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Anlise das placas de transformao

A transformao de leveduras consiste na introduo de molculas de DNA


em clulas vivas. No nosso caso, trataram-se clulas intactas com sais de
ltio seguindo-se um tratamento com PEG. Os ies de ltio afetam a
permeabilidade da parede celular, enquanto que a adio de uma molcula
de DNA de cadeia simples no codificante (DNA carrier ) ao DNA exgeno
que se pretende introduzir na levedura (que neste caso DNA plasmidico)
aumenta a eficincia da transformao. O PEG, faz com que o DNA exgeno
e o DNA
carrier se

concentrem superfcie da clula o que facilita a respetiva entrada para o


interior da clula.
Neste trabalho foram usados dois plasmdeos (pFL44L e pZWF1).
Plaquemos seis caixas de Petri de forma a verificar se houve sucesso na
transformao. O DNA plasmidico a utilizar na transformao da levedura
deve possuir marcadores de seleo conhecidos. Neste caso usou-se o
Uracilo como marcador. Deste modo, trs das caixas realizadas eram Ura + (o
meio de crescimento continha uracilo) e trs delas eram Ura - (o meio tinha
deficincia de Uracilo).
esperado que nas caixas Ura+ cresam todo o tipo de leveduras, visto que
h uracilo no meio, pelo que tanto leveduras capazes de produzir uracilo
como as que no tem o gene que codifica para a produo de uracilo so
capazes de crescer pois retiram uracilo do meio.
J nas caixas Ura- espera-se que apenas as leveduras transformadas sejam
capazes de crescer visto que estas contm o plasmdeo com o gene que
codifica para a sntese de uracilo ao contrario das leveduras no
transformadas que tal como foi referido acima so incapazes de produzir
esta base azotada.

Na figura que se encontra abaixo so apresentadas as placas de


transformao obtidas na aula.

Legenda:
Placa 1 Meio CAA Ura- , estirpe ZWF1 + pZWF1
Placa 2 Meio CAA Ura Ura +, estirpe ZWF1 + pZWF1
Placa 3 Meio CAA Ura -, estirpe ZWF1 + pFL44L
Placa 4 Meio CAA Ura + , estirpe ZWF1 + pFL44L
Placa 5 Meio CAA Ura - , sem plasmdeo (s DNA carrier)
Placa 6 Meio CAA Ura+, sem plasmdeo (s DNA carrier)
Iremos ento analisar as placas. Na placa 1, o meio utilizado foi Ura- e foi
inoculado ZWF1 + pZWF1. Observou-se apenas uma colonia de
transformantes e algumas colonias de bactrias contaminantes. Era
esperado crescimento de transformantes visto que o plasmdeo pZWF1 tem
o gene codificante para a produo de uracilo e experimentalmente isso foi
observado, embora com um pequeno numero de transformantes. O numero
reduzido de colonias transformantes pode ter sido devido existncia de
pouco DNA plasmidico o que se verificou no gel de eletroforese visto que
no apareceram bandas.
Na placa 2, o meio usado foi Ura+ e foi inoculado ZWF1 + pZWF1. Neste
caso de esperar que cresam ambas colonias transformantes e no
transformantes pois o meio tem uracilo pelo as colonias de levedura que

no produzem uracilo podem ir busca-lo ao meio. Experimentalmente o


resultado foi concordante. Esta placa serve de controlo da viabilidade das
clulas, e como houve uma elevada taxa de crescimento de clulas
podemos concluir que as clulas se encontravam viveis. Deste modo se
no tivesse ocorrido crescimento na placa 1 saberamos que era por as
clulas no estarem transformadas e no por estarem inviveis.
Na placa 3, o meio usado foi Ura- e foi inoculado ZWF1 + pFL44L. Era
esperado crescimento apenas de colonias transformantes tal como na placa
1, pois o plasmdeo Pfl4L tem o gene codificante para a produo de uracilo.
Experimentalmente foram observadas algumas colonias de transformantes
e colonias contaminantes que tm forma e textura diferente das colonias de
levedura. Nesta placa tivemos maior numero de colonias transformantes o
que pode ser explicado pelo facto do plasmdeo pfl44l ser mais pequeno que
o pzwf1 pelo que tem mais facilidade em entrar na clula e autoreplicar-se.
Na placa 4, foi usado meio Ura+ e inoculado ZWF1 + pFL44L. Era
esperado que tal como na placa 2 crescessem colonias transformantes e
no transformantes. Isto foi verificado experimentalmente com um grande
crescimento de colonias e conclumos assim que as clulas eram viveis.
Na placa 5, foi usado meio Ura- e inoculado apenas DNA carrier. Neste caso
espera-se que no cresa nada pois o DNA carrier no tem genes
codificantes para a produo de uracilo, pelo que as leveduras no so
capazes de produzir uracilo. De facto, isto foi observado experimentalmente
pois no crescerem colonias transformantes, apenas se observaram alguns
contaminantes que se conseguem identificar pois tem forma e textura
diferentes das colonias de levedura.
Na placa 6, usou-se meio Ura+ e foi inoculado apenas DNA carrier. Aqui j
seria de esperar crescimento pois temos uracilo no meio pelo que mesmo
que as leveduras no o consigam produzir podem ir busca-lo ao meio. O
resultado experimental foi concordante.
Podemos concluir que a transformao foi bem sucedida e mesmo no se
observando bandas na eletroforese como o processo de transformao e
mais sensvel conclumos que tnhamos de facto colonias transformantes.