme


enviado aos produtores).

1 Etapa: Reavaliao da potncia do lote n 05 do Veneno Botrpico de Referncia


BRA/BOT/05 e a avaliao da potncia do candidato a Soro Antibotrpico de
Referncia Nacional (BRA/ANTIBOT/01).
Foram realizados trs ensaios independentes (repeties em momentos diferentes) das
seguintes determinaes:

Determinao da DE50 do Soro Antibotrpico de Referncia Nacional


(BRA/ANTIBOT/01). Esta determinao dever ser em duplicata.

Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05. Esta


determinao foi feita em paralelo com as determinaes da DE50 e potncia do
Soro de Referncia.

Avaliao da aplicabilidade de um controle de veneno paralelamente a cada


determinao de potncia dever ser inoculado com 5 DL50 um grupo de 10
animais.

32

3.2.5.1 MATERIAL

BRA/ANTIBOT/01: Foram enviados para cada laboratrio 12 frascos do soro candidato,


para a determinao da potncia em unidades neutralizantes (UN) e para a comparao
entre as metodologias de determinao da potncia pela DE50 e pela Potncia Relativa.
BRA/BOT/05: Foram enviados para cada laboratrio 05 frascos de veneno botrpico de
referncia.
E o protocolo do estudo colaborativo est no Anexo 1.

3.2.6 COLETA E ANLISE DOS DADOS


O INCQS foi responsvel pelo recebimento, reviso e codificao dos dados
submetidos pelos laboratrios participantes, pela anlise estatstica e interpretao dos
resultados. Os laboratrios foram identificados por um cdigo em todas as anlises para
manter a confidencialidade dos resultados. Um relatrio final ser preparado
posteriormente e distribudo para todos os participantes.
A potncia do Veneno Botrpico de Referncia foi expressa em quantidade de
veneno, em g/0,5 mL capaz de causar a morte em 50% dos animais inoculados (DL50). A
potncia dos soros antibotrpicos foi expressa na quantidade de veneno de referncia (em
mg) neutralizado por 1 mL de Soro Antibotrpico (mg/mL). O INCQS utilizou planilha
eletrnica desenvolvida e distribuda pela Organizao Mundial de Sade (WHOPROG,
1997). Os dados brutos de todos os laboratrios foram calculados pelo INCQS utilizando a
planilha da OMS do referido programa.
Todos os ensaios foram revalidados quanto a sua validade de acordo com os
seguintes critrios:

os animais utilizados devero morrer/sobreviver proporcionalmente dose


de veneno/soro presentes nas diluies;

deve ser utilizado, para efeito do clculo, o resultado de pelo menos 03


(trs) diluies consecutivas;

a dose letal/efetiva 50% deve estar no intervalo compreendido entre a maior


e a menor diluio utilizada.

A determinao da DL50 e DE50 foi feita pelo mtodo dos probitos. A preciso
intraensaio (repetibilidade), interensaios (preciso intermediria) e interlaboratrios
(reprodutibilidade) dos ensaios de potncia do Veneno Botrpico e do Soro Antibotrpico
33

foram calculadas atravs do coeficiente de variao (CV) de acordo com a seguinte


frmula: (TIAN, 2005)
CV = (Desvio Padro) x 100.
Mdia

3.2.6.1 CRITRIOS DE ACEITAO


Os materiais de referncia (soros e venenos) sero considerados aptos, caso a
preciso interlaboratorial (reprodutibilidade) dos ensaios de DE50 do soro e da DL50 do
veneno apresentem coeficientes de variao inferiores a 50% (WHO, 1997; van der Ark e
cols, 2000). A metodologia da potncia relativa ser considerada aplicvel, caso a preciso
interlaboratorial (reprodutibilidade) seja maior do que para a potncia absoluta, ou seja,
apresente coeficientes de variao (CV) inferiores aqueles observados para a potncia
absoluta. A aplicabilidade da implantao da metodologia, caso seja considerada apta,
dever ser definida aps uma avaliao de custo benefcio.

34

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 RESULTADOS
Este estudo foi inicialmente proposto para ser realizado em duas etapas, porm
devido ao prazo de defesa desta dissertao de Mestrado Profissional (24 meses), e tendo
em vista que todos os resultados no foram remetidos em tempo hbil para a incluso neste
trabalho, iremos abordar somente os resultados referentes primeira etapa do estudo.
A primeira etapa compreendeu a reavaliao da potncia do lote n 05 do Veneno
Botrpico de Referncia Nacional BRA/BOT/05 e a avaliao da potncia do candidato a
Soro Antibotrpico de Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01. Da segunda etapa s
foram utilizados, para efeito dos clculos os valores mdios referentes s potncias
determinadas do soro BRA/ANTIBOT/01.
Este estudo ainda mostrou que os resultados obtidos permitiram a avaliao das
precises intraensaios, interensaios e interlaboratrios dos ensaios de potncia do veneno
botrpico e do soro antibotrpico, a freqncia e causas dos ensaios invlidos assim como
as diferentes interpretaes dos laboratrios monografia do Soro Antibotrpico da
Farmacopia Brasileira (BRASIL, 2004).

A. Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05


Foi solicitado que cada laboratrio realizasse trs ensaios independentes (repeties
em momentos diferentes) para determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia
BRA/BOT/05. Observamos que os laboratrios 01 e 02 realizaram cinco ensaios, portanto
dois acima do solicitado.

35

LABORATRIO: INCQS

Ensaio de DL50 n: 1
Data: 15/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

8
8
7
5
0

DL50 39,69 g/0,5 mL

Ensaio de DL50 n: 2
Data: 30/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
8
5
4
0

DL50 42,53 g/0,5 mL

Ensaio de DL50 n: 3
Data: 14/05/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
9
5
3
1

DL50 40,96 g/0,5 mL


36

LABORATRIO: 01
Ensaio de DL50 n: 1
Data: 08/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

6
9
8
7
5

DL50 Invlido
Ensaio de DL50 n: 2
Data: 12/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
5
7
4
1

38,49 g/0,5 mL

Ensaio de DL50 n: 3
Data: 13/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
09
10

6
7
8
4
2

36,78 g/0,5 mL

37

Ensaio de DL50 n: 4
Data: 14/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
9
5
6
7

Invlido

Ensaio de DL50 n: 5
Data: 03/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

10
8
6
8
2

Invlido

38

LABORATRIO: 02
Data: 02/2008
Ensaio de DL50 n: 1
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

6
8
4
3
0

43,62 g/0,5 mL

Ensaio de DL50 n: 2
Data: 02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0

DL50

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

7
1
1
1
0

59,76 g/0,5 mL

Ensaio de DL50 n: 3
Data: 03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2

Diluio
1
2
3
4
5

DL50

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

2
5
3
1
0

Invlido

39

Ensaio de DL50 n: 4
Data: 14/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2

Diluio
1
2
3
4
5
DL50

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

7
7
4
8
1

Invlido

Ensaio de DL50 n: 5
Data: 05/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

7
4
9
2
0

38,72 g/0,5 mL

40

LABORATRIO 03
Ensaio de DL50 n: 1
Data: 20/03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
8
6
3
1

DL50 41,57 g/0,5mL


Data: 26/03/2008
Ensaio de DL50 n: 2
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
8
7
5
1

DL50 39,01 g/0,5mL


Ensaio de DL50 n: 3
Data: 28/03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2

Diluio
1
2
3
4
5

Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0

Salina
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

N de mortos
em 48 horas

5,26
5,38
5,49
5,57
5,64

0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

10
10
10
10
10

9
8
6
2
1

DL50 42,42 g/0,5mL

41

Na avaliao dos resultados apresentados, ficou demonstrada que cada


laboratrio interpreta diferentemente as recomendaes da Farmacopia Brasileira,
monografia de Soro Antibotrpico (BRASIL, 2004) que estabelece critrios para a
aceitao do ensaio de determinao da DL50 do Veneno Botrpico de referncia como
vlido.

A Farmacopia Brasileira preconiza que:

A faixa de resposta (porcentagem de mortes) deve estar compreendida entre


10% e 90%, formando a curva de regresso que deve apresentar relao linear. Os
limites de confiana no devem ser amplos, indicando melhor preciso do ensaio quanto
menor forem os seus limites. Expressar o resultado em microgramas de veneno por 0,5
ml.

O INCQS em seu Procedimento Operacional Padronizado n 65.3440.006


Determinao da Dose Letal 50% dos venenos Bothrops jararaca e Crotalus durissus
terrificus estabelece que para que um ensaio seja considerado vlido, necessrio que:

a) o valor da DL50 do veneno testado deve estar dentro dos limites de confiana (p
= 0,95) compreendidos entre 50 e 200% do valor nominal do veneno de
referncia;
b) os animais utilizados no ensaio devem morrer proporcionalmente quantidade
de veneno presente nas diluies, em pelo menos trs diluies consecutivas;
c) a dose que mata 50% dos animais deve estar no intervalo compreendido entre a
maior e a menor diluio do ensaio;
d) a faixa de resposta (porcentagem de sobrevivncia) deve estar compreendida
entre 10 e 90% formando a curva de regresso que deve apresentar relao
linear, ou seja, desvio de linearidade no significativo (p>0,05).
Obs: a interpretao dos critrios preconizados pela Farmacopia Brasileira para a
aceitao dos ensaios de DL50 e DE50 foi estabelecida pelo INCQS, com a colaborao
do Dr. Bertrand Poirier estatstico da Agence Franaise de Scurit Sanitaire des
Produits de Sant Afssaps, em 2005, quando visitou o Instituto.

42

Dos 16 ensaios de DL50, realizados nos laboratrios produtores todos foram


avaliados pelos critrios de aceitao de ensaios adotados pelo INCQS, cinco ensaios
(31,25%) foram considerados como invlidos (Quadro 13).

Quadro 13 - Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05,


realizada pelo INCQS e pelos laboratrios produtores.
INCQS Laboratrio 01 Laboratrio 02 Laboratrio 03
ENSAIO I (g/0,5 mL)
39,69
INVLIDO
43,62
41,57
ENSAIO II (g/0,5 mL)
42,53
38,49
59,76*
39,01
ENSAIO III (g/0,5 mL) 40,96
36,78
INVLIDO
42,42
ENSAIO IV (g/0,5 mL)
NR
INVLIDO
INVLIDO
NR
ENSAIO V (g/0,5 mL)
NR
INVLIDO
38,72
NR
MDIA (g/0,5 mL)
41,06
37,64
47,37
41,00
DESVIO PADRO
1,42
1,21
11,01
1,78
CV INTERENSAIO (%)
3,46
3,21
23,24
4,33
* Resultado considerado aberrante pelo teste de qui-quadrado na planilha de
combinao ponderada de resultados (Council of Europe, 2008)
NR - No realizado

Os principais motivos das invalidaes dos ensaios foram:

1. A ausncia de linearidade em pelo menos trs diluies consecutivas,


evidenciada pela inverso dos pontos da curva - quando um maior valor obtido
no corresponde ao maior estimulo aplicado ou quando a curva de regresso
apresentou um valor de p < 0,05.

2. Quando a dose que mata 50% dos animais no se encontra no intervalo


compreendido entre a maior e a menor dose. Em muitos dos casos, a dose letal
50% estava exatamente sobre a maior ou a menor dose ou at mesmo fora da
curva, o que no considerado como vlido.

Inicialmente o valor mdio das determinaes de potncia do veneno de


referncia botrpico (DL50) foi calculado pelo INCQS, pela planilha eletrnica
(WHOPROG, 1997) utilizando todos os ensaios considerados vlidos, segundo os
critrios adotados pelo INCQS com o objetivo de verificar o impacto das diferentes
interpretaes

dos

critrios

recomendados

pela

Farmacopia

Brasileira

nas

determinaes da DL50.
43

O valor mdio obtido com os critrios e os ensaios considerados vlidos pelo


INCQS foi de 42,14 g/0,5 mL com os valores do Desvio Padro e do Coeficiente de
Variao (DP = 6,20 e CV = 14,71%) (Quadro 14).
Quadro 14 - Determinao do valor mdio da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia
BRA/BOT/05 (INCQS).

DL50 Potncia (g/0,5 mL)


Desvio Padro
CV Interlaboratrios (%)

INTERLABORATORIAL
42,14
6,20
14,71

Tendo em vista que cada laboratrio realizou trs determinaes da DL50


independentes (no foram feitos experimentos em duplicatas), no foi possvel calcular
a preciso intraensaios, porm no comprometeu os objetivos deste estudo.
A preciso interensaios variou entre um CV de 3,21% (Lab 01); 3,46 %
(INCQS); 4,33 % (Lab 03) e 23,24% (Lab 02). A preciso interlaboratrios apresentou
um CV de 14,71 % (Quadro 13 e 14). Estes resultados representam, em termos de
ensaios biolgicos, um desempenho excelente, considerando-se que um CV de at 20 %
para imunoensaios como ELISA um valor aceitvel (van der ARK et al., 2000) e um
CV maior de 50 % pode ser obtido em ensaios com o uso de animais e clulas como
substrato (WHO, 1997).
Com o objetivo de eliminar resultados aberrantes no clculo da potncia
declarada do lote n 05 do veneno botrpico de referncia BRA/BOT/05 foram
aplicados os testes de Grubbs e de qui-quadrado na planilha de Combinao Ponderada
de Ensaios, recomendada pela Farmacopia Europia (Council of Europe, 2008) onde
foi identificado como aberrante o valor de 59,76 g/0,5 mL obtido pelo laboratrio 02.
Aps a excluso dos resultados aberrantes pelo teste de Grubbs. Foi obtido o valor
mdio da DL50 de 40,05 g/0,5 mL, com um limite inferior de 38,92 g/0,5 mL e limite
superior de 41,21 g/0,5 mL (Quadro 15).

44

Quadro 15 Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia - combinao


de 10 ensaios
DL50
39,69
42,53
40,96
38,49
36,78
43,62
38,72
41,57
39,01
42,42

LI
35,87
38,3
37,01
34,59
33,09
39,37
36,56
37,16
34,39
38,13

LS
43,91
47,23
45,34
42,83
40,89
48,32
41
46,5
44,25
47,19

Teste de Homogeneidade
p
X2 calc
X2 tab
0,2387
11,570
16,919
Dados homogneos
DL50
LI
LS

40,05
38,92
41,21

g/dose
g/dose
g/dose

Grfico 4 Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia - combinao de


10 ensaios.
Intervalos de confiana
50
48
46

Ttulo

44
42
40
38
36
34
32
30
1

10

Resultado n

LS

LI

Resultados

45

B. Determinao da potncia do Soro Antibotrpico candidato a Referncia


Nacional BRA/ANTIBOT/01
Foi solicitado que cada laboratrio realizasse trs ensaios independentes
(repeties em momentos diferentes) da determinao da potncia do Soro de
Referncia BRA/ANTBOT/01, sendo que cada ensaio em duplicata. Observamos que o
laboratrio 01 realizou dez ensaios, portanto quatro acima do solicitado.

LABORATRIO: INCQS
Ensaio de potncia n: IA Data: 15/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
5
2
2

28,63 g
6,69 mg/mL

Ensaio de potncia n: IB Data: 15/04/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
5
1
1

29,70 g
6,44 mg/mL

46

Ensaio de potncia n: IIA Data: 30/04/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
1
1
0

Invlido (p<0,05)
Invlido

Ensaio de potncia n: IIB Data: 30/04/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
2
2
1

Invlido (p<0,05)
Invlido

47

Ensaio de potncia n: IIIA Data: 14/05/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
5
1
1

29,70 g
6,44 mg/mL

Ensaio de potncia n: IIIB Data: 14/05/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
2
7
2
0

27,04 g
7,08 mg/mL

48

2 Etapa: Determinao da potncia do Soro Antibotrpico candidato a


Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01

Ensaio de potncia n: 1 Data:11/07/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
6
1
0

DE50: 28,82 g
Potncia: 6,64 mg/mL

Ensaio de potncia n: 2 Data: 10/09/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
4
2
2

DE50: 29,52 g
Potncia: 6,48 mg/mL

49

LABORATRIO: 01
Ensaio de potncia n: IA Data: 08/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
6
4
3

22,79 g
8,40 g/0,5 mL

Ensaio de potncia n: IB Data: 08/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
(g)
Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
7
5
0
0

32,12 g
5,96 g/0,5 mL

50

Ensaio de potncia n: IIA Data: 12/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
(g)
Soro
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50
Potncia

Invlido
Invlido

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
4
5
0
0

Ensaio de potncia n: IIB Data: 12/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
7
2
1
1

33,94 g
5,64 mg/mL

51

Ensaio de potncia n: IIIA Data: 13/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
(g)
Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
6
3
2
1

33,10 g
5,78 mg/mL

Ensaio de potncia n: IIIB Data: 13/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
5
2
4

28,63 g
6,69 mg/mL

52

Ensaio de potncia n: IA(I) Data: 13/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
7
2
2
3

Invlido
Invlido

Ensaio de potncia n: IB(I) Data: 13/02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
4
3
2
4

Invlido
Invlido

(I) ensaios invlidos

53

Ensaio de potncia n: IA(R) Data: 03/04/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
Diluio do Soro
(g)
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

10
10
10
10

N de sobreviventes
com 48 horas
10
4
4
0

29,32 g
6,53 mg/mL

Ensaio de potncia n: IB(R) Data: 03/04/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
6
4
0
0

34,32 g
5,58 mg/mL

(R) - repetio

54

2 Etapa: Determinao da potncia do Soro Antibotrpico candidato a


Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01
Ensaio de potncia n: 1 Data:16/04/08
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
7
0
0
1

DE50: Invlido
Potncia: Invlido

Ensaio de potncia n: 2 Data: 25/06/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
6
7
1
3

DE50: Invlido
Potncia: Invlido

Ensaio de potncia n: 3 Data: 01/07/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
6
4
4
1

DE50: 38,09 g
Potncia: 5,02 mg

55

LABORATRIO: 02
Ensaio de potncia n: IA
Data: 02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
7
2
2

26,97 g
7,10 mg/mL

Ensaio de potncia n: IB Data: 02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
6
0
0

30,37 g
6,30 mg/mL

56

Ensaio de potncia n: IIA Data: 02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

DE50
Potncia

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
7
7
3
2

24,37 g
7,85 mg/mL

Ensaio de potncia n: IIB Data: 02/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
(g)
Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
6
2
2

27,78 g
6,89 mg/mL

57

Ensaio de potncia n: IIIA Data: 03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)

1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50
Potncia

Invlido
Invlido

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
8
4
4

Ensaio de potncia n: IIIB Data: 03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4
DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
5
3
1

26,82 g
7,14 mg/mL

58

2 Etapa: Determinao da potncia do Soro Antibotrpico candidato a


Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01

Ensaio de potncia n: 1 Data:03/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
8
8
2
8

DE50: Invlido
Potncia: Invlido

Ensaio de potncia n: 2 Data:04/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
4
0
2

DE50: 31,80 g
Potncia: 6,02 mg/mL

59

LABORATRIO 03
Ensaio de potncia n: IA Data: 20/03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
8
6
4
3

22,79 g
8,40 mg/mL

Ensaio de potncia n: IB Data: 28/03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
Diluio do Soro
(g)
1
2
3
4
DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
8
6
3
1

25,97 g
7,40 mg/mL

60

Ensaio de potncia n: IIA Data: 28/03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4

DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
8
7
3
1

25,14 g
7,61 mg/mL

Ensaio de potncia n: IIB Data: 26/03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

Ttulo Soro/Animal Salina


(g)
(mL)
do Soro
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

2,70
2,82
2,91
2,98

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

N de sobreN de
viventes com
animais
48 horas
8
8
8
8
8
6
8
3

DE50:20,44
Potncia 9,36 mg/mL

61

Ensaio de potncia n: IIIA Data: 20/03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
8
2
1
0

32,49 g
5,89 mg/mL

Ensaio de potncia n: IIIB Data: 20/03/2008


Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo Soro/Animal
Diluio do Soro
(g)
1
2
3
4
DE50
Potncia

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes
com 48 horas
8
3
1
1

31,52 g
6,00 mg/mL

62

2 Etapa: Determinao da potncia do Soro Antibotrpico candidato a


Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01

Ensaio de potncia n: 1 Data:04/04/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo do Soro/Animal
Diluio
Soro
(g)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

Salina
(mL)

Soro
(mL)

Veneno
(mL)

N de
animais

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

2,8
2,8
2,8
2,8

8
8
8
8

N de sobreviventes com
48 horas
7
2
0
4

DE50: 35,15 g
Potncia: 5,45 mg/mL

Ensaio de potncia n: 2 Data:04/04/08


Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3

Diluio
1
2
3
4

Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14

41,4
31,8
24,5
18,8

N de sobreviventes com
48 horas
8
7
2
1

DE50: 25,91 g
Potncia: 7,39 mg/mL

63

Na avaliao dos resultados da DE50 e potncia do candidato a Soro de


Referncia, tambm ficou evidente que cada laboratrio interpreta diferentemente as
recomendaes da Farmacopia Brasileira, monografia de Soro Antibotrpico
(BRASIL, 2004). Portanto, todos os experimentos foram avaliados seguindo os critrios
de aceitao de ensaios adotados pelo INCQS pelo programa WHOPROG, mesmo
procedimento adotado para a determinao da potncia do Veneno de Referncia.

A Farmacopia Brasileira preconiza que:

A faixa de resposta (porcentagem de sobrevivncia) deve estar compreendida


entre 10% e 90%, formando a curva de regresso que deve apresentar relao linear. Os
limites de confiana no devem ser amplos, indicando melhor preciso do ensaio quanto
menor forem os seus limites. Expressar o resultado em miligramas de veneno
neutralizado por mL de soro.

O INCQS em seu Procedimento Operacional Padronizado n 65.3440.004


Ensaio de Potncia para o Soro Antibotrpico IN VIVO estabelece que para que um
ensaio seja considerado vlido, necessrio que:

a. para o clculo da DE50 deve-se levar em conta: o limite de confiana (p =


0,95) compreendidos entre 50 e 200% da potncia estimada;
b. os animais utilizados no ensaio devem sobreviver proporcionalmente
quantidade de soro presente nas diluies, em pelo menos trs diluies
consecutivas;
c. a dose que mata 50% dos animais deve estar no intervalo compreendido
entre a maior e a menor diluio do ensaio;
d. a faixa de resposta (porcentagem de sobrevivncia) deve estar compreendida
entre 10 e 90% formando a curva de regresso que deve apresentar relao
linear ou seja, desvio de linearidade no significativo (p>0,05).

64

Os resultados obtidos para as titulaes do Soro de Referncia na 2 etapa do


estudo, tambm foram considerados para efeito dos clculos do valor mdio da potncia
do candidato BRA/ANTIBOT/01 (Quadro 16 Ensaios IV e V)
Dos 37 ensaios de potncia realizados nos laboratrios produtores todos foram
avaliados pelos critrios de aceitao de ensaios adotados pelo INCQS, dez ensaios
foram considerados como invlidos (Quadro 16).
Quadro 16 - Determinao da potncia do Soro Antibotrpico de Referncia
BRA/ANTIBOT/01, realizada pelo INCQS e pelos produtores.
Ia
Ib
IIa
IIb
IIIa IIIb
IV
V
INCQS
6,69
6,44
INV
INV
6,44 7,08 6,64
6,48
INV
8,40* 5,96
5,64
5,78 6,69 INV
INV
Lab 01
6,53
INV
INV
5,58
NR
NR 5,02*
NR
Lab 02
7,10* 6,30 7,85* 6,89
INV 7,14 INV 6,02*
Lab 03
8,40* 7,40* 7,61* 9,36* 5,89* 6,00 5,45* 7,39*
INV - Ensaio invlido
NR - No realizado
* Resultado considerado aberrante pelo teste de qui-quadrado na planilha de
combinao ponderada de resultados (Council of Europe, 2008)
Os principais motivos das invalidaes dos ensaios foram:
1. No apresentar as trs diluies consecutivas, como os animais sobrevivendo
a quantidade de soro presentes nas diluies.
2. Quando a dose que mata 50% dos animais no se encontra no intervalo
compreendido entre a maior e a menor dose. Em muitos dos casos, a dose
letal 50% estava exatamente sobre a maior ou a menor dose ou at mesmo
fora da curva, o que no considerado como vlido.

Inicialmente o valor mdio das determinaes de potncia do soro antibotrpico


de referncia foi calculado pelo INCQS, pela planilha eletrnica (WHOPROG, 1997)
utilizando todos os ensaios considerados vlidos, segundo os critrios adotados pelo
INCQS com o objetivo de verificar o impacto das diferentes interpretaes dos critrios
recomendados pela Farmacopia Brasileira nas determinaes da DE50.
O valor da potncia do soro antibotrpico de referncia obtida por cada
laboratrio com os critrios e os ensaios considerados vlidos pelo INCQS foi de 6,63
mg/mL com CV intraensaios de 7,51% (INCQS), 6,15 mg/mL com CV intraensaios de
16,23% (Lab.01), 6,88 mg/mL com CV intraensaios de 11,95% (Lab. 02) e 7,19 mg/mL
com CV intraensaios de 12,82% (Lab. 03) (Quadro 17).
65

E o valor mdio interlaboratorial da potncia do soro antibotrpico de


referncia antibotrpico obtido com os critrios e os ensaios considerados vlidos pelo
INCQS foi 6,73 mg/mL, com o valor do Desvio Padro de 1,01 e dos Coeficientes de
Variaes: CV interensaios de 12,26% e CV interlaboratrios 15,03% (Quadro 18).

Quadro 17 - Mdia dos resultados da potncia do Soro Antibotrpico candidato a


Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01
INCQS Laboratrio 01 Laboratrio 02 Laboratrio 03
Potncia (mg/mL)
6,63
6,15
6,88
7,19
Desvio Padro
0,25
1,11
0,66
1,34
CV Intraensaios (%)
7,51
16,23
11,95
12,82
CV Interensaios (%)
3,70
18,04
9,61
18,64

Quadro 18 - Preciso do ensaio de potncia do Soro Antibotrpico de Referncia


Potncia (mg/mL)
Desvio Padro
CV Interensaios (%)
CV Interlaboratrios (%)

INTERLABORATORIAL
6,73
1,01
12,26
15,03

A preciso interlaboratrios apresentou um CV de 15,03% (Quadro 18). Este


resultado representa, em termo de ensaio biolgico, um desempenho excelente,
considerando-se que um CV de 50% pode ser obtido em ensaios com o uso de animais e
clulas como substrato (WHO, 1997).
Com o objetivo de eliminar resultados aberrantes no clculo da Potncia
Declarada do Lote n 01 do Soro Antibotrpico de Referncia BRA/ANTIBOT/01 foi
aplicado o teste de Grubbs na Combinao Ponderada de Ensaios, recomendado pela
Farmacopia Europia (Council of Europe, 2008) onde foram identificados como
aberrantes os valores de 8,40 e 5,02 mg/mL para o Laboratrio 01, os valores de 7,10;
7,85 e 6,02 mg/mL para o Laboratrio 02 e os valores de 8,40; 7,40; 7,61; 9,36; 5,89;
5,45 e 7,39 mg/mL para o Laboratrio 03. A homogeneidade dos dados avaliados pelo
teste de Grubbs, obteve o valor mdio da DE50 de 29,84 g/0,5 mL, com um limite
inferior de 29,03 g/0,5 mL e limite superior de 30,67 g/0,5 mL, que corresponde a
uma potncia de 6,41 mg/mL, com limite inferior de 6,24 mg/mL e limite superior de
6,59 mg/mL (Quadro19).

66

Quadro 19 Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico de


Referncia - combinao de 15 ensaios.
DE50
28,63
29,70
29,70
27,04
28,82
29,52
32,12
33,94
33,1
28,63
34,32
30,37
27,78
26,82
31,52

LI
25,31
26,76
26,76
24,51
26,16
25,99
28,77
29,71
26,25
25,31
30,19
28,13
24,75
23,23
28,24

LS
32,38
32,96
32,96
29,83
31,76
33,53
35,86
38,77
41,73
32,38
39,01
32,78
31,19
30,96
35,18

Teste de Homogeneidade
p
X2 tab
X2 calc
0,0538
23,420
23,685
Dados homogneos
29,84
29,03
30,67

DE50
LI
LS

g/dose
g/dose
g/dose

6,41
6,24
6,59

Potncia
LI
LS

mg/mL
mg/mL
mg/mL

Grfico 5 Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico de


Referncia - combinao de 15 ensaios
Intervalos de confiana

45
40
35
30
25
20
1

10

11

12

13

14

15

Resultado n

LS

LI

Resultados

67

4.2 DISCUSSO

O Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Sade (INCQS), pertencente


Fundao Oswaldo Cruz FIOCRUZ no Rio de Janeiro RJ, tem como misso
contribuir para a promoo e recuperao da sade e preveno de doenas atuando
como referncia nacional para as questes cientficas e tecnolgicas relativas ao
controle da qualidade de produtos, ambientes e servios vinculados Vigilncia
Sanitria. Alm de realizar o papel de instituto oficial de controle da qualidade de
imunobiolgicos, onde so analisados os soros produzidos e utilizados no pas.
O Brasil pela sua grande extenso territorial e suas diferenas regionais de
desenvolvimento tambm demonstra situaes especiais quanto aos relatos dos
acidentes ofdicos e conseqentemente as providncias necessrias e urgentes. Merece
destaque a regio nordeste que registra o maior coeficiente anual de acidentes ofdicos
por regies fisiogrficas, e maior ndice de letalidade desse agravo (SINITOX, 2009).
H, portanto a necessidade de maior vigilncia quanto aos acidentes ofdicos. Estes
ndices elevados podem ser pela falta de unidades de sade equipadas e com pessoal
tcnico treinados nesta regio do pas ou tambm somados os tratamentos empricos
rotineiros nesta rea. Situao oposta encontrada na regio sul. Esta apresenta o
grande nmero de notificaes de casos de envenenamentos ofdicos no pas e a menor
taxa de letalidade. Observa-se a necessidade de investimento na preparao de pessoal
especializado e maior nmero de unidades de atendimento para fornecer uma real
situao nacional dos acidentes ofdicos.
O desenvolvimento desta rea necessita tambm de pesquisa para melhoria dos
antivenenos oferecidos a populao e conseqentemente a padronizao de mtodos
para dosagem de sua eficcia. Sendo o INCQS, referncia do Ministrio da Sade nesta
rea, a partir de 1991 criou-se o Setor de Soros Antipeonhentos, considerando-se o
interesse em projetos de pesquisa de relevncia ou programas de monitoramento dos
produtos, oferecidos a populao, bem como o controle dos mesmos para a sade
pblica.
A Unidade da Garantia da Qualidade e Segurana de Biolgicos da OMS organizou
em fevereiro de 2001 em Londres o Workshop on the Standardization and Control of
Antivenoms, para discutir o progresso na padronizao e controle da qualidade de
antivenenos. Recomendou-se o estabelecimento de padres de referncia nacionais ou
regionais para o ensaio de potncia de modo a permitir a comparao lote a lote, assim
como a comparao entre laboratrios.
68

Sob a responsabilidade do INCQS foi realizada uma reunio em maio de 2002, com
todas as entidades relacionadas com a produo, controle e distribuio dos soros
antipeonhentos no Brasil, aonde vimos o interesse pela implantao de melhorias nas
metodologias analticas para o controle da qualidade dos soros antipeonhentos assim
como a necessidade de se produzir novo lote de veneno de referncia, e que o ttulo
deste veneno fosse estabelecido atravs de um estudo colaborativo interlaboratorial. At
hoje a potncia (em DL50) do veneno botrpico (lote 05) foi estabelecido unicamente
pelo INCQS o valor de 47,8 g/0,5mL, sendo este utilizado por todos os laboratrios
produtores.
O trabalho recente de Arajo e cols, (2008) constitui um dos poucos onde
realizada a avaliao de metodologias para determinao da potncia do soro
antibotpico no Brasil. Neste proposto, a metodologia da potncia relativa para
determinao da potncia do soro antibotrpico.
Desta forma esperamos que nossa linha de trabalho possa contribuir para a rea de
controle da qualidade de soros antiofdicos, rea esta to carente de publicaes em
nosso pas.
Um estudo colaborativo visando determinar a potncia do veneno e do soro
antibotrpico de referncia foi realizado no ano de 2007 e contou com a participao
dos produtores nacionais, onde, na realizao de uma primeira etapa, foi reavaliada a
potncia do veneno botrpico e avaliada a potncia do soro antibotrpico de referncia.
Os resultados obtidos mostraram uma homogeneidade e padronizao na realizao dos
ensaios necessrios.
De acordo com os critrios de aceitao previamente estabelecidos para este estudo
(ANEXO I), que previa que os materiais de referncia (soro e veneno) seriam
considerados aptos, caso a preciso interlaboratorial (reprodutibilidade) apresentasse
coeficientes de variao inferiores (CV) a 50 %, vimos que a potncia declarada em
DL50 do lote 05 do veneno botrpico de referncia deve passar a ser de 40,0 g/0,5 mL,
este valor dever ser adotado por todos os laboratrios em substituio ao valor de
47,85 g/0,5 mL, tendo em vista que a preciso interlaboratrios (CV) foi de 14,71 %,
resultado considerado excelente. Tendo em vista que um (CV) de at 20 % para
imunoensaios como ELISA um valor aceitvel (van der ARK et al., 2000) e um (CV)
maior de 50 % pode ser obtido em ensaios com o uso de animais e clulas como
substrato (WHO, 1997).

69

Coube ao INCQS, rgo da Vigilncia Sanitria como funo por ser tambm o
organizador deste estudo, o estabelecimento de um soro antibotrpico de referncia.
Foram utilizadas amostras de soros enviadas e previamente analisadas pelos
laboratrios produtores nacionais. Estas amostras constituram um pool, dando
origem ao lote de soro antibotrpico candidato a referncia, conforme descrito na parte
da obteno do pool de soro antibotrpico (3.2.2). Os resultados encontrados de DE50
foram 27,63 g/0,5 mL, com um limite inferior de 26,22 g/0,5 mL, e um limite
superior de 29,11 g/0,5 mL e a sua potncia de 6,92 mg/mL, estando este valor dentro
do limite aceito pela Farmacopia Brasileira (BRASIL, 2004). Alquotas desse pool do
soro antibotrpico candidato referncia foram utilizadas no presente estudo
interlaboratorial.
Como resultado desse estudo o valor da DE50 obtida foi de 29,84 g/0,5 mL,
com um limite inferior de 29,03 g/0,5 mL, e um limite superior de 30,67 g/0,5 mL,
sendo sua potncia de 6,41 mg/mL, com um limite inferior de 6,24 mg/mL e limite
superior de 6,59 mg/mL (Quadro19), o que estaria de acordo com a potncia mnima
para liberao de lote de soro antibotrpico segundo a Farmacopia Brasileira de 5,0
mg/mL. O CV interlaboratorial obtido foi de 15,04 % (Quadro 18) menor do que os 50
% - valor aceitvel pela OMS - estando apto, para o objetivo proposto.
Todos os experimentos foram avaliados seguindo os critrios de aceitao de
ensaios adotados pelo INCQS e calculados pelo programa (WHOPROG, 1997), sendo o
mesmo procedimento adotado para a determinao da potncia do Veneno de
Referncia, assim como para a determinao da potncia do soro antibotrpico de
referncia.
Este estudo mostrou alm dos resultados significativos, a necessidade da
continuidade desta linha com estudos interlaboratorial, desenvolvendo e validando uma
metodologia de avaliao da Potncia Relativa do soro antibotrpico frente a um soro
padro de referncia nacional, possivelmente seria a estratgia mais adequada no
sentido de se obter resultados mais confiveis e precisos, em curto e mdio prazo.

70

5 CONCLUSO

Baseado nos resultados expostos podemos concluir que:


 A potncia declarada em DL50 do lote n 05 do Veneno Botrpico de Referncia
(BRA/BOT/05) passa a ser 40,0 g/0,5 mL. Este valor deve ser adotado por
todos os laboratrios nos ensaios de potncia para liberao de lotes em
substituio ao valor anteriormente utilizado.
 A potncia declarada do lote n 01 do Soro Antibotrpico de Referncia
(BRA/ANTIBOT/01) de 6,41 mg/mL. Este valor deve ser adotado por todos os
laboratrios nos estudos de avaliao da metodologia da potncia relativa para a
liberao de lotes do Soro Antibotrpico em substituio a metodologia oficial
da potncia absoluta.
 Os ensaios de potncia do veneno botrpico (BRA/BOT/05) e do soro
antibotrpico (BRA/ANTIBOT/01) revelaram que a preciso obtida foi
satisfatria por ser menor de 50%, valor aceito pela OMS.
 O candidato a Soro Antibotrpico de Referncia pelos resultados apresentados,
est apto para ser adotado como a Referncia Nacional cumprindo, portanto um
dos objetivos deste estudo.
 H necessidade de reviso da monografia atual de Soro Antibotrpico da
Farmacopia Brasileira, bem como uniformizar as diferentes interpretaes dos
laboratrios, mostradas neste estudo.

71

6 REFERNCIAS
ACIDENTES por Animais Peonhentos. Instituto Butantan. Disponvel em:
http://www.butantan.gov.br/novapagina/perguntas.htm . Acesso em: 20 abr 2006
ARAJO, H.P,; BOURGUIGNON, S.C.; BOLLER, M.A.A.; DIAS, A.A.S.O.;
LUCAS, E.P.R.; SANTOS, I.C.; DELGADO, I.F. Potency evalution of antivenenoms in
Brazil: The national control laboratory experience between 2000 and 2006. Toxicon, v.
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aux

em:

immunesrums

75

ANEXO I
ESTUDO COLABORATIVO:
DETERMINAO DA POTNCIA
DE UM CANDIDATO A SORO ANTIBOTRPICO NACIONAL
BRA/ANTIBOT/01, PARA A AVALIAO DA METODOLOGIA DA POTNCIA RELATIVA E PARA
REAVALIAO DA POTNCIA DO
LOTE N 05 DO VENENO BOTRPICO DE REFERNCIA BRA/BOT/05

76

ESTUDO COLABORATIVO PARA A DETERMINAO DA POTNCIA DE


UM CANDIDATO A SORO ANTIBOTRPICO DE REFERNCIA NACIONAL
BRA/ANTIBOT/01, PARA A AVALIAO DA METODOLOGIA DA POTNCIA RELATIVA E PARA REAVALIAO DA POTNCIA DO LOTE N 05 DO
VENENO BOTRPICO DE REFERNCIA BRA/BOT/05

I.

INTRODUO:

Com o objetivo de aperfeioar a metodologia analtica para a determinao da


potncia do Soro Antibotrpico e de acordo com as recomendaes do
Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms realizado em
Londres em 2001 e coordenado pela Quality Assurance and Safety of
Biologicals Unit da Organizao Mundial de Sade (Theakston, 2003), que
preconiza ... o estabelecimento de venenos e antivenenos de referencia
essencial para a padronizao destes ensaios e para permitir a comparao lote
a lote, assim como a comparao entre laboratrios. Idealmente a atividade dos
antivenenos deve ser expressa em unidade neutralizante de toxina baseada em
um padro nacional ou regional.

O INCQS se prope a organizar um estudo colaborativo com o objetivo de:


1.

Avaliar a potncia de um candidato a Soro Antibotrpico de Referncia Nacional.


O lote candidato a Soro Antibotrpico de Referncia Nacional
BRA/ANTIBOT/01, foi produzido no INCQS a partir de um pool de 360
frascos provenientes dos seguintes produtores: Centro de Produo de
Pesquisa de Imunobiolgicos CPPI; Fundao Ezequiel Dias FUNED; Instituto Butantan IB e Instituto Vital Brasil IVB. Este lote
consiste em uma preparao lquida em alquotas de 3 mL, estocado entre
4 e 8 C.

2.

Comparar a metodologia de determinao da Potncia do Soro Antibotrpico pela determinao da Dose Efetiva 50% (DE50) com a metodologia da Potncia Relativa.
77

Com o objetivo de discutir as questes relacionadas produo e controle da qualidade dos soros antipeonhentos produzidos no pas o INCQS
convocou uma oficina de trabalho nos dias 22 e 23 de maio de 2002, intitulada: Situao atual e perspectivas futuras para a produo e controle
de soros antipeonhentos utilizados no Brasil. Esta reunio contou com a
participao das seguintes entidades: Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Sade - INCQS/FIOCRUZ, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA, Fundao Nacional de Sade FUNASA, Centro de Produo de Pesquisa de Imunobiolgicos CPPI, Fundao Ezequiel Dias FUNED, Indstria Qumica do Estado de Gois IQUEGO,
Instituto de Biologia do Exrcito IBEx, Instituto Butantan IB e Instituto Vital Brasil IVB. Dentre vrias deliberaes resultantes da reunio,
podemos destacar a disposio de todos os envolvidos em trabalhar conjuntamente na avaliao e implementao de melhorias nas metodologias
analticas para o controle da qualidade destes produtos. Foi ponto consensual que o desenvolvimento e validao de uma metodologia de avaliao da potncia relativa do soro antibotrpico frente a um soro padro
de referncia nacional, possivelmente seja a estratgia mais adequada no
sentido de se obter resultados mais confiveis, em curto prazo.

3.

Reavaliar a potncia do lote n 05 do Veneno Botrpico de Referncia


BRA/BOT/05.
De acordo com as concluses e recomendaes do estudo colaborativo
para o estabelecimento do veneno botrpico de referncia nacional
realizado em maro de 2003 onde foi consenso que: Tendo em vista os
diferentes resultados obtidos pelos Laboratrios participantes, no
possvel a determinao de um valor de DL50 para o Lote 05 do Veneno
de Referncia que represente o comportamento do ensaio nos diferentes
Laboratrios nas condies atualmente observadas e tambm, at que
seja possvel a titulao do Lote 05 do Veneno Botrpico de
Referncia atravs de um Estudo Colaborativo, os Laboratrios
devero utilizar como referncia o valor da DL50 de 47,85 g/0,5 mL,
obtido pelo INCQS, propomos a uma reavaliao do ttulo do lote n 05
do Veneno Botrpico de Referncia.

78

4.

Avaliar a aplicabilidade de um controle de veneno.

Tendo em vista que a metodologia preconizada pela Farmacopia


Brasileira no prev a realizao de controle positivo para a dose de
veneno utilizada no desafio, propomos a avaliao da aplicabilidade da
introduo de um controle positivo para a dose desafio (5 DL50), em
paralelo as determinaes da potncia. Em observaes preliminares
evidenciamos, com uma certa freqncia, que a dose desafio (5 DL50)
pode no matar 100% dos animais inoculados, o que seguramente
interfere significativamente nos resultados obtidos.

Este estudo consistir em duas etapas, primeiramente ser determinada a


potncia do soro candidato referncia, reavaliado o ttulo do lote n 05 do Veneno
Botrpico de Referncia BRA/BOT/05 e avaliada a aplicabilidade de um controle de
veneno. Em uma segunda etapa ser realizada a comparao entre as metodologias de
determinao da potncia pela DE50 e pela Potncia Relativa.

II. PARTICIPANTES

Laboratrios brasileiros produtores de Soro Antibotrpico e o INCQS.

III. MATERIAL

BRA/ANTIBOT/001: Sero enviados 12 frascos do soro candidato, para a


determinao da potncia em unidades neutralizantes (UN) e para a comparao entre as
metodologias de determinao da potncia pela DE50 e pela Potncia Relativa.
BRA/BOT/005: Sero enviados 05 frascos de veneno botrpico de referncia.

Amostras codificadas: Sero enviados 04 frascos de quatro amostras


codificadas (de A a D).

79

IV. MTODO

1 Etapa: Avaliao da potncia do candidato a Soro Antibotrpico de


Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01, reavaliao da potncia do lote n 05 do
Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05 e avaliao da aplicabilidade de um
controle de veneno.
Devero ser realizados trs ensaios independentes (repeties em momentos
diferentes) das seguintes determinaes:

Determinao da DE50 do Soro Antibotrpico de Referncia Nacional.


BRA/ANTIBOT/01. Esta determinao dever ser feita em duplicata.

Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05.


Esta determinao dever ser feita em paralelo com a determinao da DE50.

Avaliao da aplicabilidade de um controle de veneno. Paralelamente a cada


determinao de potncia, dever ser inoculado com 5 DL50 um grupo de 10
animais.

2 Etapa: Comparao da metodologia de determinao da Potncia do


Soro Antibotrpico pela determinao da Dose Efetiva 50% (DE50) com a
metodologia da Potncia Relativa.
As quatro amostras codificadas devero ser tituladas em dois ensaios
independentes (repeties em momentos diferentes) em paralelo com o soro candidato a
referncia.
Todas as amostras sero analisadas de acordo com a 4 Edio da Farmacopia
Brasileira, parte II, 2004. As determinaes da DL50 e DE50 devero ser realizadas
seguindo os procedimentos operacionais padronizados de cada laboratrio.

V. COLETA E ANLISE DOS DADOS

O INCQS ser responsvel pelo recebimento, reviso e codificao dos dados


submetidos pelos laboratrios participantes. Um relatrio ser preparado e distribudo
para todos os participantes, para comentrios. Os laboratrios sero identificados por
um cdigo em todas as anlises para manter a confidencialidade dos resultados.
Os materiais de referncia (soros e venenos) sero considerados aptos, caso a
preciso interlaboratorial (reprodutibilidade) apresente coeficientes de variao
80

inferiores a 50% (WHO. 1997. A WHO guide to good manufacturing practice (GMP)
requirements, Part 2: Validation. Chp. 15. Validation of analytical assays. p. 65- 69.
Geneva).
A metodologia da potncia relativa ser considerada aplicvel, caso a preciso
interlaboratorial (reprodutibilidade) apresente coeficientes de variao do ensaio da
potncia relativa inferiores aqueles observados para a potncia absoluta. A
aplicabilidade da implantao da metodologia, caso seja considerada apta, dever ser
definida aps uma avaliao de custo benefcio.

VI. PUBLICAO DOS RESULTADOS

O INCQS ser responsvel pela publicao dos resultados do estudo em revista


cientfica especializada. Sero considerados autores a equipe tcnica do INCQS e at
dois tcnicos de cada laboratrio participante, designado pelo investigador principal.

VII. CRONOGRAMA

O estudo seguir o seguinte cronograma:


-

Confirmao da participao no estudo: at 10 de dezembro de 2007.

Remessa das amostras pelo INCQS: at 15 de dezembro de 2007.

Envio dos resultados e dados brutos da 1 etapa: at 15 de maro de


2008.

Envio dos resultados e dados brutos da 2 etapa: at 15 de abril de 2008.

VIII. CORRESPONDNCIA

Correspondncia, dados brutos e resultados devem ser encaminhados para:


Maria Aparecida Affonso Boller
Fundao Oswaldo Cruz
Departamento de Imunologia
Laboratrio de Vacinas Bacterianas e Soros Hiperimunes
Av. Brasil 4365, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ
CEP:21045-900
e-mail: maria.boller@incqs.fiocruz.br
Tel: (21) 3865-5130 Fax: (21) 2290-0915
81

ESTUDO COLABORATIVO:

AVALIAO DA POTNCIA DO CANDIDATO A SORO ANTIBOTRPICO DE REFERNCIA NACIONAL


BRA/ANTIBOT/01

REAVALIAO DA POTNCIA DO LOTE N 05


DO VENENO BOTRPICO DE REFERBRA/BOT/05

AVALIAO DA APLICABILIDADE DE UM CONTROLE DE


VENENO (5DL50)

AVALIAO DA METODOLOGIA DA POTNCIA RELATIVA

82

1 Etapa
1. Avaliao da potncia do candidato a Soro Antibotrpico de Referncia
Nacional. BRA/ANTIBOT/01.

Nome do Laboratrio
Ensaio de potncia n: IA Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50:

41,4
31,8
24,5
18,8

2,70
2,82
2,91
2,98

Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22

Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8

N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8

Potncia:

Ensaio de potncia n: IB Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50:

Potncia:

41,4
31,8
24,5
18,8

2,70
2,82
2,91
2,98

Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22

Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8

N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8

83

1 Etapa:

1. Avaliao da potncia do candidato a Soro Antibotrpico de Referncia


Nacional. BRA/ANTIBOT/01.

Ensaio de potncia n: IIA Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50:

Potncia:

41,4
31,8
24,5
18,8

2,70
2,82
2,91
2,98

Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22

Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8

N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8

Ensaio de potncia n: IIB Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50:

Potncia:

41,4
31,8
24,5
18,8

2,70
2,82
2,91
2,98

Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22

Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8

N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8

84

1 Etapa:

1. Avaliao da potncia do candidato a Soro Antibotrpico de Referncia


Nacional. BRA/ANTIBOT/01.

Ensaio de potncia n: IIIA

Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50:

Potncia:

41,4
31,8
24,5
18,8

Soro
(mL)

2,70
2,82
2,91
2,98

0,50
0,38
0,29
0,22

Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8

N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8

Ensaio de potncia n: IIIB

Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3

Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4

4,61
6,00
7,80
10,14

DE50:

Potncia:

41,4
31,8
24,5
18,8

2,70
2,82
2,91
2,98

Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22

Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8

N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8

85

1 Etapa:
2. Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05
Ensaio de DL50 n: 1
Data: / /
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2

Diluio
1
2
3
4
5
DL50:

Concentrao
Salina
de Veneno
(mL)
(g)
62,2
5,26
51,8
5,38
43,2
5,49
36,0
5,57
30,0
5,64

Veneno
(mL)
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

N de sobreN de aviventes em
nimais
48 horas
10
10
10
10
10

Ensaio de DL50 n: 2
Data: / /
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50:

Concentrao
Salina
de Veneno
(mL)
(g)
62,2
5,26
51,8
5,38
43,2
5,49
36,0
5,57
30,0
5,64

Veneno
(mL)
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

N de sobreN de aviventes em
nimais
48 horas
10
10
10
10
10

Ensaio de DL50 n: 3
Data: / /
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50:

Concentrao
Salina
de Veneno
(mL)
(g)
62,2
5,26
51,8
5,38
43,2
5,49
36,0
5,57
30,0
5,64

Veneno
(mL)
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36

N de sobreN de aviventes em
nimais
48 horas
10
10
10
10
10

86

1 Etapa:
3. Avaliao da aplicabilidade de um controle de veneno

Experimento n: 1

Concentrao
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50

de

de

Data:

Salina
(mL)
3,2

Experimento n: 3

Concentrao
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50

Salina
(mL)
3,2

Experimento n: 2

Concentrao
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50

Data:

de

Data:

Salina
(mL)
3,2

Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8

N de sobreviventes em 48 horas

10

Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8

N de animais

N de animais

N de sobreviventes em 48 horas

10

Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8

N de animais

N de sobreviventes em 48 horas

10

87

2 Etapa: Comparao da metodologia de determinao da Potncia do Soro Antibotrpico pela determinao da Dose Efetiva 50% (DE50) com a metodologia da Potncia Relativa.

Ensaio de potncia n: 1

Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3
N de soTtulo
Soro/Animal Salina Soro Veneno N de brevivenAmostra
do
Diluio
animas tes em 48
(g)
(mL) (mL) (mL)
Soro
horas
1
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
2
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
Soro de
Referncia
3
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
4
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8

DE50:

Potncia:

Ttulo
Soro/Animal Salina
Amostra Diluio do
(g)
(mL)
Soro
1
4,61
41,4
2,70
2
6,00
31,8
2,82
Soro A
3
7,80
24,5
2,91
4
10,14
18,8
2,98

DE50:

Potncia:

Amostra

Soro B

DE50:
Potncia:

N de sobreSoro Veneno N de
viventes em
(mL) (mL)
animas
48 horas
0,50
2,8
8
0,38
2,8
8
0,29
2,8
8
0,22
2,8
8

.
N de soTtulo
Soro/Animal Salina Soro Veneno N de brevivendo
Diluio
(g)
(mL) (mL) (mL) animas tes em 48
Soro
horas
1
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
2
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
3
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
4
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
.
.
88

Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
viventes em
do
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8

Amostra Diluio

Soro C

DE50:

1
2
3
4
.

Potncia:

Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
viventes em
Amostra Diluio do
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
1
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
2
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
Soro D
3
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
4
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
DE50:

Potncia:

Avaliao da aplicabilidade de um controle de veneno


Experimento n: 1

Concentrao de
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50

Data:

Salina
(mL)
3,2

Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8

N de animais

N de sobreviventes em 48 horas

10

89

Ensaio de potncia n: 2

Data:

Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL


Fator de diluio do soro: 1,3
N de soTtulo
Soro/Animal Salina Soro Veneno N de brevivenAmostra
do
Diluio
(g)
(mL) (mL) (mL) animas tes em 48
Soro
horas
1
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
2
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
Soro
de
Referncia
3
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
4
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
DE50:

Potncia:

Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
do
viventes em
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8

Amostra Diluio

Soro A

1
2
3
4

DE50:

.
.

Potncia:

Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
do
viventes em
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8

Amostra Diluio

Soro B

DE50:
Potncia:

1
2
3
4
.
.

90

Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
viventes em
do
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8

Amostra Diluio

Soro C

1
2
3
4

DE50:

.
.

Potncia:

Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
do
viventes em
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
18,8
2,98 0,22
2,8
8
10,14

Amostra Diluio

Soro D

DE50:

1
2
3
4
.

Potncia:

Avaliao da aplicabilidade de um controle de veneno


Experimento n: 2

Concentrao de
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50

Data:

Salina
(mL)
3,2

Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8

N de animais

N de sobreviventes em 48 horas

10

91

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