Anvisa 2 Bioequivalencia

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DirectorGeneraldeInspeccinyControldeMedicamentosyProductos
AntnioCarlosdaCostaBezerra
CoordinacindeInspeccinenCentrosdebioequivalencia
CludiaFranklindeOliveira
Email:bioequivalencia@anvisa.gov.br
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
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AgenciaNacionaldeVigilanciaSanitaria
Manualparaunabuenabiodisponibilidady
Bioequivalencia
Prcticas
VolumenII
Brasilia
2002
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DerechosreservadosdelaAgenciaNacionaldeVigilanciaSanitaria
SEPN515,edificioOmega,BlocoB,Brasilia(DF),CEP70770502.
Internet:www.anvisa.gov.br
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Copyright2002AgenciadeVigilanciaSanitariadelBrasil.
Sepermitelareproduccintotaloparcialdeestaobrasiemprequesecitelafuente.
Primeraedicin2002
ISBN:8588233061
AgenciaNacionaldeVigilanciaSanitaria
Realizadopor:InspeccinCoordinacindeCentrosdebioequivalencia
DireccinGeneraldeInspeccinyControldeMedicamentosyProductos
CoordinacinGeneral:CludiaFranklindeOliveira/CoordinacindeInspeccinen
Centrosdebioequivalencia
Revisin:KarlaFerreiradeArajo/CoordinacindeInspeccinenCentrosdebioequivalencia
Divulgacin:UnidaddeDivulgacin
Cubiertas:OficinaJooCarlosdeSouzaMachado/ComunicacinMultimedia
ArteGrfico,composicineimpresin:.DupligrficaEditoraLtda/DF
ImpresoenBrasil
ManualdeboasPrticasbiodisponibilidadeem:bioequivalncia/Agncia
NacionaldeVigilanciaSanitaria.GernciaGeraldeInspeocorreo
ControledeMedicamentoseProdutos.Brasilia:ANVISA,2002.
2v.
QV38
1.Teraputicaequivalencia.2.Bioequivalncia.3.Disponibilidade
biolgica.4.Medicamentos.I.AgenciaNacionaldeVigilanciaSanitaria.
GernciaGeraldeInspeoeControledeMedicamentoseProdutos.
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PRESENTACIN
LaAgenciaNacionaldeVigilanciaSanitaria,embebidodesumisininstitucional,elabor
el
presentetrabajoconlaintencindefomentareldebate,laeducacinylaconduccindelaclnica
estudiosenBrasil.
Encuantoalosestudiosdebiodisponibilidad/bioequivalencia,estecompendioespartedeuncontextomsgrande
queestdestinadoaencerrarlainvestigacinclnicaensuaspectomsamplio:estudiosnoclnicosy
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LosestudiosclnicosdefaseI,faseII,faseIIIyIV.
Enlapresentacindeestetrabajo,laAgenciaNacionaldeVigilanciaSanitariaagradeceralacontribucin
detodoslosprofesionalesinvolucradosdirectaeindirectamenteensuconsolidacin,yestdisponiblepara
crticasysugerenciasquepuedencontribuirparafuturasediciones,ascomo,paralosmdulosposteriores.
Dr.GonzaloVecinaNeto
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PRLOGO
VariosensayosclnicosestnsiendoactualmentellevaacaboenBrasilconelobjetivodeevaluarla
Biodisponibilidad/bioequivalenciadelosproductosfarmacuticos.Enjuniode2001,laAnvisa,atravsdela
CoordinacindeInspeccinenCentrosdebioequivalenciaunidoalaDireccinGeneraldeInspeccin
yControldeMedicamentosyProductoscomenzlaevaluacindedichoscentrospormediodelapublicacin
inspeccionesconelfindeasegurarlacalidaddelosensayos.
Durantelasactividadesdeinspeccin,originalmenteparafinesdeorientacin,lacoordinacinobservla
lanecesidaddeaclararalgunosaspectosquetodavaplanteancuestionestcnicasaloscentros,especialmenteenrelacincon
laestandarizacindelosmtodosdeanlisis,elanlisisestadsticodelosensayos,elalmacenamientodearmasbiolgicas
muestras,elconfinamientodelosvoluntariosylosestudiosdeestabilidaddelosmedicamentosyotros.
Cuandoseidentificcomorequisitoyenunintentodeevitarperjudicarlacalidaddelasobras
llevadoacabo,lacoordinacinestimullacreacindencleosdediscusindestinadosallevaracabola
explicacindetodoslosaspectosrelacionadosconlaconduccindelosestudiosylaintegracindesu
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fases.Talesncleoscontabanconlaparticipacinde40expertosdelaFarmacia,Medicina,
Estadsticasycamposdelaqumica.
Este"Manualparaunabuenabiodisponibilidad/bioequivalenciaPrcticas"fuecreadobajotalcontexto
ycomprendeseistemasprincipalesquesepresentandeunamaneradidctica,tratandodeaplastaraloscentros'
dificultadesy,comoresultado,secomplementanlasdirectricesprevistasenlalegislacinsanitariabrasilea
paralarealizacindeensayos.
Losncleosdetrabajocomenzaronlasdiscusionesenseptiembrede2001.Cadancleosededicaauno
unadelastresfasesdelprocesofasesclnicas,analticasyestadsticasbajolacoordinacin
delaDra.CludiaFranklindeOliveiraylacolaboracininestimabledelaprofesoraSilviaStorpirts.
Durantelosmesessiguientes,secelebraronvariasreunionesconelfindepromoverdebatestcnicosy
llegaraunconsensoentornoaestosdebates.Enconsecuencia,cadagrupopreparunconjuntoderelevantes
temasquedebenincluirseenelmanual.Todoslostemastalesfueronsometidosainvestigacionescuidadosasy
losresultadosquesemencionanafindepermitirunabuenacomprensindelapoblacinobjetivo.Lacompleta
Manualtom11mesesparaserterminado.Esteprocesocontconlaparticipacindealrededorde50
profesionalesentotaldesdediversasreasdelconocimiento,incluyendoinvestigadoresdelasuniversidadespblicas,
tcnicosdeAnvisayfabricantesdeinstrumentosyequiposdelaboratorio.ANVISAes
agradecidoatodossusasociadosporhabercontribuidoauntrabajotanexcelente.
Laestructurafinalsecomponededosvolmenescontresmduloscadauno.Elprimervolumentcnicamente
detallacadafasedelosestudiosdebiodisponibilidad/bioequivalenciaenlasecuencianaturaldeconduccin:
Mdulo1:FaseClnica,Mdulo2:FaseAnalticayMdulo3:FasedeEstadstica.Elsegundo
volumenabarcalosaspectosimportantesrelativosalainstrumentacinyequiposdelaboratorioutilizados
parallevaracabolafaseanalticayconsideradocomocrticoparaelproceso.Enesevolumen,Mdulo1
serefierealosprincipiosyelfuncionamientodeMicropipetas,Mdulo2serefierealagua,fuentedeQumica
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LosanlisisinstrumentalyelcontenidodelMdulo3serelacionaconelVisibleUltravioleta
Espectrofotometra,cromatografalquida(LC),cromatografadegases(GC),cromatografa
LossistemasconectadosadetectoresdemasasycomprobacindeInstrumentacinAnalticarendimiento.
Valelapenasubrayarelcarcterinternacionaldelanovedaddelarecopilacindeinformacindevarios
sujetosenunsolocompendioencaminadasasintetizartodoslosaspectosrelacionadosconlaBuena
Biodisponibilidad/BioequivalenciaPrcticas.
EsevidentequeelprincipalobjetivodeestetrabajoesmejorarlacalidaddelaBiodisponibilidad/
LosensayosdebioequivalenciallevaronacaboenBrasily,comoresultado,contribuiralacalidaddelosmedicamentosgenricos
disponibleenelmercadoalofrecersubsidiostcnicosampliamenteestudiadosycuidadosamentepreparados.Con
Desdeestaperspectiva,esperamoscontribuiracapacitaralosCentrosdebiodisponibilidad/bioequivalencia,en
Ademsdedesarrollarlosmonitoresdeestudioparalaindustriafarmacuticanacionalyayudarenel
formacindeagentesmultiplicadoresdelconocimientoenlasuniversidadesbrasileas.
Lapreparacindeestemanualfuesloposiblegraciasalalaborcrucialdevariaspersonas.YO
legustarapedirdisculpasdeantemanoporposiblementeolvidandocualquiernombre.LoseditoresJosPedrazzoli
Jnior(USF/Unifag)yJooAntnioSaraivaFittipaldi(Pfizer)eranesenciales,ascomola
cooperadoresFernandaMariaVillaaBoueri(Anvisa),ElianaReginaMarquesZlochevsky(Anvisa),
CludiaSimoneCostadaCunha(MinisteriodeSalud)yBeatrizHelenaCarvalhoTess(Ministerio
deSalud),paralaFaseClnicamduloeleditoresCludiaFranklindeOliveira(GGIMP/Anvisa),
RuiOliveiraMacedo(UFPA),FlvioLeite(T&EAnaltica)yPedroEduardoFroehlich(UFRGS),
ylacooperadoresPedrodeLimaFilho(GGMEG/SP),DaviPereiradeSantana(UFPE),Rafael
EliseoBarrientosAstigarraga(Cartesius),SilvanaCalafattideCastro(Unifag),ThasReisMachado,
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JaimeOliveiraIlha(Cartesius),ItapuanAbimaelSilva(Anvisa),KarenNoffsBrisolla(Anvisa),Marcelo
CludioPereira(Anvisa),paralafaseanalticamduloloseditoresArmindaLuciaSiqueira
(UFMG),ChangChiann(GGMEG/SP),CiciliaYukoWada(Unicamp),KarlaFerreiradeArajo
(Anvisa)yGilbertoBernasconi(USF/Unifag),yloscooperadoresReinaldoCharnet(Unicamp)
yRenatoAlmeidaLopes(Anvisa),paralaFasedeEstadsticamduloloseditoresMelissaM.Silva
(NovaAnaltica)yWalterPereira(NovaAnaltica),losprincipiosyelfuncionamientodeMicropipetas
eleditorJosMuradianFilho(Millipore),AguaparaanlisisclnicosloseditoresIvanJonaitis
(Agilent),RenatoGarcaPeres(Flowscience),RicardoLira(Flowscience),RenatoGouveia,Jos
AparecidoSoares(Varian),JosuDMNeto(SincBrasil)JuarezArajoFilho(SincBrasil),Alexandre
Rosolia(Waters),AdautoSilva(Varian)yReinaldoCastanheira(Agilent),Analtica
InstrumentacinyelequipodecoordinacinintegradoporCludiaFranklindeOliveira(GGIMP/
Anvisa),MarceloCludioPereira(GGIMP/Anvisa),MaxWeberMarquesPereira(GGIMP/Anvisa),
KarladeArajoFerreira(GGIMP/Anvisa),KarenNoffsBrisolla(GGIMP/Anvisa),ItapuanAbimael
daSilva(GGIMP/Anvisa)yRenatoAlmeidaLopes(GGIMP/Anvisa).
Dr.GonzaloVecinaNeto
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PERSONALTCNICO
VolumenIIMdulo1Micropipetas:PrincipiosyOperacin
Editores:
MelissaM.SilvaNovaAnaltica
ValterA.PereiraNuevaAnaltica
Coordinacin:
CludiaFranklindeOliveiraANVISA
ItapuanAbimaeldaSilvaANVISA
KarendeAquinoNoffsBrisollaANVISA
KarladeArajoFerreiraANVISA
MarceloCludioPereiraANVISA
MaxWeberMarquesPereiraANVISA
RenatoAlmeidaLopesANVISA
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RESUMEN
1.DEFINITION...................................................................................................................................5
1.1.Tiposdepipettes...........................................................................................................................5
PRINCIPIO2.FUNCIONAMIENTO..............................................................................................................6
2.1.Desplazamientodeairepipettes.............................................................................................................6
2.2.Desplazamientopositivopipettes.....................................................................................................8
3.FUNCIONAMIENTOTECHNIQUE.........................................................................................................11
3.1.Cmoalmacenarlapipeta...........................................................................................................11
3.2.Elajustedelvolumen.....................................................................................................................11
3.3.Tipguarnicin.....................................................................................................................................12
3.4.Preenjuaguedelapunta..................................................................................................................13
3.5.Aspiration.....................................................................................................................................13
3.6.Dispensing....................................................................................................................................14
3.7.Consejosejection.................................................................................................................................14
4.TIPS......................................................................................................................................................15
4.1.Consejosparaeldesplazamientodeairepipettes.............................................................................................15
4.2.Consejosparapipetasdedesplazamientopositivo....................................................................................15
5.MANTENIMIENTO.............................................................................................................................16
5.1.Cleaning........................................................................................................................................16
5.2.Regionesreplacement........................................................................................................................17
5.3.Lacomprobacindelrendimiento................................................................................................................20
6.SUGERENCIASDEPROCEDIMIENTO............................................................................................21
7.ANEXOI:EJEMPLODEPROCEDIMIENTODELIMPIEZA......................................22
7.1.Disassembling..............................................................................................................................22
7.2.Cleaning........................................................................................................................................23
7.3.Assembling...................................................................................................................................23
8.ANEXOII:NormadeDesempeoVERIFICACIN..............................24
8.1.General.........................................................................................................................................24
8.2.Condicionesdelasaladepruebas............................................................................................................24
8.3.Operador.......................................................................................................................................25
8.4.Consejos...............................................................................................................................................25
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8.5.Elequipoutilizadoeneltest........................................................................................................25
8.6.Lacomprobacinprocedure.............................................................................................................27
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9.ANEXOIII:Procedimientosdedescontaminacin............................................38
9.1.Qumica.....................................................................................................................................39
9.2.Microbiologaycelularculture....................................................................................................40
9.3.Labiologamolecular.......................................................................................................................41
9.4.Mtodosespectrodeaction.....................................................................................................44
9.5.Ventajasydesventajas..................................................................................................45
9.6.Eltratamientoenautoclave..................................................................................................................................46
9.7.UVirradiation..............................................................................................................................46
9.8.Qumicosolutions......................................................................................................................46
10.ANEXOIV:DEFINICIONES...........................................................................................50
11.Glosarioyabreviaturas........................................................................................51
12.Referencias..................................................................................................................................52
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VolumenII/Mdulo1Micropipetas:PrincipiosyOperacin
1.DEFINICIN
Pipetasdemboloquefuncionanconequiposutilizadosparaaspirarydispensarvolmenesespecficosdeloslquidos.
Laspipetasmonocanaltienenunsolopistn.Laspipetasmulticanaltienensimultneamente
variosrecipientes.Laspipetaspuedenserparadispensarunciertovolumendedadoovolmenesajustadosdefbrica
seleccionadoporelusuariodentrodeunrangodevolumenespecfico,porejemplo,entre10ly100l.Pistn
pipetasoperadaspuedenserdedostipos:dedesplazamientodeaireydedesplazamientopositivo.
1.1.Tiposdepipetas
Laspipetaspuedenserdiseadoscomosigue:
Encuantoelvolumen:
Volumenfijo,diseadoporelfabricanteparadispensarslosuvolumennominal,porejemplo,
100pl.
Lavariacindevolumen,diseadoporelfabricanteparadispensarvolmenesseleccionadosporelusuariodentrode
unrangodevolumenespecfico.
Encuantoelpistn:
Puedehaberunacapadeaireentreelpistnylasuperficiedellquido(pipetasdedesplazamientodeaire).
Elpistnestencontactodirectoconellquido(desplazamientopositivoodesplazamientodirecto
pipetas).Elcapilaryelpistnpuedenserreutilizablesodesechables.
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PRINCIPIO2.FUNCIONAMIENTO
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Lapuntadeplsticoodevidrioestacopladoalapipeta.Conelpistnenellmiteinferior(aspiracininferior
posicin),quemojelapuntaenellquidoquesevaatransferir.Cuandoelpistnsemuevehaciaarribaalapartesuperior
posicindeaspiracin,seextraeellquido.Elvolumendelquidosedispensacuandoseempujaelpistn
denuevoalaposicininferior.
Elprincipiodefuncionamientosedetallaacontinuacindeacuerdoconeltipodepipeta(desplazamientodeaireo
dedesplazamientopositivo).
2.1.Pipetasdedesplazamientodeaire
Cuandosepulsaelbotndeunapipetadedesplazamientodeaire,elpistnsituadodentrodelequipo
muevehaciaabajoydesplazaelaireencontactoconellafueradelapipeta(elvolumendeaireexpulsadoes
igualalvolumensituadoenlapipeta).Elvolumendeairequequedadentrodelapipetaesinversamente
proporcionalalvolumendelamuestra:cuantomenoreselvolumendeairedentrodelapipeta,mayoresla
volumendelquidoqueseextrae.
a)Ajustedevolumen(vlidoparalaspipetasdevolumenvariandosolamente)
Elusuarioajustaelvolumendeseado.Elpistnsemuevealaposicinapropiada.
Observaciones:Enlaspipetasdevolumenfijo,esteposicionamientoseproporcionaenlafbrica.
Pistn
Volumenseleccionado,
porejemplo,100ml
Posicindelpistndespusdevolumen
ajuste
TitularCono
Zonadellenado
conelaire
Punta
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b)Preparacinparalaaspiracin
Sepulsaelbotn.Elpistnsemuevehaciaabajoyexpulsaunvolumendeaireigualalaseleccionada
volumen(enpipetasdevolumenfijo,elvolumendeaireexpulsadoesigualalvolumennominaldela
pipeta).
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Elpistnsemueveala
lmiteinferior
Volumendeaireexpulsado
(Igualalvolumenseleccionado)
c)laaspiracindelquidos
Sumerjalapuntaenellquidohastaquesesumergeeltaladro.Alsoltarelbotn,losrendimientosdepistn
alaposicininicialyunvacoparcialseformaenelinteriordelapipeta.Lapresinatmosfrica
obligaalaentradadelquidoatravsdelorificiodelapunta.
Elpistnvuelveala
posicininicial
Vacoparcial
estformado
Volumende
lquidodibujado
TaladroSugerenciasumergida
enellquido
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d)dedispensacindelquido
Sevuelveapulsarelbotn.Elpistnsemuevehaciaabajodesplazandoelaireyaumentalapipeta
presininterna.Elairecomprimidoexpulsaellquidodelapunta.
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Contenedordedestino
e)Segundaetapa
Enalgunaspipetasdedesplazamientodeaire,elpistnpuedeserdesplazadojustodebajodellmiteinferior(porlotanto
desplazandounacantidadadicionaldeaire),loquepermitelaexpulsindelasltimasgotasdelquido.Lamayorparte
trminocomnempleadoporlosusuariosdeestedesplazamientoadicionales"segundaetapa".
2.2.Pipetasdedesplazamientopositivo
Laspipetasdedesplazamientopositivofuncionancomounajeringa.Nohayvolumendeaireentreelpistny
ellquido.Puestoquenohayaireparacontraeroexpandir,lafuerzadeaspiracinessiempreconstantee
permanecesinmodificacionesenlaspropiedadesfsicasdellquidoseanmanipuladas.Estetipodeequipo
esidealparalamanipulacindelquidosviscososodealtadensidad.
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a)Ajustedevolumen
Elusuarioajustaelvolumendeseado.Elpistnsemuevehaciaabajoalaposicininicial.
Volumenseleccionado,
porejemplo,100L
TitularCono
Capilar
Pistn
Posicininicial
b)Preparacinparalaaspiracin
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Sepulsaelbotn.Elpistnsemuevehaciaabajohastaelextremodelcapilar.
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c)laaspiracindelquidos
Elorificiocapilarestsumergidoenellquido.Alsoltarelbotn,elpistnsemuevehaciaarriba
ylapresinambienteobligaalaentradadellquidoatravsdelorificiocapilar.
Pistnenlaposicininicial
Volumenextrado
Capilarsumergido
d)dedispensacindelquido
Sevuelveapulsarelbotn.Elpistnsemuevehaciaabajoyexpulsaellquidofueradelcapilar.
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Contenedordedestino
Volumendispensado
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TCNICA3.FUNCIONAMIENTO
Unabuenatcnicadepipeteoesesencialparaasegurarbuenosresultados.Unasecuenciadecomandosenalgunosaspectosdela
tcnicaparaserconsideradodurantelaoperacinsemostrsiguiente.
3.1.Cmoalmacenarlapipeta
Lapipetadebeseralmacenadoenlaposicinverticalpordosrazones:
Evitaqueentreencontactoconlassuperficiesquepuedenestarcontaminadas,porejemplo,eltrabajo
banco(alcolocarlapipetaenelbancooenunmuebleconcajones,loscontaminantespuedenser
transferidaalcuerpodelinstrumentoyposteriormentetransferidoalaexperimento).
Silosconsejosnosonexpulsados
ysiunacantidadresidualdelquidopermanecedentrodelosconsejos,estelquido
puedeentraralinstrumentocuandolapipetaseestablece,contaminandoydaando
laspartesinternasy/oelsoportedecono.
Ejemplosdesoportes:
3.2.Elajustedelvolumen
Conelfindeevitarunerrordeparalaje,elvolumendebeserajustadaconlapipetaenlahorizontal
posicin.Sieloperadorprefiereajustarelvolumenconlapipetaenposicinvertical,
unodelosojosdebenestarcerrados.
Cuandosereduceelvolumen,alcanzarcuidadosamentelacantidaddeseadaynosuperarlamarca.
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Alaumentarelvolumen,superarlacantidaddeseadapor1/3deuncicloyluegocuidadosamente
reducidoelvolumenhastaquesealcanzalacantidaddeseada.Nosuperarlamarca.
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3.3.Tipguarnicin
Lapuntaestequipadodeacuerdoconlasinstruccionesdelfabricante,asegurandoasuncierrehermticoadecuado
entrelapuntadelapipetayelsoportedecono.
Observacin:Sellosignificaunanilloopacoformadoalrededordetodoelcollardelaextremidad,loqueindicaunaconexinperfecta
entreelsoportedeconoylapunta.Unselloincompletadarlugararesultadosimprecisos.
Sedanalgunassugerenciasparaelmontajedelossiguientesconsejos:
consejossueltos:
Mantengalapuntadesucollar(tengacuidadodenotocarelextremo)ycolquelaenelsoportedecono.Presionelapunta
contraelsoportedeconosiguiendounmovimientoderotacin,comoseindicaenlafigurasiguiente.Este
aseguraunaconexinperfectaentrelapuntayelsoportedelcono(elsellomencionadoanteriormentees
formado).
Consejossobrebastidores:
Montarelsoportedeconoenlapuntaypulselapipetahaciaabajobyfollowingunmovimientoderotacin
comoseindicaenlafigura.
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Multicanalapropiado:
Paraunajustesimultneoentodosloscanales,laposicindelossoportesparacucuruchosenloscuellosdepunta.HagaunaTo
ydemovimientocomosemuestraenlafigura,asegurandoasunaconexinadecuadadetodoslosconsejos
entodosloscanales.
3.4.Preenjuaguedelapunta
Cuandosecolocaunanuevapunta(ocuandoseaumentaelvolumenqueseextrae),esnecesarioparapreservar
enjuaguelapunta.Paraello,acabadedibujaryentregarellquidounpardeveces.
Elpreenjuaguedelanuevapuntaaseguralaexactitudyprecisindelvolumenaserposteriormente
transferido.Estoesporqueunapelculaseformaenlaparedinteriordepuntaenlaelaboracindeunlquido.La
lanaturalezadeestapelcula,quecausaunerrorenlaprimeramedicin,dependeenelserlquida
transferido.Sinembargo,estapelculasemantienerelativamenteconstantedespusdealgunasoperacionesdepipeteadoutilizando
lamismapunta.Esnecesariopreenjuaguelapuntaconelfindemaximizarelrendimientodelaspipetas.
3.5.Aspiracin
Laaspiracindebeserlentayconstante,manteniendosiemprelamismaprofundidaddeinmersindelapunta
(Durantelaaspiracinyentrelasmuestras).Serecomiendaquelaprofundidaddeinmersines
alrededorde2a3mmpordebajodelasuperficiedellquido.Algunosfabricantessugierenquelaprofundidaddeinmersin
debevariardeacuerdoconelvolumendetrabajo,talcomosedescribeenlatablasiguiente:
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Lapipetadebemantenerseenposicinverticaldurantelaaspiracincompleta.Espere1a2
segundosantesderetirarlapuntadellquido.Silasgotasdelquidoanpermanecenfueradelapunta,limpia
usandopapelsuave(silametodologalopermite).Tengacuidadodenotocareltaladrodepunta.
3.6.Dosificacin
Toqueelextremodelapuntaenlaparedinteriordelrecipienteylainclinacindelapipetadeaproximadamente30a
45
Presionarcontinuamenteelbotnhastaelfinaldelaprimeraetapa.Esperealgunossegundos(de1a3
dependiendodelaviscosidaddellquido)ydespuspulseelbotnhastaquelasegundaetapa(purga)a
eliminarlasgotasquepuedanhaberquedadoenlapunta
Mantengapulsadoelbotnhastaelfinal.Retirelapipetadelenvasemanteniendolapuntaen
toqueconlaparedinteriordelrecipiente("cero"elextremodelapuntaenlaparedinteriordelrecipiente).
3.7.Consejosdeeyeccin
Desechelapuntapresionandoelbotneyectorconsejos
Tomartodaslasprecaucionesnecesariascuandosetrabajaconmaterialescontaminadosy/oradioactivos.
Elprocedimientoadecuadodebeserdefinidoporellaboratoriodeacuerdoconeltipodematerial
pipeteado,teniendolaseguridaddelosusuariosyellugardetrabajoenconsideracin.
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4.CONSEJOS
Lacalidaddelosresultadossevedirectamenteafectadaporlacalidaddelapuntautilizada.Buenosresultadosnorequieren
sloconsejosdebuenacalidad,sinotambinconsejosquesonmsapropiadasparaelmodeloylamarcadelapipeta
utilizado.
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4.1.Consejosparapipetasdedesplazamientodeaire
Elfabricantedebeindicarquelamarcadelapuntaelusuariodebeemplearparacumplircon
lasespecificacionesindicadasenelmanualdeusodelapipeta.
Laspuntasdeplsticoparapipetasdedesplazamientodeairesedebenutilizardispuestadespusdesuuso.
Estosconsejosnodebenlimpiarsenireutilizarse,yaquesuscaractersticasmetrolgicasnopuedenser
asegurada.
4.2.Consejosparapipetasdedesplazamientopositivo
Elfabricantedebeindicarquelamarcadelapuntaelusuariodebeemplearparacumplircon
lasespecificacionesindicadasenelmanualdeusodelapipeta.
Elajusteentreelpistnyelcapilar(selladoperfectoentreelcapilaryel
pistn),ascomoeldesplazamientodelpistnenelinteriordelcapilar,debeserptimaparaaseguraruna
inclusodispensacindellquidodibujado.
Estosconsejospuedenserreutilizadosoeliminados(alcambiarlapunta,elcapilaryelpistndebe
sercambiadodeformasimultnea).
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5.MANTENIMIENTO
Estecaptulocubretrespasosesencialesdelprocedimientodemantenimiento:limpieza,cambiode
piezasylacomprobacindelrendimiento.
OBSERVACIN
Esnecesarioadaptarlainformacindeestecaptuloenelmanualdeinstruccionesdelfabricante.
Enparticular,lossiguientesaspectosdebenserconsiderados:
Pedidodesilaspartesquefiguranenelpresentedocumentopuedenserlavados
Montajeyprocedimientodelapipetadesmontaje
Cmocambiarlaspiezasdaadas
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Pedidodesicualquieradeestosprocedimientosalteranlacalibracindepipetas.
Silohacenelcambio,esnecesarioverificarelfuncionamientodelinstrumento(veranexoII)e
ocasionalmenteajustarelequipo(deacuerdoconlasinstruccionesdelfabricante).
5.1.Limpieza
Esnecesarioparacrearunarutinadelimpiezaylainspeccindelaspartesdelapipeta.Asquelamejor
Losresultadossonsiemprealcanzado,laspartesdepipetastienenqueestarenbuenascondicionesdefuncionamiento.Haydos
diferentessituacionesquerequierendiferentesprocedimientosdelimpieza:
a)limpieza"Standard"
Losaerosolesformadosduranteelpipeteadoseasientanenelinteriordelapipeta,perjudicandoassufuncionamientonormal.
Ademsdeobstruirelorificiodesoportedeconoyponerenpeligroeldesplazamientodeairedentrodelapipeta,esto
asentamientopuededaarlaspartesinternas,porejemplo,elpistn(queconduceaaraazosocorrosin).En
amboscasos,lapipetanofuncionarnenelcumplimientodelasespecificaciones.
Conelfindeevitarestasituacin,laspartesinternasdelapipeta(soportedecono,eyector,elpistn,elselloy
juntatrica)debeserlimpiado.Sigaelprocedimientorecomendadoporelfabricante.AdjuntoI
describeunejemplodeunprocedimientodelimpieza.
Lalimpiezaeslaprincipalherramientaparapermitiralosusuariosaextenderlavidadelapipetayasegurarresultadosconfiables.
Nohayhorariodelimpiezaaseradoptadoporellaboratorio(estodependerdeltipo
dematerialmanipulado,larutinaalaquesesometelapipeta,elnmerodeusuariosdela
mismapipetayerroresaceptablesparaelprocedimiento).Conelfindeasegurarresultadosfiables,las
pipetadebesersometidoapruebasderendimiento,ademsdeserlimpiadoconfrecuencia
(AnexoII).
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b)Pipetearutilizaparaelmanejodematerialescidosocorrosivos
Lascondicionesdepistninterfierendirectamenteconlasespecificacionesdepipeta.Siserayaelpistno
corrodo,nosecumplenlosestndaresdeexactitudyprecisin.Materialesdecido(porejemplo,sulfrico
cido,cidoclorhdrico,cidontrico,fenol)omaterialescorrosivos(porejemplohidrxidodesodio,
disolventesclorados)puedendaarelpistn.Unpistndaadoconducearesultadospocofiables.
Conelfindeevitardaosenelpistn,serecomiendalimpiarlaspartesdepipetadespusdemanipular
estetipodelquido.
Contrariamentealprocedimientodescritoenelpunto"a",estalimpiezanorequiereelusodeunproductoqumico
agente.Elaguadestiladadebesersuficiente.
Desmontarlapipetadeacuerdoconlasinstruccionesdelfabricante.
Viertaaguadestiladaenlassiguientespartes:eyector,soportedecono,elpistnyjuntasdepistn.
Dejequesesequeatemperaturaambienteoenunhornodehasta40.
Montarlapipetadeacuerdoconlasinstruccionesdelfabricante.
OBSERVACIONES
Certificarquedichaspartessepuedenlavarysiesteprocedimientoafectarnsucalibracin(que
esdecir,siesnecesarioseguirelprocedimientodecomprobacinderendimientojustodespusdelalimpieza).
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Elprocedimientodescritoenelpunto"b"anteriorestespecialmenteindicadoparapipetasconmetlico
pistn.Parapistoneshechosdeotrosmateriales(vidrio,plstico,cermica)elusodegrasadesiliconapara
finesdeselladoescomn.Porlotanto,serecomiendaverificaryseguirlosprocedimientosespecficos
contenidaenelmanual.
5.2.Sustitucindepiezas
Algunaspartesdelapipetatienenqueserreemplazadosperidicamente,yaquesedesgastanyinterfierendirectamente
conelrendimientodelaspipetas.
5.2.1.Juntasdepistn
Estaparteopartesproporcionanunselladoentreelpistnyelsoportedecono(partesuperior).Con
uso,microvellosidadesseformanenlasuperficiedeestaspartesyelselladosevuelveimperfecta,porlotanto
menoscabarlaprecisindelinstrumento.Estaspartesdebensercambiadasunavezalao(vaselasustitucin
procedimientoenelmanualdelfabricante).
5.2.2.TitularCono
Otropuntoimportanteeselselladodelazonadecontactoentreelsoportedeconoylapunta.Conel
uso,lasuperficiedesoportedeconollevaacaboenlapartedelapuntadeajusteyelcontactoentreellas
sevuelveinsuficienteyperjudicalamedicin(prdidadeprecisin).Serequierereemplazo
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siemprequelapartedelapuntadeajustesellevaacabooencasodedaoparcial(roto,raspado).Compruebeen
elmanualdelfabricantesielprocedimientoafectaalacalibracindelinstrumento.
5.2.3.Otraspartes
Otraspartesinterfieranconlapipetarendimiento.Unprocedimientodecomprobacinmuysimplesedescribe
abajoparaayudarareconocerlaspartesdaadas.Algunosprocedimientossedebenseguirsegn
elmanualdelfabricante(porejemplo:eldesmontaje,montaje).Destacamosdenuevola
importanciadecertificarsiesnecesariovolveracalibrarlapipetadespusdeunodeestosprocedimientos
(Estainformacinsepuedeencontrarenelmanualdelfabricante).
1erPASO:ASPECTOGENERAL
BarradeOperaciones
Botn
Botneyector
Volmetro
TitularCono
Consejoseyector
Punta
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Verifiquequenohayningndefectoaparente.
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2PASO:PRUEBASDEFUNCIONES
Gireelvolmetroplenamenteconelfindeiratravsdelagamacompletavolumtricadelapipeta.
Verificarsilosvolmenesmnimosymximosajustablescoincidenconelvolumtricareal
gamadelapipeta.
Losproblemasylascausas:
Elajustenoesposible
Pipetaenautoclave*
Ajustedevolumenincorrectaajusteincorrectooensamblardelavolmetro
*Algunaspipetaspuedenseresterilizadosenautoclave,otrosnopueden.Consulteelmanualdelfabricante.
Conlavolmetrofijadoenelvalormximoespecificadoparaelmodelodepipeta,pulseelbotn
totalmenteparaverificarlafacilidaddemovimiento,sentirobstruccionesocasionalesovariacionesdefriccinque
puedecausardaos,comolacorrosindelpistnolabarradeoperacionestorcida.Escuchalaprimavera
elruidoquepuedeindicarsuposicinincorrecta.
Losproblemasylascausas:
Movimientodesigual
Lafaltadedesplazamiento
Daosdelanillodefriccin
Labarradeoperacionesesttorcida
Movimientoinapropiado
Corroda,pistnsucioorayado
Colocarunapuntaenlapipetaypresioneelbotndesugerenciaseyectorparaverificarlaeficaciadelainyeccin.
Lafaltademovimiento
Eldaodelmecanismodeeyeccin
Ajusteindebidodelapunta
EliminacinDifcil
Malacolocacindelexpulsor
Corrosin
3erPASO:PRUEBASDEFUGA
Parapipetasquetieneunvolumenmximoporencimade200l,ajusteelvolumenenelvalormximoy
sacaraguaparallenarlapuntadelapipeta.Observelapuntadurante20segundos.Unagotaenelextremodelapunta
significalaocurrenciadefugas.Estotambinesciertoparapipetascongamasdevolumenpordebajode200l
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paraesterangodevolumen,sinembargo,elsiguienteprocedimientodebeseradoptado:despusdeobservarla
presenciadeunagotapor20segundos,sumergirelextremodelapuntaenelaguaenelrecipiente.Elniveldeagua
dentrodelapuntanodebesercambiado.Lapresenciadefugasseconfirmasielniveldisminuye.
Lacausadelasfugaspuedeser:
Juntasdepistndaados
rasguadaopistncorrodo
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Qumicaodaosmecnicosenelsoportedeconoenlapartedelapuntadeajuste
Usodelosconsejosnorecomendadosporelfabricante(vaseelcaptulo4).
4PASO:DESARMAR
Esteprocesodebeadoptarseencasodecualquierfugaenelpaso3.Aldesmontarlapipeta,
sepuedeevaluarlaspartesinternasyaveriguarlacausadelproblema(pistndaado,faltao
deteriorodelossellos,etc.)ydefinenqusedebenreemplazarpartes.Unejemplodedesmontaje
rutinaadoptadoparaciertosmodelosdepipetassemostracontinuacin.Asegresedeseguirelfabricantede
instruccionesparadesmontarymontarlapipeta.
Tirehaciaabajoyretireelexpulsordepuntas(enalgunosmodelos,eleyectornoesdesmontable)
Retirelatuercadeconexin
Retireconcuidadoelpistn
Verifiquequelasuperficiedelpistn(siestcorrodoy/orayado),ascomolossellos.
5PASO:MONTAJE
Montarlapipetadeacuerdoconlasinstruccionesdelfabricante.
OBSERVACIN
Lerecomendamoslospasos1a3parallevaracabotodoslosdasantesdecomenzareltrabajoygrabadoparael
decontroldellaboratorio.Sisedetectananomalas,llevaracabolospasos4y5.
Algunaspartespuedensermodificadosporelpropiousuariosincomprometerlacalibracindelinstrumento.
Traselcambiodealgunasotraspartes,esnecesariocomprobarlacalibracindelinstrumentoy
ocasionalmenteajustarlo.Estainformacinestcontenidaenelmanualdeinstruccionesdepipeta.
5.3.Lacomprobacindelrendimiento
Ademsdelaspartesdelimpiezayprocedimientosdereemplazo,elusuariotienequeverificarlapipeta
rendimientoconelfindeasegurarmedicionesconfiables.Talcomprobacinanalizatantolaexactitud
(Errorsistemtico)ylaprecisin(erroraleatorio).
Lacomprobacinderendimiento,dehecho,evalalapipetaset+punta+operador(tcnicadepipeteo).
Conelfindellegararesultadosdepruebasfiables,eloperadordebeestarcapacitadoycalificado(tcnicadepipeteo
describenenelcaptulo3)ylosconsejosdebenserlosrecomendadosporelfabricantedelapipeta.
Elusuariodebedefinirunaprogramacinparaprobarlaspipetasconbaseen:requisitosentrminosde
exactitudyprecisin,frecuenciadeuso,nmerodeusuariosdeunamismapipeta,elnmerodeciclosen
queseusalapipetaylanaturalezadeloslquidospipeta.EnelanexoII,sedescribela
mtodogravimtricoparaevaluareldesempeopipetas(ReferencianormaISO/FDIS8655pistn
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aparatosvolumtricosoperadoParte6Mtodosdeensayogravimtricos).
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6.SUGERENCIASDEPROCEDIMIENTO
pipetasdemboloquefuncionanconequiposparalaelaboracinydispensacindevolmenesespecficosdeloslquidos.
Conelfindeasegurarlafiabilidaddelosresultados,esnecesarioimplementarlasiguienterutina:
Comprobacindelaspectogeneral,laspruebasdelasfuncionesylaspruebasdefugas(pasos1,2y3)
descritoenelpunto5.2.3.enelpresentedocumento.Silasanomalasseencuentranfuera,sigalospasos4y5dela
mismoprocedimiento.
Lalimpiezaperidicadelaspiezasdelapipeta
Laperiodicidaddelimpiezadebeestablecerseenfuncindelafrecuenciadeuso,nmero
deusuariosdeunamismapipeta,elnmerodeciclosenlosqueseutilizalapipetaylanaturalezade
loslquidosconpipeta.Recomendamoslaboratoriosparaseguirelprocedimientodelimpieza
cadatresmeses(silasuciedadseacumulaenestostresmeses,reducirlosintervalos
entrecadaprocedimientodelimpieza).Esmuyimportanteparaellaboratorioparagrabarla
procedimientosdelimpiezadichosregistrosdeberncontenerelnmerodeseriedelapipeta,fechalimpieza
yelprocedimientoutilizado.
Sustitucindepiezas
Lasjuntasdepistndebenserreemplazadosanualmente(sielnmerodeciclosdepipeteadoexceda
100.000,lossellosdebensustituirseenunplazodetiempomscortoqueserestimadoporel
laboratorioderutina).Elsoportedeconodebeserreemplazadocada2aosocuandoelconsejo:
partedeajustesellevaacabo.Talesreemplazosdebenregistrarse(registrodebecontener
elnmerodeseriedelapipeta,fechadesustitucinylainformacinsobrelapartenuevaloteoel
nmerodeventa).Piezasqueafectanelrendimientodelapipeta(porejemplo:pistn,volumeter,varilla)
reemplazooreparacinquerequieredebernserremitidasalaasistenciatcnicaespecializadala
trabajosdereparacindebeserdebidamenteregistrado,ademsdelanuevacalibracindelapipeta.
Controlarperidicamenteelrendimientodelaspipetas(exactitudyprecisin)comosedescribeenelarchivoadjunto
II.Estaverificacindebehacersecada3mesesydebidamenteregistrado(ejemplograbacin
EnelanexoIIpunto8.6.5.enelpresentedocumento).Loserroresmximosencontradospuedenserhastadosvecesmsalta
queloserroresdefinidosenlastablas1y2enelpresentedocumento(anexoII,punto8.6.4.).Alreemplazar
partesqueafectanalacalibracindepipetas,elprocedimientodecomprobacinsedebeseguir(verpunto
"Sustitucindepiezas"msarriba).
PruebasdeOperador
Dadoquelatcnicadeoperacinescrucialparaobtenerbuenosresultados,esnecesarioparaprobary
grabartcnicadepipeteodeloperador.Paraello,utilizandounequipoqueoperadentrodel
lasespecificacionesdelfabricante,realizar10medicionesconelmnimomximoe
volumenespecificadoparaesemodelodepipeta.Evaluarlaexactitudyprecisindela
medicionesobtained.Theerroresmximosencontradosdebenserhastaeldobledelosvaloresespecificados
Enloscuadros1y2enelpresentedocumento(anexoII,punto8.6.4.).Registrardatosenuninforme(unejemploes
EnelAdjuntoIIpunto8.6.5.)laidentificacindeloperadordelaprueba.
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7.ANEXOI:EJEMPLODEPROCEDIMIENTODELIMPIEZA
Elejemplosiguientesepuedeutilizarparavariosmodelosdepipeta,enparticularlosquetienenunmetlica
pistnsingrasaparaotrosmodelos,serequiereunaadaptacin.Sigaelfabricantede
instruccionescontenidasenelmanualdelusuario.Asegresedecertificarquelospasosdescritosenestedocumentono
ponerenpeligrolacalibracindepipetas.
Advertencia!Nomezclepartesdeunapipetaconpartesdeotropipeta
7.1.Desmontaje
Esnecesariodesmontarlapipetaparalalimpieza(useguantescuandoelriesgodecontaminacines
involucrados).Unesquemageneraldelaspartespipetassemostracontinuacin:
LISTADEPIEZAS
Lasfiguras1y2
La
B
Botn
Manejar
C
D
E
F
TitularCono
Consejoseyector
Punta
Tuercadeconexin
GyH
Juntasdepistn
Observaciones:Esteesquemapuedetenervariacionesdeacuerdoconelmodeloylamarcadelapipeta.Para
obtenermsdetalles,consulteelmanualdelfabricante.
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Retirareleyectorpuntas(D)tirandodel
Desconectarlatuercadeconexin(F)separandoaselcuerpodelapipeta(B)delsoportedecono
(C)
Retireelpistnestablecercuidadosamenteysepararlasjuntasdepistn(GyH),manteniendoelcono
titularconlamejorpartedeabajo.
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Lasjuntasdepistnsoncapturadosconfrecuenciadentrodelsoportedelcono.Paraeliminarlos,coloqueelpistn
nuevoypresionarlocontraelsoportedeconocomosiustedestpipeta.Alretirarelpistn,el
precintosseadjuntanalamisma.
7.2.Limpieza
Coloqueelsoportedecono,elconjuntodepistn,eleyectorconsejos,lasjuntas(nocoloqueelmango)enun
vasodeprecipitadosycompletarelvolumenconsolucindedetergenteneutral4%a8%conaguacaliente(
50C)
Colocarelvasoenunbaodeultrasonidosduranteunos15minutos(silaecografanoestdisponible,
mantenerelvasodeprecipitadosenlasolucindurante40minutos)
Desechelasolucindedetergenteutilizado
Lavarcadaparteconaguacorriente
Coloquelaspiezasenunrecipientelimpioylavarporltimavezconaguadestilada
Secarenunhornoaunos50C(nosobrepasarestatemperatura)duranteunmximode2horas,o
dejequesesequeatemperaturaambiente.
OBSERVACIONES
Useunasolucindedetergenteneutroal4%paralalimpiezadepipetasligeramentesuciasyunasolucinde8%para
pipetasmuysucias.
Paralaspipetassiguesuciodespusdellavado,elusodealgodnhumedecidaconalcoholisoproplico.Tencuidado
denodaarelpistn.
Despusdeutilizarlapipetaencidoy/osolucionescorrosivas,siemprelavetodaslaspiezasconaguadestilada
aguaoetanol.
7.3.Montaje
Coloquelajuntaylajuntatricaenelpistnporprimeracolocarlajunta
Usandounadelasmanos,sujeteelcuerpodelapipetaenposicinverticalycoloqueelpistn
Montarelsoportedeconoenelcuerpodelapipeta
Acontinuacin,ellugaryelhilodelatuercadeconexin
Coloqueeleyectordepuntas
Lapipetaestlistoparasuuso.
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8.ANEXOII:VerificacinSTANDARD
8.1.General
Esteaccesoriosedescribeelprocedimientodecomprobacinderendimientopipetasutilizandoelmtodogravimtrico
(SegnlareglaISO/FDIS8655pistnquefuncionaconaparatosvolumtricosParte6:gravimtrico
pruebas).Elusodelosprocedimientosdescritosenestemtodoaseguraelcumplimientodelainternacional
especificacionesdeexactitudyprecisin.
Lapruebadecumplimientoparaelcontroldelaexactitudyprecisinesaplicableacualquierpipeta(definicionesen
captulo1).Estapruebaestenacuerdoconlosestndaresinternacionales,analizaelsistemadepipeteocomo
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conjunto:lapipeta,lapuntayeloperador.
Elmtododescritoenestedocumentoincluyeunprocedimientoparalacorreccindelasprdidasporevaporacinparalapequea
volmenes(pordebajode50l).Adems,alconvertiralvolumendemasasobtenidosenelequilibrio,
correccionesestnrealizadosenrelacinconlatemperaturaylapresinenelmomentodelaprueba.
Elusuariodebedefinirunarutinaparaprobarlaspipetasconbaseen:requisitosentrminosdeprecisin
yprecisin,frecuenciadeuso,nmerodeusuariosdeunamismapipeta,elnmerodeciclosenlosquela
pipetaseutilizaylanaturalezadeloslquidospipeteadas.Nohayningnintervaloestandarizadaentre
cadaunodecheques.Esresponsabilidaddelusuarioparadefinirunintervalotal.ReglaISO/FDIS8655
defineunaperiodicidadmnimadeunavezalao.
Lapipetadebeserdesmontadoymontado(deacuerdoconelmanualdelfabricante
instrucciones)almenosunavezalaoantesdelapruebadecomprobacin.Lapipetadebesermanejadodeacuerdo
elmanualdelfabricante.
8.2.Condicionesdelasaladepruebas
Lasaladepruebas(delaboratorio)sedebelimpiarylatemperaturayhumedadcontroladademanera
quelascondicionesdelahabitacinenquelaverificacinsellevaracaboylatemperaturadelequipo
sonestablesyhomogneas,tantoantescomoduranteelprocedimiento.
Lapipetayelaguautilizadaenelensayogravimtricodebenestabilizarseenlasaladecomprobacin
temperaturadealmenos2horasantesdecomenzarelprocedimiento.Idealmente,laverificacindeberealizarse
bajolassiguientescondiciones:
1)Temperaturaestable(elagua,lapipetayhabitacin)entre15y30C
2)humedadrelativasuperioral50%.
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8.3.Operador
8.3.1.Usodelapipeta
Unprocedimientodepipeteadoadecuadacontribuyedemanerasignificativaparalareproducibilidaddelaverificacin
resultadosdelaprueba.Losoperariossinexperienciapuedentenerfluctuacionessignificativasenlosresultados.Parafiable
resultados,eloperadordebeestardebidamentecapacitadoycalificado.Losaspectosdetcnicadepipeteoeran
discutidoenelcaptulo3.
8.3.2.Entrenamiento
Unoperadorcalificadodebetomarlapruebadecumplimiento.Siesnecesario,pngaseencontactoconunaempresaespecializadapara
solicitarelprogramadeinstruccindelexplotador.
8.4.Consejos
Lapipetaaensayardebesermanejadodeacuerdoalasinstruccionesproporcionadasenlaoperacinde
manual.Unavezms,conbaseenelmanualdeoperacindelapipeta,certificoquelapipetaestlimpio,correctamente
montadoyquelaspuntasrecomendadosporelfabricanteseutilizanantesdecomenzarlaprueba.
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Vaseelcaptulo4paraobtenermsdetalles.
8.5.Elequipoutilizadoenlaprueba
Paraasegurarlaintegridadprocedimientodeverificacin,todoslosequiposutilizadosduranteelprocedimientodeberaser
verificadaregularmente.
8.5.1.Equilibrio
Losbalancesdebensercalibradosycertificadospersonalbyskilledconpesascertificadasbydomestic
autoridades(Empresas/InstitucionesacreditadosporINMETROymiembrosdelaRedeBrasileirade
CalibraoRBC).
Lalegibilidadequilibriodebeserelegidodeacuerdoconelvolumenseleccionadoenlapipetaseestprobando.
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Enlaprctica,elvolumennominal(seleccionablevolumenmsaltoporelusuario)sepuedeutilizarparalaeleccindela
equilibrio.
8.5.2.Otrosequipos
Termmetro:mximaincertidumbredemedidade0,2C
Higrmetro:medidamximadeincertidumbrede10%
Barmetro:mximaincertidumbredemedidade0,5kPa
8.5.3.Contenedores
Losrecipientesutilizadosduranteelprocedimiento:
ContenedorOrigen
Elrecipientequecontieneelaguaqueseutilizarenlasmediciones(elvolumendeunrecipientetal
deberasersuficienteparatodaslasmediciones).
Recipientedepesaje
Elrecipientequeseutilizaparalamedicin(parasercolocadoenelplatillodelabalanzadepesada).
ContenedorDisposicin
Untercercontenedorpararecogerlasalcuotasnoponderado.
Especialmenteparaprobarelvolumenmsbajodelapipeta,serecomiendaunarelacinpromediode3:1a
eldimetroylaalturadecontenedorparalospropsitosdepesajeoqueelrecipienteestprovistodeunatapa.
Algunasempresasdesuministrodekitsdecontenedoresadecuadosparaelensayogravimtrico.
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8.5.4.Agua
Lapruebarequiereaguadestiladaodesionizada.Enamboscasos,elaguadebeserdesgasificado(grado3
aguadeacuerdoconelartculoISO3696)alatemperaturadelahabitacinenquelaverificacinsellevara
lugar.Conelfindeevitarlasfluctuacionesdetemperaturadelagua,utiliceunrecipienteorigensuficientementegrandeparacontener
elaguaparatodaslasmediciones.
8.6.Elprocedimientodecontrol
Lacomprobacinderendimientoanalizatantolaprecisin(errorsistemtico)yprecisin(alazar
error).Lascondiciones,procedimientosyrequisitospreviamentedescritosenestedocumentodebenser
implementadoconelfindeasegurarlavalidezdelosresultadosdelaspruebas.Despusdeenjuagarlapunta,realice10
carrerasindividualesdepesaje*paracadavolumenseleccionado.Paralaspipetasdevolumenvariable,tresdiferentes
volmenesdebenserseleccionadosdeacuerdoconlaqueseevalaelrangodevolumendelmodelo.Tal
*Oelusuariopuedeseleccionarelnmerodemedidasdeacuerdoalasespecificacionesdeexactitudyprecisinaceptadospor
sumetodologa.
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volmenesdebenserelvolumennominal(mximo),50%delvolumennominal(Intermedio
volumen)yelvolumenmnimodelagamadevolumendemodelo(estosvolmenessedefinenenel
elmanualdepipeta).Paralaspipetasdevolumenfijo,seempleasloelvolumennominal.
1.Ajusteelvolumendelapruebaenlapipeta(estevolumendebemantenersedurantetodoelprocedimiento).
2.Estimarlatasadeevaporacin(paravolmenespequeos,pordebajode50l).Consulteelprocedimientosiguiente.
3.Ejecutelapruebadecomprobacin:grabarlasmasasenelInformededesempeodeComprobacin.
4.Calcular:registrarlosresultadosenelInformedeVerificacindeDesempeo.
5.Comparelosresultadosconlasespecificacionesdeexactitudyprecisinmostraronenlastablas1y2
(Punto8.6.4).
Estospasossedetallarnmsadelante.
8.6.1.Laestimacindelatasadeevaporacin(masamediaevaporporciclodepesaje)
Paravolmenesinferioresa50l,esnecesarioutilizarunrecipientecontapa.Elobjetivoesreduciralmnimo,
controlarycuantificarlaprdidaporevaporacinduranteelciclodepesaje.Elusodepinzasparalamanipulacin
esterecipienteestambinrecomendable.
Laevaporacinsepuedeestimarmedianteunasecuenciadecuatrosimulacionesdepesajedondeelpesaje
cicloserepitesinsurtirelaguaenelpesajediferenciatotalcontainer.Theatribuido
alaevaporacinsecalculaysedividepor4paraobtenerlamedia.Lagamaseexpresa
enmg/ciclo(encasodeunsolociclo,quedebeserexpresadaenmg).Elmanejoexcesivodela
envasedebeserevitado.Elusodepinzasparamanipularelrecipientedepesadaesaconsejable.
Lastasasdeevaporacinsonporlogeneralentre0.010mgy0.025mgporciclodepesaje.Recalcular
latasadeevaporacinsiemprequesecambienlascondiciones(temperatura,presinehumedad).
1.Aadiraguaalrecipienteunpesodehasta1/3desuvolumen.
2.Coloqueelrecipientetapadoenelplatillodelabalanza.
3.Elusodelapipeta,dibujeelalcuotadelcontenedororigen.
4.Tarelabalanzayretireelrecipientedepesajedelaplaca(elusodeabrazaderaspara
eliminacinesaconsejable).
5.Viertalaalcuotaenelcontenedordeeliminacinodevolverloalcontenedordeorigen.No
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dispensarenelrecipientedepesaje.
6.Anoteelresultadoe
.
1
7.Repitalospasos3a8tresvecesafindeobtenere
,e ye .
2 3
4
8.Calcularlaprdida/ciclo:e=(e +E +E +E )/4(mg).
1
2
3
4
9.Laevaporacinporeciclo(mg)debeaadirsealpesopromedioantesdecalcularla
volumenmedio.
*OusuriopodeselecionaroNmerodeMedidasdeacordocomcomoEspecificacionesdeexatidoePrecisoaceitas
pelasuametodologia.
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Unejemplodeclculodelatasadeevaporacinsemostralfinaldeestecaptulo.
8.6.2.Controlgravimtrico
Laaspiracinydispensacintcnicassedescribenenelcaptulo3.Aunquevariasalternativas
mtododepipeteosonposibles,sigasiempreelmodonormal(mododirecto,noutiliceelreverso
modo).Paratodaslaspipetas,evitarlacelebracinocalentarelsoportedeconoconlamanodurantelaprueba.
Parapipetasmulticanal,encajarlosconsejosencadacanalsinembargo,probarcadacanalindividualmente.
Anotelosresultadosparacadacanal.
1.Preparacin
1.1.Transferirelaguadesdeelrecipientedeorigenhastaelrecipientedepesajeaunaprofundidaddealmenos3
mm.
1.2.Mediryregistrarlatemperaturadelaguacontenedororigen(t
),Lapresindelaireyrelativa
1
lahumedaddelahabitacin.Sielrecipientedelabalanzatieneunatapa,colocarla.
1.3.Montarlanuevapunta.
1.4.Seleccioneyajusteelvolumenaprobar(estevolumennosepuedecambiardurantelaprueba).
1.5.Preenjuaguelapuntadibujandounaalcuotadelcontenedordeorigenyladispensacinenla
contenedordisposicin5vecesparaequilibrarlahumedaddelaireenelinteriordelaatmsferadelapipeta.
1.6.Pongaelrecipienteconaguaenelplatillodelabalanzaydetara(m
=0).
0
2.CiclodePruebas
Cadaciclodepruebasdebetenermenosde1minuto.Sinembargo,unritmoconstantedurantelaponderacin
operacindebemantenerse(elritmodelcicloyelritmoentrelosciclos).
2.1.Colocarunanuevapuntadelapipeta.
2.2.Preenjuaguelapuntamediantelaelaboracinydispensacinenelrecipientedisposicinunavez.
2.3.Dibujaelvolumenaensayarcomoseespecificaenelcaptulo3.
2.4.Sielrecipientedelabalanzatieneunatapa,retrela.
2.5.Dispensarelvolumendepruebaenelrecipientedepesajeyreemplazarlatapaconlaayudadela
abrazaderas.
2.6.Registrarlamasam delvolumendeprueba.
1
2.7.Tarelabalanza.
3.Repitalapruebadescritamsarriba(delapartida02.01a02.07)hasta10mediciones(m
m ).
10
4.Despusdelaltimamedicin,verifiqueyregistrelatemperaturadelaguacontenedororigen
(T),Lapresinatmosfricaylahumedadrelativadelahabitacin.
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8.6.3.Clculos
1.Clculodelvalorpromediodetemperatura
Calculalatemperaturamedia(t)deladestilada
agua(fluctuacinmximaentret
yt
:0.2C)
1
2
t=(t +T )/2
1
2
2.Clculodelvalorpromediodepresin
Uselapresinbaromtricamedia(B)yel
temperaturamedia(t)paradeterminarla
correspondienteZ
factorenlatabla.
B=(B +B )/2
1
2
3.Elclculodelvolumendelamasa
Despusdelascorreccionesprdidasporevaporacin(paravolmenes
pordebajode50l),multiplicarlasmasas(mg)bytheFactorZ
V =Z(m +E)
yo
yo
paraobtenerlosvolmenes(mul).
V =volmenesindividuales(mul)
yo
m =masasindividuales(mg)
yo
e=tasadeevaporacin(mg)
Z=factordeZ(l/mg)
4.Clculodelvalorpromediodevolumen
Despusdecalcularlaponderacindevolumenindividual,
calcularelvolumenpromedio(resultadoexpresadoenl).
Vi=volmenesindividuales
V=volumenpromedio
n=nmerodeponderaciones
5.Precisin(errorsistemtico)
Ladiferenciaentreelvolumenmediodepruebay
elvolumenajustadoenlapipeta.Porvolumenfijo
pipetas,reemplaceV conV =Volumennominal.La
s
o
exactitudpuedeserexpresadoenmLo...
e =VV
s
s
e =Promediodeerror
s
'V=volumenmedio
V =Volumenajustado
s
...Comoporcentaje:
e =100%(VV )/V
s
s
s
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6.Precisin(erroraleatorio)
Ladispersindelosvolmenesdispensadoalrededordela
volmenesdispensados
promedio.Tambinconocido(deacuerdo
SD
alcontexto)comoladesviacinestndar,lareproducibilidad
orepetibilidad.
Vi=volmenesindividuales
V=volumenmedio(calculadocomo
enelpuntoanterior)
n=nmerodemediciones
SD=desviacinestndar
Comoporcentaje,tambinconocidocomocoeficientedevariacin
(CV).
CV=(SD/V)x100%
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Clculos:factordeZ
Z=factordeconversin(ml/mg),t(C)=mediadelatemperatura*,B=presinatmosfrica(hPa)
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*Estepromedioseobtieneapartirdelatemperaturadelaguacontenedordeorigenmedidoalcomienzo
delaprueba(t)Ylatemperaturadelaguacontenedordeorigenmedidoalfinaldelaprueba(t
).
1
2
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8.6.4.Especificaciones
TABLA1
Estatabladeespecificacionesseaplicaalaspipetasdevolumendedesplazamientodeairefijosypositiva
pipetasdedesplazamientoutilizandocapilaresreutilizablesypistones.
Estatablapuedetambinserutilizadoparalaspipetasdevolumendedesplazamientodeairevariables.Elnominal
volumenenestaspipetaseselmayorvolumenseleccionableporelusuarioyespecificadaporel
fabricante.Porejemplo:unapipetaconunrangodevolumenespecificadode10la100l,la
volumennominales100l.Loserroresmximosaceptablesparaelvolumennominalseaplicanatodos
losvolmenesdentrodelintervaloespecificado:sitenemosencuentaunapipetaconunagamadevolumende10l
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a100l,elerrorsistemticomximoaceptableparacualquiervolumenseleccionadoesde0,8lyla
mximoerroraleatorioaceptableparacualquiervolumenseleccionadoes0,3l.
Paravolmenesintermediosalosquesesealanenlatabla,elvalorabsolutodeinmediatomayordela
volumenmximodebenaplicarseloslmitesaceptables.Porejemplo:paradeterminarelmximo
erroresaceptablespara25l,seutilizanlosvaloresespecificadospara50l.
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TABLA2
Estatabladeespecificacionesseaplicaalaspipetasdedesplazamientopositivousandocapilaresreutilizablesy
pistonesy/opipetasdevolumenfijo.
Paravolmenesintermediosalosquesesealanenlatabla,elvalorabsolutodeinmediatomayordela
volumenmximodebenaplicarseloslmitesaceptables.
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OBSERVACIONES
Elusuariopuededefinirloserroresmximosaceptables(sistemticosyaleatorios)enfuncindesu
metodologa.
Elusuariopuedecomprobarconregularidadelequipo,porejemplo,cadatresmeses.Otrosintervalosdetiempo
entrelaspruebassepuedenestablecer(siemprequenoexcedandeunao)enbaseala
siguientesaspectos:lafrecuenciadeuso,elnmerodeusuariosdelapipeta,lanaturalezaagresivadela
materialtransferido,loserroresmximosaceptadosporelusuario.
Cuandosellevaacabolapruebadespusdequeelmantenimientodelosequiposolareparacin,elmximoaceptable
errores(sistemticosyaleatorios)debenseguirlastablasquefiguranenelpresentedocumento(tablas1y2).
8.6.5.Comprobacininformeprocedimiento
Despusdelaprueba,lainformacintienequesergrabada.Adjuntamosunaplantilladeinforme,sinembargo,elusuario
puedenprepararsupropiaplantillasiemprequecontengalasiguienteinformacin:
Identificacindepipetas
Fecha
Condicionesdeensayo(temperatura,presin,humedadrelativa)
Lasmedicionesobtenidasparacadavolumenprobado
Losresultadosdelosclculos'
Elresultadodelacomparacinconlatabladeespecificaciones.
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PLANTILLA:
Identificacindepipetas
Modelo
Nmerodeserie Consejosutilizadosenelensayoen
IdentificacinTcnico
Empresa
Nombre
Telfono/Correoelectrnico
Tcnico
Nombre
Telfono/Correoelectrnico
Condiciones
Fecha/horadeprueba
Ubicacin
Temperatura(C)
Humedad(%)
Equilibrio
Modelo
Nmerodeserie Sensibilidad
Presin(hPa)
Resultadosdelaprueba
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COMPARACINCONLASESPECIFICACIONES:
APROBADO
FALLADO
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8.6.6.Rendimientocomprobarejemplonumrico
Ahoravamosadarunejemplodelosclculosparalacomprobacindelrendimiento.Vamosaestarbasadaen
unaverificacinhipotticode10lenunapipetadevolumendedesplazamientodeairevariable.
1.Dadoqueelvolumenevaluadosesinferiora50l,lavelocidaddeevaporacindebeserdeterminada(punto
8.6.1.).
Nmerodemediciones:04(e
,E ,E ,E )
1 2 3 4
Tasadeevaporacinmedia:e
e =0,016
e =0,021
1
3
e =0,018
e =0,017
2
4
e=(e +E +E +E )/4(mg)
1
2
3
4
e=(0.016+0.018+0.021+0.017)/4
e=0.018mg/porciclo
2.Latemperaturainicialdepruebaylapresinseregistran:
T =21,5C
yo
P =1013
yo
3.Diezmediciones(punto8.6.2.)Sellevanacaboylosresultadosregistrados.
W1=9,84
W6=9,90
W2=9,90
W3=9,91
W4=9,86
W7=9,92
W8=9,93
W9=9,95
W5=9,87
W10=9,92
4.Latemperaturafinaldepruebaylapresinseregistran:
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T F=21,5C
P =1013
F
5.Lapresinytemperaturadeclculomedia:
T=(Ti+Tf)/2
P=(Pi+Pf)/2
T=(21,5+21,5)/2
T=21,5C
P=(1013+1013)/2
P=1,013
Estosresultadospromediosdetemperaturaypresinseutilizarnparadeterminarlaconversin
factordeZ.
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6.Laconversindemasaavolumen:
Vi=(Wi+)xZ
Paraunatemperaturade21,5Cyunapresinatmosfricade1013hPa,elfactorZes1,0032l/
mg.
7.Clculodelvalorpromediodevolumen
V=(9,89+9,95+9,96+9,91+9,92+9,95+9,97+9,98+10,00+9,97)/10
V=9,95l
Anlisis8.Precisin
ElerrorsistemticoE
E=VVo
Voeselvalorestablecidoenlapipeta(volumennominal).Enesteejemplo,es10L.
E=9,9510
E=0,05l
ErrorrelativoE%
E%=(VVo)x100/Vo
E=%(0,05*100)/10
E=%0,50%
9.Anlisisdeprecisin(repetibilidaderroraleatorio)
DesviacinestndarSD
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SD
SD
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SD2 =1/9x[(9,899,95) 2+(9,959,95) 2 +(9,969,95) 2+(9,919,95) 2+(9,929,95) 2
v
+(9,959,95) 2 +(9,979,95) 2+(9,989,95) 2+(10,009,95) 2 +(9,979,95) 2+]
SD =0,03L
v
CoeficientedevariacinCV
CV=(DP/V)x100%
CV=(0,03/9,95)x100%
CV=0,34%
10.Losresultadossetransfierenalinforme(artculo8.6.5).
Lassiguientesespecificacionespara10lsemuestranenelcuadro1(punto8.6.4.):
Bastacompararlosresultadosobtenidos(informe)conlosqueseespecificanenlatabla.Enestecaso,el
pipetaprobadoesaprobado.
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9.ANEXOIII:Procedimientosdedescontaminacin
Losprocedimientosdescritosacontinuacinpuedenutilizarseparaalgunosmodelosdepipeta,enparticularlosquetienenuna
pistnmetlico.Porlotanto,esesencialparaleerlasinstruccionesdelfabricanteantesdeaplicarcualquierade
Losmtodosaqudescritos.
INTRODUCCIN
Estedocumentodescribeunaseriedemtodosparaladescontaminacindelapipeta,especialmentelosquetienen
unpistnmetlico.Talesmtodospuedenserfsicos(autoclaveoirradiacinUV)oqumicos.Conforme
paraeltipodeaplicacin,elmtododedescontaminacinmseficientedebeserelegido.
Sinembargo,teniendoencuentaelespectrodeaccin,ascomolasventajasydesventajasdeestos
mtodos,llegamosalaconclusindequeelproductoqumicoeselmseficaz.Solucionesqumicascomerciales
quecontienendetergentestalescomodesinfectantes,aseguranunadescontaminacineficiente.
Elmtododedescontaminacinqumicaesrecomiendaparalosprocedimientosdedescontaminacinderutina
yaqueeseficaz,rpidoyfcil.
Procedimientodedescontaminacin
Lostiposdecontaminacinincluyen:apartirdelamuestraparaeloperador,deunamuestraaotraode
lamuestraalapipeta.Estopuedeafectaralaseguridaddeloperador,lamuestray,enconsecuencia
elresultadoexperimentoo,eventualmente,lapipeta.
HayvariosmtodosparalaeliminacindecontaminantesSinembargo,hayalgunasdudassobre
sueficienciaycompatibilidadconlaspipetas.
Estedocumentopretendesolucionardudarelacionadaconelprocesodedescontaminacin,teniendolosdiversos
aplicacionesdelaspipetasenconsideration.Thus,diferentescamposdeaplicacinserncomentadas
(Qumica,microbiologaybiologamolecular)ylaindustriaqumicaomtodosfsicosdiscutieron.
Laeficienciadeunmtodopuedeserexplicadopormediodesumecanismodeaccin.Cuandoms
queseproponeunmtodo,habrunacomparacinparaayudaraelegirelmsadecuado.
Unavezelegidoelmtododedescontaminacin,leerlosprotocolosalfinaldeestecaptulo.
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Elcampodeaplicacin
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9.1.Qumica
Porelsimplelavadolaspipetasconaguadestiladaeliminacontaminacionesporcidos,lcalis,tampn
solucionesodisolventesorgnicos.
Puedesernecesarioparaeliminarotrosproductostalescomoaceitesygrasas.Entonces,elusodedetergentes
serequiere.Losdetergentes(tensioactivosaninicos)sonmolculasorgnicasquetienenunextremopolarhidrfilo
yunextremohidrfobonopolar.Debidoasuestructura,conviertenlosresiduosinsolubles(grasa,para
ejemplo)enlosresiduossolubles,porlotanto,convertirseenagentesdelimpiezaeficaces.
9.1.1.Procedimientoestndardelimpieza(paramsdetalles,vaseelanexoI)
Esteprocedimientodebeserutilizadoparaeliminarloscontaminantesderivadosdelautilizacindelapipeta(para
ejemplo:protenasysolucionestampn)yquenorequierendeuntratamientoespecialparasueliminacin,
talescomomicroorganismos,radiactividadyotrosqueveremosmsadelante.
Retirareleyectorconsejostirandodel
Desconectelatuercadeconexinseparandoaselcuerpopipetadelsoportedecono
Retireelpistnfijadocuidadoyporseparadolajunta(s),manteniendoelsoportedeconoconlamsfina
lasporcioneshaciaabajo
Coloqueelsoportedecono,elconjuntodepistn,eleyectorconsejos,lajunta(s)enunvaso(nocoloqueel
cuerpopipeta)ycompletarelvolumenconsolucindedetergente4%a8%enaguacaliente(
50C)
Colocarelvasoenunbaodeultrasonidosduranteunos15minutos(silaecografanoestdisponible,
mantenerelvasodeprecipitadosenlasolucindurante40minutos)
Desechelasolucindedetergenteutilizado
Lossellossoncapturadosconfrecuenciaenelinteriordelsoportedecono.Paraeliminarlos,coloqueelpistndenuevo
yapoyarlosobreelsoportedeconocomosiustedestpipeta.Alretirarelpistn,lossellosdelavoluntad
seleatribuye.
Coloquelaspiezasenunrecipientelimpioylavarporltimavezconaguadestilada
Secarenunhornoaunos50C(nosobrepasarestatemperatura)duranteunmximode2horas,o
dejequesesequeatemperaturaambiente.
OBSERVACIONES
Useunasolucindedetergente4%paralalimpiezadepipetasligeramentesuciasyunasolucinde8%parapesadamente
pipetassucias.
Paralaspipetassiguesuciodespusdellavado,elusodealgodnhumedecidaconalcoholisoproplico.Tencuidado
denodaarelpistn.
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Despusdeutilizarlapipetaencidoy/osolucionescorrosivas,siemprelavetodaslaspiezasconaguadestilada
aguaoetanol.
Montarlapipeta.
9.2.Microbiologaycultivocelular
Enestoscamposesesencialparaeliminarvariosmicroorganismos(porejemplo:virus,bacteriasy/o
hongos,talescomolevaduras).
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Variastcnicascondiferentesespectrosymecanismosdeaccinpuedenserutilizados.
9.2.1.Eltratamientoenautoclave
Lascaractersticasdelciclodeesterilizacindependendelacantidadinicialdemicroorganismos(la
lallamadacargamicrobiana).Esgeneralmenteaceptadoquelaposibilidaddeunorganismoviableparaser
presenteenunelementoautoclaveestpordebajode1en1milln(NiveldeAseguramientodeEsterilidad10
6).
Objetivos
Cualquierclulavegetativaoendospora
19.
Lacinticaqueconducenalainactivacindevirustodavanoestclaro
9.
Elcalorsedegradacidosnucleicos,enzimasyotrasprotenasesenciales.
Lamembranacelularpuedeestardaado.
Accin
9.2.2.IrradiacinUV
LalongituddeondaUVesdeentre100nmy400nm.Hay3tiposderadiacinUV,deacuerdo
alalongituddeonda:UVC(200nma290nm),UVB(290nma320nm)yUVA(320nma400
nm).
Objetivos
Accin
Letalparalamayoradelosmicroorganismos
19(Tabla2.1)
Cambiosfotoqumicosdeenzimascelulares(UVA)yADN(UVC)vasedetalles
enlatabla1.3.2.
9.2.3.Losagentesqumicos
Unasolucinqumicasedebeelegirteniendoenconsideracineltipodemicroorganismopara
sereliminado.
40de53
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Lasiguientetablamuestralosprincipalesmicroorganismosyalgunosagentesqumicoscomunes.Cuandoespecial
semanejan,sedebentomarcuentalascepasconrespectoalosproductoscomercialesespecficosutilizados
paradestruirlasytambincertificarlacompatibilidadqumicadelapipetayelcorrespondiente
qumica(vaseel3.3).
Niveldeactividad:+++:fuerte,++:medio,+:dbil,:nohayactividad.
Losmecanismosdeaccindeestosproductosqumicossedescribenenlasiguientetabla:
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9.3.Labiologamolecular
Losbioqumicosybilogosmolecularesestnfamiliarizadosconlasfuentesdecontaminacin,talescomo
proteasascontaminantes,cidonucleico(ADN,ARN),nucleasas(RNasas,DNasas)yradiactividad.
9.3.1.Lasproteasas
Lasproteasassonenzimasquedegradanlasprotenas.Variosmtodosdedescontaminacinysusmecanismos
deaccinsedetallanenlasiguientetabla:
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9.3.2.Loscidosnucleicos(ADNyARN)
LaespecificidadylasensibilidaddelastcnicasdePCRyRTPCRimplicanunadesventaja:fcil
contaminacindelosreactivosymuestras,loqueconduceaerroressistemticos7.
Otromtodo:
Tampndeglicina/HCl(pH=2).Laaccindeestasolucinnoestdocumentada(vaseelprotocolomsadelante)
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Nota:todosestosmtodosdegradanloscidosnucleicosenlasmolculasquetienenpesosmolecularesmsbajos
quenormalmentenoseamplificaSinembargo,estosmtodosnohacenlimpio.
9.3.3.Nucleasas
Lasnucleasassonenzimasquedegradanloscidosnucleicos.Tienenunaampliadistribucinyseencuentranen
clulasprocariotascomoeucariotas,vegetalesyanimales(piel,agua).DNasasnosonmuyresistentes
ynosonesencialesparalamayoradelasaplicacionesenbiologamolecular,mientrasquelasRNasassonms
duraderoyresistentealcalor.
DNasasnecesitanionesmetlicosparasuactividadypuedeninactivarsefcilmenteusandoalgunostampnapropiado
soluciones(talescomoagentesquelantes,porejemplo,EDTA).RNasasnorequierenionesmetlicos,yaque
utilizarelgrupo2hidroxilocomoreactivoporlotanto,nosonfcilesdeinactivar.
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Mtodoagente/Qumica
Accin
Eltratamientoenautoclave NosiempreessuficienteparainactivarRNasasquepuedenrecuperar
suactividaddespusdevariosmtodosdetratamiento
IrradiacinUV
DEPC
(Pirocarbonatodedietilo)
(Puntodeebullicin,porejemplo)
Lafaltadedatosalleer.
Residuosdehistidinaalquilatosdelossitioscatalticosde
RNasasA,inactivandoasellos.
EsteesunfuerteagenteSinembargo,noesuninhibidorabsoluta.
9.3.4.Loscomentariossobreloscidosnucleicosynucleasas
Todoslosmtodosdescritossedegradanparcialmenteloscidosnucleicosynucleasas,sinembargo,ningunodeellosmostr
100%deefectividad.
Laprecaucineslamejormaneradeevitarlacontaminacinenlabiologamolecular:
Separarlasreasyjuegosdepipetasparaprepararlasmuestrasyllevaracabolosensayos.
Usarpuntasprovistodefiltrosconelfindeevitarlacontaminacinporaerosoles.
Outilizarpipetasdedesplazamientopositivoprovistosdecapilaresdesechablesypistones(entotal
laproteccincontralacontaminacincruzada).ParalosprotocolosdePCRcrticos,elusodepositivo
Serequierepipetasdedesplazamientocuandonohaycontaminacinestinvolucrado.
9.3.5.Radioactividad
Encasodecontaminacinradiactivadbil,detergentesespecficosquecontienenformadoresdecomplejospuedenlos
serutilizado.
Comparandolosmtodos
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Losmtodossecompararonconsiderandoprimerosueficienciaentrminosdecontaminantesyentoncesla
ventajasydesventajas.
9.4.Mtodosespectrodeaccin
Consideredosenfoques:
1.Tengolosmaterialesnecesariosparaestemtodoenmilaboratorio.Qutanefectivassonellos(leerlatabla
verticalmente)?
2.Necesitoeliminarestecontaminante.Qupuedohacer(leerlatablahorizontalmente)?
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Niveldeactividad:+++:fuerte,++:medio,+:dbil,:nohayactividad,SI:noinformado.
*:Detergentesespecficos(conagentescomplejantes).
ParalairradiacinUV:+:algunaactividad,:nohayactividad.
EllmitedeactividadirradiacinUVesdifcildeevaluaryaquesuaccinnodependedelalongituddeonda
solamente(entre100nmy400nm),sinotambinotrosfactorescomo:tiempodeexposicin,ladistanciade
lalmpara,ladensidaddeemisin,elngulodelaexposicinylatemperaturaatmosfrica.
9.5.Ventajasydesventajas
Consultelatablasiguiente.Elmtododebecumplirconlossiguientesrequisitos:
Compatibilidadconlosmaterialesdefabricacindelapipeta.
Laaccinrpida.
Fcilysegurodeaplicar.
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*LosdePVDF.TitularesresistentealaradiacinUV(hechasdePBT)estndisponiblesparaP200
yP1000.
Porlotanto,losprocedimientosqumicospuedenserconsideradoscomolosmsapropiadosparapipetasdescontaminacin.
Protocolos
Deacuerdoconelmtodoutilizado,lasdiferentespartesdelapipetapuedenserdescontaminados.
Mtodo
Eltratamientoenautoclave
IrradiacinUV
Solucionesqumicas
Porcindelapipeta
TitularCone,tuercadeconexin,consejoseyector
Porcionesexternas
Losdiferentesniveles,dependiendodelasolucinusada
(Parteexterna,inmersincompleta)
Nota:Useguantesdesechablesdurantetodoelprocedimientodedescontaminacin.
9.6.Eltratamientoenautoclave
Retireeleyectorconsejosydesenroscarlatuercadeconexin.Limpieelsoportedecono,laconexin
tuercayeleyectordepuntasconundetergenteyluegoautoclavedurante20minutosa121C,0,1Mpa.Permitir
laspiezassesequenocolocarlosenunhornoa5060Cduranteunos30minutos.
Nota:Noautoclavedichaspiezasa134C,yaquesepuedendaar.
Noesterilizarenautoclavepartesdistintasdelasenumeradasanteriormente.
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9.7.IrradiacinUV
LmparasUVsepuedeninstalarenlapartesuperiordelbancooenunacampanadebioseguridaddondesepermitelamanipulacin.
Lacombinacinde254nmy300nmbombillasdurante20minutospuededestruirelADNdedoblehebra
(Secuenciaslargassonmsfcilesdeinactivar)
7.
9.8.Solucionesqumicas
Antesdeutilizarunasolucinqumica,estarsegurodelacompatibilidaddelosmaterialesutilizadosparalafabricacinde
laspipetas.Elfabricantedebeproporcionarunalistadelosmaterialesutilizadosparalafabricacindelapipeta.
Algunosejemplossemuestranacontinuacin:
PVDF,PBT,PC,PE,POM,cauchonitrilo,aceroinoxidable,ABS,PEIyPMP.Consulte"Glosarioy
Abreviaturas".
Nota:noesaconsejableremojarelselloylajuntatrica.
9.8.1.TitularCone,consejoseyectoryconexintuercadescontaminacin
Dosejemplosdesolucionesqumicasysusprotocolossemostraronacontinuacin.
Elhipocloritodesodio
Elhipocloritodesodiotieneunaampliaactividadantimicrobiana,rpidaaccinantibacterianaetambindesnaturaliza
proteasas,ADNyARN.Adems,esunatxicofcildeusoyagentequmicodebajocosteenel
concentracionesutilizadas.
Esmuyimportantelimpiarlapipeta(usandoundetergente,porejemplo,Mucapur)antesdedesinfectar
elusodehipocloritodesodio,yaqueelmtodopuedeperdereficaciaenpresenciadealta
concentracionesdematerialorgnico.
Limpieza
Retirareleyectorconsejos,desenroscarlatuercadeconexinyquitarelpistnsoportedecono.
Diluireldetergenteconaguacalientea5060Cen:
a)Unbaodeultrasonidooen
b)Unvasodeprecipitados.
Coloqueelsoportedecono,eleyectorconsejosylatuercadeconexin:
a)Enunbaodeultrasonidosdurante15minutos.
o
b)Enelvasodeprecipitadoslaspartesdebensercepillados.
Retirelaspiezasyenjuagarmuybien.
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Antesdeeliminarlasolucindelimpieza,aadir10%dehipocloritodesodioalasolucinypermitirquese
reaccionardurante10minutos.Esteprocedimientodescontaminarlasolucindelimpiezaantesdeentrarenel
reddeagualocal.
Desinfeccin
Diluirelhipocloritodesodioenaguadestiladaaunaconcentracinde10%ycolocarloenuna
vasodeprecipitadosgrande.
Coloqueelsoportedecono,eleyectorconsejosylatuercadeconexinenelvasoydejequese
reaccionardurante30minutos.
Lavarbienconaguacorrienteyluegoconaguadestilada.
Dejequesesequea50C60Cduranteaproximadamente30minutos.
Manteneratemperaturaambientedurante15minutosantesdemontarlapipeta(paraquela
piezasseenfrenantesdemontarlapipeta).
Nota:lasolucindehipocloritosedebedesechardespusde3das.
Glicina/HClBuffer(pH2=2)
Prepararlasolucindelasiguientemanera:
10xtampn:NaCl30,6gglicina39,2g,completaconaguadestiladahastaelvolumende523ml.
AadirHCl1Nenunacantidadsuficienteparaalcanzarunvolumenfinalde1000ml.
Retireconsejosoeyector,desenroscarlatuercadeconexinyquitarelpistnsoportedecono.
Coloqueelsoportedecono,latuercadeconexinyeleyectordepuntaseneltampndiluido1x(1/10
dilucindelamemoriaintermediasehamencionadoanteriormente)a95Cdurante30minutos.
Dejequesesequea50C60Cdurante30minutos.
Manteneratemperaturaambientedurante15minutosantesdemontarlapipeta.
9.8.2.Descontaminacindelaporcinyelcuerpodelapipetamenor
Paralamayoradelasaplicaciones,ladescontaminacindelaparteyelcuerpodelapipetainferiorbasta.
Unamezcladelosagentesqumicosserecomienda(detergenteydesinfectanteenunsoloproducto).
Elcuerpodelapipetadebelimpiarseconunasolucincompatible(verpunto3.3)enlasuperficieslo
(Nosumerjaelcuerpodelapipetaenlasolucindescontaminante).Laporcininferiordela
pipeta,incluyendoelpistn,eleyectorconsejos,eltitulardeconoylatuercadeconexin(exceptoparael
sellosdepistn)debesertambinlimpiado(utilizandopequeoscepillosparalimpiarelinteriortitulardecono)opuedeser
inmersosegnlossiguientesprocedimientos:
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Retirareleyectorconsejos,desenroscarlatuercadeconexinyquitarelpistnsoportedecono.
Diluirelagentequmicoelegido(deacuerdoconlasinstruccionesdelfabricante)enunvasodeprecipitados.
Cuandodesmontado,coloquelaspartesinferiores(pistn,consejoseyector,soportedeconoyconexin
tuerca)enelvasodeprecipitados.
Secara50C60Cdurante30minutos.
Mantengalaspiezasatemperaturaambientedurante15minutosantesdemontarlapipeta.
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Conclusin
Elmtododedescontaminacindelapipetaseseleccionadeacuerdoaltipodeaplicacin.Paralamayorade
lasaplicaciones,slodescontaminarafondolaspartesinferioresylimpiarelcuerpodelapipetausando
unasolucinelegida(ver3.3.2).
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Apndice1
Qupasaconlosmaterialesdesechables(puntas,capilares,pistonesyDistritips)?
Losmtodosutilizadosparalaesterilizacindelosplsticosdeconsumodelaspipetas
Enellaboratorio,laesterilizacinenautoclaveeselmtodomscomnparalaesterilizacindelaspuntas.Sinembargo,este
procesollevasutiempo:elpropioperododeautoclave,elciclodesecadoyestabilizacinatemperaturaambiente
durantealgunashoras.
Nota:elprocesodeesterilizacinenautoclavedebellevarseacaboa121C(20minutos,1MPa).Noloes
recomendadoaautoclavea134Ccomoplsticospuedenresultardaados.
Dependiendodeltipodematerial,otrosmtodossonutilizadosporelfabricanteparaesterilizar
consumibles:xidodeetilenooconmsfrecuenciadeirradiacin(rayosgamma:
60Co,obetarayos:loselectrones
haz).
Comoseautomatizaesteprocesodefabricacin,incluyendoelpasofinal,consejos"limpias"sonengeneral
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producidosincontactomanual.
Mtodo
Accin
Elxidodeetileno Alquilatoselextremoaminodelosaminocidos,loqueresultaenel
Irradiacin
lamuertecelular
11.
Laionizacindeloscomponentescelularesimportantes(incluyendoaminocidos)
11.
LainactivacindeADNdeplantillasatravsdelosradicaleslibres.
Comentarios
Elxidodeetilenoesaltamentetxicoylasautoridadesdecontrolmutagenic.Therefore,saludymedioambiente
envariospaseshavequestionedsuuso.Lairradiacinseutilizaenlosprocesosdeesterilizacinindustriales
nohacequelosmaterialesradiactivos.Ladosisseeligieronenbasealaexperimentalregulares
determinaciones.
Apndice2
Materialespirognicos
Lacontaminacinpormaterialespirgenospuedeserproblemticoenalgunosprocedimientosfarmacuticosen
dispositivosmdicosqueseutilizanenlaspreparacionesparenterales(mencionadoenvariosmtodosdela
Pharmacopeia) 4.
LospirgenossonendotoxinasproducidasporbacteriasGramnegativasysonqumicamenteyfsicamente
estable.Muypocosehapublicadosobrelaformadeeliminarlos.
Elusoderayosgammaaaltosnivelesdeenerga(mnimode25kGy)pareceeliminarlosriesgos
decontaminacindepirgenos.Enotraspalabras,unproductotienequeserfabricadoycontroladocomouna
dispositivomdicoconelfindesercertificadocomo"libredepirgenos.
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10.ANEXOIV:DEFINICIONES
Precisin(errormediooerrorsistemtico):ladiferenciaentreelvolumendispensado
yelvolumennominaloelvolumenseleccionadoenlapipeta.
Calibracin:conjuntodeoperacionesqueestablecenlarelacinentreelvolumendispensadoyel
volumennominaloelcorrespondientevolumenseleccionadoenlapipeta.
VolumendeaireDead:enpipetasdedesplazamientodeaire,elvolumendeaireentrelaparteinferiordela
pistnylasuperficiedellquido.
Tasadeevaporacin:laprdidadeaguaestimadocausadoporevaporacinduranteelprocesodeponderacin.
Anlisisgravimtrico:procedimientogeneralbasadoenladeterminacindelamasadelagua
alcuotasdispensados
porunapipeta.Losvaloressecorrigenrespectoalaprdidaporevaporacinentonces,la
masarealyelvolumensecalculanenbasealadensidaddelaguaatemperaturasespecficascon
correccionesalapresinatmosfricaambiente(factorZ).
Volumennominal:elmayorvolumenseleccionableporelusuarioyespecificadaporelfabricante.
Nota:porlotanto,paraunapipetadevolumenvariableconunrangodevolumentilde10la100l,su
volumennominales100pl.
Volumenseleccionada:elvolumenestablecidoporelusuarioparadispensarelvolumenelegidodentrodelautilidad
rangodevolumen.
Nota:paralaspipetasdevolumenfijo,elvolumenseleccionadocorrespondealvolumennominal.
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Precisin(erroraleatorio):dispersindelosvolmenesdispensados
porlosvolmenesdispensados
promedio.Tambinconocido(deacuerdoconelcontexto)comoladesviacinestndar,reproducibilidadorepetibilidad.
Repetibilidad:ladispersinentrelosresultadosdemedicionessucesivas(llevadaacabodentrodeun
cortoperododetiempo)sincambiodeparmetrosocondiciones.
Reproducibilidad:ladispersinentrelosresultadosdelasmedicionesrealizadasencondicionesdiferentes
(Diferenteubicacinuoperador),losparmetrossonconstantes.
Especificacionesvolumtricas(erroresmximosaceptables):loslmitespermitidos(superioreinferior)
paraladesviacinentreelvolumendispensadoyelvolumennominaloelvolumenseleccionado.
tilrangodevolumen:partedelvolumennominalquepuedeserdispensadadentrodelmximo
errorespecificadoenlaNormaInternacionalISO/DIS8655.Elvalorsuperiordelvolumentil
gamaessiempreelvolumennominal.Elvalorinferiores10%delvolumennominalsinolocontrario
especificadoporelfabricante.
Larecalibracin(operadorajustados):unprocedimientodefinidoporelfabricantequepuedeserseguido
porpartedelusuariofinalparaasegurarquelapipetatrabajadeacuerdoalasespecificacionespublicadas.
Ponderacin:sopesarmediosparadeterminarlamasadeunaalcuota.
FactordeZ:factordeconversin(l/mg)teniendoencuentaladensidaddelaguaencontactoconelairecuando
unafuncindelatemperaturaylapresin.
Ex:Designacin(abreviatura)deuninstrumentodiseadoparadispensarvolmenes.
En:Designacin(abreviatura)deuninstrumentodiseadoparadibujarvolmenes.
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11.GLOSARIOYABREVIATURAS
Glosario
Detergente:molculasorgnicasqueconviertenlosresiduosinsolublesenresiduossolubles(aceitesygrasas).
Sonagentesdelimpiezaeficaces(lamayoradeellosnomatanalosmicroorganismos).
Descontaminacin:desinfeccindeartculosinfectados,loquepermitesumanejo/uso(reduccinde
microorganismosaunnivelaceptable).
Nota:ladescontaminacinqumicarequiereunprocesodelimpiezaanteriorutilizandoundetergentedemaneraquela
procesodedescontaminacinpuedesereficaz.
Desinfeccin:eliminacinselectivadealgunostiposdemicroorganismosconelfindeevitarlatransmisin
(Reduccindelnmerodemicroorganismosqueinfectanpordebajodelnivelrequeridoparacausarunainfeccin).
Esterilizacin:eliminacincompletadetodoslosorganismos(porejemplo:clulas,esporasyvirus).
Abreviaturas
ADN:cidodesoxirribonucleico
EDTA:EtilenotetraacticoDiamina
ARN:cidoribonucleico
Materiales
ABS:acrilonitrilobutadienoestireno
PBT:tereftalatodepolibutileno
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PC:policarbonato
PE:Polietileno
PEI:politerimida
PMP:polimetilpenteno
POM:Polioximetileno
PP:Polipropileno
PVDF:fluorurodepolivinilideno
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12.Referencias
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800353A
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enlaReaccinenCadenadelaPolimerasa'.BioTechniques,10(4):442.
Parte1:Terminologa,generales
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Intitulado
Parte2:pipetas
Parte6:gravimtricomtodosdeensayo
Prince,AMyAndrus,L.1992."PCR:cmomatarADNnodeseado'.BioTechniques,12(3):358
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VIH1porlosdesinfectantesqumicos:.Hipocloritodesodio'EpidemiolInfect,115(3):567579.
'Lecontrledesmicroorganismesparlesagentesfsicosetchimiques'.Partie4,Chapitre5:LE
contrledesmicroorganismes.
"ExtraccinypurificacindeRNA'.Extraccin,purificacin,yanlisisdeARNmensajero
apartirdeclulaseucariotas(7.3a7.5).
Laesterilizacinylagarantadelaesterilidaddelosartculoscompendio,USPXXI.Esterilizacinyesterilidad
seguridad,informacingeneral
'EvitarRibonucleasacontaminacin".'neb.com'.
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PERSONALTCNICO
VolumenIIMdulo2AguadeAnlisisInstrumentalQumica
Editor:
JosMuradianFilhoMillipore
Coordinacin:
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RESUMEN
1.AGUAPARAANLISISQUMICOSINSTRUMENTALES.....................................................5
1.1.Introduction...................................................................................................................................5
1.2.Loscontaminantesdelagua......................................................................................................................5
1.2.1.Compuestosinorgnicosdisueltos......................................................................................6
1.2.2.Compuestosorgnicosdisueltos.........................................................................................6
1.2.3.Partculasy6
1.2.4.Microorganismos..................................................................................................................7
1.2.5.Losgasesdisueltos7
1.3.Seguimientoycontroldelacalidaddelaguapurificada..............................................................7
1.3.1.Elmonitoreodecontaminantesinicosinorgnicosconductividadyresistividad..............8
1.3.2.ElmonitoreodeloscontaminantesorgnicosTOCcarbonototaloxidable..................10
1.4.Calidadspecifications..................................................................................................................11
1.5.Tecnologasdepurificacindeaguaparalaboratorios....................................................................12
1.5.1.Destilacin12
1.5.2.Deionization......................................................................................................................13
1.5.3.Lasmosisinversa................................................................................................................14
1.5.4.Continuoelectrodeionization......................................................................................16
1.5.5.Ultrafiltration.....................................................................................................................18
1.5.6.Microfiltracindemembrana...............................................................................................19
1.5.7.Carbnactivado20
1.5.8.Laradiacinultravioleta(UV)...............................................................................................20
2.ESPECIFICACIONESaguapurificada......................................................................................23
2.1.Purpose.........................................................................................................................................23
2.2.Elmonitoreodelacalidaddevariostiposdeagua..............................................................24
2.3.Calibracinyqualification......................................................................................................24
2.4.Recomendacionesdealmacenamiento.........................................................................................................25
2.5.Purificacindeaguademantenimientodeequipos............................................................................25
2.6.Controlforms..............................................................................................................................25
2.7.Documentosdereferencia.................................................................................................................25
3.REFERENCIAS...................................................................................................................................29
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VolumenII/Mdulo2AguadeAnlisisInstrumentalQumica
1.AGUAPARAANLISISQUMICOSINSTRUMENTALES
1.1.Introduccin
Elagua,comoseencuentraenlanaturaleza,contienevariassustanciasdistintasdelaH
Omolcula:sales,orgnica
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compuestos,microorganismos,partculas,gasesdisueltos.Estoseatribuyebsicamenteaunnivelmuyconocida
2
caracterstica:elaguaesundisolventeuniversal.
Enellaboratorio,losdiversosusosdelaguarequierenungradomayoromenordelapureza.Estegrado
sedefinecomounafuncindelaaplicacin,elmtododeanlisis,deinterferenciaydesusensibilidadylmite
deladeteccin.Esporelloqueelaguapurificadaysucalidadsonfactoresesencialesparalapreparacin
desolucionesengeneral,solucionestampn,fasesmvilesencromatografa,espaciosenblancoEtambinotro
aplicacionescomunes,peronomenosimportantes,comoellavadodevidrio(enjuaguefinal).
Definir,asabiendas,laeliminacinyelcontroldeloscontaminantesdelaguasonpasoscrticosparaconeficacia
yeconmicamenteobteneraguapurificadaenellaboratorio,especialmenteelcumplimientodelasolicitud
requisitos.
Informacinyconceptossepresentarnacontinuacinencuatrotemasparaayudaralaconsecucindetalesfinesy
decidirloqueesunaespeciedeaguaqueseutilizarenunanlisisinstrumentalesespecficos:
Loscontaminantesdelagua
Seguimientoycontroldelacalidaddelaguapurificada
Lasespecificacionesdecalidad
Lastecnologasquesepuedenutilizarparapurificarelaguaenloslaboratorios
1.2.Loscontaminantesdelagua
Comosehamencionado,loscontaminantestienenunarelacindirectaconelanlisisencurso,ascomola
sensibilidadylmitededeteccindelmtodoutilizado.Porejemplo,enHPLCHighPerformance
Cromatografadelquidoslosanlisisutilizandoundetectorultravioletasonsensiblesaloscompuestosorgnicos
presenteenel(componentedelafasemvil)queabsorbenelaguayenlalongituddeondautilizada.Este
comprometelosresultadosylapropiacurvadecalibracin.Adems,loscompuestosorgnicosnodetectados
enestalongituddeondapuedeserretenidoyseacumulanenlacolumnadelaHPLC,perjudicandoassueficiencia
ylafuncionalidad,dandolugaralosllamados"picosfantasma"enuncromatograma.
Parafinesdidcticos,sedividialoscontaminantesdelaguaencincocategoras:
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1.2.1.Compuestosinorgnicosdisueltos
Bsicamenteconsistenensalesdisueltasenagua,losionesinorgnicospresentes.Puedenestarpresentescomocationeso
aniones.
Losaniones:
Elcontenidodecloro(Cl
),Ionhipoclorito(HClO
),Nitratos,nitritos,carbonatos,sulfatos,silicatos,etc...
Loscationes:
Desodio(Na+),Calcioymagnesio(Ca
(Pb,Ni,Cr,Hg),etc...
++,Mg++,Hierro(Fe
++),Aluminio(Al +++),metalespesados
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1.2.2.Compuestosorgnicosdisueltos
Estaclasedecontaminantessepuedeencontrarenlanaturalezaoelresultadodelacontaminacinolapotabilidaddelagua
procesoensmismoparaelconsumohumano.
Deorigennatural
Incluyamaterialesorgnicosresultantesdeladescomposicinvegetalyanimal.DescomposicinVegetal
esmuycomnenfuentesabiertas(presas,embalses),dondesecapturaelaguaparasuposterior
tratamiento.Entreotrosejemplos,podemosmencionarlostaninos,ligninas,fenoles,cidoshmicos(complejo
mezclademacromolculasquetienenestructuradepolmerofenlico).Tambinincluyaprotenas,enzimas
(Nucleasas,porejemplo),losaminocidosaesusderivados.
Origennonatural
Incluyecompuestosorgnicosoriginadosporlasactividadeshumanas.Sepuededestacartodotipode
pesticidassolublesenagua(fungicidas,insecticidas,herbicidas),hidrocarburosaromticospolicclicos(HAP),
bifenilospoliclorados(PCB),EDTA(agentequelantesiemprepresentesenjabones,detergentesy
formulacionesdecosmticos),citratos(enlasregionesprximasaloscultivosdectricos).
1.2.3.Laspartculasycoloides
Laspartculaspuedenserrgidos(arena,piedras,tierra)odeformable(desechosvegetales).Secaracterizacomouna
contaminanteporserunescudoprotectorparalosmicroorganismoscontralaaccindelosrayosUVy
agentesdesinfectantes.Sontambinunvehculoparatalesmicroorganismos,yaquelasbacterias,porejemplo,
puedeadherirsealaspartculas.
Enlosanlisisinstrumentales,laspartculastambinpuedencausarproblemasgravesdirectos.EnHPLC,porejemplo,
siemprehayunriesgodeobstruccindelacolumnaydaosalabombadeinyeccinpiston.Further,partculas
inmovilizadaenlaentradadelacolumnapuedeconvertirseenotrafaseestacionaria,porlotantoinesperadamente
menoscabandolascaractersticasderetencindecolumnaylapropiaseparacin.
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Loscoloidessonsuspensionesestablesdepartculasorgnicasoinorgnicascontamaoquevarade0,1a0001
mm.Todaslaspartculastienenlamismacargayseal.Larepulsinresultantemantienelasuspensin
estable.Ellossondifcilesdeeliminarporfiltracinmicroporosa,peropuedenserfcilmenteretenidosporinversa
smosisinversaoultrafiltracin.
1.2.4.Microorganismos
Losmicroorganismosbacterias,hongos(mohoylevaduras)yvirusestncomnmentepresentesenelaguapotable
aguadistribuidaenunaciudad.Aunquelasempresasdetratamientodeprocesarelaguaafindeeliminar
microorganismospeligrososparalasaludhumana,elaguasuministradanoesestrilenabsoluto.Elotro
microorganismosquequedandespusdelprocesodepotabilidaddelaguapuedenafectarlosanlisis.
1.2.5.Losgasesdisueltos
Podemosencontrartodoslosgasesexistentesenlaatmsferadisueltoenagua.
Elgasmsimportantedisueltaenaguaesdixidodecarbono(CO
cidoque,asuvez,estequilibradoconelionbicarbonatode:
).Seequilibraconcarbnico
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Esteequilibriogenerauninimportante,bicarbonato,quepuedeinterferirconlosanlisisy
deteriorarlosprocesosdepurificacin.
Colorado
velocidaddedisolucinysuconcentracinenelaguadependendelatemperatura(menoresla
2
temperatura,mayoreslavelocidaddedisolucinyabsorcin)yenelCO
presinparcialen
2
elmedioambientealqueestexpuestoelagua.
Otrosefectosdeotrosgasesenelaire:
Oxgeno:causacorrosinentanques,tuberas,etc.
Amonaco:contaminanteresultantedelafertilizacinagrcola.
SO
Contenidasenlosautomvilesescaparlosgasesylasemisionesindustriales.
1.3.Seguimientoycontroldelacalidaddelaguapurificada
Comosemencionanteriormente,loscontaminantescontenidosenelaguapuedeninterferirsignificativamenteconlaanaltica
determinaciones.Porlotanto,esimportantecuantificarellosyasegurarsedequecumplenconlacalidad
especificaciones.Adems,estacuantificacinesunamedidadelaeficienciadelapurificacindeagua
proceso.
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Enestetemasetendrencuentafundamentalmenteladeteccindeinorgnicos(iones)ycontaminantesorgnicos.
Hayunaampliagamadecontaminantesinorgnicosyanalizardeformaindividualseraextremadamente
duroylaborioso.EsposibledeterminareltotalTotalcontaminacininicadeunasolucinacuosa
solucinusandounsoloparmetro:laconductividadqueeslaconductanciaespecficaosurecproco,
laresistividad(resistenciaespecfica).
Igualmente,hayvarioscontaminantesorgnicoscontenidosenelaguapurificada.Aqu,tambin,uno
parmetrosolosepuedeutilizarparacuantificarlos:OrgnicoTotal/oxidabledecarbono(oTOCTotal
Oxidabledecarbono).
Lasbacteriasyotrosmicroorganismossecuantificaronutilizandomtodosqueempleanfiltracinenmicroporoso
membranasyposteriorincubacinutilizandomediosdecultivoo,msrecientemente,quimioluminiscencia.
Losresultadosseexpresanenufc/ml(unidadesformadorasdecoloniasporml).
Lacantidaddepartculaspuedesercontroladobymeansdetecnologasdeeliminacinespecficos(microfiltracin,
ultrafiltracinysmosisinversa).Enlosprocesosdepurificacindeagua,estoessuficientey,engeneral
nohaypreocupacionessobrelacuantificacindepartculasutilizandotecnologasapropiadasyasegurando
queseeliminantodaslaspartculasdeunciertotamao.
1.3.1.Seguimientodeloscontaminantesinicosinorgnicosconductividadyresistividad
Laconduccindelacorrienteelctricadependedelosionescontenidosenelagua.Cuantomspuraeselagua,
menoreslaconcentracindetalesionesy,porlotanto,menoreslaconductividad.Parabajo
conductividad,seaplicaelrecproco,dealtaresistividad,yaquesondiferentesexpresionesdelamisma
fenmenos.
Porlotanto:C=1/RoR=1/C
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Unidadesdemedida:
Conductividadmicrohm/cmomicroSiemens/cm
ResistividadMegohm.cm
Laconductividaddelaguaenellmitetericodepurificacin,esdecir,cuandocasitodoslosioneshansido
eliminadoysloH + yOH siguesiendo,es0.055microsiemens/cmo18,2Megohm.cm,a25C.
EstosellamadetipoIaguaultrapura(ASTM).
Elgrfico1muestraquelatemperaturaesunaspectoimportanteenlamedicindelaconductividad.Cuantomenores
latemperatura,mayoreslaresistividad(porlotanto,menoreslaconductividad).Estoesporqueen
bajastemperaturas,unamenormovilidaddeionesensolucinsellevaacaboyestamovilidadesinversamente
proporcionalalaresistividadodirectamenteproporcionalalaconductividad.
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Grfico1.ResistividadyconductividadVariacincomounafuncindelatemperatura
Resistividad
(Megohm.cm)
A25C,laresistividaddelaguaultrapuraes
18,2M.cm
Temperatura(C)
Esporelloquelatemperaturadelaguadebeserconocidocuandosecomparanestasmediciones.Conductividad
metrosymetrosderesistividadinstaladosenequiposdepurificacindeaguaengeneral,tienenunatemperatura
circuitodedesplazamientode25C,loquepermiteunalecturadirecta.
Comoelaguasevuelvemspura,esdecir,comodisminuyesuconductividadoresistividadaumenta,esmspropensa
ymsrpidoaloscontaminantesagregadosdelmedioambiente,volviendoasasuestadonatural.Para
esarazn,esfundamentalqueelaguaultrapuranosealmacenayobtuvojustoantesdesuuso.
Elgrfico2muestralatendenciadelaguaaltamentepurificadapararecaptacincontaminantes,evidenciadoporunaaguda
disminucindelaresistividaddealgunosminutosdespusdelapurificacin.Estadisminucindelaresistividadesdebidoala
lacontaminacindedixidodecarbonoatmosfricoqueseequilibraconelionbicarbonato,lapresencia
deloscualesconduceaunaumentoenlaconductividad(odisminuirlaresistividad).
Grfico2.ContaminacindeaguaultrapuraporlosgasesatmosfricosCO
(20C)
Resistividad(M.cm)
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1.3.2.ElmonitoreodeloscontaminantesorgnicosTOCcarbonototaloxidable
ActualmentehaydostiposdeanalizadoresdeTOC.Analizadoresutilizandooxidacinfisicoqumicasy
analizadoresutilizandounatecnologapatentadaporAnatelCorporation.
DeterminacinTOCpormtodosfisicoqumicosprimeraimplicalaeliminacindeCO
desdeelagua
2
paraserprobadomediantepurgaconnitrgeno.Estoconduceaunproblema:esdifcileliminartodoelCO
.
2
Elsegundopasoconsisteenlaadicindereactivos(perxidos)ylaaccindeuncatalizador(UVo
calor)parainiciarlareaccindeoxidacin.Unavezqueestaoxidacinescompleta,eldixidodecarbonoproducido
seretiradelamuestradeaguaporburbujeoconnitrgenoyserecogeporadsorcinenuna
columna.Acontinuacin,lacolumnasedesorbemedianteelaumentodelatemperaturayelarrastreusandounflujode
nitrgenopuro.LapresenciadeCO
esdetectadaporespectrometrainfrarrojaylaconcentracin
2
determinadoporlaintegracindepicos.
EstemtodotienevariaslimitacionesenlamedicindeTOCenaguaultrapura:
Enprimerlugar,existeelriesgodecontaminacinduranteelmuestreoyelmtodonopuedeserfcilmenteadaptado
paramedicionesenlnea.
Comosemencionanteriormente,esdifcilremovedorlasltimastrazasdeCO
enlaetapadepurga.
2
Loscompuestosorgnicosvoltilespuedensertambinprorrogadosbynitrogeny,porlotanto,nosontenidos
enelTOCtotal.
Losreactivosdeoxidacinutilizadossemantienenenunahabitacinnormaly,porlotanto,sujetoaCO
2
contaminacin.
Losmaterialesorgnicosquesonadsorbidosysincontrolliberanlentamenteydeformaacumulativa
contaminadalatuberadeinstrumentoylacolumna.
Porltimo,latcnicarequiereelusodeunagrancantidaddenitrgenodealtapureza,loqueestmuy
caro.
Lasegundatcnica,desarrolladaporAnatelCorporation,essimpleyconsisteenlaorgnica
compuestosoxidadosporlaradiacinUV.LaradiacinUVaunalongituddeondade185nmconvierteO
2
enozono(O )Queesunagenteoxidantefuerte.ConlaayudadelaradiacinUVa254nm,elozono,en
3
asuvez,reaccionarconaguaparaformarradicaleslibreshidroxiloqueluegoreaccionarconcompuestosorgnicos,
oxidanteporlotantoendixidodecarbono.Ladisminucinresultantedelaresistividad(ounaumentode
conductividad)semideysecorrelacionaconlalecturadelaTOCentonces.
Laventajaprincipalesquetalmtodopermiteunrpidoeautomticasmedicionesenlnea,siendo
muysensible(<1ppbCOT),reproducible,noutilizareactivosydefinirtodaslasclasesdeorgnico
compuestos,inclusivolosvoltiles.
Sinembargo,estemtodoesadecuadoparaaguasquetienenunaresistividadporencimade3Megohm.cm.
LaconcentracindeCOTseexpresacomoppbpartespormilmillones.
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1.4.Lasespecificacionesdecalidad
Unaseriedeespecificacionesautoridadesdenormalizacinhavequalitydestinaacubrirlasactividadesespecficas
aloscualesestndedicados.LasespecificacionesdelaASTMSociedadAmericanaparaPruebasyMateriales
Estndestinadosacubrirlainstrumentacinanalticaylaindustriaelectrnica.LosEstadosUnidos
Pharmacopeia(USP)especificacionescubrenlaproduccindedrogasyelISOInternational
OrganizacindeNormalizacin.Adems,elNCCLSComitNacionaldeLaboratorioClnico
Normas,encoordinacinconlaPACColegiodePatologistsestadounidenses,especificalostiposdeaguautilizados
enloslaboratoriosclnicos.
NormaASTM,lareferenciaD119399,eselmsadecuadoparalaespecificacindelostiposde
aguaqueseutilizaenqumicalaboratoriose,especialmente,elanlisisinstrumental.
Histricamente,ASTMfuelaprimeraentidaddeproponernormasparaaguadelaboratorio,dividiendoelaguaen
cuatrogrados,deacuerdoconlasaplicaciones:
TipoI
comoseconocecomoaguaultrapuraoaguadegradoreactivo,queseutilizaenellaboratoriocrtico
aplicaciones,incluidoslosanlisisinstrumentalesHPLC.
TipoIIparaaplicacionesmenosexigentes,talescomoenjuaguecristalera,anlisiscualitativoo
sntesisorgnica.
TipoIIIparaaplicacionesgeneralesdelaboratorio:preparacindemediosdecultivoylafinal
cristaleralavadoenaplicacionesnocrticas.
TipoIVSuministrodesistemasdeproduccindeaguagradoreactivo.
MicrobiolgicaContaminacincuandoelniveldebacteriasrequiereuncontrol,eltipodegradodebeser
proporcionadodelasiguientemanera:
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1.5.Tecnologasdepurificacindeaguaparalaboratorios
ConelfindepurificarelaguaalosnivelesespecificadosenlanormaASTMyotrasautoridades,variastecnologas
estndisponibles:
Destilacin
Desionizacin
Lasmosisinversa
Electrodesionizacincontinua(EDI)
Laultrafiltracin
microfiltracindemembrana
CarbnActivado
RadiacinUltravioleta
1.5.1.Destilacin
Ladestilacinesunprocesodepurificacindeaguaclsicoqueseaplicacambiodeaguadesdeellquidoalgas
estado,concondensacinenfaselquida.Alutilizarelprocesodedestilacin,varioscontaminantesson
eliminado,sinembargotodavanoesposibleobtenerdetipoIaguaultrapura.
Lassustanciasorgnicasquetienenunpuntodeebullicinbajotambinseconviertenenaguadestilada.Azeotrpica
mezclastambinseformaneinclusocompuestosdealtopesomolecularsetransfierenconel
vapor.Adems,cuandoelclororeaccionaconloscompuestosorgnicosnaturalesaaltastemperaturas,
compuestosorganocloradosseformanytambinprorrogadosporelvapor.
Lasliceseextraedelosdestiladoresdevidrio,ascomootrosionesendestiladoresdemetal.
Adems,elprocesodedestilacinconsumeunagrancantidaddeelectricidadyaguaderefrigeracin.
DESTILACIN
Ventajas
Desventajas
Eliminaungranporcentajedetodoslostiposde
contaminantes
Notodosloscontaminantesseeliminany
muchosdeellosseproducenduranteel
Produceaguaconresistividadentre0,2
proceso.
y1Megohm.cm.
InversindeMediano
Lacalidaddelaguanosecontrola.
Altocostodelaoperacin:laelectricidadyelagua.
Comnmenteconocidaydefcilmanejo
proceso
Regularymantenimientopretratamientoson
esencialparaasegurarelrendimiento.
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1.5.2.Desionizacin
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Figura1.Esquemadelprocesodedesionizacinlechomixto
Elprocesodedesionizacinserealizamedianteresinasdeintercambioinicoglobularesporososquetienendimetros
entre0,3y0,8mm.Talesresinassefabricanconlascadenaspolimricasquecontienenestireno
ydivinilbencenoenlacescruzadosenelquelosgruposqumicoscargadosestnunidos.
Enresinasaninicas,esdecir,lasresinasdecapturadeaniones,estosgruposcontienenamoniocuaternario.Sulfnico
gruposseutilizanenresinascatinicasresinascationescaptura.
Alcomienzodeunprocesodedesionizacin,cuandolaresinaesttodavasinusar,ionesunidoanegativo
gruposderesinascatinicassonH+ losprotonesylosionesunidosaresinasaninicassonhidroxilosOH
.
Duranteelproceso,loscationescontenidosenelagua(Na
+,Ca ++,Etc.)seuniralaresinacatinicae
desplazarelH + deprotones,mientrasquelosaniones(Cl
,NO )Seuniralaresinaaninicaydesplazarhidroxilos.
3
Desionizacinesunprocesomuyeficienteparaeliminarlosioneseinclusoalgunoscompuestosorgnicosionizados.
Sinembargo,lasresinassonunexcelenteapoyoparaelcrecimientobacteriano.Comoelaguadealimentacinnoesestril,la
resultadoesqueelaguadelacontaminacinbacteriolgicadespusdeunacolumnadedesionizacinpuedeser1000veces
mayorquelaentradadeagua.
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Desionizacin
Ventajas
Eliminacinefectivadeiones
(Resistividad:110Megohm.cm)
Instalacinsencilla.
Bajainversin.
regenerable.
Desventajas
Noeliminapartculas,materiaorgnicao
microorganismos.Resinasregeneradaspuedenproducir
partculas,materialesorgnicosopromoverlabacteriana
crecimiento.
intercambioinicoestndar:elorigenderesinaesdesconocido.
Losaltoscostosdeoperacin:laregeneracin/
eltransporte.
Lacalidaddelaguaesvariableglbulosdaados.
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Lasresinaspuedenserregeneradosenellaboratoriooenempresascontratistasqueproporcionaronesteserviciopor
cambiarunacolumnadesgastadoporunoregenerada.Estopuedeserunafuentedeinicoresidual
contaminacincomoresultadodelaaplicacindelaentradadeaguaodelmedioambienteenqueestosresina
estnexpuestos.
Deunsolouso,porlotanto,noregenerable,resinassonelmsindicadoparaevitartodosestosproblemas.
1.5.3.Lasmosisinversa
Reverse
smosis
smosis
Osmtico
Presin
OsmosisInversa
Membrana
(RO)
Figura2.Esquemadelasmosisinversayprincipiodesmosis
SesuponequetenemosuntuboenformadeUcondosramasseparadasporunamembranadesmosis.Enel
ramaizquierda,lasmolculasdeaguasedisuelven(representadosporpuntos).Deacuerdoconlasleyesdela
latermodinmica,lasmolculassedifundadesdelaizquierdahacialaderechahastaquesusconcentraciones
sonequivalentes.Sinembargo,estasmolculasnopuedencruzarlamembrana,perolasmolculasdeaguapueden.
As,elaguaatravesarlamembranadesdeladerechahacialaramaizquierdaparadiluirladisuelto
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molculas.Esteprocesocontinuarhastaquesecreaundiferencialdepresin(presinosmtica)entre
lasramas,equilibrandoasladiferenciaenlasconcentraciones.
Unadesmosisinversaesexactamentelocontrariodeesteproceso:ionesdeaguaquecontieneuotroscontaminantes
sesometeapresincontraunamembranadesmosisinversaelaguapuraseobtieneenelotroladode
lamembrana.Lapresinejercidadebesermayorquelapresinosmtica.
Membranasdesmosisinversatpicamenterechazados90%delamonovalente,95%delabivalentee99%
delosionespolivalentes.99%deloscompuestosorgnicosquetienenunpesomolecularsuperiora300,virus
ylasbacteriastambinsonrechazados.
Afindeobtenerunflujocontinuodemolculasdeaguaenestamembrana,loscontaminantestienenque
serremovidoregularmente.Estosepuedelograrporelllamadoflujotangencial(figura3)quepermite
partedelflujodeaguaparairatravsdelasuperficiedelamembrana,promoviendoasunescaneoautntica
ylaprevencindelaacumulacindecontaminantes.
Reverse
smosis
Membrana
Agua
Impregnado
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Alimentacin
Rechazado
Figura3.Esquemadelflujotangencialenunsistemadesmosisinversa
Enelequipo,esteajusteseproporcionacomomembranasenrolladashelicoidalmente,formandoasuncartucho
dondepermearyseniegancanalesestnperfectamenteseparadosyapretado.Estocreaunagranseparacin
reaenunvolumenrelativamentepequeo,loquepermitelaconstruccindesistemascompactos.
Sistemasdesmosisinversaeliminanunporcentajerazonabledetodotipodecontaminantessinembargo,
yaqueestaesunaeliminacinpercentil,noessuficienteparaalcanzarinclusolosnivelesdepurezadelaguadetipoII
requeridoparalamayoradelassituaciones.Lasiguientetablamuestralasventajasydesventajasdeeste
proceso.
OSMOSISINVERSA
Ventajas
Desventajas
Eliminaunporcentajerazonabledetodos
Loscontaminantesnosonsuficientemente
tiposdecontaminantesdelagua(iones,orgnica eliminadoafindecumplirconeltipoII
materia,pirgenos,virus,bacterias,partculas
lasnecesidadesdeagua.
ycoloides).
Lasmembranasdesmosisinversasonsujetas
Bajoscostosdeoperacincomoresultadodelabaja aincrustacinyobstruccinalargoplazo(sino
elconsumodeelectricidad.
adecuadamenteprotegidos).
Mantenimientomnimo
Hastahacepoco,elconsumodeaguaera
Unbuencontroldelosparmetrosdeoperacin.
similaralosdestiladores.
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Laelectricidadseempleaenesteprocesoparafuncionarslolabombadepresurizacinporlotanto,unamuy
bajoconsumosisecomparaconelprocesodedestilacin.
Lasmembranasdesmosistambinpuedenserincrustadasyobstruidoscomoresultadolaprecipitacindesales,principalmente
carbonatodecalcio,reduciendodeestemodoelflujodesalidaydaandolaestructuradelamembrana.Porestarazn,
Serequiereelcontroldelosionesincrustantesparaevitarestetipodeproblema.
1.5.4.Electrodesionizacincontinua
SisumergimosdoselectrodosdenodoyctodoenunasolucindeNaCl,porejemplo,yaplicamos
unadiferenciadepotencialentrelosdoselectrodos,elNa
+ yCl ionesmigrarnhaciael
ctodoyelnodo,respectivamente.
Haymembranasllamadasmembranasdeintercambiodeionesselectivamentepermeablealoscationesoaniones
yquepermitenestetipodemigracinquesedeseacontrolar.Estasmembranasestnhechasderesinadeintercambioinico
fragmentosincluidosenunamatrizdepolietileno.Talesfragmentosderesinascatinicasoaninicas,respectivamente
permitencationesoanionesparapasar.
SiseintroducenestasmembranasenelsistemadeNaClyloselectrodosdescrito,somoscapacesde
controlarlamigracindeNa + yCl
ionescomosemuestraenlasiguientefigura.
Membranaaninica
nodo
Ctodo
CatinicoMembrana
nodo
Ctodo
Figura4.Controldelamigracindelosionesatravsdemembranasdeintercambiodeiones
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Ennuestromodelo,slolosionescloruropuedencruzarlamembranaaninica.Elcontrario,sloionesdesodio
puedecruzarlamembranacatinica.Elllamadosistemadeelectrodilisissecreaenunsistemadonde
ambasmembranassealternanyloselectrodosmantienen(figura5a).
Ctodo
nodo
Aaninicosdemembrana
CMembranacatinica
Producto
Figura5.sistemadeelectrodilisis
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Enlasiguientecelda,continuandoaladerecha,tantolosionesdecloruroysodiopuedendejar.Podemosclaramente
notarunadisminucindeioneselectroneutralidadtambinsemantieneyaqueparacadaioncloruroexiste
unodesodiosalirdelamismaclula.
Porelcontrario,losionessonacumulandoenlaceldadeallado,yaqueningunadesodioocloruropuedendejar.
Comoresultado,hayunsistemaenelquelosionesseconcentranenalgunasclulas(flujodeeliminacin)y
prcticamenteausenteenotras(elflujodelproducto).Esteprocesosepuedeutilizarparapurificarelaguasinembargo,
esextremadamentelentaunavezquelosionestendranquepasardeunaclulaaunamembranayhaciael
electrodo.
Conelfindemejorarelrendimientodelsistema,lasclulasestnllenasdeproductosdeionesdelechomixto
resinasdeintercambioaninico(+catinicos).Estopermitirunatransferenciainicadesdeelcentrodelacelda
hacialamembranasemipermeableenlugardemoverseaunavelocidadbajaenelaguadondelascolisiones
causadaporlosmovimientosbrownianosdisminuirasuavance.Porlotanto,losionessaltandeuna
resinasitioactivoaotrohaciaelelectrodoquetieneunasealopuesta.Esteajustetambinpermite
lacapturadesustanciasorgnicasdbilmentecargadas.
LasresinasseregenerancontinuamentecomoH + yOH
componiendomicroambientesalrededordelasresinas.
segeneranenelcampoelctricocreado,
Sinembargo,elprocesodepurificacindeelectrodesionizacincontinuatienequeseralimentadoconagua
previamentepurificadaporsmosisinversayquetieneunaconcentracindesalesatenuada.
nodo
Ctodo
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Producto
Aaninicosdemembrana
CMembranacatinica
Figura6.Resinasdeintercambioinicodellenadodelasceldasdeproductos
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ElectrodesionizacinCONTINUO(EDI)
Ventajas
Eliminaeficazmenteelmaterialorgnicodisuelto.
Requiereunmantenimientomnimo.
Norequierelaregeneracindelasresinas.
Bajocostodeoperacin.
Excelentepretratamientoparaultrapurificacinagua
sistemas
Desventajas
Requiereprepurificacin
1.5.5.Laultrafiltracin
Figura7.Representacinesquemticadelaseccindeunultrafiltroquemuestralarelacinentre
lacapaactivadeseparacin(1)ylacapadesoporte(100).
Ultrafiltrossonmembranasasimtricaspolimricosconunacapaactivamuyfino(1micrmetrodeespesor)
enlapartesuperioryunacapadesoportemsgruesa(100micrmetros).
Lasmembranasdeultrafiltracin(UF)operanbajopresin.Enestascondiciones,lasmolculaspequeas
sercapazdeatravesarlacapaactiva,mientrasqueseretienenlasmolculasmsgrandes.Elpuntodecortesellama
NominalMolecularLmitedepesoNMWLyseexpresaendaltons.Estevalorseutilizapara
caracterizarlasmembranasdeUFunavezqueelpesomolecularesmsfcildeencontrarenlaliteraturaquela
tamaosmolculas.
Elpesomolecularestdirectamenterelacionadaconeltamaodelamolcula,sinembargo,otrosfactorestambintienenqueestar
considerado:forma,laestereoqumicayelpHdeladispersinenlaqueestn.Estoesesencialpara
protenas.
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LasiguientetablamuestralasventajasydesventajasdelaUF.
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ULTRAFILTRACINUF
Ventajas
Desventajas
Eliminacineficaz(>99%)detodoslosorgnica Casilanoeliminacindeiones,gasesybajo
molculasquetienenunpesomolecularporencimade
materiaorgnicadepesomolecular(UF
membranasproporcionadasconunamallamsestrecha
laNMWL.Eliminacinmuyeficazde
pirgenosyvirus,ascomopartculas.
tenerunvalordecortede1.000Dalton)
Nohayriesgodeincrustacin.
Bajoconsumodeaguayelectricidad.
Bajomantenimientobiendocumentado/
procedimientosaceptados
Comonotado,estasmembranassonmuyeficientescuandoseretiradealtopesomolecularorgnica
compuestos.
1.5.6.Microfiltracindemembrana
Superficie
Filtro
Durapore
Membrana
Microfotografa
Figura8.Seccintransversalrepresentacindeunfiltrodesuperficieydelamicrofotografa
Durapore membrana(Foto:.cortesadeMilliporeIndeComLtda.).
Haytrestiposprincipalesdefiltros:filtrosdeprofundidad,desuperficieydemembrana.
Losfiltrosdeprofundidadestnhechosdefibrasaglomeradasyretienenloscontaminantesentodosuespesor.
Apesardetenerunaaltacapacidad,sulmitededeteccinnoesmuyclara.Sueficienciaesdealrededorde
95%yvaracomounafuncindelasalida.Adems,sepuedenliberarcontaminantesenelfiltrado,
generalmentefibrasomaterialretenido.
Losfiltrosdesuperficiesehacengeneralmentedevariascapasdematerialesnofibrosos,lacapturadecontaminantes
principalmenteensusuperficieyquetieneunaretencinintermediaylacapacidadderendimiento(98%).
Filtrosdemallaomembranaretienencontaminantesensusuperficiepormediodeunefectodetamizado.En
Apesardesubajacapacidad,talesfiltrosretienen100%deloscontaminantesquetienenuntamaoporencimadesu
lmitedecortebiendefinido.Filtrosdepantallatpicossonlosfiltrosquelaintegridaddelamembranapuedeser
verificadapormediodepruebasespecficas,porejemplo,puntodeburbujaodifusin.
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MICROFILTRACINMEMBRANA
Ventajas
Desventajas
total(100%)deeliminacindetodosloscontaminantes(partculas,
efectomnimosobreotra
bacterias)mayorqueeltamaodeporo.Pruebadeintegridad contaminantes.
disponible.
filtracinesterilizante(0,22mmdemembrana).
Mnimomantenimiento:simplementereemplacesegnseanecesario.
Altassalidasseobtienenabajaspresiones.
Retencindelasuperficie:puedenestarsujetos
Caudaldesalidaeficienciaindependiente.
alaobstruccinolaobstruccin.
Laprincipalventajadelosfiltrosdemembranaeslaeliminacintotal(100%)detodosloscontaminantesquetiene
untamaomayorquesudimetrodeporo.Sehanutilizadomembranasconundimetrodeporode0,22micras
enlaindustriafarmacuticadurantevariosaosenlafiltracinesterilizantedesoluciones.
1.5.7.Carbnactivado
Elcarbnactivadoseutilizaprincipalmentedebidoalacapacidadparaadsorbermaterialesorgnicoscomoresultadodesu
ampliasuperficiedehasta1.000m2/G.
Otrafuncinesreduciroxidantes,comoelclorolibre,contenidasenelaguayquepodran
afectaramembranasdesmosisinversaoresinasdeintercambioinico.Porlotanto,estaesunatecnologaprincipalmente
dirigidoaltratamientoprevioylaproteccindeotrospasos.
CARBNACTIVO
Ventajas
Desventajas
Eliminacinefectivadeunaampliagamade
Efectomuydbilenotroscontaminantes
sustanciasorgnicas(inclusoaquellosconbaja
peso)bymeansmolecularesdenoespecfica
bonos(FuerzasdeVanderWaals).
Grancapacidadcomoresultadodelagran
readesuperficie.
(Aexcepcindealgunaspartculaseliminadaspor
filtracinenprofundidad).
Cuandotodoslossitiosestnocupados,sealcanzaelequilibrio
yloscompuestosorgnicosliberados.
Lasbacteriaspuedendesarrollardespusdealgntiempo.
Sueficienciadependedelasalida.
1.5.8.Laradiacinultravioleta(UV)
RadiacionesUVtienenlongitudesdeondaentre100y400nm,divididoencuatrocampos:ultracorta,corta
(UVC),medio(UVB)yondaslargas(UVA).Estasradiacionespuedenserfcilmenteproducidosporlabaja
lmparasdevapordemercuriodepresinqueemiteradiacionesendoslongitudesdeonda:185y254nm.
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Radiacionesconunalongituddeondaentre200y300nmdestruirmicroorganismosrompiendola
CadenadeADN.Estoesmsintensaa260nm.Porlotanto,lalongituddeondade254nmtieneunaeficiencia
queestmuycerca(80%)alaconsideradacomoptimaparaestepropsito.
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Sinembargo,serequiereundiseomuycomprobadaporloquesellegaesarealidadtaleficiencia,teniendoprincipalmente
lacapacidaddepenetracindelaradiacinUV(enelordende1cm)enlaconsideracin.Esnecesario
proporcionarunflujodesalidasuficienteparapermitirqueestapenetracin,respetandoeltiempodepermanenciadelaguaenel
cmaradeexposicin.
OtraaplicacinmuycrticodelaradiacinUVeslareduccindelaoxidablecarbonototal
(TOC)nivelesdeaguapurificada.
Dehecho,laradiacinUVnodestruyedirectamentecompuestosorgnicos,perogeneraozonoque
seoxidalassustanciascontenidasenelagua.
Comopuedeverseenlafiguradeabajo,alaizquierda,doslongitudesdeondadiferentessonnecesariasparagenerar
Losradicaleshidroxilolibre(OH)queposteriormenteseoxidacompuestosorgnicos.
Figura9.Alaizquierda:lasecuenciadereaccionesparaformarelradicallibrehidroxilo.Por
reaccionesdeoxidacindecompuestosorgnicos:derecho.Ejemplo:metanol.
Ambosmecanismosdescritosenlaliteratura(Norrishetal.,1965y1967Banfordetal.)Requieren
laaccindelaslongitudesdeonda185y254nmylapresenciadeoxgenoenelagua.Ambos
mecanismoshavethemismaestequiometrayelresultadoenlaformacindeelmismonmerodehidroxilo
radicales.
Enelladoderechodelafigura,unejemplodelaoxidacindeuncompuestoorgnicosincargo
(Metanol)semostr.Estaesunadelasmolculasorgnicassimples,quetieneslountomodecarbono.
Bajolaaccindelosradicaleshidroxilolibre,estamolculaseoxidasucesivamenteenunacreciente
escaladelaoxidacin:comenzandoconelalcohol,yluegoaldehdo,cidoydixidodecarbonoyfinalmente
agua.
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Comosediscutipreviamente,dixidodecarbonoyaguaseequilibranconcidocarbnicoque,asuvez,es
equilibradaconelbicarbonatoyH
+ iones.Porlotanto,lasresinasdeintercambioinicoeliminarelcarbn.
Tengaencuentaquemediantelaconversindecarbonoorgnicoenunionqueesfcildequitarpordesionizacin,era
posiblereducirelniveldeTOCaguapurificada.
RADIACINUV(185+254nm)
Ventajas
Conversindetrazasdeorgnica
Desventajas
TcnicaPulidosolamente:puedeverseafectada
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contaminantesenmuestrasycargados,
alfinal,enCO
(185+254)
2
destruccinlimitadademicroorganismosy
virus(254).
Bajoconsumodeenergaelctrica.
Fciloperacin.
silaconcentracindemateriaorgnicaen
elaguadealimentacinesmuyalta.
Loscompuestosorgnicosseconviertenyno
eliminado.
efectolimitadosobreotroscontaminantes.
Eldiseotienequeserapropiadoparaasegurar
laeficiencia.
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2.ESPECIFICACIONESaguapurificada
2.1.Propsito
Estaespecificacinserefierealosrequisitosadecuadosdelasaguasqueseutilizarnenelanlisisqumico
mtodosypruebasfsicas.SehabasadoenlasespecificacionesdelaASTMD119399,segnenmendada.Cuatro
Seespecificaronlascategoras:
LamedicindepHeneltipoI,IIyaguagradoreactivoIIInoestincluidoenelpliegodecondiciones,
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yaqueelaguaenestosgradosdepurificacinnocontienencomponentesencantidadessuficientesparadarlugarauna
cambiodepH.
Losmtodosparalapreparacindevariostiposdeaguadeterminarloslmitesdeimpurezasydeberan
cumplirconlassiguientesespecificaciones:
2.1.1.TipoIreactivoaguadecalidaddebeserpreparadoporunprocesodeprepurificacinapropiado,
seguidoporelpulidousandounsistemadeultrapurificacinquecomprendeunlechodeintercambioinicomixto
resinayunfinaldemembrana0,22m.Lapreparacindebesersiemprellevadaacaboenel
tiempodeuso.Serecomienda,peronoesobligatorio,paradotaralsistemaultrapurificacin
(Pulidofinal)conunalmparadeUVconemisina185y254nmconelfindereduciralmximo
losnivelesdeTOC.Adems,tambinesrecomendable,peronoobligatorio,paraproporcionarla
equiposultrapurificacin(pulidofinal)conunmedidordeTOCenlneaparaelmonitoreoconstante
decontaminantesorgnicos.Suministro(pretratamiento)delaetapafinaldeaguadebeteneruna
conductividaddealmenos10mS/cma25C.
2.1.2.TipoIIdeaguadegradoreactivodebeserpreparadoporunprocesodesmosisinversacombinada
conelectrodesionizacin,destilacinointercambioinicoquetieneunaconductividadpordebajode1,0mS/cm
a25C.Elintercambiodeiones,odesmosisinversaylaadsorcinorgnica,puedensernecesariosy
asociadaconladestilacinsilapurezanoesalcanzadoporunasolaetapadedestilacin.
2.1.3.TipoIIIdeaguadegradoreactivodebeserpreparadoporsmosisinversaseguidodecontinuo
electrodesionizacin,destilacin,intercambioinicoounacombinacindelosmismos,seguidobyapulidor
conunfiltrode0,45micrasmembrana.Serequiereelusodeestefiltrocuandomicrobiolgico
Serequierelacontaminacin.
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2.1.4.TypeIVaguadegradoreactivodebeserpreparadobyreversedesmosis,destilacin,intercambioinico,
smosisinversaseguidaporelectrodesionizacincontinua,electrlisisounacombinacin
delosmismos.
Losvariostiposanteriormentepuedenserelegidosporelmtodooinvestigacin.
Estaespecificacinnosedestinaacubrirproblemasdeseguridadasociadosconlaaplicacin.Es
responsabilidaddelusuarioestablecerlanormadeseguridadapropiadayprcticassaludablesydefinirel
aplicabilidaddeloslmitesdeusoderegulacinprioritarios.
2.2.Elseguimientodelacalidaddevariostiposdeagua
2.2.1.Conductividadyresistividad:Paralamedicindelaconductividadoresistividad,laconductividad
ometroresistividaddelequipodepurificacindeaguasedebeutilizarsiemprequeseandebidamente
calibrado.Siseutilizaundestiladorquenotienemetrosacoplada,lamedicindebellevarseacaboutilizando
unmedidordeconductividadporttildebidamentecalibrado.
2.2.2.TOCoxidabledecarbonototal(orgnica)ApesardequelosvaloresdeCOTparatodotipode
aguaseespecifican,slodetipoIdeaguadegradoescrtica,yaqueestaaguaestarencontactoconel
equiposdeanlisisynivelesaltosdeTOCpuedenconduciraresultadosdeteriorados.Porlotanto,estegradoagua
requieredeunseguimientosistemticodelosnivelesdeTOC.Lerecomendamosqueultrapurificacinagua
equipo(pulidoresfinales)estprovistodeunTOCdebidamentecalibradametrosenlnea.Siestonoes
posible,lamedicindebehacerseenlneautilizandoequipoaplicandolafotooxidacin
tcnicapararesistividadesporencimade3megohm.cm.
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2.2.3.Lasmedicionesdefrecuencia:
2.2.3.1.Resistividadyconductividad:
2.2.3.1.1.DiariodetipoI,II,IIIoIVagua.
2.2.3.1.2.TraslaeliminacindeaguaparaelaguadetipoI.
2.2.3.2.TOCcarbonototaloxidable:
2.2.3.2.1.Cuandoelequiponoestprovistodeunmetro,losnivelesdeTOC
sedebemediralmenosunavezcadaquincedas.
2.2.3.2.2.CuandoelequipodeultrapurificacinestprovistodeunmetroTOC,
lamedicindebehacersesobrelaeliminacindeagua.
2.3.Calibracinycalificacin
2.3.1.Cadasistemadepurificacindeaguadeberahabersusmedidorescalibradosyseclasificdeacuerdocon
lainstalacin,funcionamientoylosaspectosderendimiento.
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2.4.Recomendacionesdealmacenamiento
2.4.1.EscribaaguadegradoINodebealmacenadadebidoaladegradacinrpida.Debeprepararseen
elmomentodeuso.
2.4.2.TipoII,IIIyaguadegradoIVsepuedealmacenarenundepsitoprotegidacontraexterna
contaminaciones.Serecomiendaencarecidamenteaalmacenaraguapurificadaporunperodonosuperiora
veinticuatrohorascomodesupreparacin.
2.5.Mantenimientodeequiposdepurificacindeagua
Todaslasindicacionesdelfabricantedebeserseguidosobretodoenrelacinconelcambiodevezencuando
materialfungibleylalimpiezanecesaria.Serecomiendaestablecerunmantenimientopreventivo
programaparacadaequipoymantenerregistrosparasustitucindematerialesconsumiblesy
mantenimientosrealizan.
2.6.Formasdecontrol
Anexos1y2muestranlasplantillasdeformulariodecontrolparaelregistrodelaresistividadoconductividad
mediciones,ascomoTOC.
2.7.Documentosdereferencia
EspecificacionesestndarD1193deReactivoAgua
MtodosdeEnsayoD1125paralaconductividadelctricaylaresistividaddelagua
TermninologyD1129relacionadosconelagua
MtodosdeEnsayoD1293depHdelagua
PrcticaD4453paramanipulacindelasmuestrasdeaguaultrapura
D4779MtododepruebaparaTotal,Orgnica,InorgnicaydecarbonoenaguadealtapurezaporUltravioleta
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(UV)olaoxidacindepersulfato,oambos,ydeteccindeinfrarrojos
D5391Mtododepruebaparalaconductividadelctricaylaresistividaddeunfluyeaguadealtapureza
Muestra
D5542MtododepruebaparaTrazasdeanionesenaguadealtapurezaporcromatografainica
D5997Mtododepruebaparamonitoreoenlneadecarbonototal,carbonoinorgnicoenelaguapor
Ultraviolet,persulfatodeoxidacinydemembranadeteccindeconductividad
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Adjuntoplantilladeformulario1.Controlparaequiposultrapurificacinagua(ltimo
pulido)provistodeunmetroTOC.
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Adjuntoplantilladeformulario2.Controldeequiposultrapurificacinagua(ltimo
pulido)noproporcionadaconunmedidordeTOC.
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Adjuntoplantilladeformulario3.Controldeequiposdepurificacindeaguaparalaobtencinde
tipoII,IIIoaguadegradoIV.
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3.REFERENCIAS
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Intitulado
SociedadAmericanaparaPruebasyMaterialesD119399,"EspecificacinestndarparaReactivoAgua"
(1999).
Millipore,sitiodeInternet:http//millipore.com/H2O.
MilliporeIndstriaeComrcioLtda.SeminariosdePurificaodeaguaparaLaboratorios.
Norrishetal.,Proc.Roy.Soc.Ser.A.288:316(1965).
Banfordetal.,Fotoqumicaycinticadereaccin.PGAshmoreetal.,Ed.Cambridge(1967).
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PERSONALTCNICO
VolumenIIMdulo3InstrumentacinAnaltica
LoseditoresylosCooperadores:
AdautoDaSilvaVARIAN
CelsoRicardoCamargoSINCBRASIL
DemianRochaIfaSINCBRASIL
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IvnJonaitisAGILENTTECHNOLOGIES
JosApareidoSoaresVARIAN
LuizRinaloBizaioVARIAN
RenatoGuvaTechnlogiesAGILENT
RenatoEresFLOWSERVICE
RicardoLiraFLOWSERVICE
RobsonSanchesBiziVARIAN
Coordinacin:
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RESUMEN
1.INTRODUCTION.........................................................................................................................7
ESPECTROFOTOMETRA2.ULTRAVIOLETAvisible(UVVIS).............................8
2.1.Introduction................................................................................................................................8
2.2.PrincipioTcnica.................................................................................................................10
2.2.1.Espectrodeluz
2.2.2.Procesosdeabsorcin.................................................................................................10
2.2.3.UVVisespectrodeabsorcin..................................................................................12
2.2.4.Efectodedisolventes.......................................................................................................14
2.3.Descripcinbsicadelsistema.............................................................................................15
2.3.1.Lasfuentesderadiacin...................................................................................................15
2.3.2.Monocromador(ptico)...........................................................................................16
2.3.2.1.Solohaz...................................................................................................17
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2.3.2.2.Diodosdisposicin....................................................................................18
2.3.2.3.Doblehaz................................................................................................18
2.3.3.Muestracompartments................................................................................................19
2.3.3.1.Acopladordefibraptica....................................................................................19
2.3.3.2.Sipper19
2.3.3.3.Soporteparamuestrasslidas...........................................................................19
2.3.3.4.Accesoriosdereflectancia................................................................................20
2.3.4.Datosacquisition...........................................................................................................20
2.4.Requisitosdeinstalacinyoperacinmnimos.............................................................20
2.5.Precaucionesbsicas.....................................................................................................................21
3.cromatografadegases(GC)......................................................................................22
3.1.Introduction..............................................................................................................................22
3.3.1.Gasesused....................................................................................................................24
3.3.2.Flujoypresincontroladores...................................................................................25
3.3.3.Injectors........................................................................................................................25
3.3.3.1.Almuerzosinyectores............................................................................................25
3.3.3.2.Inyectorescapilares.........................................................................................26
3.3.4.Columnas.......................................................................................................................27
3.3.4.1.HornoColumnas...............................................................................................28
3.3.5.Detectors......................................................................................................................28
3.3.5.1.Detectordeionizacindellama(FID)................................................................28
3.3.5.2.Elnitrgenoyelfsforo(NPD)odetectorestermoinicoespecficos......
(TSD)............................................................................................................29
3.3.5.3.LoselectronesdetectordecapturaECD............................................................30
3.3.6.Adquisicindedatosyprocesamiento...............................................................................31
Pgina96
4.cromatografalquida(LC)...............................................................................33
4.1.Introduction..............................................................................................................................33
4.2.1.Separacinmodes:.......................................................................................................34
4.2.1.1.Cromatografaenfasenormal...................................................................34
4.2.1.2.Cromatografadefaseinversa...................................................................35
4.3.1.Mvilphase................................................................................................................37
4.3.2.Disolventessistemadebombeo...........................................................................................38
4.3.3.Introduccindelamuestrainyector..................................................................................38
4.3.3.1.Inyectormanual..............................................................................................38
4.3.3.2.Inyectorautomtico.........................................................................................39
4.3.4.Columnas.......................................................................................................................39
4.3.4.1.Fasesestacionariasabasedeslice......................................................................39
4.3.4.2.Fasesmodificadoqumicamente.........................................................................40
4.3.5.Detectors......................................................................................................................40
4.3.5.1.DetectoresdeUVVIS..........................................................................................41
4.3.5.2.Detectordefluorescencia...................................................................................43
4.3.5.3.Detectoreselectroqumicos............................................................................43
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4.3.6.1.Porcentajesderea...........................................................................................45
4.3.6.2.Zonanormalization........................................................................................45
4.3.6.3.Patrnexterno..........................................................................................46
4.3.6.4.Estndarinterno............................................................................................46
4.4.1.RequisitosBench....................................................................................................47
4.4.2.Redelctrica
4.4.3.Condicionesambientales.........................................................................................48
5.sistemasdecromatografaCONECTADOSAdetectoresdemasas..50
5.1.Introduction..............................................................................................................................50
5.3.1.Ionizacin
5.3.1.1.Loselectronesdeimpacto(EI)...................................................................................51
5.3.1.2.Ionizacinqumica(CI)..............................................................................51
5.3.1.3.Electrospray(ES)...........................................................................................52
5.3.2.Analizadoresdemasas.............................................................................................................54
5.3.2.1.Analizadoresdemasascuadrupolo..........................................................................54
5.3.2.2.analizadoresdemasascuadrupolo"trampadeiones".......................................................55
Pgina97
5.3.2.3.Tandemespectrometrademasas..........................................................................57
5.3.3.Detectors......................................................................................................................58
5.3.3.1.Electronesmultiplicadores.....................................................................................58
5.3.3.2.Placasdemicrocanal......................................................................................59
5.3.3.3.Photomultiplier..............................................................................................60
5.4.1.RequisitosBench....................................................................................................61
5.4.2.Redelctrica..........................................................................................................61
5.4.3.Condicionesambientales.........................................................................................62
5.5.1.Vacosystem............................................................................................................62
5.5.2.Iones63
5.5.3.Sistemadenitrgeno..........................................................................................................63
5.5.4.Formacinprecaucionesbsicas..........................................................................................63
5.5.5.ArchivosAutotune63
6.INSTRUMENTOSDEANLISISVerificandoelfuncionamiento.........................64
6.1.Introduction..............................................................................................................................64
6.1.1.DQCalificacindeDiseo.......................................................................................65
6.1.2.IQInstalacinCalificacin...................................................................................65
6.1.3.OQOperacinCalificacin...................................................................................65
6.1.4.PQRendimientoCalificacin...............................................................................66
6.2.Ultravioletavisible(UVVIS)espectrofotometra............................................................66
6.2.1.Mantenimientopreventivo.............................................................................................66
6.2.2.OperacinCualificacin(OQ)..................................................................................67
6.2.3.CalificacindelDesempeo(PQ)...............................................................................67
6.2.3.1.Farmacopeaeuropea............................................................................67
6.2.3.2.FarmacopeadeEstadosUnidos......................................................................68
6.3.LacromatografadegasesGC....................................................................................................68
6.3.1.MantenimientopreventivoGC......................................................................................68
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6.3.2.Calificacindelaoperacin..............................................................................................68
6.3.2.1.Flujosdecontrol.................................................................................................68
6.3.2.2.Controlarlastemperaturas....................................................................................69
6.3.2.3.Detector(s)precisindelaseal..........................................................................69
6.3.2.4.Precisinautomticasampler.......................................................................70
6.3.2.5.Clculosrealizadosporelsistemadedatos...................................................................70
6.4.CromatografadelquidosHPLC............................................................................................70
6.4.1.HPLCMantenimientopreventivo.................................................................................70
6.4.2.1.CualificacinDetector...................................................................................72
6.4.2.2.Bombacalificacin........................................................................................72
6.4.2.3.Columnasdecalificacinhorno.........................................................................73
6.4.2.4.Laclasificacinautomticademuestras..................................................................73
Pgina98
6.4.2.5.Sistemadedatos....................................................................................................73
6.5.Sistemasdecromatografaconectadosadetectoresdemasas.....................................................73
6.5.1.Sistemasdedeteccindemasasdemantenimientopreventivo......................................................73
6.5.1.1.Lossistemasdevaco............................................................................................73
6.5.1.2.Detectordemasas.................................................................................................74
6.5.1.3.Chromatographer..........................................................................................74
6.5.2.1.PrecisinInyector...........................................................................................75
6.5.2.2.Inyectorlinearity.............................................................................................75
6.5.2.3.Carryover.......................................................................................................75
6.5.2.4.Linealidaddeldetector...........................................................................................75
6.5.2.5.ExactitudMisa................................................................................................75
6.5.2.6.Sensitivity........................................................................................................75
7.REFERENCES..................................................................................................................................76
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VolumenII/Mdulo3InstrumentacinAnaltica
1.INTRODUCCIN
Elusodetcnicasdeinstrumentacinanalticaenloslaboratorios,unrequisitonoslopara
caracterizarunasustanciaoasegurarlacalidaddeunproducto,sinotambinparaaumentarlosanlisis
productividadPorlotanto,existeunnmerocrecientedeinstrumentosdegradoaltodeautomatizacin,que
puedeserremotamenteoperated.However,tenemosqueserconscientesdequeparaunusoyunrendimientosatisfactorio
detalesinstrumentos,algunasreglasbsicasdebenserconsiderados,talescomo:elpropsitodeuso,adecuada
instalacin,pruebasderendimiento,elpersonalcapacitadoparaoperar,elcumplimientodelosfabricantesde
instruccionessobrelasprecaucionesbsicasquesedebenconsiderarbyTheoperadoryrutinasparalasustitucin
materialesconsumibles,personalconconocimientosfiabletcnicaparaunaaplicacinocasional
deunmtodoanaltico,compatibleslosprogramasdemantenimientoycontroldefuncionamientopreventivas
conlarutinautilizada,parmetrosdeevaluacinparagarantizarunaseguramientocontinuodelacalidaddelosresultados
y,porltimo,unaplanificacindetalladasiempreincluyendoevidenciasdelasactividadesactuales.Estecaptulo
abarcalasprincipalestcnicasdeinstrumentacindeanlisisutilizadosenunlaboratoriodebioequivalenciaas
queelprofesionalenestecampopuedecomenzarsu/susestudiosyutilizarestematerialcomoreferencia.
Otroobjetivoeradiscutirlacomprobacinderendimientodecadainstrumentoyvalidacinconceptos
aplicadaalainstrumentacinanaltica.
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2.ULTRAVIOLETAVISIBLEESPECTROFOTOMETRA(UVVIS)
2.1.Introduccin
Elultravioletaespectrofotometravisibleesunatcnicaanalticabasadaenlapropiedadde
variosespecmenesinicasomolecularesparaabsorberlasradiacionesultravioletasyvisiblesenlasolucin.Radiaciones
enestasregionesimplicarfotonesconenergasuficienteparaprovocarlatransicindeelectronesdevalencia,
comounafuncindelasperturbacionesqueseproducendeinicio.
Laperturbacincausadaporcamposelctricosymagnticosviajaatravsdelespacio,creandoasla
radiacinelectromagnticaexpresin.Debemostenerencuentaqueloscamposelctricosymagnticos
soncamposperpendicularesentresyquelosvaloresdepropagacinenelcampo'
mximosymnimossonsiemprecoincidentes,esdecir,loscamposestnenfase,talcomoenunaonda.
Podemosverenlafigura1que,sibienlapropagacinhacialaderechaaunavelocidadV,cualquierpuntofijoenelX
ejecomienzasucesivamenteatenerpicosdelaondayvalles.Entonces,lalongituddeonda(l)sedefinecomola
distanciarecorridabyThewavesoqueambosmximosalcanzanunalongituddeondapoint.Theobservacinfijo
porlogeneralseexpresaennanmetros(nm).
Figura1.Longituddeonda
ElUltravioletradiaciones(UVVis)Visibleconstituyenunaporcinrelativamentepequeadelaelectromagntico
espectroincluyendootrasformasderadiacionescomoondasderadio,deacuerdoconlafigura2.Loslmitesde
talesregionessedeterminanporloslmitesprcticosdelosmtodosexperimentalesparalaproducciny
deteccinderadiaciones.
Elregionesdiferenciacinespectraltieneunsignificadoadicionalparaelqumico,unavezfsica
interaccionessiguendiferentesmecanismosyofrecendiferentestiposdeinformation.Whenunaradiacin
llegaunasustanciasemitransparente,laradiacinessloparcialmentetransmitted.Thelaradiacinrestante
esreflejadaoabsorbidaenvariosngulos(figura3),dependiendodelasustanciaylaradiacin
longituddeonda.
Eltipoylacantidadderadiacinabsorbidaeselmsimportanteparafinesanalticos.
Desafortunadamente,nohayningnmtododirectoparadeterminarlaradiacinabsorbidasinembargo,esta
informacinpuedeserindirectamenteobtienemidiendolaradiacintransmitida.
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Figura2.Espectroelectromagntico
Absorbido
Radiacin
Incidente
Radiacin
Transmitido
Radiacin
Reflejada
Radiacin
Figura3.absorbida,transmitidaylaradiacinreflejada
Silaintensidaddeunaluztransmitidaserepresentagrficamentecomounafuncindelalongituddeonda,una
seobtieneelespectrodeabsorcindelasustancia.Estaeslaabsorcinselectivaradiacinque
proporcionalabaseparaelanlisiscuantitativoycualitativoporabsorcinmolecular
espectrofotmetro.
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2.2.PrincipioTcnica
2.2.1.Espectrodeluz
Laluzvisibleesunaregindelespectroelectromagntico,lasradiacionesdeloscualessoncapacesde
sensibilizaralaretina.Laradiacinvisiblecomprendelasradiacionesconlongitudesdeondasituadasentre
400y700nm,aunqueestoslmitesnosonfijoscomolacapacidaddepercepcinvarasegn
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elobservador.Dentrodeesterangodelongitudesdeonda,lossubgrupospuedenserseparadosdeacuerdoconelcolor
producidoenunpequeorangodeespectro,comolatabladeabajo.
Tabla1.Laslongitudesdeondaseextiendeenlareginvisible
2.2.2.Procesosdeabsorcin
Teniendoencuentaquelaluzesunaformadeenerga,laabsorcindefotonesdeluzporunamolcularesultaenuna
aumentarlaenerga,E,delaenergacontenidaenlamolcula.Lacantidaddeaumentoesexactamente
igualalaenergadelfotn,esdecirE=hn.Elprocesodeabsorcinserepresentaesquemticamenteenla
eldiagramadenivelesdeenergasimplificadaenlafigura4.
Figura4.DiagramadeEnerga
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Silamolculaseencuentrainicialmenteenunestadonormalofundamental,E
,Antesdelainteraccin,laabsorcin
0
procesoaumentalasenergycontainedenunnivelsuperioroenunestadoexcitado,E
.Elenergyexchange
1
procesoporlaluzabsorbidanoseatena,seproducecomopormltiplesunidadesdeenergallamadoscuntica.
Elquantum(gallina)escaractersticoparacadaespcimenabsorbidas.Paraserabsorbidaporunamolcula,la
fotndeenergadebecorresponderprecisamentealadiferencia,?E,entrelosdosestadosdeenerga.
Eltotalpotencialenergticototaldeunamolcula,exceptolaenergancleo,puedeserconsideradocomoel
sumadelasenergaselectrnicas,devibracinyrotacin.Lasenergaselectrnicasestnasociadas
conlastransicionesdeloselectronesdentrodeltomoomolcula.Estasumadeenergasestrepresentadoen
lafigura5comouncambioenorbitales.
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Figura5.Laenergaelectrnica
Lasenergasdevibracinyrotacinestnasociadosconlasvibracionesmolecularesyrotaciones.En
lafigura6unamolculadiatmicasencillasemostrdespusdeunmovimientodecompresinyelongacin
(Vibracin).Unarotacinmolecularseejemplificaenlafigura7.
Figura6.energavibracional
Figura7.energarotacional
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Ladiferenciaentrelosestadosdeenergaderotacinesrelativamentepequea,muchomenorquela
diferenciasentrelosestadosdeenergaelectrnicos.Ladiferenciaentrelaenergavibracional
estadosesintermediasisecomparaconlosestadosanterioresentonces:
Absorcionesasociadosconlastransicionesentrelosnivelesdeenergaderotacinseencuentrangeneralmenteen
laenergadebajaoaltaregindelongituddeondadelespectroelectromagntico,esdecir,elcontrolremoto
regininfrarroja.
Absorcionesasociadosconlastransicionesentrenivelesdeenergaelectrnicaseencuentranenelalto
energaoregindebajalongituddeonda,esdecir,elultravioletavisibledelareginelectromagntica
espectro.
Absorcionesasociadoscontransicionesentrenivelesdeenergadevibracinseencuentranentrela
dosnivelesmencionadosanteriormente,enlaregininfrarroja.
Losdistintostiposdetransicionesenergticasnosonindependientes,perointerconectadas.Laenergaderotacin
estadossesuperponenenlosestadosvibracionales,yambossesuperponenenlosestadoselectrnicos.
2.2.3.UVVisespectrodeabsorcin
Lapresenciadeinsaturacionesoenlacesmltiplessonampliamenteconocidoscomounprocesocaractersticode
absorcinultravioletamientrasqueelcompuestosaturadoestransparente.
Segnlateoradeorbitalesmoleculares,loselectronesimplicadosenenlacessimples,talescomolaC
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enlaceH,sellamansigmaelectrones().Losenlacesdobles,comoC=O,implicanpielectrones().
Enlaregindelinfrarrojocercano,lastransicionesqueimplicanpielectronespermitenunamejorobservacindela
bandasdeabsorcin.Loselectronesnounidosalamolcula,contenidoentomostalescomooxgenoo
nitrgeno,sellamannelectrones,ylasinteraccionesentrepiynelectronessonresponsablesde
ungrannmerodebandasdeabsorcinultravioletacaractersticos.
Uncromforoesungrupoque,cuandosehaintroducidounhidrocarburosaturado,produceuna
bandacompuestoquetieneydeabsorcinentre180y1000nm.Porejemplo,noctanoesuna
hidrocarburostransparenteenestareginsaturadoSinembargo,siungruponitriloseintroduceenel
octilradical,elcompuestooctilnitriloseproduce.Elgruponitriloseclasificacomouncromforo
yquemostrarsignosdeabsorcindeluzenelrangoultravioleta.
LaTabla2muestraunpequeogrupodecromforossencillaconsuslongitudesdeondaymximosmolar
capacidaddeabsorcin.Laabsortividadmolareslamedidadelaintensidaddelabandadeabsorcin.Comosepuede
visto,laintensidaddeabsorcindevarioscromforosenparticularvaradeungrupoaotro.
Sinembargo,todoslosmiembrosdeunaclaseporlogeneraltienenbandasdeabsorcinigualintensidadyseproducenenun
rangoespectralrelativamenteestrecho.Porejemplo,losdatosmostraronparaelcidoacticosontpicasdesaturada
cidoscarboxlicosresultantesdecidofrmicoacidoesterico,C1aC18,todosellosconlaabsorcin
bandasenlareginde204210nmabsortivitiesymolaresde40a75.
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Tabla2.LoscromforosGrupo
Siseproducenunoomscromforosenunamolcula,susposicionesrelativasdeterminarelefecto
producidoenelespectro.1hexanotieneunaabsortividadmolarde10.000a180nmy1,5hexadieno
tieneunacapacidaddeabsorcinmolarde20000enlamismalongituddeonda.2,4hexadieno,conlabandaenotro
regin,tieneunaabsortividadmolarde25.500a227nm.
Laposicinylaintensidaddelabandadeabsorcinde1,5hexadienosonaproximadamenteloque
puedeesperardedosmolculasdepropilenoindividuales.Obviamente,losdosgruposcromforosestn
ampliamenteespaciadosynointeractan.Sinembargo,cuandolosdoscromforosseconjugancomoen2,4
hexadieno,elefectonoeselesperadoapartirdedosmolculasindividuales.
Similaresobservacionesdeungrannmerodecompuestoshaninterpretadolaargumentacinbsicapara
algunasreglasgenerales:
Cuandodoscromforosenunamismamolculaestnseparadospormsdeuntomodecarbono,el
espectrodeabsorcinesunasimplesumadelespectrodecadacromforo.
Cuandodoscromforosenunamismamolculasonadyacentes,seobservalamximaabsorcin
aaltaslongitudesdeondayseaumentalaintensidad.
Cuandodoscromforosenunamismamolculaestnunidosaunmismotomodecarbono,elresultadoes
intermedioentrelosdearriba.
Enlaespectrofotometraultravioletavisible,loscompuestosmsinteresantessonporlogenerallosquetienen
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msdeuncromforo,especialmentecuandoloscromforosestnconjugados(sistemasconjugados).
Loscompuestosconalmenosdoscromforosconjugadosabsorbendentrodelagamavisible.Saturado
hidratosdecarbono,grasas,aceites,teressimples,cidos,lamayoradeloshidratosdecarbonoyprotenasnoabsorben
luzenelrangovisible,yaquesusestructurasnotienencromforos.Lasmolculasconlamisma
cromforoylaestructuraelectrnicasimilartienenespectrosdeabsorcinsimilar.
Lapresenciadevariosgruposcromforosvecinocambiaelespectrodeabsorcinmolecular
personaje.Losposiblesresultantespuedenserdivididosen4grupos:
Efectobatocrmico.Eldesplazamientodelasbandasdeabsorcinhaciaelrojodelagama
espectro,intensificandoaselcolor.
Efectohipsocrmico.Eldesplazamientodelasbandasdeabsorcinhaciaelrangovioletadela
espectro(deunalongituddeondainferior).
Efectohipercrmicas.Aumentodelaintensidaddelasbandasdeabsorcin.
Efectohipocrmica.Disminucindelaintensidaddelasbandasdeabsorcin.
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Losauxochromeshaygruposque,cuandoseintroduceenunsistemacomouncromforo,aumentarla
longituddeondadelabandadeabsorcinmxima,losllamadosauxochromeseffect.Thebatocrmicos
havenopropiabandadeabsorcinlongitudesdeondaAtlow.Porejemplo,elgrupohidroxiloesunauxochrome.
Losalcoholessontransparentesyusados
comodisolventesenlongitudesdeondabajas,sinembargo,laintroduccindeuna
grupohidroxiloenunsistemaquetieneuncromforodarlugaraunefectobatocrmico.Eltpico
auxochromessonlosgruposaminoysusderivadossustituidos,halgenos,grupoalcalinoy
otros.
2.2.4.Efectodedisolventes
ElanlisisespectrofotomtricoenlareginUVgeneralmentesellevanacaboensoluciones.Bajo
concentracionesdelanalitodeintersseempleanporlogeneraldisolventesdecalidaddealtapurezatienenqueestar
utilizadodesdeimpurezaspuedeafectaralosresultadosdebidoasualtaconcentracinenrelacinconelanalito.
Adems,disolventesparaespectrofotometraUVdebentenerunaltogradodeestabilidadpticaPorlotanto,
Noserecomiendaelusodedisolventesdegradodepurezacomercialquedifcilmentecumplirnconel
losrequisitosantesmencionados.
Carbohidratossaturados,talescomonhexano,sonlosdisolventesmscomunesenespectrofotometraUV
ydebeserpreparadoespecficamenteparaestepropsito.Susabsorcioneselectrnicoscausados
porel
transicionesdeelectronesseproducenfueradelagamaanalizado.Solventesconheterotomos,porejemplo,H3
COH,tambinseutilizan.Debidoasustransicioneselectrnicas,estosdisolventestienenbandasdeabsorcindbiles.
Esteproblemasedebetambinsecentrenfuncindelgradodedisolventesdepolaridad.
Lasbandasdeabsorcindevariassustanciassonmsclarasypuedentenerestructurasmuybiencuando
lamedicinserealizaendisolventesdebajamomentobipolares.Lasinteraccionesdisolventesolutossonmsfuertes
cuandosetratadefuertesfuerzasbipolares.
LaFigura8muestradosespectrosobtuvoutilizandofenolenisooctanoyetanol.Sepuedeobservarla
influenciadeldisolventeorgnicoenladeterminacindesustancias.
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Figura8.fenolenisooctano(____)yetanol()
UnadiferenciaenelpHtambinpuedeconducirafluctuacionesenelcasodeestedesplazamientodelongituddeonda.
14de76
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2.3.Descripcinbsicadelsistema
Elsistema,figura9,queincluyeunespectrofotmetroUVVIS,comprende:
1.Fuentedeluz
2.monocromador
Compartimento3.Muestra
4.Detector
5.SistemadeLectura
Ranuradeentrada
DispersinElemento
Ranuradesalida
Figura9.UVVis
2.3.1.Lasfuentesderadiacin
LaespectrofotometraUVVisrequierefuentesquepuedenproducirradiacincontinuaenelespectral
regionesdeinters.Laradiacindefuentesdeenergaconsistenenmaterialquepuedeserexcitadoporelctrica
calefaccinodedescargadealtatensin.Alregresaralosnivelesenergticos,losmaterialesexcitadosemiten
fotonesquetienenenergasquecorrespondenalasdiferenciasentrelasenergasdeexcitado
estadosylasenergasdelosestadosfundamentales.Algunosmaterialestienentannumerososycercaenergtica
nivelesquelasfrecuenciasemitidasformanunagamarelativamenteampliaderadiacincontinua.
LasfuentesderadiacinutilizadosenlaproduccindeequiposdeespectrofotometraUVVisdebe
cumplirconalgunosrequisitos:
Lafuentedebeproporcionarunhazconlasuficientepotenciaderadiacinparapermitirladeteccinpor
mediosapropiados.
Lafuentedebegenerarradiacincontinua,esdecir,quecomprendetodaslaslongitudesdeondadentrodela
reginespectralqueelequipofuncione.
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Lafuentedebeserestable,esdecir,lapotenciadelhazdeluzgeneradodebepermanecerconstante
durantelasdeterminaciones.Enelequipodehaznico,estacondicinescrticademaneraquela
medidasdeabsorbanciasepuedenreproducir.Enlosequiposdedoblehaz,quesonalmismotiempo
medidoporlotanto,unaaltaestabilidaddelafuentenoestancrtica.
Lafuentemsadecuadaparalaobtencinderadiacincontinuaenlareginvisibleeselcristal
lmparaincandescentedetungstenobombilla.Elfilamentooperaa26003000K,elsuministrocontinuo
radiacin350a2500nm.Laenergaemitidaenlareginvisiblevaraaproximadamentecon
elcuartopotencialdelatensindeoperacinPorlotanto,lafuenterequiereunestrictocontroldevoltaje
paragenerarlosreguladoresderadiacinodetensinelectrnico.
Lasfuentesderadiacinultravioletamsutilizadossonlaslmparasdedescargadehidrgenoodeuteriocon
ventanadecuarzo.Cuandoabajapresinysujetasadescargaelctrica,hidrgenoproduceuna
vigacontinuaenlareginultravioleta.Lalmparadedeuterioproduceunespectrocontinuo
180380nm.
Cuandoseopera,laslmparasdexenndealtafrecuenciaproducenimpulsosderadiacinquecubrenelespectro
1801100nm.
2.3.2.Monocromador(ptico)
Monocromadoressondispositivosbasados
enredesdedifraccinquedispersanlaradiacincomplejosensu
longitudesdeondadeloscomponentesyluegoaislarelrangoespectraldeseada.Monocromadorespermitenlalibre
aislamientodelongituddeondaespectralpuroymuyestrechovaraalolargodelaestrechaultravioleta,visible
yregionesdeinfrarrojos.
Elrendimientofotomtricodeunespectrofotmetroestdirectamenterelacionadoconelmonocromador
lacalidad(sistemaptico).
Elajustemonocromadordebeproporcionaraltaresolucindelalongituddeondamuestraanalizada
y,almismotiempo,unamayorcantidaddeluztransmitidayunabajacantidaddeluzespuria
(Cantidaddeluzquenofuedebidamenteaisladoporelsistemaptico).Elajustedelsistemapticotieneque
permitir:
Altaeficienciadetransferenciaentrelafuentedeluzyelmonocromador.
ranuradesalidadelmonocromadoradecuadoparaevitarlaprdidadeluzexcesiva.
Mayorenfoquedelhazdelafuentedeluzsobrelamuestra.
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LaFigura10muestraunmonocromadorutilizadonormalmenteenlafabricacindeUVVis
espectrofotmetros.
Figura10."CzernyTurner"monocromador
Hay,adems,otrosajusteshabituales,talescomo:Littrow,Ebertyrejillacncava.Estos
configuracinmonocromadoressepuedenverenlossiguientestiposdeespectrofotmetrosUVVIS:
solohazespectrofotmetrosUVVis
DiodosArregloespectrofotmetrosUVVis
HagadoblehazespectrofotmetrosUVVis
2.3.2.1.Dehaznico
Enestetipodeespectrofotmetro,ladispersindelhazdeluzdelmonocromadoresttotalmentecentradoen
elcompartimentodelamuestray,comoresultado,laluznoabsorbidasedirigealsistemadedeteccin
quecomprendeundetectorporlogeneralesdeltipofotodiodo.
Lafabricacindedispositivosdeunsolohazrequierecomponentesdeprecisinestabledealtacalidad.La
espectrofotmetrosdelecturadirectaoperanconprecisinmoderadaalrededorde1%detransmisin
estossonrelativamentebaratosyfcilesyrpidadeoperarlosdispositivosdefcilmantenimiento.Lasola
dispositivodehazrequierelaincorporacindecircuitodeceroparamedirlatransmitanciaafindemejorar
laprecisindeltrabajo.
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2.3.2.2.Diodosdisposicin
Estetipodeespectrofotmetrotieneunaconfiguracinmonocromadorsimple,figura11,utilizandouna
rejilladedifraccinindividualyunsistemadedeteccinquecomprendevariosfotodiodosunaluzpolicromtica
hazalcanzaelcompartimientodelamuestrayjustodespusdelaluztransmitidasedirigeala
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monocromadordespusdeladispersin,laluzllegaalsistemadedeteccin.
Figura11.monocromadorPolychromatic
2.3.2.3.Doblehaz
Losespectrofotmetrosdedoblehazseparanlaradiacininicialenelespacio(pormediodeunespejo)
oeneltiempo(pormediodeunespejogiratoriosectorial).Estetipodeespectrofotmetroseutilizatpicamente
enlosanlisisquerequieremayorprecisinanaltica.Elhazdeluzdispersaenelmonocromador
(Figura12)estsincronizadoporundispositivopticoquellevaracabolavigatantoaunamuestra
compartimento(tambinllamadohazanaltica)yotrocompartimentodereferencia(tambinllamadodereferencia
haz).Laluztransmitidaaamboscompartimentossesincronizadenuevoconelsistemadedeteccin
comoresultado,lasinterferenciaspuedensereliminados,talescomo:fluctuacionesfuentedeenerga,tensinelctrica
variaciones,ascomoeldisolventeutilizadoenlapreparacindelamuestra.
Porlotanto,lasfluctuacionesdeenergadeorigen,larespuestadeldetectorylagananciadelamplificadorsecompensanconla
diferenciaenlasseales.Losespectrofotmetrosdedoblehazsonmecnicamenteyelectrnicamentems
complicadoquelosdispositivosdeunsolohazy,comoresultado,laconstruccinyelmantenimientosonms
caro.
Difraccindecuadrcula
Ranuradeentrada
Sincronismo
Dispositivospticos
Compartimientodelamuestra
Figura12.monocromadordedoblehaz
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2.3.3.Compartimentosdelamuestra
ElcompartimientodemuestrasdelespectrofotmetroUVViscuentaconunaampliagamadeconexionesy
accesoriosquepermitenampliarlasposiblesaplicacionesdelinstrumento.Lasmuestrasbsicas
compartimentoestequipadoconunsoportedelamuestrarectangularparacubetasdecuarzode10mm.Conforme
alaaplicacin,esposibleintroducirsoportesparalasmuestrasdecubetasquevarade1100mm
delargo.
2.3.3.1.Acopladordefibraptica
Envarioscasos,elespectrofotmetroseutilizaclsicamenteparamedirsoluciones,esdecir,usando
cubetas.Sinembargo,algunasmuestrassondifcilesdeanalizardebidoasutipoovolumen.Afindeque
facilitarelanlisisdedichasmuestras,unsistemadeacopladordefibrapticasepuedeutilizaralgunosbeneficiosson
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alcanzado:
Manipulacindemuestrasquesernaaltastemperaturasy/opresionesoradiadasseevita.
Medicindemuestrasverysmall,talescomocristal,overylargesamples,comolaestructurademetal
ventanasque,delocontrario,nuncapodrahacerseusodedispositivosconlaconfiguracinnormal.
Seguimientodelosprocesosqumicos.
Determinacionesensistemascerrados(reactores).
Unaseriedesensoresdefibrapticasepuedeutilizarparaalcanzarelobjetivoanterior,talescomoreflectancia,
deabsorbancia,latransmitanciadevidrioydefluorescenciasensores.
2.3.3.2.Sipper
Unsistemaquecomprendeunabombaperistlticasepuedeutilizarparabombearlasolucindemuestraaunacubetadeflujo
sinrequerirlatransferenciamanualdelamuestraalacubeta,reduciendoaselmanejodelamuestra.
Talescubetasdeflujosepuedencolocarensoportesespecialesquepuedencalentarlamuestra.
2.3.3.3.Soporteparamuestrasslidas
Estetipodeapoyoesbrindaralosresultadosanalticosenmuestrasslidastransparentes,comola
vidrios,plsticosylentes.Ademsdelaconexindelinstrumentofcil,esteapoyotambinpuedetener
unaversinenlaquelamuestratransparenteviajaenfrentedelhazpticoafindeobtenerla
perfildelahomogeneidaddelamuestra.
Undispositivoderotacinsepuedeutilizarparacomprobarelcomportamientodeestamuestraslidaytransparente,perotener
diferentesngulosderadiacinincidente.
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2.3.3.4.Accesoriosdereflectancia
Solidmuestrasnotransparentespuedenseranalizadosyelperfildelamuestra(espectrodereflectancia)puedenser
obtenido.Hayvariostiposdeaccesoriosdereflectanciadisponiblesyquesepuedenacoplarala
espectrofotmetros,porejemplo:espejodereflectancia,lareflectanciadifusa,detemperaturacontrolada
ylareflectanciadepresin,lospolvosycremasreflectanciaycomparacionesdecolordelamuestraslidas.
2.3.4.Laadquisicindedatos
Losdispositivosfotosensiblesutilizadosenaparatosdemedicindetransmitanciaconviertenlaenergaradiante
enunasealelctrica.Losdetectoresfotosensiblesdebenresponderalaenergaqueirradiaenun
ampliorangoespectral.Ellosdebensersensiblesabajosnivelesdeluzeresponderrpidamentealincidente
radiacin.Escrucialquelasealelctricageneradaesdirectamenteproporcionalalhazincidente
poder,esdecir,
R=kP+k'
DondeReslarespuestaelctricadeldetectorenlasunidadesactuales,resistenciaoemfLaconstantekesun
medidadelasensibilidaddeldetectorentrminosderespuestaelctricaporunidadderadiarenerga.Cierto
detectoresmuestranunpequeorespuestak'llamadacorrienteoscura,inclusocuandonoestnrecibiendoincidente
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radiacin.Losdetectoresdeenergaqueirradiautilizanactualmenteenlafabricacindemedicin
equipossonfotodiodosofotomultiplicadores.
Lassealesdetectadasporelfotomultiplicadorofotodiodosdespusdelaamplificacingeneranunalongituddeonda
Xtransmitanciaoabsorbanciaintensidadgrficallamanespectroultravioletavisible.Laidentificacin
esposiblemediantelacomparacindeesteespectroconelespectrodeunasustanciaestndar.Lacuantificacin
Tambinesposiblemediantelafijacindeunalongituddeondaylaobtencindelatransmitanciaolaabsorbanciacorrespondiente
valor.Estevalorserproporcionalalaconcentracindecomponentedelamuestra.Elreal
concentracinsedeterminamedianteelusodeunestndarconunaconcentracinconocida.
2.4.Requisitosmnimosdeinstalacinyoperacin
Conelfindeasegurarresultadosconfiablesenelcumplimientodelosrequisitosdelacalificacindeinstalacin(IQ),
losrequisitosdeinstalacinyfuncionamientosehandecumplirenestecaso,losiguientepuedeser
mencionado:
Redelctrica:quecumplaconlasespecificacionesdelfabricante,conespecialintersparala
estabilizacindelaredelctrica.
Instrumentosituadobajocondicionesdehumedadytemperaturaapropiadas.
Conocimientooperacionalparautilizarelequipocorrectamente.
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2.5.Precaucionesbsicas
Algunossedebentomarprecaucionesparamantenerlavidayelrendimientodelequipo.Talesprecauciones
estnrelacionadascondostiposdeacciones:lasaccionesdelusuarioyaccionesdemantenimientopreventivoquegeneralmentetoman
elfabricante.Estaseccintratasobrelasaccionesdelusuario.Lasaccionesdelfabricantesedescribenen
laseccindechequesrendimiento.
Accionesdiariasarealizarporelusuariosoncrucialesparareducirlosdaosquesepuedencausarala
instrumento.Talesaccionessonnormalmentesimplesypuedenresumirsecomosigue:
LimpiezaexternaEquipo.
compartimentosdelamuestradelalimpieza.
Cubetasdelavado.
Consultealdistribuidormanuales/equipoparaaclararlasdudasdefuncionamiento/mantenimiento.
Limpiezadelasventanasdelasaladeinterconexinloshacesdeluzyloscompartimentosdelamuestra.
Elusodematerialdeseguridadalmanipularmuestrasesfundamentalparalaseguridaddeloperador.Elpersonal
equipodeproteccinrequeridoincluye:delantalseguridad,guantesquirrgicosydegranvisingafas.
Elequipodebetenerlosconsumiblesdeformaque,serequiere,elpropiooperadorpuedetomaracciones
comoelcambiodelmparas.Losprincipalesartculosdeconsumorequeridosincluyen:
deuterioywolframiolmparasolmparadexenn.
cubetadecuarzo.
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3.CROMATOGRAFADEGASES(GC)
3.1.Introduccin
Lacromatografadegasesesunatcnicaanalticautilizadaparasepararmezclasdesustanciasqumicas.
Elpropsitodelatcnicaespermitirunaseparacinqueayudaenlaidentificacinylacuantificacindela
sustanciascontenidasenlamezcla.
Comoelelementoprincipalutilizadoenlatcnicadecromatografadegases(GC),laprimeracromatogrfica
columnasseenvasaronenuntubotpicoentre1a5mdelargoy2a4mmdedimetro.Comoel
Actualmenteseutilizananalticasinstrumentacinavanzada,tubosabiertosdeslicefundida(capilares),la
longituddeloscualesintervalode10a100mylosdimetrosinternosde0,1a0,8mm,porlotanto
proporcionandomejoresresultados.
3.2.PrincipioTcnica
Lamuestraseintroduceenelsistemausandounajeringaounavlvuladeinyeccin.Lamuestrasevolatiliza
justodespusdeserintroducidoenelsistemadecromatografaysedisolvienungasportadorinerte
(Fasemvil).Cuandosedisuelveenelgas,estamuestrasellevaralacromatogrfico
columnaquecontienelafaselquidaoslidacomounafaseestacionaria,separandoasloscompuestosen
estacolumna.Laseparacinsellevaacabodebidoaqueloscomponentesdelamuestratienendiferentesafinidadescon
lafaseestacionaria,loqueresultaendiferentesvelocidadesdeelucindeloscomponentesdelacolumna,esdecir,
cuantomayoreslaafinidaddelcomponentealafaseestacionaria,mslentoviajaratravs
lacolumnayviceversa.
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Inyeccin
Migracin
Elucin
Figura1.Esquemabsicodeunprocesodeseparacinporcromatografa
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Despusdelaseparacin,loscomponentesdelamuestraalcanceneldetectorquegeneraunasealelctricapor
mediodeunfenmenofsicoqumicas(porejemplo,ladiferenciaenlaconductividadtrmica,lallama
ionizacin).Estosdetectorespuedenserselectivoaungrupoqumicodeterminado(porejemplo,
compuestosorganoclorados)ymssensibleparaelanlisis.Comolasealesporlogeneralenunmuy
debajaintensidad,seamplificaysetransmiteaunaestacindedatosdondesepuedeverenunasealde
intensidadXgrficodetiempo.Estegrficosellamauncromatograma.Lasealesproporcionalala
concentracinomasadecadacompuestonodebehaberdiferentesrespuestasdeuncompuesto
aotro(elcompuestomsabundantenosiempregenerarlasealsuperior).Porestarazn,
lamuestrasepuedecuantificar.
ElGCpermiteelanlisisdediferentesmateriales,incluyendoalgunosgasesinorgnicostalescomoO
,CO,
2
Colorado
,NO ,Etc.,ascomomilesdesustanciasorgnicasdevariosgruposfuncionales,talescomo,
2
2
alcoholes,cetonas,aminas,compuestosaromticosyotros.Medianteelusodedetectoresaltamenteselectivos,esposible
determinarcantidadesmuypequeasdecomponentescontenidosenlamuestra,porejemplo,enelordende
picogramos(huellas)ascomomayorescantidades,porejemplo,enelordendeporcentaje.
Unsistemabsicoincluyelossiguientesmdulos:
1.Sistemadelosgases:Losgasesmscomunesutilizadoscomofasemvil(gasportador)sonhelio,hidrgeno,
argnynitrgeno.Otrosgasespuedensertambinutilizados.Serequiereelusodegasesauxiliaresdependiendo
deldetectoraserempleado.
2.Flujoypresincontroladores:Seutilizanparamantenerlauniformidaddesalidadelafasemvil.Ellosson
utiliza,adems,paramedirlarelacindedivisindelamuestra(splitter),cuandoinyectoresparacolumnascapilares
ytambinseutilizanparacontrolarelflujodesalidadelosgasesauxiliaresdelosdetectores.
3.Inyectores:lugardondeunamuestraseintroduceefectivamenteenelsistema.Losinyectorespuedenser
diseadaparacolumnasderellenoocapilarexistendiferentestcnicasparaelusodelosmismos(ensitio
columna,vaporizacininstantnea,dividir,sindivisin,etc).Lamuestrapuedesertambinintrodujomediantemuestreo
vlvulas,principalmenteparalosgases.Laautomatizacinpuedeserutilizadoparaaumentarlaproductividadyreproducibilidad.
4.Columnas:Lassustanciascontenidasenlamuestraseseparandentrodelascolumnas.Lascolumnas
puedeestarhechodevidrio,aceroinoxidable,nquel,teflnoslicefundidaquepuedenserempacadosocapilar.
Lascolumnascapilarespermitenmejoresseparaciones.
5.Detectores:Losdispositivosquecontrolanlasalidadesustanciaseluidasdelacolumna,generandouna
sealelctricaqueesproporcionalalamasadesustanciaodelaconcentracin.Losdetectorespuedenser
delosdetiposelectivoouniversalismo.Estosdetectoresestnconectadosaamplificadoresdeseal,llamada
electrmetros,queamplificanlasealytransmitirlaalosdispositivosdedatosdesalida.
6.Losdatosdeadquisicinyprocesamientodelsistema:Unsistemaquerecogelosdatosgeneradosenel
cromatgrafo,realizalosclculosnecesariosparacuantificarlassustanciasy
generaelcromatograma.Estesistemapuedeserintegradoresosoftwaredeintegracin(PC).
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Inyector
Presin
Controlador
Detector
Cromatograma
GC
Neumtica
Portador
Gas
Columna
Puestodetrabajo
ColumnaHorno
Figura2.Cromatografadegasesdelsistema(GC)
3.3.1.Gasesutilizados
Dosclasesdegassepuedenutilizarenelsistemacromatogrfico:gasesportadores(fasemvil)y
losgasesauxiliares.
Losgasesportadoresmshabitualessonnitrgeno,argn,hidrgenoyhelio.Elgasmsindicado
eselhelio,debidoalamejorrendimientocromatogrficoencomparacinconotrosgasessinembargo,
algunosaspectosdecisivosalmomentodeelegirelgasportadorsedebenconsiderar:
compatibilidadDetector:escrticoparadeterminarqueelgasportadorescompatibleconel
detectorydarlugaraunaprdidadesensibilidadoexcessivenoise.Porejemplo,alanalizarhidrgeno
gasenTCD,nitrgenoyargnimpartenunamayorsensibilidadqueelhelio,comolaconductividadtrmica
diferenciaentrelosdosprimerosylosgasesdehidrgenoesmayorquelaconductividadtrmica
diferenciaentreelhidrgenoyelhelio
Costos
Disponibilidad
Rendimiento
Pureza:Lapurezadelosgasesdebeserrespetada,dependiendodelaaplicacin.La
manualesdelosfabricantescontienentodalainformacinrequerida.
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3.3.2.Flujoycontroladoresdepresin
Elflujoopresindelgasportadoresunparmetroimportantequedependedeldimetrodelacolumna
ylalongitud.Sedebecontrolarseduranteelanlisis.Estecontrolserealizausandoflujoo
presinmandodevlvulas.Esteparmetrosepuedeajustarmanualmente,conlaayudadeunmedidordeflujo
ounmedidordeburbuja,oelectrnicamentemedianteunsoftwareelpropsitoesobtenerunamejorcromatogrfica
laeficiencia.
Paralosgasesauxiliares,serequiereuncontroldesdeelajustedeflujoesfundamentalparaalcanzarelmejor
rendimiento.
3.3.3.Inyectores
Lafuncinbsicadeuninyectoresintroducirlamuestraenelsistemacromatogrfico.En
inyector,loscontactosdelamuestradelgasportadorysedisuelveenella.Porlotanto,enelcasode
muestraslquidas,elinyectortienequesercalentadoafindeasegurarunavolatilizacintotaldelamuestra.
Haydoscategorasdeinyectores:inyectoresparalascolumnasylosinyectoresparallevarparacolumnascapilares.
Muestrasgaseosaspuedenserinyectadosconlaayudadeunavlvulademuestreodegasproporcionadoonoconuna
inyectorenserieconlavlvula.Paracadaclasedeinyectores,algunasopcionesestndisponiblesdependiendode
laaplicacin.
3.3.3.1.Almuerzosparainyectores
Estosinyectoresseutilizanconcolumnasderelleno.Sepuedenutilizarencolumnascapilaresdetipomegabore
(Dimetrointernodelacolumna:>0,53mm).Todalamuestraseinyectadirectamenteenlacabezadela
columnacromatogrfica.Estoesparaeliminarcualquierprdidacuandosetransfierelamuestraala
columna.Esteinyectorestindicadoparalimpiarysediluyemuestras,ademsdemuestrasquetienenungran
variacindelavolatilidaddeloscompuestos.
Tabique
Inyector
Cuerpo
Gas
Entrada
Columna
Figura3.Embaladoinyector
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3.3.3.2.Inyectorescapilares
Inyectoresdiseadosparasuusoencolumnascapilares.Losinyectoresprincipalesincluyen:
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Dividir/splitlessinyector:Losinyectoresmsutilizados.Permitequelasmuestrasquesedividen(split)
afindepermitirelusodecolumnascapilares(yaquesoncapacesderecibirunapequeacantidadde
delamuestra).Haydosmodosdefuncionamiento:
ModoSplitLamuestrainyectadasedivideentrelacolumnaylatomadeeliminacininyector
(Ventilacin).Lavlvulaacargodeestaaccindedivisinsellamadivisoryseusaconconcentrado
muestras(enelordendemg/ml).
ModosplitlessUsadoconmuestrasdiluidas.Enestecaso,eldivisorpermanecercerradaduranteel
solutotransferenciaalacolumnaAcontinuacin,eldivisorseabreparadisponereldisolvente.
Portador
Gas
Entrada
Tabique
Purga
Inyector
Disposicin
Inyector
Disposicin
Columna
Figura4.deSplit/splitlessinyector
Enlacolumnay/oinyectordetemperaturaprogramable:Permitedosmodosdefuncionamiento:
EnlacolumnadelainyeccinParamuestrasconampliorangodepesomolecular,loqueeliminalamasa
efectoladiscriminacin.
inyeccinencolumnacontemperaturaprogramablePorlabajatemperaturadeebullicinobaja
muestrastermolbilesconcentracin.ConocidoenelmercadocomoPTVoSPIinyector.
Enfriamiento
Salida
Tabique
TabiquePurga
GlassLinner
Enfriamientodeentrada
Inyector
Cuerpo
Calentador
Portador
Entradadegas
Tuerca
Lavadora
Columna
Figura5.temperaturadelinyectorprogramable
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3.3.4.Columnas
Lacolumnaeslaparteprincipaldelsistemacromatogrficodondelaseparacindelamuestra
componentestienelugarcomoresultadodelasdiferentesafinidadesdelassustanciasconelestacionaria
fase,migrandoadiferentesvelocidadesatravsdelacolumna.Lascolumnassepuedenclasificarendos
grupos:
Embaladocolumnas:Lascolumnasantiguascromatogrficas.Porlogeneral,hechodeaceroinoxidableodevidrio
tubos,sinembargo,sepuedenutilizarotrosmateriales.Unrelleno(unadsorbenteounsoporteslido
impregnadoconunapelculadeunasustanciaquetieneunapresindevaporbaja)seintroduceenestetubo.
Actualmente,estascolumnasnoseutilizanconfrecuenciadebidoalamenorrendimientoencomparacin
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alascolumnascapilares.Almuerzoscolumnassonmscomnmenteutilizadosenelanlisisdeinorgnica
gases.
Columnascapilares:Lascolumnasmsutilizadosactualmente.Porlogeneralsondefundido
tubosdeslicerecubiertasexternamenteconunapelculadepoliamida,conloquelacolumnamuyflexible.La
faseestacionaria(unapelculaounadsorbenteslido)sedepositaenlaparedinterior.Estetipodecolumnatiene
grancapacidaddeseparacinyunaampliagamadesustanciaspuedenserseparadosporcadatipodecolumna.
Laeleccindefasedeterminalaselectividaddelacolumna.Cientosdefasesestacionariasestndisponiblesen
elmercadoconvariosnombrescomerciales.Porlogeneralsonelegidosenfuncindelapolaridaddela
sustanciasaanalizar.Fasesestacionariaspolaressuelensermsreactiva,porlotantoteneruntrabajo
latemperaturalmiteinferiordelascolumnasnopolares.
POLIAMIDA
PELCULA
DERRETIDO
SILICA
TUBE
ESTACIONARIO
FASE
WCOT
PARCELA
SCOT
PAREDDECINE
Lechoporoso SOPORTEDEPARED
TUBOABIERTO
TUBOABIERTOTUBOABIERTO
Figura6.Tiposdecolumnascapilares
Paraelegirlacolumnamsadecuada,lossiguientesparmetrosdebenserevaluados:
Columnasdelongitudyeldimetrointerno
Espesordelapelcula(capilar)
Faseestacionarialquida
soportesslidos
Fasesestacionariasslidas.
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3.3.4.1.HornoColumnas
Lacolumnacromatogrficasealmacenaenelhorno.Paracadatipodeanlisis,elhornodebeser
ajustadoaunatemperaturadetrabajoAestatemperatura,loscomponentesdelamuestradeintersseseparan
yquetieneeltiempodeelucinmscorto.
Unbuenhornotieneunaprecisindemedicinyunampliousorange.Theprogramacinrampadecriogenia
permiteelanlisisdeloscompuestosmsvoltiles.
3.3.5.Detectores
Hayvariostiposdedetectores:detectoresuniversales(conductividadtrmica(TCD),Misa
Espectrometra(MS)),ydetectoresselectivosoespecficos(deionizacindellama(FID),electronesCapture
Tabla1.Tiposdedetectoresysuuso
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Sediscutirnlosdetectoresmsutilizadosenlacromatografadegases(GC).
3.3.5.1.Detectordeionizacindellama(FID)
Eldetectormsutilizado.Algunascaractersticasincluyen:fcilmanejo,altasensibilidadylaincomparable
linealidad.LasiguientefiguramuestraunesquemadeldetectorFID.
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Coleccionista
Cermico
aislante
Sondadeseal
Sondadeencendido
Primaveradeencendido
Puntadelallama
Figura7.DetectorFID
Elfuncionamientodeldetectorimplicaunamezcladegases,aireehidrgeno,formandoasunallamaquetiene
unatemperaturadeaproximadamente2000C.Lamuestrasequemaenestallama.Unpardeelectrodosestposicionado
cercadelallamaparacapturarlasealgeneradaporlasmuestrasionizadosyloselectronesresultantesde
lassustanciasquemadosenlallama.
Estedetectorgeneraunasealcorrespondientealoscompuestosquetienencarbonoehidrgenoen
sumolcula.RarasexcepcionesincluyenCS .
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Eldetectordebefuncionaratatemperaturadeunos400C.However,latemperaturaelegida
debeasegurarquelassustanciaseluidasdelacolumnanosecondensan.
Lasconcentracionestpicasparaseranalizadosincluyenlagamadebajos(ppb)paravaloresaltos(%).
3.3.5.2.Elnitrgenoyelfsforo(NPD)odetectorestermoinicoespecficos(TSD)
Eldetectortienerespuestaselectivaacompuestosquecontienentomosdenitrgenoodefsforo.
Internamente,eldetectortieneunasalderubidioincorporadoaunaperlarefractariosujetaalaaprobacin
degases,elaireyelhidrgeno.Cuandocalientaelctricamente,laperlaproduceunplasmagaseosoa600a
900C.
ElplasmaproducidodeestamaneraessuficienteparahacerquelosextremosNyPquecontienensustanciasrespondenala
detector.
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CermicaAislante
Coleccionista
Sealdelasonda
Cermico
Perla
PerlaSonda
LlamaSugerencia
H2yMaquillaje
Aire
Columna
Figura8.TSDodetectorNPD
3.3.5.3.DetectordecapturadeelectronesECD
Estedetectoressensitivetomolculasquetienenaltostomosdeafinidadelectrnicosytienedentrodeunradiactivo
fuente,tpicamente
63Ni,queemitepartculasbeta.Estaspartculasseionizanelgasportador,normalmentenitrgeno,
ygenerarunanubedeelectronesdentrodelaclulaECD.Loselectronesproducenunfondoestable
corrienteatravsdeloselectrodosdelaceldadeDIT.Estasealesamplificadaporelelectrmetrodetector.
Cuandounamuestradeelectrones,absorbentepasaatravsdelacelda,lacorrientesedisminuyecomouna
resultadodeloselectronescapturaporelespcimenabsorbentes,disminuyendoaselnmerodeelectrones
enlaclula.
Aislamiento
NquelFuente
Nubede
Loselectrones
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Intitulado
Clula
Sondacelular
Coleccionista
Electrodo
Sealdelasonda
Aisladoresdecermica
Maquillaje
Columna
Figura9.detectorECD
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3.3.6.Adquisicinyprocesamientodedatos
Adquisicinyprocesamientodedatossediscutieronenelpunto4.6delatcnicaHPLC.
Conelfindeasegurarresultadosconfiablesyreproduciblesenelcumplimientodelacualificacindelainstalacin
Requisitos(IQ),lascondicionesdellugardeinstalacindebenserverificados.Paraello,la
siguientescondicionessepuedenmencionar:
Redelctrica:esnecesarioparacomprobarquelatensindelaredelctricaesdeconformidadcon
laespecificacindelequipo.Estabilizacinderedylaposicintaponesdesalida(faseinvertida)
debentenerunaatencinespecial,yaquepuedeninterferirconelfuncionamientoylavidadelequipo.
Condicionesambientales:Elinstrumentodebeinstalarseslosilahumedadlocaly
condicionesdetemperaturasonapropiadasparalaoperacin.Adems,lascondicionesdeseguridad,talescomo
laproximidadalosagentesinflamablesycorrosivosdebeevaluarse.
Lapurezadelosgases:Encasodeestardeacuerdoconlosrequisitosdelsistemadecromatografa,principalmente
relativaalosdetectores.
GasesFiltro:Debeserutilizadoparaasegurarlacalidaddelosgasesutilizadosylaslneasdegasdelsistema.
Encasodeserreemplazadoenformaperidica.
Reguladoresdepresin:Debeasegurarlaspresionesdetrabajomnimasespecificadasparaelequipo.
Encasodesertambinprovistodedispositivosdeseguridad,comodedobleetapaydiafragmasmetlicos.
Conocimientooperacionaldelosequipos:Paraelusocorrectodelosequipos.
Tabla2.Lapurezadelosgases
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Afindeasegurarbuenosresultados,serequierenalgunasprecaucionescuandosetrabajaconGC.Estosson
porlogeneralprocedimientossimples,peroimportantesdemodoqueelequipopuedefuncionarcorrectamente.
Unadelasprecaucionesmscomunesestcambiandoeltabiqueinyectortpicamenteentre30y
100inyecciones,dependiendodelatcnicadeinyeccin(manualoautomtico).Elinsertorvidrioinyector
estambinunelementomuyimportanteparaelbuenfuncionamientodelequipo.Porlotanto,lasustitucines
requeridodeacuerdoconlaaplicacinyeluso.
Otraprecaucinrelevanteserefierealusodelascolumnasquedebensercondicionadosy
sujetoalalimpiezatrmicacuandoseanecesario.Alcalentarlacolumna,sedebetenernotomar
sobrepasarellmitetrmicofaseestacionaria.
Encuantoalosgases,ademsdelasprecaucionesdepurezadiscutidosanteriormente,esimportante
reemplazarlosgasesdefiltroscuandoseanecesarioytambincomprobarregularmentelapresindelcilindroparaevitarcompleta
utilizar,evitandoaslacontaminacindevezencuandoporelairedelmedioambienteadmitidopordifusin.
Serecomiendalimpiarlosdetectorescadaseismesesocadavezdisminucinderendimiento
ocurre.Losprocedimientosdelimpiezasedescribenenlosmanualesdefuncionamientodelequipo.
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4.Cromatografalquida(LC)
4.1.Introduccin
Cromatografadelquidosdealtaresolucin(HPLC)secrecuandolacromatografalquidaera
aplicadaalasteoraseinstrumentacionesoriginalmentedesarrolladoparacromatografadegases.
Lacromatografalquidadealtaindispensable(HPLC)seponederelieveenlaactualidaden
trminosdemtodosdeseparacinmodernas.Ladiferenciaentrelacromatografalquidaydealta
cromatografalquidadealtorendimiento(HPLC)sebasaenelusodefasesestacionariaspreferiblementecon
micropartculasesfricas(10.5o3mm).Yaquesonmuchomenospermeable,serequierequetalesfases
paraelusodebombasparaeluirlafasemvil.
4.2.PrincipioTcnica
Laseparacincromatogrficasebasaenlamigracindiferencialdeloscomponentesdeunamezclade
debidoalasdiferenciasentredosfasesinmiscibles,lasfasesmvilyestacionaria,ycuando
ampliacindelasbandasdependiendodelosprocesosfsicosynoladiferenciaenequilibrio.Estos
interaccionespuedentenerlugarbyhydrogeninteraccionesdebonos,lasinteraccioneselectrostticasehidrofbicas
ylasfuerzasdeVanderWaals,yotros.
Losresultadosdelamigracindiferencialdeladiferenciaequilibrioentreambosanalitosinmiscibles
fases,siendodeterminadosporfactoresqueafectanesteequilibrio:lasfasesmvilyestacionaria
composicinylatemperaturadeseparacin.Loscambiosdecualquieradeestosfactoresconducenacambiosenel
migracindiferencial.
Laclasificacincromatografalquidadeacuerdoconlafaseestacionariadiolugaraunaampliavariedad.
Laprimeragrandivisinfuelacromatografadeadsorcinylacromatografadereparto,
refirindosealasfasesestacionariasslidasylquidas,respectivamente.Tomandolanaturalezadelasinteracciones
ylosfenmenosanteriormentemencionadosenconsideracin,losmodosdeseparacinpuedenserclasificadoscomo
siguiente:cromatografadefaseinversa,cromatografadefasenormal,cromatografadeparesinicos
(Intercambioinico)ycromatografadeexclusin.
Siellquido,lasfasesestacionariaspuedensersimplementeadsorbidossobreunsoporteslidooinmovilizadosenl.En
elprimercaso,lacromatografasedenominacomocromatografadeparticin.
Lacromatografaderepartofuereemplazadoporlacromatografadefasesligadasqumicamentepor
virtuddelamayorestabilidadimpartidaencomparacinconlasfaseslquidasadsorbidas.Estasfases,
quetienesoportesmodificados,seconsideranporseparadoporquedifieredelosotrosdosmodosentrminos
demecanismodeseparacin.
Elgrandesarrollocromatogrficoobtenidodelasfaseslquidaqumicamenteacotadasliderados
estasfasesqueseutilizanprincipalmenteenHPLCanaltica.
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4.2.1.Modosdeseparacin:
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Siemprehaydependenciaentrelaeliminacindesolutosmvil,faseymvilsolutoestacionaria
interaccionesdefaseenfaseestacionaria.Entonces,laeleccindelmododeseparacindependedelaeleccin
delasfasesestacionariasymvilesparacadaclasedesoluto.
Sepropusierondosmodosderetencinencromatografalquida.ElprimeroporScottyKucera,
interaccindisolvente,yelsegundoporSnyder,competenciadisolvente.Losdosmodelossonequivalentes,
yaquetantoconsiderarqueenunaseparacindada,lainteraccindelsolutoconlafaseestacionaria
permanececonstante.Porlotanto,laretencinestdeterminadaporlacomposicindelafasemvil.
4.2.1.1.Cromatografadefasenormal
LafaseestacionariaesmspolarquelafasemvilLocontrarioocurreenmodoinverso
cromatografa.Losdisolventesutilizadossongeneralmenteunamezcladedisolventesorgnicossinlaadicin
deagua.Lasfasesestacionariassonadsorbentesorgnicos(slice,almina)odelimitadoqumicamente
fasespolares(ciano,diol,fenilo,amino).
Ambosmodelosderetencin,lainteraccindisolventedisolventeylacompetenciasehanutilizadoconxitopara
describirelefectodelafasemvilencromatografalquidademodonormal.Independientementedel
modeloutilizado,laretencinenincrementosdefasenormalamedidaquedisminuyelapolaridaddelafasemvil.
Estemodocromatografaseaplicaprincipalmenteamolculasneutras,aunquepuedesertambinutilizadopara
ionizanteseparadoomolculasinicas.
Elordendeelucinrespetalasiguientesecuencia:molculashidrofbicas(menospolar)seeluyen
enprimerlugar,mientrasquelasmolculashidrfilas(mspolar)seconservan.
Cuandoladisolucindemuestratieneproblemasendisolventespolares,lainyeccindefaseinversaesdifcil
Serecomiendaentonceslaseparacindefasesnormal.
Eldisolventedeelucinenelmodonormalesseleccionadoporlaeleccindeundisolventedbilymezclndoloconuna
solventefuerteparaalcanzarlaresistenciadeseada.
Lapresenciadetrazasdeaguaenlafasemvileslaprincipalcausadelamalareproducibilidadderetencin
cuandosetrabajaenunafasenormal,especialmentecuandoslicesinmodificar,seutilizacomofaseestacionaria.
Esteproblemahasidoresueltoporelusodedisolventesanhidrosconunvolumenconocidodeagua,
metanolocidoacticoparadesactivarlosgrupossilanolmsreactivosdelafaseestacionaria.Adems
mejorarlareproducibilidad,sinoquetambinmejoralaformadelpico.Estemismoefectosepuedeconseguirpor
laadicindetrietilamina,uncompuestoesencialenlaseparacindeaminasengeldeslice.
Elusoslicesmodificadasqumicamenteenelucinmodonormalsehapreferido,yaqueofrecen
sitiosdeinteraccinconelsoluto,ademsdeunasuperficiemshomogneaencomparacinalaslice
gelquetieneunavariedaddegrupossilanolcondiferentespolaridades.Lasfasesdelimitadasqumicamente
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tilparalacromatografadecompuestosmoderadamentepolares.Sinembargo,estossolutospuedensertambin
resueltodemaneraeficienteenlaelucinmodoinverso.Laeleccinentreelucinnormaloinversamodoes
porlogeneralmsdependientedelamatrizqueelsoluto.
4.2.1.2.Cromatografadefaseinversa
Mientrasqueenlacromatografaenfasenormalenunafaseestacionariaesmspolarquelafasemvil,
enelmododeinvertirlafasemvilesmspolarqueelestacionaria.Lafaseinversa
cromatografaseutilizamscomnmenteenHPLC,yaquepermitelaseparacindeunaampliavariedad
desolutosyelusodefasesmvilesacuosas.Lafasemvilmsutilizadoesunamezclade
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acetonitrilo/aguacuandoseanecesario,acetonitrilosesustituyeconmetanolytetrahidrofurano(THF).
Elusodeslotresdisolventeseselresultadodelapequeacantidaddedisolventesorgnicosmisciblesconagua.En
elmodonormal,unagamamsampliadedisolventesestdisponible.
Elprincipiodelaseparacindefaseinversaeslahidrofobia,seatribuyeprincipalmenteala
interaccionesentrelaporcinnopolardelsolutoylafaseestacionaria,esdecir,larepulsin
deestaporcindelsolutoporlafasemvilacuosa.
Valelapenasubrayarquelafuerzadisolventeenincrementosdefaseinversacomolapolaridaddeldisolvente
disminuye.Porlotanto,lafuerzadelagua(disolventemsdbil)esmenorqueelmetanol,acetonitrilo,
tetrahidrofuranoyfuerzadiclorometano,teniendoencuentaelordencreciente(vaseelcuadro1).Como
sustanciainsolubleenagua,diclorometanonoseutilizaenlafaseinversaSinembargo,como
diclorometanoesundisolventemuyfuerte,avecesseutilizaparalimpiarlascolumnasdefaseinversa
contaminadaporsolutosfuertementeretenidas.
Tabla1.Comparacinentrelospuntosfuertesdedistintasfasesmviles
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Ademsdeserutilizadoenunrangodebajaabsorcinenelultravioleta,resultadosdeacetonitriloensolucionesacuosas
conbajaviscosidad(segnsedesee).Porlotanto,juntoconmetanolyTHF,estossonlosms
disolventescomnmenteutilizadoparacontrolarlaselectividadylaseparacinmododeelucininversa.
Cuandoporalgunaraznnoseutilizaaguaenlafasemvilylafaseestacionariaapolarseutilizan,
lacromatografasellamacromatografadefaseinversanoacuoso.Estacromatografa
seusarcuandosetrabajaconsolutosaltamentehidrofbicos,talescomolpidosypolmeroseldisolvente
porlogeneralconsisteenunamezcladedisolventespolares,talescomoacetonitriloometanol(disolventeA),conuna
disolventemsdbil(B),talcomoTHF,cloroformo,diclorometano,acetona,termetiltbutilo.En
estecaso,laretencintambinsecambiaporelporcentajededisolventeB.
Hayotrasmodalidadesdecompuestoscromatografainicaocromatografadeexclusinportamao
(Permeacinengelyfiltracin,aplicadosalasseparacionesdetamaodelasmolculas,porejemplo,polmeros,
biopolmeros,protenas,pptidos,etc.).Amedidaqueseapenasseaplicanenlaseparacindelasdrogasy
medicamentos,estasmodalidadesnoserndiscutidosenelpresentedocumento.
OtroaspectoimportanteparticipacindelasseparacionescromatogrficasHPLCeselmododeseparacin:
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isocrticoodegradado.Enelmodoisocrtico,lascondicionesdeseparacinsemantienensincambiosalolargo
elanlisiscromatogrfico,limitndoseaunacomposicinsolventesolo.Enelmododegradiente,
hayunavariacincomposicindelafasemvily/oelflujodurantelaseriecromatogrfica.
Hayunaseriedeparmetrosrelevantesatenerencuentaduranteeldesarrollodeun
mtodocromatogrfico,talescomolaresolucincromatogrfica,selectividad,factorderetencin,etc.
Estosparmetrossonmuyimportanteseneldesarrollo,validacinyutilizacindeHPLC
mtodoscromatogrficos.
UnsistemaHPLCconsistebsicamenteenmdulosquetienenfuncionesespecficasycuidadosamentediseadopara
proporcionaranlisisprevistosconversatilidad,rapidez,reproducibilidadyaltasensibilidad.
EquipodeHPLCactualenelmercadopuedevariardesdemuysimple,dondelasmuestrassonmanualmente
inyectado,asistemasmscomplejosprovistosdeunmdulodemuestreoautomticoycontroladospor
softwareinformticocapazdecontrolarlasfuncionesdelsistema,adquirir,procesareimprimirlosdatos,almacenary
organizarlosparareferenciafutura.
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Paraunamejorcomprensin,elsistemadeHPLCsepuededividirenseismdulosprincipales:
Figura1:RepresentacinesquemticadeunsistemadeHPLC:
1.depsitoFasemvil
2.Disolventessistemadebombeo(bomba)
3.Introduccindelamuestra(inyector)
Compartimento4.Columna
5.SistemadeDeteccin
6.SistemadeDatos
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4.3.1.Fasemvil
Lafasemvilutilizadaenlacromatografadelquidoesextremadamenteimportanteparalaobtencindeldeseado
separacin,yaqueencontactoconelanalitoqueseestseparada,ascomounacolumnacromatogrficayla
sistemacomountodo.
UnaampliagamadedisolventesestdisponibleSinembargo,hayalgunaspropiedadesdeseablesparasuusoen
HPLC:
Altapureza
Nodescomposicindelanalitoylafaseestacionaria
Compatibilidadconelsistemadedeteccin
Bajaviscosidad
ladisolucindelamuestra
Bajocosto.
Entrelosdisolventesutilizadosenlacromatografalquida,esdignoenfatizandolascaractersticasy
purezadelaguaelaguaultrapuraesmuyrecomendableyaquelosresultadosaltamentefiablesseobtienen.
Suresistividad(tpicamente18,2MO/cma25C)esunaindicacinexcelentecalidad.Sinembargo,laorgnica
compuestosdebensercontrolados,yaquepuedeninterferirconlasensibilidaddelosdetectoresUV
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comnmenteutilizadoenlosanlisisdeHPLC.Esimportanterecordarqueelaguaultrapuradebeser
siempreseutilizadeinmediatocomoelalmacenamientomodificasuscondiciones.
4.3.2.Sistemadebombeodedisolventes
Lafuncinprincipaldelabombaesparaempujarlafasemvilatravsdelacolumna.
Unavezquesehancompactadorellenoconsistenteenpartculasdedimetromuypequeo,delordende3a
10um,lascolumnasaltamenteresistenalpasodelafasemvilPorlotanto,elsistemadebombeo
debesercapazdesobrepasarestabarrerayproporcionarunflujoconstante,reproductivasinpulsaciones.
Lamayoradelasbombasutilizadassondeltipodemovimientoalternativo,tambinllamadasbombasdepistnodiafragma.La
funcionamientosebasaenunmotorelctricoconectadoaengranajesquesemuevendeunsistemadepistones.
Comoestetipodebombadeproducirflujospulsantesdebidoalmovimiento"aandforward"dela
pistn(s),sehandesarrolladoalgunosrecursosparasuperaresteproblemaestosmecanismossedenominan
silenciadoresdepulso.
Bombasdeanlisisestndiseadosparafuncionaraaltaspresionesytasasdeflujovariablesde0,01a10
ml/min.Porlogeneralsondematerialinerte,comoelaceroinoxidable(bombeocabezas,tuberasy
conexiones),zafiro,cuarzo,cermicaytitanio(pistones),rub(vlvulasderetencin)ymaterialesinertes
(sellos).
4.3.3.Introduccindelamuestrainyector
ElinyectoreselmduloenelqueseintroducenlasmuestrasenelsistemadeHPLCparapermitir
separacinenlacolumna.
Elinyectorpuedesermanual(elusuariointroducelamuestraconlaayudadeunamicrojeringadepuntarecta)
oautomtico,tambinconocidocomoautoinyectoromuestreadorautomtico,queescapazdeinyectarautomticamenteuna
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grannmerodemuestraseinclusorealizarlasoperacionesdesumadedilucin,derivacinoreactivos.
4.3.3.1.InyectorManual
Losinyectoresmanualesmsutilizadossonbsicamentelosinyectoresdeltipodevlvulaquetieneunaexterna
bucledemuestreo,definidoytuberasvolumenprecisoquepuedesersustituidoparapermitirlainyeccinde
diferentesvolmenesdemuestra.
LaFigura2muestraeldiagramaesquemticodelavlvula.Losseispequeoscrculosrepresentanlosorificiosinternosdelavlvula,
mientrasqueelgrancrculorepresentalaentradadeagujadelajeringadeinyeccin.
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Bomba
Bomba
Columna
Columna
Jeringa
Figura2.Diagramaesquemticodeunavlvuladeinyeccin
Lavlvulatienedosposiciones:CARGAeinyectar.Enlaposicindecarga,sedesvaelcaudaldelabomba
directamentealacolumna(entraenysalede2a3).Mientrastanto,lamuestraseintroduceenel
bucledemuestreo(LOOP)atravsdelorificiodelaaguja.Elexcesoestdispuestoinmediatamenteatravsdelasalida6,
esdecir,laprecisindeinyeccinsedeterminaporelvolumendelamuestraenelbucle.
EnlaposicinINYECTAR,lafasemvilahoraviajaatravsdelbuclearrastrandolamuestraa
lacolumna(viajes2143).
4.3.3.2.Inyectorautomtico
Losinyectoresautomticossondispositivosampliamenteutilizadosenlaboratoriosconelobjetivodealtaproductividad,yaque
operarenunmodosinayuda.Seproporcionanademsunamejorreproducibilidadencomparacinconel
inyectoresmanuales.Algunosmodelossoncapacesdetrabajarcomountermostatoparalasmuestras,aumentandoasla
laversatilidaddelsistemacromatogrfico.
4.3.4.Columnas
4.3.4.1.Fasesestacionariasabasedeslice
Laslicees,sinduda,elmaterialmsimportanteutilizadoenfasesestacionariasparaHPLC.Elsliceesun
materialverstilysusuperficiepuedensermodificadosporderivacinqumica,acontinuacin,quedalugaravarios
materialesinteresantescomofasesestacionariasparacromatografalquida.Slicetambinpermiteeltrabajo
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condiferentesmecanismosdeseparacin.
Lasliceesunmaterialamorfo,altamenteporosoyparcialmentehidratadosueleprepararsehidrlisisbyacid
desilicatodesodio,seguidoporemulsificacinenunamezcladealcohol/aguayposterior
lacondensacin,selavaysesecaparasuuso.
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Resultadossuperficiedelasliceapartirdesuscondicionesdepreparacinslicesquetienenunaaltacantidaddesilanoleslibres
sonmscidosqueslicescongruposhidroxiladosdelimitadas.
Lasliceesampliamenteutilizadoencromatografadefasenormalnoserecomiendaenfaseinversa
cromatografa.
4.3.4.2.Fasesmodificadosqumicamente
Actualmente,lasfasesmsutilizados.Suaplicacinacompuestospolaresseparadosera
difundidoampliamentecomoresultadodelasdificultadescuandoseutilizacolumnasbasadasenslice.
Coneladvenimientodelasfasesqumicamenteacotadas,estabrechasellenyenlaactualidadpodemosafirmar
quealrededordel90%delaseparacincromatogrficaserealizausandodichasfases.Tienenuna
interesantemecanismoderetencindesolutospormediodeinteraccionesnobasaexclusivamenteenlapolaridad.
Elusodegruposoctadeciloconducenalaformacindelafasedeoctadecilsilano,conocidocomoODSo
C .Estegrupoimpartelafasedeuncarcterpolarencomparacinconlaslicesinmodificar.
18
Retencinenestasfasesdependedelacantidaddecarbonopresente,generalmenteseexpresacomoporcentaje.
Lacalidaddelaseparacinalaqueseaplicandependerdeesteporcentajeyel
cantidaddesilanolesresiduales.
Porrazonesestricas,estaderivacinnoafectaatodoslosgrupossilanol.Enalgunoscasos,elrestante
grupostienenunproblemaconlacolapicosenlainteraccinconelsoluto.Esteproblemapuedeser
resueltomediantelareaccindeslicecontrimetilclorosilanodespusdeladerivacincomoeltrimetilclorosilano
esmspequeo,sepuedellegaraalgunosdeestosgrupos,formandoentoncestrimethylsilanes.Aunquenoes
posiblederivartodoslosgrupossilanol,esteprocesosedenominadeproteccinterminal.
Algunosanlisisrequierendelatemperaturadelacolumnaaserestabley,paraesepropsito,haydispositivos
disponibleenelmercadotalesdispositivosseconocencomocompartimientodelhornoocolumna.
4.3.5.Detectores
Losdetectoressetransducingdispositivosconectadosjustodespusdelasalidadelacolumna.Ellossonresponsablesde
generarsealeselctricasproporcionalesaloscompuestosquepasanatravsdeellos.Variostiposde
LosdetectoressehanutilizadoenHPLCenfuncindelascaractersticasfsicasofisicoqumicasdela
delamuestraylafasemvil.Undetectoridealdebetenerlassiguientescaractersticas:
Altasensibilidadybajolmitededeteccin
Respuestarpidaatodoslossolutos
Insensibilidadacambiosdetemperaturaydeflujodesalidadefasemvil
respuestaindependientedelafasemvil
Pequeoaporteparaelensanchamientodepicoporelvolumenadicionaldelaceldadeldetector
Respuestaaumentarlinealmenteconlacantidaddesoluto
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Nodestruccindelsoluto
Laseguridadylacomodidaddeuso
Lainformacincualitativadelpicodeseado
Bajocosto.
TodaslascaractersticassepuedenencontrarenapenasunnicodetectorPorlotanto,eldetectormsapropiado
debeserelegidodeacuerdoalamuestrayquetienetantascaractersticascomoseaposible.
Losdetectoresmsutilizadosdisponiblesenelmercadoincluyen:
Detectoresdeabsorbancia(UVVIS)ultravioletasyvisibles
Losdetectoresdefluorescencia
detectoreselectroqumicos
Losdetectoresdemasas.
Otrosdetectores:
Detectoresdendicederefraccin
detectoresdeconductividadelctrica.
4.3.5.1.DetectoresdeUVVIS
EstosdetectoresfuncionanbasadoenlacantidaddeluzabsorbidabyThesolutociertacaractersticaata
longituddeonda.Puedenserdividenbsicamenteentrestipos:
Sehacorregidolalongituddeonda
longituddeondavariable
Diodosarreglo.
4.3.5.1.1.Detectoresdelongituddeondafija
Elmssimpledetodoslosdetectores.Noesmuycomnhoyenda,yaquesonsensiblesalasvariacionesde
lacomposicindelafasemvil,perjudicandoassuusoensistemasdegradiente.Seseleccionalalongituddeonda
atravsdefiltrospticosdelongituddeondaespecficas.
4.3.5.1.2.Detectoresdelongituddeondavariable
Losdetectoresmsutilizadoshoyenda,yaquepuedenserutilizadostantoenisocrticoyelgradiente
sistemas.Utilizadoporlamayoradeloslaboratoriosenlosquelamuestraysucorrespondientelongituddeonda
sonconocidos.LaFigura3muestraeldiagramaesquemticodeundetectordelongituddeondavariable.
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Reddedifraccin
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Clula
Lmpara
Fotodiodo
Figura3.Diagramaesquemticodeundetectordelongituddeondavariable
4.3.5.1.3.Diodosdetectoresdisposicin
Detectoresdequetienenlacapacidaddegenerarespectrosdeabsorbanciaaunavelocidadcompatibleconeleluyente
fluir.Proporcionadatostridimensional:absorbanciaxtiempoxlongituddeonda.Seutilizanenlainvestigaciny
desarrollocuandonoseconocelamejorlongituddeonda,cuandosedeseaelespectrode
finesdecaracterizacin(biblioteca)yparaobtenerelporcentajedepurezadelospicos.
Eldiagramaesquemticosemuestraenlafigura4.
Reddedifraccin(fijo)
Clula
Diodosdisposicin
Lmpara
Figura4.Diagramaesquemticodeundetectordediodosdisposicin
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4.3.5.2.Detectordefluorescencia
Losdetectoresdefluorescenciasonespecficos,yaqueelsolutotienequeemitirfluorescencia.Esunodelosmssensibles
entrelosdetectoresmsutilizadosenHPLC.
LaFigura5muestraundiagramaesquemticodeestetipodedetector.
Fuentedeluz
Celdademuestra
Detector
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Intitulado
Absorcin
Detector
Emisin
Figura5.Esquemadeladetectordefluorescencia
Algunosdetectoresdefluorescenciaenelmercadotienenlacapacidaddegenerarexcitacinydeemisin
espectrosdefluorescenciaduranteelanlisiscromatogrfico.
4.3.5.3.Detectoreselectroqumicos
Elmssensibledetodoslosdetectoresytambinelmsdelicadodetrabajar.Lasmolculassean
analizadadebetenercaractersticasquepermitenlaoxidacinoreduccin.Ladeteccinserealizpor
losmediosdeelectrodoscomosemuestraenlafigura6.
Auxiliar
electrodo
Mvil
fase
Trabajo
electrodo
Potencimetro
Grabadora
Figura6.Diagramaesquemticodeundetectorelectroqumico
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Comopartedelcromatgrafo,laadquisicindedatosysistemadeprocesamientosepermitiralusuario
verificarydocumentarlosresultadosobtenidos.
Elsistemabsicamenterecibirlasealelctricaenviadaporeldetector(s),convertirlosengrficos
llamadoscromatogramas,integranlospicosusandoelparametersandpredeterminado,apartirdeunacalibracin
curva,cuantificarlasmuestras.
Estagrficatiempoderetencindelasealxtienedoscaractersticasimportantes.Enprimerlugar,eltiempoderetencinescaracterstico
yrepetitivoparacadasustanciasegundo,elreadelpicoolaalturaesdiferenteproporcionalala
concentracindelasustanciaomasa.
Consultelafigurasiguiente:
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Intitulado
Tiempoderetencin
readelpico
AlturadePico
Base
Acta
Unarchivosecreainicialmenteycontienelainformacinnecesariaparaelanlisisdelinters
sustancias,talescomo:
Eltextoquedescribelascondicionescromatogrficas,talescomo,lafasemvilylacolumnautilizada
Programacindeparmetrosdeintegracincromatogramas.
Cuandoelsistemaseestabiliza,lasnormasseinyectanconelfinderevisarlaactuacin.
Cuandotodoslosparmetrosseestablecenycorrecta,unestndarquecontienetodosloscomponentesasercuantificadaes
inyectadademaneraquesecreaunatablaenestalatabla,elsistemaest"informado"sobrelospicosdeser
analizadoatravsdelostiemposderetencincorrespondientes.Serequiereestatablaparacrearunacalibracin
curva.
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Acontinuacin,lasnormasparalacreacindeestacurvaseinyectanysealmacenan,poniendofinalacreacindeeste
archivodeanlisis.
Cuandolainyeccindelasmuestras,sedebetenercuidadoparainyectarlasnormasdecontrolaintervalosregulares,
permitiendoasquelaverificacindelaestabilidaddelsistema.
Acontinuacin,loscuatromtodosquesepuedenutilizarparafinesdecalibracinserndiscutidos:
reaPorcentaje.
readeNormalizacin.
Estndarexterna.
NormaInterna.
4.3.6.1.Porcentajesderea
Elporcentajedereaeselmtododeclculomssimple,yaqueserequiereningnestndar.
Sebasaenelprincipiodequelarespuestadeldetectoresproporcionalalacantidaddesustancia
pasandoatravsdesuclula.
Puedeserutilizadoparasustanciasquetienenlamismarespuestaaldetector,esdecir,sisoncantidadesiguales
inyectado,reasigualesdebenobtenerseparatodoslospicos.Elclculodelamuestraes:
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ComponenteAconcentracin(%)=
ComponenteUnreade100x
reasdetodosloscomponentes
4.3.6.2.Lanormalizacindelazona
Elprincipioeselmismodelazonadeporcentaje,sinembargo,larespuestadeldetectorparacadasustancia
secorrigeutilizandounodelospicoscomounareferenciadeclculo.Paraestemtodo,esnecesario
inyectarunestndarparacalcularelfactorderespuestadecadapico,comosemuestraenlasiguientefrmula:
ComponenteA=
ComponenteAzona
x
factorderespuestaComponenteAlaconcentracin
Concentracindelcomponentedereferencia
readecomponentedereferencia
Cuandoelfactorderespuestadecadacomponenteestdisponible,sepuedeanalizarlamuestrausandola
siguienteecuacin:
ComponenteA=
ComponenteAzonaxComponenteUnfactorderespuesta
concentracin(%)(reasdetodosloscomponentesxFactorderespuestadetodosloscomponentes)
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4.3.6.3.Patrnexterno
Elestndarexternoeselmtododecalibracinmscomn.
Consisteenlacuantificacindelamuestramediantelainyeccindeestndaresconconcentracionesconocidas.
Lazonaestndarestcorrespondialaconcentracinyelfactorderespuestaseobtieneparacada
compuesto,deacuerdoconlasiguienteecuacin:
ComponenteA=
ComponenteAzona
Conestefactorderespuestageneradadespusdelainyeccindelanorma,seinyectalamuestra.
Elreageneradaenlamuestrasedivideporelfactorderespuestageneradaporelestndar,el
concentracindelamuestraseobtieneporlaecuacin:
ComponenteA=
concentracin
ComponenteAzona
ComponenteAfactorderespuesta
4.3.6.4.Estndarinterno
Elestndarinternoeselmtododecalibracinmsprecisa,yaquecorrigelasfluctuacionesdevolumen
medianteelusodeunpatrndereferenciaaadidoenlamismacantidadtantoconelestndarylamuestra.
Laeleccindeestanormadereferenciadebercumplirlassiguientescondiciones:
Nodebeestarpresenteenlamuestra
Lamuestranodebetenerningncomponenteconuntiempoderetencinmuycercadelanorma
Debeserpuro,noreactivoypreferiblementedelmismogrupofuncionaldelcomponente
quesedetermine.
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MuchasvecesestemtodonopuedenutilizarsecomoresultadodetalescondicionesSinembargo,cuandoseaposible,esta
mtodoproporcionaresultadosmuyprecisosinclusocuandoseutilizalainyeccinmanual.
Elclculoconsisteendeterminarelfactorderespuestarelativaacadacomponentemediantelainyeccinde
elestndaryelusodelasiguienteecuacin:
ComponenteA=
ComponenteAzona
x
Concentracindelestndarinterno
readelestndarinterno
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Cuandosecalculanlosfactoresderespuesta,lamuestraseinyectaconelestndarinternoy,con
lasreasasobtenida,laconcentracindecomponentesecalculautilizandolaecuacin:
ComponenteAElcomponenteA=
concentracin
zona
x
Estndarinterno
concentracin
x
readelestndarinterno
ComponenteA
factorderespuesta
Actualmenteexistendosopcionesparalaadquisicinyprocesamientodedatos:elintegradoryelpersonal
ordenadorconunsoftwarededicado.Ambospermitenalusuariorealizarlasmismastareas.Elbsico
diferenciaentreelloseselsistemaoperativo.
Valelapenasubrayarlaimportanciadelatransferenciadedatosobtenidos(cromatogramas)deun
plataformaaotraparalospropsitosdeintercambioentrelaboratorios,estonopuedeseruninconvenienteparalosresultados
comparacinyanlisis.
Conelfindeasegurarresultadosconfiablesyreproduciblesenelcumplimientodelacualificacindelainstalacin
Requisitos(IQ),lascondicionesdellugardeinstalacindebenserverificados.Paraello,la
siguientescondicionessepuedenmencionar:
4.4.1.Requisitosdebanco
ElbancodebedimensionarseparaacomodaradecuadamenteelequipoHPLCyhacerqueelusuario
sentirsecmododuranteeltrabajo.
EltamaodelaHPLCyelsistemadedatos(integradorocomputadora),generalmentededosmetroslineales,es
suficienteparaacomodarelsistemacompleto.
ElequipodeHPLCactualsesuelemodular,susmdulosrestantessobrelaotraformando
unatorrePorlotanto,laalturatotal(bancomstorre)debeserseguroparaevitaraccidentesprincipalmente
cuandoeloperadorseencargadelafasemvil.
Laestructuradebesercapazdesoportarfirmementealrededorde80kgsinvibracionesocambios.
Losfabricantesdeequiposproporcionandescripcionesdetalladasdelbancorequeridoenla
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manualesdepreinstalacin.
4.4.2.Redelctrica
Laredelctricadebeestardebidamenteconectadoatierrayseestabiliz.Elusodeunallavemagnticaes
serecomiendaencasodefallasdesuministrodeenergaelctricaconstante.
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Elnmerodepuntosdeventadebeseradecuadaydeconformidadconlasnormasdeinstalacindelsistema.
Serequiereunasalidaparacadamdulo,ademsdelospuntosdeventaparaelintegrador.Siunequipo
seemplea,serequierenpuntosdeventaparalaCPU,monitorylaimpresora.ParaunaHPLCtradicional,quetiene
unabomba,inyectorautomtico,horno,detectoryelordenador,ochosalidassonsuficientes.Nodebehaber
unatomaderepuestoparasuusoenlaasistenciatcnicay/ovalidaciones.
LaFigura7muestralasalidaestndarqueseutilizaenequiposdeHPLC.
Salidaestndarparacromatgrafolquido
Figura7.salidaestndarparaHPLC
ElfabricanteHPLCdebeinformaralconsumototaldeenerga,ascomoelpoder
consumopormdulo(expresadaenWattsoVAokVA).Paraeldimensionamientoyladistribucindela
lacapacidaddelsistemaelctrico,unprofesionalelctricodebesercontactado.
EquipodeHPLCnotoleralasfluctuacionesdelaredelctricaPorlotanto,esfundamentalparaconocerla
Estabilidaddevoltajeydeterminarquelatensinescompatibleconlasespecificacionesrequeridasdecada
modelo.
4.4.3.Condicionesambientales
Latemperaturaylahumedadsonlascondicionesambientalesbsicasparaserconsideradas.
LatemperaturadelahabitacindondesevaainstalarelequipoHPLCdebecontrolarse
singrandesfluctuacionesduranteeluso.Latemperaturatpicarequeridaporlosfabricanteses25C,
sepermitenlasfluctuacionesde+/2C.
Lahumedaddebeserinferioral95%nosepermitelacondensacin.
Mantenimientoporelusuarioescrticaparaelbuenfuncionamientoyladurabilidaddeuncromatgrafo.
Despusdeusarelequipo,unprocedimientodelimpiezadebeserseguido(queserdependientedela
tipodefasemvilutilizada)Estotambinesciertoparalacolumnacromatogrficacomocomponenteprincipal
delsistema,lacolumnacromatogrficasedebeprestarespecialatencin.
Paralalimpiezadelacolumnacromatogrfica,sigacuidadosamentelasinstruccionesdelmanual.
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Sistemasdetrabajoconlasolucintampncomolafasemvilrequierenuncuidadoespecial.Despusdesuuso,esesencial
utilizaragua(100%)paralaeliminacincompletadelasolucintampnyluegounamezcla,porejemplo,
70%demetanol(oacetonitrilo)y30%deagua.Estamezclaserequierecomohongospuedencrecersi
elsistemasedejaensloagua.Elusuariodebeestarfamiliarizadoconlasustitucindeconsumibles
partesdelsistema.Cualquierintervencindemantenimientodebeserreportadoenunlibroderegistro.
Lasprincipalespartesconsumiblesparacadamdulosonlossiguientes:
BombaSellos,pistones,filtros.
Manualdelinyectorsellodelrotor,bucledemuestras,lasconexiones.
inyectorautomticoFiltros,septos,sellodelrotor,piezasdelaunidaddejeringa(siloshay),vialesparamuestrasy
reactivos,aguja,lazomuestra.
LosdetectoresdeUVVisibleyfluorescenciaLmparas,lentes,juntastricas.
detectorelectroqumicosolucinElectrodos,KCl,juntastricas.
Ademsdelaoperacindelequipo,porlotanto,laformacindelusuariodebeincluirestosbsicos
precauciones.CualificacinprofesionalDueescrticoparaesteniveldeaprendizaje.
Lalecturadelosmanualesestambinunaexcelenteprctica.Ademsdeproporcionarinformacindetalladasobrela
laoperacindelequipo,elmanualaclaravariasdudasdelusuario.Esimportanteobservarla
lasreglasdeseguridadalmanipularelequipo.Elusodedelantal,guantesygafasevitalesionesgraves
comocegueraolacontaminacindelamuestra,porejemplo,plasma.
Elsistemadedescontaminacinsiempreesobligatoriaconelfindeprotegerlasaluddelapersonaen
encargadodemantenimiento.
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5.sistemasdecromatografaRELACIONADOS
DETECTORESDEMASA
5.1.Introduccin
Lacromatografaesunatcnicadeseparacinesencialencienciasdelavidayloscamposdelaqumicarelacionados.
Detectorestradicionales,talescomoultravioletavisible,electroqumica,ndicederefraccin(HPLC),lallama
ionizacin,laconductividadtrmica,etc(GC)sonampliamenteutilizadosparacuantificarcompuestoscomobidimensional
losdatosseproducen(respuestaxtiempo).
Losdetectoresdemasassecaracterizanporlageneracindedatostridimensionales(respuestaxtiempoxinica
lamuestra),esdecir,espectrodemasasquepuedeproporcionarinformacinmuyimportantesobrelamuestra
pesomolecular,suestructuramolecular,laidentidad,cantidadypureza.Losdatosdelosespectrosdemasas
aadirespecificidadparaambosanlisiscuantitativosycualitativos.
Paralamayoradeloscompuestos,losdetectoresdemasassonmssensiblesymuchomsespecficoque
detectorestradicionales.Theycananalizarvarioscompuestoseidentificarloscomponentesennoseparado
cromatogramas,reduciendoaslanecesidaddeunacromatografaperfecto.Losdatosespectralesdemasapuede
complementarlosdatosdeotrosdetectores.AunquedoscompuestospuedentenerUVsimilaresoMisa
espectros,comoenLCMS,estefenmenoesdifcilmentesimultneaporlotanto,ambostiposdedatos
juntospuedeserutilizadoparaidentificar,confirmarycuantificarcompuestosconresultadosaltamentecorrectos.
Algunosespectrmetrosdemasastienenlacaractersticaderealizarmltiplesmedidasdeespectrometrademasas
enunasolamuestra.Puedengenerarunespectrodemasas,seleccioneunionespecficoyluegogenerarunnuevo
espectro.Algunosdeellossoncapacesderepetiresteciclovariasveceshastaquesedeterminalaestructura
(MS/MSoMS n).
5.2.PrincipioTcnica
Elespectrmetrodemasasoperabsicamenteatravsdelaionizacinylafragmentacindelasmolculas.
Despus,losionesresultantesseidentificarondeacuerdoconsurelacinmasa/carga.Laclavedetres
componentesdelprocesoincluyen:fuentedeiones,unanalizadoryeldetector.Elpropsitodelosiones
fuenteesgenerariones.Hayvariostiposdefuentedeionesenlacromatografaconectados
alosdetectoresdemasas.Cadatipoesespecficoparaunaclasedadadecompuestos.Tambinhayvarioskinas
deanalizadoresparalaseparacindeionesydetectoresparalageneracindesealesmedibles.
Cadaunotieneventajasydesventajasdependiendodeltipodeinformacinbuscada.Detalles
enrelacinconlasfuentesmscomunes,analizadoresydetectoressediscutiracontinuacin:
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MUESTREO
SISTEMA
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IONESFUENTE
ES
MASASFILTRO
MF
DETECTOR
EM
SISTEMADEDATOS
DS
5.3.1.Fuentedeionizacin
Lasmolculasdeionizacinyfragmentacinsellevarnacaboenlastcnicasdeionizacinsource.Several
estndisponibles,incluyendo:bombardeoAtomFAB,desorcinporlserLD,TermonebulizacinTS,Partculas
viga,etc.Sinembargo,lasfuentesmsutilizadasson:
5.3.1.1.Loselectronesdeimpacto(EI)
ElImpactoelectrones(EI)deorigenutilizaunfilamentoacargodelaemisindeelectronesconundefinido
energade70eV.Unavezqueloselectronesenergadelhazesmuchomsaltoqueelprimerpotencialdeionizacin
enlamayoradeloscompuestosdelamuestra,estaenergaseionizayluegofragmentado.Estetipode
ionizacinestrelacionadaconlaGC.
5.3.1.2.Ionizacinqumica(CI)
LaIonizacinqumica(CI)deorigenutilizaagenteslquidosogasesareaccionarconlasmolculas.Ionizacin
porlogeneralsellevaacabobymeansdelatransferenciadeunprotnalamolcula,formandoasespecmenes
llamadoseudoionesmoleculares.Comoestaionizacinesmucho"mssuave"queelimpactodeelectrones,la
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espectroproducidocontienealgunosfragmentosycasiexclusivamentelapseudoionmolecular
Porlotanto,seempleaenladeterminacindelpesomoleculary/oanlisiscuantitativos.
EstetipodeionizacinserelacionaconGC.
5.3.1.3.Electrospray(ES)
Laionizacinelectrospraytieneungranimpactoenelusodelaespectrometrademasasaplicadaabiolgica
investigaenlosltimosaos.Fueelprimermtodoparaampliarlagamadeinstrumentosmasatil
porencimade50.000Da.Sinembargointroducidoensumodeloactualenelao1984,latcnicavuelveala
investigacionesdeasistenciaelctricadedispersinlquidoenelprincipiodeestesiglo.Dehecho,la
descubrimientoprincipalfuecasiaccidentalen1968cuandoMalcolmDoleysuscolaboradoresfueroncapacesde
traermacromolculasalafasedegasapresinatmosfrica.Eraposibleporpulverizacindeunamuestrade
solucinaunpequeotuboconunfuertecampoelctricoenpresenciadeunflujodenitrgenocalienteparaayudar
eneldissolvationyluegolamedicindelosionesformados.Experienciasposteriores,innovadorasenestecampo
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conducidoalaintroduccindeunafuentedeionizacinES.Desdeentonces,unaampliagamadebiomolculasera
investigadoporES.PorlogeneralLamuestrasedisuelveenunamezcladeaguaydisolventeorgnico,
tpicamentemetanol,isopropanolyacetonitrilo:puedeserinfundidadirectamenteoseinyectaencontinuo
flujo,esdecir,contenidaeneleluyentedelacolumnadelacolumnadeHPLCyCEcapilar.
LafuenteESessimples,formandounaerosolqueocurreenuncampodealtovoltajecomosemuestraenlaFigura5.En
unmecanismopropuesto,secreequelaformacindeioneseselresultadodeunaevaporacininica
proceso,primeropropuestoen1976.gotitasdeunaerosolesgeneradoporladispersinelectrostticadela
lquidoaplicadoporelextremocapilar.Favorecidoporungascaliente(normalmentenitrgeno),lasgotitasson
desglosados,perdermolculasdedisolventeenelprocesoyenocasionesproducirionesindividuales.En
Otromecanismopropuesto,lasgotitasdissolvationconducenaunadensidaddecargacrecientesobrela
superficiedelagotaqueprovocarunaexplosindeCoulombeventualmenteproducirionesindividuales.
Bomba
Gota
Atmosfrico
Presin
Gotita
Bomba
Clustersy
especmenesinicos
Iones
Independientementedelmecanismopropuesto,losionesseformanapresinatmosfricayentrarenuna
orificiosituadoenelvrticedeunconodeactuacincomolaprimerabarreraalafasedevaco.Unskimmer
recogelosionesylosguaparaelespectrmetrodemasas.
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LaformacindeaerosoleslapartemsimportacindelatcnicadeEE.Seaconsejageneralmenteparafiltrartodos
disolventesaltasconcentracionesdeelectrolitosdebenevitarseyaquepuedencausarsupresionesdeionizacin
ycondicionesdeoperacininestables.LosaltosflujoscompatiblesconlosutilizadosenHPLC,sepuedenutilizarahora
atravsdeungasdenebulizacinsecalientaparaayudarenlaproduccindelapulverizacin.
Paramacromolculas,cadaionquenormalmenteentraenelespectrmetrodemasastieneunnmeroaltocargo.
Comolosespectrmetrosdemasasdemedirlarelacinmasa/cargaenlugardelamasa,esposibleque
molculasdealtopesomoleculartienensuficientecargaparacaerdentrodelam/zdelalcancedeunalineal
cuadrupolo,tpicamentem/z204000.ComosemuestraenlaFigura6A,losionesdealtamasamolecularamenudotienenuna
ampliadistribucindelosdeniveldecarga.Lafiguramuestraelespectrodemasasdemioglobinadecaballo(molecular
masa:16.951,5)abajaresolucinhabiendoobservadocargosde1221.Estadistribucininica
permiteelclculodelamasamolecularanalitooriginalpormediodevecinoionesconm/z
valoresm1ym2,concargosN1yN2,respectivamente.Sim1<m2,yn2=n11,acontinuacin,
M=n1(m1mA)=n2(m2mA)(1)
n2=(m1mA)/(m2m1)(2)
enlaqueMrepresentalamasamoleculardelamolculasincargaymAeslamasadela
aductocargadaA(porejemplo,H+,Na+,NH4+).Lasecuacionessepuedenresolveracontinuacin,paraproducirn2
yM.Lamedidadeladistribucindecargasenmacromoleulesnosiempreesfciloreproducible
unavezqueloscambios,comocambiosrelativamentepequeosdelascondicionesdeanlisispuedenocurrir,porejemplo:
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pHAdemsdedisolventesosalesprotenadesnaturalizacinparcialrupturadeenlacesdisulfuro,etc.
Lafuentedeelectrosprayseutilizaenrelacinatodoslosanalizadoresdemasasindividuales.
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5.3.2.Analizadoresdemasas
Despusdelaadmisindelasmolculasenlafuentedeionesyposteriordeionizacin,esnecesario
paradeterminarlasmasascorrespondientesdeionesformadosafindeobtenerelespectrodemasas.La
funcindelanalizadordemasasessepararlosionesdeacuerdoconsusrelacionesdemasa/cargaytransmitir
ellosaldetector.
Hayvariostiposdeanalizadoresdemasas.Elmscomnyampliamenteutilizadossonel"cuadrupolo"
yanalizadoresde"IonTrampas".
Elcuadrupoloestescaneandoanalizadores,esdecir,despusdelaadmisindeunamezcladeionescon
diferentemasa/relacionesdecarga(m/z)ydiferentesabundancias,camposelctricosseaplicanenunmomentodado
tiempo,slolosionesconunamasaespecficapuededejarintacta.Mediantelavariacindelcampoelctricoaplicado,sepuede
seleccionarygrabardiferentesiones.
Losanalizadoresde"trampadeiones",sinembargo,nosonconsideradoscomodispositivosdeescaneopuros,comolosionessealmacenan
antesdelaexploracinensmisma.
5.3.2.1.Analizadoresdemasasdecuadrupolo
Elinstrumentosebasaencuatrobarrasparalelasenunreacuadrangulardondeseenfocaelhazdeiones
enelejecentraldeestasbarras,unpotencialfijoelctrico(DC)yunpotencialdefrecuenciaderadio(RF)
seaplicanaestasbarrasdiagonalesyopuestas.ParaunacombinacindeRFdadoyDC,ionesdeuna
intervalodemasam/zespecficahabercambiadosucaminodesdeelejecentral.Elespectrodemasases
obtenidoapartirdeloscomponentesdevoltajedeCCyRFdeunamanerasincronizada,esdecir,manteniendoel
RFrelacin/DCconstante.El potencialaplicadoalosparesdebarrasopuestassedeterminacomosigue:
o
=U+Vcos
o
enlaqueUesunvoltajeDCyVcos
ylafrecuenciadeRF.
latensinenfuncindeltiempoenelqueVlaamplituddeRF
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Detector
salida
Losionesdelhaz
Iones
fuente
Cuadrupolo
Arquitectura
Figura2.Representacinesquemticadeunanalizadordecuadrupololineal
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Laoperacindecuadrupolo(ascomolatrampadeionesaserdiscutidomsadelante)puedenserdiscutidoscualitativamente
atravsdeldiagramadeestabilidadcorrespondientedelaamplitudpotencialdeCC,laamplituddelpotencialdeRF
conlarutadeunionestable(esdecir,unionquepuedepermanecerintactodespusdepasarelcuadrupolo).
Estoserepresentaenlasecuacionesyenelgrfico1.
LaecuacindemovimientodeunapartculacargadasepuedeexpresarcomounaecuacindeMathieuenelquelauna
u
yq
parmetrospuedenserdefinidos.
u
un =A =a =4zU/m 2r 2
u
x
y
o
q =Q =q =2zV/m 2r 2
u
x
y
o
enlaquem/zeslamasadeiones/racindecarga,yreslamitaddeladistanciaentrelosdosopuesto
o
bares.Noexisteningnparmetroparaz,yaqueelcampodeRFactasobreelplanoX/Y(zeselejeprincipaldela
cuadrupololineal).
Grfico1.DiagramaEstabilidadenelanalizador
Enestecaso,elionm eselnicoionquepermaneceestable(observarqueestdentrodelaregindeestabilidadde
2
elgrfico),mientrasquem
ym
nopuedealcanzareldetector.ElR=1002eR=10lneasrectasrepresentan
3
1
doscombinacionesdistintasdelarelacinDC/RFcambiandoestasrelaciones,esposiblecambiarel
resolucinfiltrodemasa,esdecir,lacapacidadparadiferenciarofiltrosdemasasmuycercaunodelotro.
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La"A"ylosparmetros"q"sonrespectivamenteproporcionalesalaDCylosvaloresdeRF.
5.3.2.2.analizadoresdemasascuadrupolo"trampadeiones"
Esteanalizadordemasastienelosmismosprincipiosdefuncionamientomatemticodelacuadrupoloconvencional,
esdecir,losionesdeestabilidaddentrodeunarutaespecfica.
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Sinembargo,laprincipaldiferenciaesqueenlatrampadeionesdelosionesnosiguenunanicatrayectoriahaciael
detector,peroestn"atrapados"enrbitasdentrodelaestructuradetrampa,dandoasaelevarelnombredeiones"
trampa".
Mientrasqueenelcuadrupololosionesseformanenlafuentedeionesyluegoexpulsadohacialamasa
analizador,enlatrampadeionesdelosionesseformanionesylamasaanalizadaenlamismaregindelespacio.
Estaregindelespaciodondeseencuentranlosiones"atrapados"correspondeaaproximadamenteelvolumende
1cubocmdelado.
Lasiguientefiguramuestraunarepresentacinesquemticadelatrampadeionesanalizador.
Figura3.Representacinesquemticadelanalizador"trampadeiones"
Comolosanalizadoresdecuadrupolo,losanalizadoresdetrampasdeionestambinutilizancamposelctricosEstoscamposelctricosson
laintencindemantenerlosionesconfinadosysepararlasmasas(anlisisdemasas).
Enestetipodeanalizadordemasas,elcampoelctricoutilizadoespuramenteRF(frecuenciaderadioqueconsisteenunseno
deondaconunafrecuenciadeaproximadamente1Mhz)aplicadadirectamentesobreelelectrodoanularcentral.
Porlotanto,dependiendodelaamplituddeRFaplicado,losionespuedenpermanecerestablesdentrodelatrampa.Alaumentar
estaamplitud,losionesconmayoresmasasson"expulsado"delaregindeconfinamientoydespus
llegaraldetector.
Otrapeculiaridaddelosanalizadoresdetrampadeioneseslanecesidaddecontrolarelnmerodeionesdentrodela
estructura,conelobjetivodeevitarlasreaccionesdeestosionesconmolculasanpresentes.Estasinteracciones
puedeconduciraunligerocambioenelespectrodefinalesdealgunoscompuestos,porlotanto,lainterpretacin/
identificacindifcil.
Esteproblemaseeliminaenlosanalizadoresdecuadrupolo,comolosionessoncasideinmediato"arrojados"
delafuentedeionesdespusdelaformacinynotienenlaoportunidaddeinteractuarconlasmolculas
presente.
Porotrolado,lasensibilidadfinalenelmododeescaneototalesmayorenlatrampayaquetodoslosanalizadores
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ionesformadossedetectannecesariamenteunavezqueestnconfinados.
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Estanoeslasituacinparalosanalizadoresdecuadrupolo.Esdecir,mientrasqueelcuadrupoloeselenlatado
rangodemasasconelobjetivodeproducirunespectro,losionesinestablesconseguir"perdido"y,porlotanto,nogeneran
unasealdetectable.Esposible,sinembargo,paraaumentarsignificativamentelasensibilidadporcuadrupolo
ladefinicindeunamasafija(ounaspocasmasas)deintersestatcnicasellamaSIM(SingleMonitoreoIon).
5.3.2.3.Tandemespectrometrademasas.
Laespectrometrademasasentndem,MS/MSoMS
n enlaquen=2,3...,utilizadosomsanlisisdemasas
pasos,unoparapreseleccionarunionylosotrosparaanalizarlosfragmentosinducidos,porejemplo,
colisin(CID)conungasinerte,talcomoargnohelio.Estopuedeseruntndemenelespaciootndem
anlisisentiempo.
Tandemenelespaciosignificavariosanalizadoresdemasasenserie.Variascombinacionessonposibles,el
mscomunesincluyen:triplecuadrupolo(Q1qQ2),cuatrosectoreseinstrumentoshbridos.Qrepresenta
unfiltrodemasacuadrupolaryqaRFcuadrupoloslo(cmaradecolisin).Enelcasodelatriple
cuadrupolo,unindeintersgeneradoenlafuentedeionizacinseseleccionaconelprimercuadrupolo
Q1,disociadoenelqcmaradecolisinconenergasdehasta300eVlosproductosdefragmentacin
seanalizanconelsegundocuadrupoloQ2.
Gasdecolisin
molcula
Fuentedeiones
Detector
Losionesproducto
formacin
Masa
espectro
porCID
Masatotal
espectro
Porlotanto,esposibleobtenerinformacinsobrelasecuenciadeunpptidomediantelaseleccindelion
correspondientealpptidoprotoned(llamadoinprecursor)yelanlisisdelosfragmentosdesu
estructurarutilizandoQ2.Esteprocesosedenominaexploracindeionesproducto.Variosotrostiposdeanlisiso
experimentosdeanlisissepuedenrealizar.Porejemplo,labsquedadetodoslosprecursoresdeAdado
fragmentosedenominaionesprecursoresdeexploracin.EstosepuedellegaralmantenerQ2estableenthemass/
chargeratiodelionquesetrateyelescaneadotodoslosionespresentesATQ1,mientrasquelasdisociacionesdecolisin
enqtenerlugar.Enotromododeescaneo,losionesquepierdenunfragmentoespecficosepuedenidentificarpor
escanearQ1yQ2simultneamente,manteniendoladiferenciademasaentrelosanalizadoresdecuadrupolo
igualalamasadelfragmentoperdidoneutral.
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Tandemintimesepuedeobtenerutilizandodispositivos"trampadeiones"yespectrmetrosdemasaICR(tambinllamado
FTMS).Dehecho,estosdispositivosnoselimitanalosexperimentosdeMS/MS,peropuedenllegaramltiplesetapas
(MS/MS/MS.../MSoMS n).Entalesdispositivos,losionessonseleccionadosmediantelaaplicacindetensinespecfica
legumbresydisociacionesnormalmenteseproducenporcolisionesconotrosgases.
5.3.3.Detectores
Despusdelaseleccinporelanalizador,losionessonguiadoshaciaeldetectordondesernconvertidos
enunsignal.Detectorsmediblespuedendividirseentresgrupos.PlacasfotosensiblesyFaraday
jaulasestnincluidasenelprimergrupoysecorrelacionandirectamentelasealmedidaalacantidaddela
ionanalizado.Elsegundogrupoincluyealoselectronesmultiplicadores,fotomultiplicadoresymicrocanal
placasqueamplificanlaintensidaddelasealrecibida.Estossonlosdetectoresmsutilizados
yserdiscutidoenelpresentedocumento.EltercergruposeutilizaendispositivosdeICR(FTMS)yconsisteenunaradio
detectordefrecuenciaaplicadoalosionesatrapados.
5.3.3.1.Electronesmultiplicadores
Alllegaralaconversindinodedondeseaplicaunpotencialnegativo,positivoonegativo
ionesemitenvarioselectronessecundarios.Estoselectronessonaceleradoshaciaunmultiplicadordeelectrones
ygolpearlasparedesconlaenergasuficienteparaeliminaralgunoselectrones.Estoselectronessegolpelaotra
ladodelapared,liberandoasmselectrones.Esteefectoencascadacontinahastaqueunmedible
corrientefinalmentecrearonafinalesdelmultiplicadordeelectrones.
Electronmultiplicador
Iones
Secundario
electrones
Salidadeelectrones
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5.3.3.2.Placasdemicrocanal
Lasplacasdemicrocanalesconsistenenunaplacaquecontienemicrocanalescilndricasparalelas.Laentradade
ladodeestosmicrocanalessemantieneconunpotencialnegativodeaproximadamente1kVcuandosecompara
alladodesalida.Lamultiplicacinelectrones,comenzconlacolisindeunionenestoscanales,
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seproduceatravsdeunsemiconductivesubstancequerecubrecadacanalygeneraelectronessecundarios.
Canalescurvosimpidenlaaceleracindelosionespositivoshacialaentrada.Elefectodecascada
dentrodeloscanalessepuedenmultiplicarelnmerodeelectronesenelordende10
5yelusodevarios
placasacopladaspermitenunaamplificacinquepuedealcanzarlos10
8.Alasalidadecadacanal,unmetal
nodorecogeloselectronesactualylasealsetransmitealprocesador.Otro
caractersticadeestosdetectoresdemicrocanalesISANsealesextremadamentebajostiempomultiplicacin,haciendo
inadecuadosparaladeteccindedispositivostalescomoanalizadordetiempodevuelo.
Electronmultiplicador
Loselectronessecundarios
Loselectrones
salida
Ion
Entradadeunmultiplicadordeelectrones
Losionescondiferentesracionesdemasa/carga
separadosenelespacio
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5.3.3.3.Fotomultiplicador
Estetipodedetectorcomprendedosdinodesdeconversinunapantallafosforescenteyuna
fotomultiplicador.Estedetector,comoelmultiplicadordeelectronesylasplacasdemicrocanales,permitequeel
deteccindeionespositivosynegativos.Trasladeteccin,losionesseaceleranhaciaeldinode
quetieneunapolaridadinversainversadeladelionloselectronesseliberanyacelerados
hacialapantallafosforescentedondeseconviertenenfotones.Losfotonessonentonces
detectadoporelfotomultiplicador.Lasuperficiedelapantallafosforescenteserecubreconunafinaconductora
capadealuminioparaevitarlaformacindecargasquepodranabstenersenuevoselectronesde
llegaraella.Laamplificacinalcanzavaloresde10
4a10 5.
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Iones
Ionessecundarios
Fotonesemitidos
Fotomultiplicador
Programasinformticosespecficosrealizanintegralmenteadquisicinyprocesamientodedatos.Estosprogramas
estnacargodevariastareas,quevandesdeelcontroldetiempodevigilanciadeunionala
construccindecurvasdecalibracinenlassuperficies(oalturas)delospicosdelamuestrasondesconocidos
interpolado,produciendoaslaquantitativedatumdeseado.Cadafabricantetieneunaadquisicindedatos
yelprogramadetratamientocondiferentesrecursosylimitaciones.Porlotanto,lacomprensinde
estosprogramasyelfuturodepreparacindeprocedimientosoperativosestndar(SOP)soncrucialespara
larealizacindecualquierestudio.
Losdetallessobreelprocesodecuantificacindecompuestosseproporcionanenelpunto4.6delatcnicadeHPLC.
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Elpropsitodelosrequisitosmnimosparalainstalacinesparaasegurarqueelambientedeinstalacinesdebidamente
evaluadoypreparadoconlosconsumiblesyartculosdesuministronecesariosparaunainstalacinperfecta.
Losfabricantesproporcionarnunalistaparaserusadaantesdelafechadeinstalacin.Estalistaser
especficaparaelinstrumentocompradoSinembargo,loquedebetenerseencuentaporlogeneralsedescribeacontinuacin.
5.4.1.Requisitosdebanco
Elbancodebeserdimensionadoparaacomodaradecuadamenteel/equipoMSLCyhacerqueel
usuariosesientacmododuranteeltrabajo.
EltamaobancodebesercompatibleconelLC/MStamaomselsistemadedatos(ordenadory
impresora).Porlogeneral,tresmetroslineales,essuficienteparadarcabidaatodoelsistema.
Laestructuradebesercapazdesoportarelpesodelequipodemaneraseguraporlotanto,unmargende20%porencima
sedebeconsiderarelpesodelequipo.Laestructuratienequeserfirme,sinvibracioneso
columpios.
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Algodeespaciolibredetrsdelabancadebesertambinpermiti(nocoloqueelbancodetocarlapared)
ascomoparadarcabidaaloselementosnecesariosparaelfuncionamientodelequipo,porejemplo,bombasdevaco
ysistemasdecirculacinderefrigeracinporaguay.
Losfabricantesdeequiposproporcionandescripcionesdetalladasdelbancorequeridoenla
manualesdepreinstalacin.
5.4.2.Redelctrica
Laredelctricadebeestardebidamenteconectadoatierrayseestabiliz.Elusodeunallavemagnticaes
serecomiendaencasodefallasdesuministrodeenergaelctricaconstante.
Elnmerodepuntosdeventadebeseradecuadaydeconformidadconlasnormasdeinstalacindelsistema.
AdemsdelmdulodeLC/MS,salidasparaelsistemadeHPLCyelsistemadedatos,incluyendoel
impresora,debenserconsiderados.
LasalidaestndarparaLC/MSdependerdelatensindeoperacinrequerida.Debidoalaalta
elconsumo,estossistemasrequierengeneralmentedealimentacin220VACconcapacidadpara1.5a2KVA(parael
MduloMSsolamente).Valelapenanotarqueelequiporequiere220VACenunasolafaseodedivisin.
ElfabricanteLC/MSdebeinformaralconsumototaldeenerga,ascomoelpoder
consumopormdulo(expresadaenWattsoVAokVA).Paraeldimensionamientoyladistribucindela
lacapacidaddelsistemaelctrico,unprofesionalelctricodebesercontactado.
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ElequiponotoleralasfluctuacionesdelaredelctricaPorlotanto,esfundamentalparaconocerla
Estabilidaddevoltajeydeterminarquelatensinescompatibleconlasespecificacionesrequeridasdecada
modelo.
5.4.3.Condicionesambientales
CondicionesambientalesparaLC/MSsistemasnoincluyenlatemperaturaylahumedadsolamente.Este
tipodeequipotambinrequieredealimentacindegasyalgunosdeellosrequierenlacirculacindeenfriado
agua,ademsdeagotamiento.
LatemperaturadelahabitacindondeseinstalarlaLC/MSdebesercontroladosin
grandesfluctuacionesduranteeluso.Latemperaturatpicarequeridaporlosfabricanteses25C,con
fluctuacionesde+/2C.UnsistemaLC/MSdisipaelcalor68008000BTUestecalordebe
debentenerseencuentaaldimensionarelacondicionadordeaire.
Lahumedaddebeserinferioral95%nosepermitelacondensacin.
Gas(nitrgeno)puedeseralimentadodesdeloscilindros,loscompartimentosdenitrgenolquidoogeneradoresdenitrgeno(este
siendoesteltimomsindicado).Elconsumotpicoesdelordende15L/minylapurezadebenser
99,5%paraloscilindrosy98,0%paraotrasfuentesdenitrgeno.Presindetrabajodebeserde80a100psi.
Lahabitacindebeestartambinprovistodeunsistemadeagotamientoconunacapacidadmnimade15L/
min.Estesistemadebeestarconectadoalabombadevacoylasalidadefuentedeionizacin.
Mantenimientoporelusuarioescrticaparaelbuenfuncionamientoyladurabilidaddecualquierequipo.
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AdemsdelasprecaucionesbsicasdelsistemaHPLCdescritosenelcaptulo4,parteesencial
elementosdebenconsiderarseparaunsistemaLC/MS:
5.5.1.Sistemadevaco
Sistemasdealtovacoporlogeneraltienentresbombas,unaauxiliar(mecnico)ydosturbomolecular
bombas.
Labombamecnicarequierelareposicindelquidosporlomenoscadaseismeses,siseutilizao
no.Algunosdeellostambintienenfiltrosquetienenqueserreemplazadosy/overificarseaintervalosfijadosporla
fabricante(normalmentedeseismeses).
Lasbombasturbomoleculares(altovaco)sonmsespecficosydependendelmodeloy
recomendacionesdecadafabricante.Algunosdeellostienenlubricacinpermanente,perootros
necesitalubricacinaintervalosregulares.Algunosotros,sinembargo,requierendeloscojinetesasersustituidosen
intervalospredeterminados.Porlotanto,escrticoquelasinstruccionesdemantenimientoseobtienenapartir
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elproveedoryqueelprocesosedocumentaysesigui,yaqueunfallodetalessistemaspueden
definitivamenteponerenpeligroelequipocomounconjunto.
Elvaco(preyaltovaco)debenleersediariamenteysusvaloresregistraronsemanalmenteenunlibroderegistro.
5.5.2.Fuentedeiones
Lafuentedeionesesunapartedelosequiposmssujetoalasuciedadycontaminacinyaquerecibe
lafasemvilconlamuestraalapresinatmosfricaylosconvierteenionesparala
sistemadevaco.
Mantenimientoylimpiezadebenhacerseconbaseenelusodefondodecadaequipoy
dependerdeltipo,concentracinynmerodemuestrasinyectado.Unavezestablecido,el
intervalodelimpiezadebeserseguidoydocumentado.
Elusuariodebeestarfamiliarizadoconlasustitucindelaspiezasconsumiblesdelsistema.Cualquier
intervencindemantenimientodebeserreportadoenunlibroderegistro.
5.5.3.Sistemadenitrgeno
Elsistemadenitrgenodebeserrevisadoaintervalospredeterminados.Ungeneradordenitrgenoesnormalmente
elegidodebidoalarelacincosto/beneficio.Talesdispositivosestnprovistosdefiltros,compresores,etc.,que
tambinrequierenunmantenimientoperidico.
5.5.4.Formacinprecaucionesbsicas
Ademsdelaoperacindelequipo,porlotanto,laformacindelusuariodebeincluirestosbsicos
precauciones.CualificacinprofesionalDueescrticoparaesteniveldeaprendizaje.
Esimportanteobservarlasnormasdeseguridadalmanipularelequipo.Elusodedelantal,guantesy
gafasevitalesionesgravescomolacegueraolacontaminacindelamuestra,porejemplo,plasma.
Elsistemadedescontaminacinsiempreesobligatoriaconelfindeprotegerlasaluddelapersonaen
encargadodemantenimiento.
5.5.5.ArchivosAutotune
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ElLC/MSsistemasdisponendeprogramasdeautoajusteparallevaracaboaintervalosregulares.
Estosprogramasgeneraninformesquedebenserpresentadosporelbuenfuncionamientoyelfondode
ayudarconlasintervencionesdereparacin.
Precaucionesequiposbsicos,comolacomprobacinderendimiento,vandesdeunequipoaotro.
As,losmejoresprocedimientosparallevaracabodichastareassonlossugeridosporelfabricante.Estos
procedimientosdebenserledosyunprocedimientooperativoestndar(SOP)creadosparadefinirlafrecuencia
yeltipodetareaarealizar.CualquierincumplimientodeestaSOPdebeserdocumentadoy
justificada.
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6.INSTRUMENTOSDEANLISISVerificandoelfuncionamiento
6.1.Introduccin
Amediadosdeldeceniode1990,elrendimientodelosinstrumentosdecomprobacincomenzasertenerunagranimportancia
ylaprimeraatencinsecentrenlossistemasdeHPLCcomoresultadodesuampliousoenlaindustriafarmacutica
sinembargo,estapreocupacincubretodoslostiposdeinstrumentosutilizadosenunlaboratorio.
Aligualqueenlossistemasdegestindedatos,estosserviciosseofrecenengeneralporinstrumentoanaltico
fabricantes.Existendiferentesterminologasentreellosavecesserefierenalamisma
serviciosprestados.Porejemplo,lacomprobacindelrendimientodeuninstrumentoanalticopuedesertambin
llamadoCalificacin,OperacinCualificacin(OQ)orecertificacin.
Esimportantesealarque,independientementedelasbymanufacturersterminologyused,debecorresponder
paralacomprobacindelrendimientodelsistemadeinstrumentacinanalticasiguiendounprocedimientodocumentado
afindesatisfacerlosrequisitosdeunsistemadecalidadyenelcumplimientodelaGLP(GoodLaboratorio
Prcticas)aintervalosadecuados,definidosparacadalaboratoriodeacuerdoconelusoy/otrabajo
realizado.
Lasempresasdeinstrumentacinrecomiendanestacomprobacinenperodosregularescada6meseso1
aoycadavezqueelinstrumentoestsujetoaserviciooreparacinquepuedainterferirdirectamenteconsu
rendimiento.
Existelaterminologadevalidacindurantemuchotiempoytienealgunasvariacionessegnelpas
ycompaa.Lamejordefinicinparalavalidacines:elconjuntodeactividadesdocumentadasy/o
informacinquedemuestreunaltogradodeseguridaddelproceso/sistemaempleado,elcumplimientodela
especificacionespredeterminadasconlosatributosdecalidadadecuados.Porlotanto,lavalidacinnoesuna
comprobacinderendimiento,capacitacin,calificacindelaoperacin(OQ)oprocesoderecertificacinsolamente,
sinounprocesoquedebeincluirlassiguientesfases:
DQCalificacindeDiseo
IQCualificacindelainstalacin
OQCualificacinOperacin
PQCalificacindelDesempeo.
6.1.1.DQCalificacindeDiseo
Dentrodelacalificacindeldiseodeinstrumentos,elaccesosedebepermitirqueeldesarrollodeinstrumentos
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detalles,talescomo:
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Elusodemtodosdeespecificacionesestrictasydiseoduranteeldesarrollodelsistema.
Ladocumentacincompletadelosprocedimientosdegarantadecalidadycontroldecalidad.
Elusodepersonalexperimentadoycualificado.
plandepruebasinstrumentointegral.
Datosdecontrol,informesdeerroresyprocedimientoscorrectivosaplicadosduranteeldesarrollodelsistema
ylaproduccin.
fondoeldesarrollodelsistema.
Dichainformacindebeserproporcionadaporlosfabricantesdeinstrumentos,sinembargo,conelobjetivodeverificar
elpliegodecondicionesyusopropuestoadecuacin.
6.1.2.IQCualificacindelainstalacin
Lacalificacindelainstalacinsignifica:controltodaladocumentacineinformacinparalainstalacindel
instrumentosysoftwaredeacuerdoalasespecificacionesdelsistemaquesedescribenenlainstalacin
requisitosyregulacioneslocales.ElIQdefinequeelinstrumentoserecibecomoseespecifica,
correctamenteinstaladoyencondicionesdefuncionamiento.Estaactividaddebeincluir:
Comprobacindelosartculosrecibidosdeacuerdoconladocumentacinapropiada.
Presentacindetodoslosdetallesdedescripcineidentificacindeloscomponentesdelsistema,incluyendola
diagramasdeconexindeinstrumentos.
Lascopiasdecertificadodepruebadelusuarioydeclaracindeconformidad.
Lacalificacindeinstalacin(IQ)sehadiscutidoentodaslastcnicasdeinstrumentacinanaltica
deestecaptulocomorequisitosdeinstalacinmnimos.
6.1.3.OQOperacinCalificacin
LaOperacindeclasificacindebeserdocumentado,lacomprobacindequeelsistemacumpleconlaoperacin
especificaciones.Unsistemadeseguimientodebeserutilizadoparaverificarque:
Entrenamientooperativosedadespusdelainstalacinyantesdeiniciarlaoperacinderutinadeun
determinadoinstrumento.
Elcompromisodelusuarioseguirtodoslospasosnecesarios.
Laspruebasderendimientosellevanacabodeacuerdoconelfabricantedelinstrumentoconelfindeasegurar
elinstrumentoestencondicionesdefuncionamientoapropiadas.
6.1.4.PQRendimientoCalificacin
ElPQconsisteenlarealizacindeactividadesparacertificarquetodaslasespecificacionesdelinstrumentoestndeacuerdo
alosrequisitosdeuso.Estacalificacindebeserestrictoyhacerparticiparalaspruebasnecesariaspara
demostrarlafuncionalidaddelinstrumento.Debeincluirdetallescomo:
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Laspruebasespecficasdeloscomponentesindividualesoelsistemacomountodo.
Listadelaspruebas.
Frecuenciadelaspruebas.
Resultadosesperados.
Criteriodeaceptacin.
Cmosedocumentanpruebas.
Calificacinderequieredeunoperador.
Accionesatomarencasodefalladelaprueba.
Paraalgunastcnicasdeinstrumentacinanaltica,hayrutinasdefinidaseninternacionalmenteacreditada
literatura,talescomolaEP/BP(FarmacopeaEuropea),USP(FarmacopeadeEstadosUnidos)y
otros,elestablecimientodeparmetrosquedeterminarnparavalidarunsistemadeanlisisparaserutilizadoporelusuario.
Sonmuchasvecesrealizadasporlosinstrumentosanalticosfabricantes.
Cubrimosprocedimientosnormalmenteutilizadosparaelcontroldelaactuacindelaprincipalanaltica
Tcnicasdeinstrumentaciny,ensucaso,lacalificacindedesempeoprincipal(PQ)rutinas
descritoenlaliteraturainternacional.
6.2.Ultravioletavisibleespectrofotometra(UVVIS)
Alcomprobarelrendimiento(Operacindeclasificacin)deuninstrumentoanaltico,laprimera
pasoadaresunmantenimientopreventivoconelobjetivodecomprobarelestadodefuncionamientodelinstrumentoen
avanzar,preveniryrepararcualquierposiblefallo.
6.2.1.Elmantenimientopreventivo
MantenimientopreventivodeunespectrofotmetroUVVisescrucialparalavidadelinstrumentoydebe
llevaracaboenintervalosde6meses.Estemantenimientotienequeincluiractividadesespecficasllevadasacabopor
unexperto.Unarutinademantenimientopreventivodebeincluir:
Comprobacindeloselementosdeseguridaddelinstrumento.
Lainspeccindeloscompartimentosdelamuestra.
Comprobacindelastapasylossensoresdeproteccin.
Comprobacindelsistemaptico.
Comprobacinylimpiezadelapticaexterna.
Realizacindepruebasderendimiento:precisindelongituddeondaylaprecisin,correccindelneadebasey
ruidofotomtrico.
Verificacindelascondicioneslmparasyalineacin.
Comprobacinelectrnico.
Comprobacindelosdiagnsticosinternosdelinstrumento.
Laalimentacindelafuenteylacomprobacindelaredelctrica.
Comprobacindecablesyconectores.
Limpiezadecircuitoselectrnicosyeluso,lacorrosinyfallas.
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Comprobacindelaspiezasmecnicas.
Motoresdepruebadentrodelinstrumento.
Comprobacindelfuncionamientoylacomunicacinconlosaccesorios.
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6.2.2.OperacinCualificacin(OQ)
ElOQdeunespectrofotmetroultravioletavisiblequeconsisteenlacomprobacindelossiguientes:
Precisindelongituddeonda
Desviacindelneadebase
ruidofotomtrico.
6.2.3.CalificacindelDesempeo(PQ)
AlgunasdelasrutinasdePQquesepuedenutilizarconlosespectrofotmetrosUVVisysedefinenenlaEP
yUSPsedescribenacontinuacin.
6.2.3.1.Farmacopeaeuropea
LaspruebasacontinuacinseenumeranenlaFarmacopeaEuropeaylaFarmacopeaBritnica(EP/BP)para
elprocesodevalidacindeinstrumentos,quesedivideen:
Laslongitudesdeondadeprecisin.Laspruebasconelobjetivodecomprobarlaprecisindeposicionamientodelongituddeondaconelfinde
asegurarbajadesviacindelaposicindelsistemaptico.EP/BPrecomiendadosrutinaspara
comprobaresteartculo:
Eldeuterio,elxennyelmtododeemisindemercurioline.
Mtododepercloratodeholmio.
Resolucinmonocromador.Pruebaparaverificarsilosseparamonocromadorinstrumento
laluzdeespectroyenvaunapequeacantidaddeestaluzatravsdeloscompartimentosdemuestra.
Estapruebasellevaacaboutilizandoelmtododetolueno/hexano.
Straylight.Straylightsedefinecomolacantidaddeluzquellegaaldetectordelongituddeondacuandonohay
hasidoseleccionado.LaluzparsitaprovocadesviacionesenlaLeydeBeerLambert,reduciendoasla
linealidaddelsistema.Estapruebaserealizabymeasuringlatransmitanciapasaatravsdeunasolucin
Acontinuacin,lamismalecturaserealizaconlafuentedeapagado.ElmtodoutilizadoesKCla200nm.
precisinfotomtrica.Laprecisinfotomtricasedeterminamidiendolaabsorbanciaconocida
valoresycalculandoladiferenciaentreelvaloresperadoyelvalorrealmedido
porelinstrumento.Elmtodoutilizadoeseldicromatodepotasio.
6.2.3.2.FarmacopeadeEstadosUnidos
LaspruebasacontinuacinseenumeranenlaFarmacopeadelosEstadosUnidos(USP)paraelprocesodevalidacinde
instrumentos,quesedividenen:
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Laspruebasconelobjetivodecomprobarlaprecisindeposicionamientodelongituddeondaconelfindeasegurarlabajadesviacinde
elposicionamientosistemaptico.USPrecomiendadosrutinasparaelcontroldeesteartculo:
Eldeuterio,elxennyelmtododeemisindemercurioline.
Mtododepercloratodeholmio.
precisinfotomtrica.Laprecisinfotomtricasedeterminamidiendolaabsorbanciaconocida
valoresycalculandoladiferenciaentreelvaloresperadoyelvalorrealmedido
porelinstrumento.Losmtodosutilizadosincluyen:
Mtododedicromatodepotasio.
MtododefiltroNIST.
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6.3.LacromatografadegasesGC
6.3.1.GCmantenimientopreventivo
Antesdelaetapadeoperacindecalificacin(OQ)deunGC,esnecesarioseguirelPreventivo
Losprocedimientosdemantenimientorecomendadoporelfabricante.
EnunaCromatografaGasSystem,larutinademantenimientopreventivoincluyen:
Limpiezayrevisindefugasdelsistemaneumtico
Loscircuitoselectrnicosdelimpiezayverificacindelastensionesutilizadas
Sistemasdeventilacindelimpiezayverificacinfuncionalidad
Inyector(s)yeldetector(s)delimpieza,controldefugasyvoltajesutilizados
Detectoresderespuestaquecontrolalaprueba.
6.3.2.Operacincalificacin
LaOperacinCualificacindeunsistemadecromatografadegasesqueconsisteenlaverificacindelossiguientes:
Controldegasportadorylosflujosdegasyauxiliares
Controldelatemperaturadelinyector(s),Detector(s)yhornodecolumna
Detector(s)derepeticindelaseal
repetibilidadautomticodemuestras,ensucaso
Losclculosrealizadosporelsistemadedatos.
6.3.2.1.Flujosdecontrol
Elpropsitodeestacomprobacineslarepetibilidaddelostiemposderetencincompuestosanalizados,
repetibilidaddelvolumendelamuestraintroducidaenlacolumnacromatogrfica,encasode"split"
inyectoresylarepetibilidaddelarespuestadeldetector.Porlogeneral,cromatgrafossepuedenproporcionar
concontroladoreselectrnicosdeflujo(EFC)ocontroladoresmanuales.
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Losmaterialesnecesariosparaestaverificacinenamboscasosincluyen:
Medidordeflujodigitalcalibrado
Referenciaocolumnadecromatografapruebaespecfica.
Ademsdelflujodegasportadorquepasaatravsdelacolumna,lacomprobacindecontroldeflujodebe
tambinincluireltabiquepurgarlosflujos,latasadedivisinenelcasodeun"split/splitless"inyector,la
Flujo"maquillaje"ylosflujosauxiliaresdeldetector,elhidrgenoyelaireencasodeundetectorFID.
Estaspruebasserealizannormalmentebajociertascondicionesdefinidaspreviamenteendocumentado
procedimientos.
6.3.2.2.Controldelastemperaturas
Elhornodecolumnaseslapartemsimportanteeinterfiereconunanlisiscromatogrficopequeo
fluctuacionesdelatemperaturadelhornopuederesultarenvariacionessignificativasdeltiempoderetenciny,
comoconsecuencia,afectaralarepetibilidadanaltica.
Losmaterialesnecesariosparaestaverificacinincluyen:
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calibradasMetrosTemperatura:
Referenciaocolumnadecromatografapruebaespecfica
muestraestndardereferencia.
Elinyector(s)yeldetector(s)temperaturasdefuncionamientosecompruebanutilizandomedidoresdetemperaturaen
Ademsdelacomprobacindelatemperatura,lascolumnashornoestnsujetosalaretencindetiempoderepeticin
pruebasbajocondicionesestablecidaspreviamenteymuestradereferencia.
6.3.2.3.Detector(s)precisindelaseal
EstacomprobacintienecomoobjetivoevaluarlarepetibilidaddetectorSinembargo,enlamayoradelosprocedimientosseguidos,
estopuedeserusadocomolacomprobacindelarepetibilidaddelsistemacomountodo.
Losmaterialesnecesariosparaestaverificacinincluyen:
Referenciaocolumnadecromatografapruebaespecfica
muestraestndardereferencia.
Estacomprobacinsueletenerlugarbajounaciertacondicinanalticamedianteconsecutivo
inyeccionesdeunamuestrapatrndereferencia.Elobjetivoescalcularladesviacinestndarrelativa
comoporcentajedeestasreasdemuestreoestndar.
6.3.2.4.Precisinautomticasampler
Muestreadoresautomticossecompruebanenlasmismascondicionesdelosdetectoresdesealrepetibilidad
comprobacinPorlotanto,losresultadosobtenidoscomoRSD%delosvaloresdereaseutilizandosveces.
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6.3.2.5.Clculosrealizadosporelsistemadedatos
Comprobacioneshechasgeneralmenteensistemasdedatosserefierenalosclculosutilizadosenlaestacindetrabajoeincluir:
ClculoTiemposderetencin
reascuentaclculo
ClculoTimeEvents
ClculodelascurvasdecalibracinCoeficientesparaExternoyNormalizacinInterna
SehacorregidoelclculodelreaNormalizaciones.
Estascomprobacionessehacengeneralmenteporlosarchivosprotegidossuministradosporelfabricantedelsistemadedatos
cuandoseutilizan,estosarchivospermitencomprobarsilosclculosestnenconformidadconlosresultadosdefinidos
enlosarchivosdereferencia.
Unavezquelaoperacindeclasificacindeunsistemadecromatografadegasessecompleta,todoslosregistros
debeseralmacenadoenunlugardefcilacceso.
Losfabricantessuelenproporcionarmanualescontodaladocumentacindecumplimientodela
chromatographysystem,incluyendolainformacinparaeldiseoydesarrollodelsistemadeclasificacin
(DQ),cualificacindelainstalacin(IQ)quedebecontenerinformacinsobrequsistemaseinstal
ylaOperacindeCalificacin(OQ),incluyendotodoslosprocedimientosaseguiryelalmacenamientode
revisindelosregistros.Porlotanto,todaslasintervencionesdebenserevidenciadasenesteManual,queseutilizacomounsistema
defondo.
6.4.CromatografadelquidosHPLC
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6.4.1.HPLCMantenimientopreventivo
AntesdeiniciarelprocesodesistemaHPLCcalificacindeoperacin(OQ),esnecesarioseguir
losprocedimientosdemantenimientopreventivorecomendadoporelfabricante.
EnunsistemadeHPLC,larutinademantenimientopreventivoincluyen:
Electrnica:lalimpiezadelasparteselectrnicasycomprobacindealimentacinytensionesinternas,comprobarel
funcionalidadylmparasDetectores'evaluarsuvida.
Hidrulica:Lalimpiezadelastuberasycomponentesdesistemasneumticos,comprobaryeliminarcualquier
posiblelamicrofiltracinyelreemplazoocasionaldelasjuntasylosfiltrosdelafasemvily
bomba,compruebelafuncionalidadtransductordepresinyelsistemadepulsosdeamortiguacinensucaso,
limpiezaycomprobacindelafuncionalidaddelsistemadeintroduccindemuestras.
Mecnica:Limpiezaylubricacindelaspiezasmecnicasdelsistemadebombeomuestreadorautomtico.
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ElprocesodecalificacindeoperacinmostracontinuacinserepresentaesquemticamenteenlaFigura1:
ADetector
Nivelderuidoydesviacindelneadebase
Detectordelinealidad(opcional)
Detectordesealdeprecisin(opcional).
BCalificacindelabomba
Precisindeflujo
Rampaypruebadecadadepresin
MezcladedegradadoPrecisin
LinealidadMezcladedegradado(opcional).
CColumnasHornodeCualificacin
Precisindelatemperatura
DAutomticoInyectorCalificacin
PrecisinVolumendeinyeccin
Volumendeinyeccindeprecisin(opcional)
Lalinealidaddelainyeccin(opcional).
EDatosdelSistemadeClasificacin
Clculodelaretencinveces,reas
contarycurvasdecalibracincoeficientes.
Figura1.VistaesquemticadelprocedimientodecomprobacinderendimientodeunsistemadeHPLC.
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ComosistemaHPLCsehacegeneralmentedevariosmdulos,cadamdulodebeestarsujetoala
Operacindeclasificacin.Deestamanera,secompletarelprocesodevalidacincuandoelrendimiento
SellevaacabodeCalificacin(PQ).PQdebesiemprellevacaboutilizandoelsistemaHPLCcompleta
enlasactividadesqueconfirmaquetodaslasespecificacionesdeinstrumentoscumplenconlosrequisitosdeuso.
6.4.2.1.CualificacinDetector
Losparmetrosmsimportantesquedebenverificarseenundetectordeabsorbanciason:
Elpropsitodeestapruebaescomprobarlaexactitudlahoradeseleccionarunalongituddeondaafindeasegurar
lowpositioningdesviacindelareddedifraccinsistemaptico
Elmtododeemisindedeuterioodexennlinesepuedeutilizar(tantoconsiderarsecomolanormanatural)
yelusodeunestndarsustanciacromofricocertificada
Nivelderuidoydesviacindelneadebase
Esteensayotieneporobjetoasegurarlaespecificacindelasensibilidaddeldetector,yaqueestosfactoresestndirectamente
relacionadaconestamedida.Elmtododesupervisindelneadebaseylamedicinsepuedeutilizaren
intervalosdetiempoestablecidosylaverificacindelosvaloresestndar.
6.4.2.2.Calificacindelabomba
6.4.2.2.1.Exactitudflujodelafasemvil
Esteensayotieneporobjetoasegurarqueelflujoprogramadoeselflujodeoperacindelabombareal.Puede
determinarsemidiendo(volumtricamente)elflujobombeadoenunciertoperododetiempo.
6.4.2.2.2.Pruebaderampaylacadadepresin
Elensayodelarampacompruebalasvlvulasdeentradaydesalida,fugasdeconexinylacapacidaddelabombade
operaraaltapresin.
6.4.2.2.3.ExactitudmezclaGradiente
Elpropsitodeestapruebaescomprobarlaexactituddelacomposicinestticaydinmicademvil
mezclasdefaseduranteunanlisisensistemasdegradiente.
Lapruebadebombeodedosfasesmvilesendiferentesproporcionesatravsdetemposepuedeutilizaryverificacin
lacomposicinrealestablecida.
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6.4.2.3.Columnasdecalificacinhorno
6.4.2.3.1.Precisindelatemperaturadelhorno
Conelfindecomprobarlaexactituddelatemperaturadelhorno,sepuedeutilizarelmtodode
laprogramacindeunatemperaturadelhornoymedirutilizandountermmetroelectrnicocalibrado
quetieneunapuntaflexiblequepuedeseradaptadaalalongitudinteriordelhorno.
6.4.2.4.Laclasificacinautomticademuestras
6.4.2.4.1.Precisinautomticasampler
Afindeasegurarlaprecisinespecificadadelmuestreadorautomtico,sepuedeusarlapruebadeinyectar
muestrassucesivasdeunasolucinestndar,obteniendoaslaRSD%entrelasreasdelospicosun
Serecomiendavalorpordebajode1%.
6.4.2.5.Sistemadedatos
ElSistemadeClasificacindeDatosparaHPLCdebellevarseacabodeacuerdoconlosmismosprocedimientosdeGC.
Unavezquelaoperacindeclasificacindeunsistemadecromatografadegasessecompleta,todoslosregistros
deberatiendasenunlugarfcilmenteaccesible.
6.5.Sistemasdecromatografaconectadosadetectoresdemasas
6.5.1.Sistemasdedeteccindemasasdemantenimientopreventivo
Amedidaquelossistemasanteriores,elmantenimientopreventivodelossistemasdetectoresdemasasdebeserhechoantes
elprocesodecalificacindeoperacin(OQ).
Cadafabricanteofreceunalistadecomprobacindelequipoencuestin.Estalistadecontroldeberaser
solicitadoyterminadoentodaslasintervencionesdemantenimientopreventivo.
Loselementosquesecomprobarnenunmantenimientopreventivosedividenbsicamenteentresmdulos:
Sistemadevaco
detectordemasas
Chromatographer.
6.5.1.1.Lossistemasdevaco
Elsistemadevacoescrticoparaelbuenfuncionamientodecualquiersistemadeespectrometrademasasy,porlotanto,
serequierenmantenimientosregulares.Estosmantenimientossedebenregistrarenelequipo
fondooperacin.
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Loselementosseleccionadosenunsistemadevacoson:
Comprobacinysustitucindelosfluidoslubricantesbombas(bombasdevacoauxiliaryalto)
Lasmanguerasdechequesydelasconexionesdevaco
Medicinyregistrodelecturasdealtovacoyprevacosobreunabaseregular.
6.5.1.2.Detectordemasas
Losdetectoresdemasascuentanconunprogramadesintonizacinautomticaoautocalibracinqueseutilizarpara
laevaluacindelascondicionesdeoperacindelequipo.Esteprogramasueleproduciruninform(aser
presentada)esteinformeseutilizarparaelseguimientodelrendimiento,ascomoidentificarlasfallasprematuramente,
porejemplo,lanecesidaddelalimpiezadelafuentedeiones.Serecomiendaqueestosinformessepresentanen
menosunavezporsemana,semantuvoduranteelperododelacomprobacinderendimiento.
Loselementosobservadosenesteinformeson:precisinenmasa,resolucinpicosylarespuestaenfuncindela
lamasa.
LafuentedeionessedebelimpiarsiemprequeseanecesarioSinembargo,unafrecuenciadelimpiezamnimo
debenadoptarseydependerdecmoseestutilizandoelequipo(tipodemuestra,nmerode
muestras,etc).
6.5.1.3.Chromatographer
Elmantenimientopreventivocromatgrafodebesersimultneaconeldetectordemasas.Este
procedimientosedescribeenloscaptuloscorrespondientes(GCoHPLC).
LaOperacindeclasificacinesfundamentalparaasegurarelequipoestoperandodeacuerdoconla
especificacionesdelfabricantey,porlotanto,aintervalosregulares.Losfabricantesrecomiendanel
calificacindeoperacinporlomenosunavezalaoodespusdeunagranintervencindereparacin.Elexpertoencargado
dequelaintervencintendrmediospararecomendarsiunacalificacindelaoperacindespusdela
Serequierereparacin.Estaevaluacindebeserdocumentado.
Lostemsevaluadosenunacalificacindelaoperacinincluyen:
Precisindelinyector
linealidaddelinyector
Pruebadecontaminacindeunamuestraa(carryover)
linealidaddeldetector(opcional)
Precisindelamisa
Sensibilidad.
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6.5.2.1.PrecisinInyector
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Estapruebasellevaacabomediantelainyeccindevariaspartesalcuotasdeunestndarconocidoymediantelaverificacindelazona
reproducibilidady/oaltura.Deseisadiezmedicionessonrealizadasyladesviacinestndarrelativa
calculada(debeestardentrodelosestndarespredeterminados).
6.5.2.2.Linealidaddelinyector
Duranteestaprueba,seinyectavariasalcuotasdeunestndarconunaconcentracinconocidala
volumeninyectadotambinsevari.Entonces,lalinealidadcomounafuncindelvolumeninyectadoser
analizadosutilizandounacurvadecalibracin.Unfactordecorrelacinseutilizaparaevaluarlaprueba.Losresultadosson
acontinuacin,encomparacinconlosvaloresdeaceptacinpredeterminado.
6.5.2.3.Continuar
El"arrastre"depruebaocontaminacindemuestraamuestrasellevaacabomediantelainyeccindeunalto
estndardeconcentracinyelresultadoonly.Theentoncessolventeesptimocuandonoquedenresiduosdelaanteriormente
sedetectaestndarinyectadodurantelainyeccindedisolvente.Loslmitesseestablecengeneralmentecomomsbajo
oigualaunaciertareaoaltura.
6.5.2.4.Linealidaddeldetector
Undetectordemasasseconvierteennolinealcuandoelaumentodeconcentracindelamuestranoconduceauna
aumentoproporcionalenlaformacinydeteccindeiones.
Lapruebasellevaacabomediantelaelaboracindiferentesconcentracionesytrazarelresultadoenunacalibracin
curva.Elfactordecorrelacinesevaluadoporcomparacinconlosresultadosdeaceptacinpredeterminado.
6.5.2.5.ExactitudMisa
Laexactituddelamasaseevalamediantelainyeccindeunestndarconocido,yaseausandolaautocalibracin
sistemaoelinyectordemuestras.
Losresultadosseevalanmediantelacomparacindelamasaobtenidautilizandoelequipoalaseleccionada
valortericoestndar.Cadafabricanteharecomendadonormasycriteriosdeaceptacin
paraestaprueba.
6.5.2.6.Sensibilidad
Lapruebasellevaacabomediantelainyeccindeunestndarconocidoyelcontroldelarelacinsealruidodelpico
especificadaenelcromatogramaobtenida.Cadaequipotienediferentesvaloresdeaprobacindeesta
prueba.
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7.Referencias
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ApostiladoCursodeespectrofotometradeUVVis,VarianBrasil(1998).
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