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Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA

MANUAL DE MICROBIOLOGIA
CLNICA PARA O CONTROLE
DE INFECO RELACIONADA
ASSISTNCIA SADE
Mdulo 8: Deteco e identificao dos
fungos de importncia mdica

Copyright 2012 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.


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1 edio 2010
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Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES


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Reviso tcnica Anvisa:


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Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS


Magda Machado de Miranda

Projeto Grfico e Diagramao


All Type Assessoria Editorial Ltda

Coordenao Tcnica:
Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa
Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP

Ficha Catalogrfica
Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
Manual de Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo
8: Deteco e identificao de fungos de importncia mdica /Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013.
47p..: il.9 volumes
ISBN
1. Infeco Hospitalar Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia
Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.

Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica. . . . . . . . . . . . 7
1.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.1 Fungos e infeco hospitalar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.1 Recomendaes gerais de coleta e transporte de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3 Processamento de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3.1 Exame microscpico de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.3.2 Exame microscpico direto com hidrxido de potssio (KOH) a 20%. . . . . . . 17
1.3.3 Exame microscpico direto com tinta nanquim (tinta da China) . . . . . . . . . . . 17
1.3.4 Exame microscpico com colorao pelo mtodo de Gram. . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.3.5 Exame microscpico com colorao pantica (Giemsa, Leishman
ou Wright). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.3.6 Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos. . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.7 Meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.8 Procedimentos para cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.4 Identificao de fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4.1 Identificao de leveduras (morfolgica e bioqumica). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.4.2 Prova do tubo germinativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.4.3 Cultivo em lmina para prova de filamentao e produo de
clamidsporo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.4.4 Prova da urease. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.4.5 Prova de assimilao de fontes de carbono e nitrognio ou
auxanograma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.4.6 Fermentao de acares ou zimograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.4.7 Mtodos comerciais para identificao de leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.4.8 Identificao de fungos filamentosos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.4.9 Tcnica de microcultivo para fungos filamentosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.4.10 Identificao de fungos dimrficos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.5.1 Micoses superficiais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.5.2 Micoses subcutneas e profundas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.5.3 Micoses oportunistas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.6 Corantes e meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Corante Azul de lactofenol-algodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.7 Glossrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.8 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do
tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos
pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a
disseminao da resistncia microbiana.
Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar,
atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos
que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os
laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre
a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados
rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma
educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade.
Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos
Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia
Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com
um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber:
Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios
de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao
de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias
de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais.
A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s
exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo
de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.

OPAS/OMS Anvisa/MS 5

Captulo 1:
Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Anglica Zaninelli Schreiber


Farmacutica - Profa. Dra .do Departamento de Patologia Clnica
Responsvel pelo Laboratrio de Investigao em Fungos - Faculdade de Cincias
Mdicas da UNICAMP
Diviso de Patologia Clnica - Setor de Micologia do
Laboratrio de Microbiologia - HC-UNICAMP

Claudia Maria Leite Maffei


Mdica - Profa. Dra. do Departamento de Biologia Celular
e Molecular e Bioagentes Patognicos
Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo
Laboratrio de Micologia Mdica do Hospital das Clnicas de Ribeiro Preto

Marcia de Souza Carvalho Melhem


Farmacutica Bioqumica , Pesquisadora Cientfica do Instituto Adolfo Lutz
Docente do Programa de Ps-Graduao em Cincias
da Coordenadoria de Controle de Doenas
Secretaria Estadual da Sade de So Paulo

Coordenao do Captulo
Carlos Emilio Levy
Mdico - Prof. Dr. do Departamento de Patologia Clinica
Fac. Cincias Mdicas da UNICAMP
Diviso de Patologia Clnica - Setor de Bacteriologia - Hospital das Clnicas da UNICAMP

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.1 Introduo
1.1.1

Fungos e infeco hospitalar


Os avanos da medicina que permitem a sobrevida de pacientes crticos e
imunocomprometidos, uso de antimicrobianos de amplo espectro, implementao das tcnicas de transplantes de rgos slidos e de medula ssea
so alguns dos fatores que tm transformado a rotina diagnstica dos laboratrios de microbiologia e micologia. Antes preocupados apenas com a
deteco de patgenos fngicos clssicos (Quadro 1), hoje se deparam cada
vez mais com a visualizao e isolamento de fungos considerados saprfitas,
oportunistas e potencialmente patognicos, com a difcil tarefa de identific-los e, em conjunto com o clnico, valorizar ou no esse achado no material
clnico coletado.

Quadro 1 Principais infeces micticas que acometem os seres humanos no Brasil


MICOSES
CLSSICAS
Superficiais
Pitirase versicolor
Cutneas
Dermatofitoses
Subcutneas
Cromomicose, esporotricose
Profundas
Paracoccidioidomicose, Histoplamose

OPORTUNISTAS
Superficiais
Candidases
Dermatomicoses
Invasivas
- Candidemia
- Criptococose
- Aspergilose
- Fusariose
- Zigomicoses
-Outras hialohifomicoses
- Feohifomicoses

Agentes como espcies de Aspergillus, Candida, Cryptococcus e zigomicetos,


considerados, anteriormente, como contaminantes ambientais e, portanto,
de pouca importncia clnica, so agora conhecidos agentes causais de enfermidades disseminadas, tais como as endocardites, infeces pulmonares,
ceratites, entre outras, em pacientes imunodeprimidos. Dessa forma, esses
fungos devem ser considerados, ao lado dos patgenos clssicos, como possveis agentes de quadros infecciosos.
Dentre as centenas de espcies descritas, leveduras do gnero Candida so
os importantes agentes de infeco hospitalar e representam um desafio
para a sobrevida de pacientes com doenas graves e aqueles em perodo
ps-operatrio. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilncia operante notificaram espcies de Candida como 6o patgeno nosocomial e a

8 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

4a causa mais comum de infeces de corrente sangunea, adquiridas em


hospitais.
Diferentes espcies de Candida podem causar quadros de fungemia, a saber:
Candida albicans, Candida glabrata (Torulopsis glabrata), Candida tropicalis;
Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii, Candida lusitaniae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na dcada de 90 um
estudo multicntrico e, por anlise univariada, concluram ser C. glabrata a
espcie associada maior taxa de mortalidade e que o bito estava relacionado com maior idade e severidade da doena de base do paciente.
A manifestao clnica mais comum nas candidases hospitalares febre. A
candidemia pode ser definida como a ocorrncia de duas ou mais culturas
positivas para a mesma espcie de Candida provenientes de amostras diferentes, coletadas aps 72 horas da admisso. A infeco invasiva por Candida spp pode ser tambm considerada quando seu isolamento ocorrer a
partir de material clnico estril, associado a, pelo menos, um outro sinal de
infeco. A sensibilidade da hemocultura para Candida spp baixa, aproximadamente 50% dos pacientes com infeco invasiva podem ter culturas
negativas. Alm disso, se houver infeco bacteriana concomitante, essa
pode diminuir a chance do isolamento da levedura.
Os fatores de risco reconhecidos para infeco invasiva por Candida spp so:

Permanncia > 4 dias em UTI


Antibitico-terapia de largo espectro
Cirurgia abdominal
Cateterizao venosa central
Nutrio parenteral total
Imunodepresso
ndice APACHE II > 10
Ventilao mecnica > 48h
Neutropenia
Quimioterapia citotxica

O gnero Candida , sem dvida, o mais importante, mas existem outras leveduras no ambiente hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosfrico e gua
quanto na pele e no trato gastrointestinal dos pacientes e funcionrios, que
podem causar quadros infecciosos. Os principais gneros so Pichia spp
(Hansenula spp), Rhodotorula spp e Trichosporon spp.

OPAS/OMS Anvisa/MS 9

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Em adio, fungos filamentosos presentes no ambiente hospitalar tambm


podem causar infeco em pacientes suscetveis. O gnero Aspergillus spp
(Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger) o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes submetidos a
transplante de medula ssea e neutropnicos. A inalao de esporos a via
mais comum de transmisso e os surtos de aspergilose podem ser associados a reformas e construes, dentro e ao redor de hospitais.
Doena pulmonar e, mais raramente, sinusite so as manifestaes de aspergilose. Outros gneros tais como: Fusarium sp, Acremonium sp, Penicillium sp,
outros hifomicetos como zigomicetos (Rhizopus sp, Mucor sp) e alguns feohifomicetos (fungos negros ou demcios), tambm dispersos no ar, so capazes de causar formas localizadas ou disseminadas de infeco hospitalar.
Diante dessas condies, recomenda-se monitorao com exames micolgicos de amostras biolgicas dos pacientes, tais como sangue, escarro, pontas
de catteres intravasculares, lquido peritoneal e urina. Culturas positivas podem significar apenas colonizao, mas podem conduzir doena invasiva
subsequente.
Estudo prospectivo em pacientes cirrgicos de UTI mostrou que 38% de 29
pacientes desenvolveram infeco aps colonizao. A colonizao pode ser
demonstrada por anlise de trs ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de locais diferentes, do mesmo paciente, em dias consecutivos.
Nesse mdulo, ser apresentada uma viso geral das principais infeces
fngicas, para que os microbiologistas possam adquirir certa habilidade
para identificar fungos isolados de amostras biolgicas. Para um estudo mais
completo sobre diagnstico de infeces fngicas, recomendam-se as referncias citadas ao final do captulo.
Caractersticas gerais dos fungos
Fungos so seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosfrico,
solo e gua e, embora sejam estimados em 250 mil espcies, menos de 150
foram descritos como patgenos aos seres humanos.
Os fungos de interesse mdico, agentes de micoses, apresentam-se sob dois
tipos morfolgicos: leveduras, prevalentemente unicelulares e bolores ou
fungos filamentosos, que so multicelulares (Figura 1). H ainda importantes agentes de micoses endmicas que, na dependncia principalmente da
temperatura, mas sob influncia tambm do teor de CO2 e condies nutri-

10 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

cionais, podem se apresentar sob ambas as formas sendo chamados fungos


dimrficos.
Figura 1

Estruturas microscpicas bsicas de fungos filamentosos (a, b, c) e leveduras (d, e).

Leveduras so fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente


perda do equilbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros
infecciosos com formas clnicas localizadas ou disseminadas. De modo contrrio, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, no fazem parte da
microbiota animal e, portanto o homem no um reservatrio importante
para esse grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro so as vias
areas superiores ou quebra na barreira epidrmica aps traumatismos com
objetos perfuro-cortantes.
As leveduras tm como estrutura primria, visvel ao microscpio tico a
partir de material clnico ou colnias em cultura, clulas que se reproduzem
por brotamento, nico ou mltiplo, em geral, de forma arredondada. Essas
clulas so esporos de origem assexual e so denominadas blastocondios.
Alguns gneros de leveduras menos importantes em micologia mdica, reproduzem-se por fisso. Sob determinadas condies, as leveduras podem
produzir pseudohifas (importantes para o processo de identificao presuntiva de espcies do gnero Candida) ou at mesmo hifas verdadeiras.
A macromorfologia das colnias de leveduras a partir de crescimento em
meios no diferenciais como gar sabouraud dextrose no permite a diferenciao de gneros. A exceo a colnia mucoide caracterstica do gOPAS/OMS Anvisa/MS 11

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

nero Cryptococcus. Assim, a identificao de leveduras realizada, principalmente, por caractersticas fisiolgicas.
Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte bsico a hifa,
que pode ser septada ou no septada (cenoctica), hialina (hifomicetos) ou
demcea (feo-hifomicetos). A partir da hifa formam-se esporos, para propagao das espcies. Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser
chamados de condios, pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas
ligadas a elas.
Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificao de
um fungo, pois a classificao de filamentosos feita, em geral, pela associao de caractersticas morfolgicas macroscpicas (cor, aspecto, textura da
colnia, produo de pigmento difusvel no meio, etc.), microscpicas (forma e cor da hifa, presena ou no de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.) e
de velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rpida).

1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras


O tipo e a qualidade da amostra biolgica, submetida ao laboratrio de micologia,
so fatores pr-analticos extremamente importantes para o sucesso do isolamento e
identificao do verdadeiro agente etiolgico de infeces fngicas.
Para tanto, a coleta do material biolgico, seu transporte e armazenamento adequados devem ser cuidadosamente considerados.
O correto diagnstico laboratorial micolgico tambm depende de outros aspectos
como:

experincia do profissional que vai executar o exame;


adequada comunicao entre os clnicos, vigilncia e laboratrio, essencial para
direcionamento do tipo de amostra e quantidade a ser coletada;
cuidados de coleta, frascos e meios utilizados para transporte e armazenamento
das amostras;
identificao correta das amostras, incluindo a identificao do paciente, data de
coleta, presuno de diagnstico, para auxiliar no direcionamento das anlises laboratoriais e tempo de resposta ao clnico pelo laboratrio.

1.2.1

Recomendaes gerais de coleta e transporte de amostras


A esterilizao e desinfeco dos materiais necessrios dever ser realizada previamente, conforme recomendaes especficas.

12 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Lavar as mos e sec-las.


As amostras devem ser identificadas com nome do paciente, nmero de
registro hospitalar (quando for o caso), tipo de amostra e data da coleta,
entre outras informaes adicionais para auxiliar o laboratrio no direcionamento dos exames.
Coletar a amostra biolgica aps antissepsia e coloc-la em recipiente estril e vedado, conforme orientao para pesquisa de agente, em quantidade suficiente (>2 mL ou 0,5 cm3 ou duplicada) e no perodo de coleta
apropriado, conforme especificao de agente em estudo, para permitir
todos os procedimentos laboratoriais necessrios.
Os swabs so usados para coleta apenas para realizao do exame cultura, de materiais tais como: ouvido, nasofaringe, orofaringe e boca. Esses
devem ser colocados em tubos contendo salina estril e devem ser transportados o mais rpido possvel e/ou conservados a 4C durante o prazo
de 8 a 10 horas, de modo a evitar a dessecao da amostra.
Os materiais ditos contaminados, tais como urina, fezes, pus, secrees de
feridas ou trato respiratrio, devem ser enviados, sob refrigerao a 4C,
ao laboratrio, o mais rpido possvel, at 18 horas.
Lquor e lquidos cavitrios devem ser coletados sob cuidados de antissepsia antes da puno e enviados em tubo estril selado hermeticamente e transportados o mais rpido possvel, para assegurar o diagnstico,
mantidos temperatura ambiente.
Sangue e material de puno de medula ssea so os nicos materiais
biolgicos que devem ser semeados diretamente, em frascos contendo
meio de cultura lquido ou bifsico (lquido sobre slido), de modo a evitar coagulao e consequente diminuio da sensibilidade do exame, o
transporte deve ser em temperatura ambiente, entretanto encaminhar o
mais rpido possvel ao laboratrio, uma vez que o processamento dessas
amostras deve ser realizado em, no mximo, 8 a 9 horas.

Recomendaes adicionais:
Sempre que possvel, coletar amostras antes do incio da terapia especfica e, particularmente, para leses cutneas de pele e unhas, orientar
o paciente para evitar uso de medicao tpica por 4 a 5 dias antes da
coleta de escamas.
A requisio mdica que acompanha a amostra deve conter, sempre que
possvel, as hipteses diagnsticas que auxiliaro o micologista na escolha da colorao e do meio de cultura mais adequado para o isolamento
do agente etiolgico suspeitado.
Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um
mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em 2 ou 3 dias consecutivos,
importante para a interpretao correta de resultados positivos para
OPAS/OMS Anvisa/MS 13

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

fungos considerados como saprfitas, ou seja, contaminantes do meio


ambiente, ou mesmo, constituinte da microbiota normal do paciente.
Nesses pacientes, os fungos saprfitas podem se tornar oportunistas e
comportarem-se como patgenos.
Quadro 2 Procedimentos para coleta de amostras
Material Clnico

Procedimento de coleta

Escarro

Recolher, de preferncia, a primeira expectorao da manh, aps gargarejo


com gua limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. No deve
conter saliva.

Aspirado gstrico

Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gstrico, atravs de sonda nasogstrica,


pela manh, em jejum.

Aspirado traqueal e
secreo obtida por
broncoscopia

Procedimento realizado por mdico treinado. O material colhido deve ser


colocado em recipiente estril.

Sangue e aspirado de
medula ssea

Fazer antissepsia rigorosa no local da puno e coletar cerca de 5 a 6 ml de


sangue venoso, que dever ser injetado diretamente em frasco contendo
meio de cultura (ver detalhes no prximo tem). A ltima gota de material
deve ser distendida em uma lmina de microscopia, para colorao de
Giemsa.

Lquor

Fazer antissepsia rigorosa no local da puno. Coletar 2 ml ou mais, para


exame microscpico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar
devem ser usados na seguinte sequncia: 1a exame bioqumico, 2a exame
de celularidade, 3a microbiolgico, reduzindo assim a possibilidade de
isolamento de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em
tubos especficos para cada um desses exames aumenta a sensibilidade do
exame micolgico e, por isso, deve ser recomendada.

Tecido obtido por


bipsia, necropsia e
peas operatrias

Colher assepticamente, utilizando instrumentos estreis e colocar o material


em recipiente estril, com salina. No adicionar nenhum lquido fixador.

Urina

A amostra biolgica mais apropriada para o diagnstico de micose do trato


urinrio obtida por sondagem ou citoscopia. Quando no for possvel, e
para evitar contaminao com microrganismos presentes nas reas vizinhas,
fazer limpeza prvia da regio perineal com gua e sabo, desprezar o
primeiro jato de urina da manh, e colher 3 a 5 ml de urina em frasco estril.
Colees de 24 horas no tm valor para diagnstico micolgico.

Fezes

Fazer lavagem prvia da regio anal com gua e sabo, coletar pores de
fezes em recipiente estril com tampa ou swab anal, mergulhar o swab em
salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.

Secreo de conduto
auditivo externo

Colher material por curetagem da leso ou com swab estril. Mergulhar o


swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.

Material de Micose ocular

O melhor mtodo para recuperao de fungos requer raspado de crnea,


aspirao de lquido intra-ocular ou bipsia. A coleta com auxlio de swab no
indicada em local de drenagem.

Leso de nariz e seios


paranasais

Coletar secreo, material necrtico ou tecido obtido por bipsia em


recipiente estril.

14 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Material Clnico

Procedimento de coleta

Mucosa oral e orofaringe

Coletar com swab estril o material de leso de mucosa jugal, papilas linguais
ou regio tonsilar. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o
tubo ao laboratrio.

Secreo vaginal

Com auxlio de espculo, coletar material da leso ou do fundo de saco


vaginal com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e
enviar o tubo ao laboratrio.

Lquidos corporais
(pleural, asctico,
pericrdico e sinovial)

Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar cerca de 5 a 10mL de


lquido em tubo de ensaio estril.

Pus e material de
abscesso

Devem ser colhidos de preferncia, por aspirao de abscessos fechados,


com seringa e agulha estril. Se a leso for aberta, limpar o local com
gaze esterilizada embebida em salina estril, para eliminar os exsudatos
superficiais que so altamente contaminados com bactrias. A seguir, colher
o material com swab. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar
o tubo ao laboratrio.

Pele e pelos

Se possvel, descontaminar a pele com lcool 70% antes da coleta. Raspar


com lmina de bisturi as escamas cutneas da borda das leses. Pode-se
utilizar tambm uma lmina de microscopia. Colocar o material entre duas
lminas limpas, de preferncia esterilizadas, vedando-se as bordas das
lminas com fita adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados,
devem ser retirados com pina estril e acondicionados entre lminas ou em
potes, de preferncia esterilizados.

Unhas

Fazer limpeza prvia das unhas escovando com gua e sabo. Cortar com
tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lmina de bisturi,
raspar as reas mais profundas e pulverulentas. Colocar esse material entre
lminas e ved-las com fita adesiva.

1.3 Processamento de amostras


O sucesso na visualizao e isolamento do agente etiolgico depende, alm da coleta, transporte, conservao e armazenamento adequados e volume suficiente da
amostra, de seu processamento correto antes do exame micolgico. As seguintes recomendaes devem ser cuidadosamente seguidas para boa resoluo diagnstica:

Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame microscpico direto e cultura, pois para exame so clarificadas com soluo aquosa
de KOH a 20% e, para cultura, no podem sofrer nenhum tratamento prvio, sendo
por isso, inoculadas diretamente na superfcie do meio de cultura.
Lquor, secrees e fludos corporais como lquido pleural, asctico, sinovial, pericrdico, aspirado transtraqueal, lavado gstrico e broncoalveolar (BAL) devem
ser concentrados por centrifugao (1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com swabs devem ser eludos em soluo salina e tambm devem

OPAS/OMS Anvisa/MS 15

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

ser centrifugados. O sedimento obtido o material adequado para o exame microscpico e semeadura em meios de cultura.
Para urina, recomendvel que uma alquota (ala calibrada) seja semeada, por
esgotamento, sobre o meio de cultura distribudo em placa de Petri, para exame
quantitativo, pela contagem de unidades formadoras de colnias (UFC). A outra
alquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm por 10 minutos) e o sedimento
ser utilizado para exame microscpico e nova semeadura em tubo (cultura qualitativa).
Escarro pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzima
dissolvidas em 1 L de soluo-tampo citrato ou soluo fisiolgica), que fluidifica
e facilita a manipulao da amostra e formao de sedimento aps centrifugao. Porm, no foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperao de
fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se utilizar, como alternativa,
para digesto da amostra, soluo de KOH 20%. A poro purulenta da amostra
prefervel e pores liquefeitas no so adequadas para isolamento do agente. A poro da amostra tratada com KOH, porm, s pode ser usada para exame
microscpico, pois a potassa destri, aps algumas horas, as estruturas do fungo,
inviabilizando seu isolamento em meio de cultura. Nesse caso, outra poro da
amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura.
Tecidos obtidos por bipsia requerem fragmentao, com o auxlio de um bisturi
estril ou macerao (gnglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de
uma placa de Petri estril. Esse procedimento visa aumentar a rea de superfcie e
expor o microrganismo ligado ao tecido, ao maior contato com o meio de cultura.
Sangue e aspirado de medula ssea no necessitam preparao, sendo que o
exame microscpico tem baixa sensibilidade e, portanto, a cultura importante
para identificao do agente. Para cultura, as amostras so semeadas imediatamente, aps a coleta, em frascos contendo meio de cultura. O meio pode ser bifsico (15 ml de gar inclinado sob 50 ml de caldo) composto de infuso de crebro-corao (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para lise e posterior centrifugao da amostra so indicados. Na prtica, frascos para hemocultura
bacteriolgica (simples ou automatizada) proporcionam isolamento adequado de
fungos, desde que respeitados os perodos necessrios ao seu desenvolvimento.
Para fungos dimrficos, de crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram
o mtodo de lise-centrifugao o mais sensvel. Sangue e medula ssea no devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois essa substncia se combina
com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do exame. Um
dos procedimentos recomendados a inoculao de 5 a 6 ml da amostra no frasco
com meio bifsico sendo uma parte para 10 partes do meio lquido, que deve ser
ento incubado temperatura de 30C.

16 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

1.3.1

Exame microscpico de amostras


Na dependncia do material clnico, a observao de um fungo na amostra
biolgica tem grande valor diagnstico, pois demonstra sua presena no tecido e permite uma informao imediata ao mdico, a qual pode ser crucial
para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biolgica for insuficiente para o exame microscpico e cultura
do material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exame microscpico, por ser mais especfico e, em muitos casos, mais sensvel.
O exame microscpico da amostra realizado por vrias tcnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita clnica.

1.3.2

Exame microscpico direto com hidrxido de potssio (KOH) a 20%


Tcnica utilizada para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por bipsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Colocar uma gota de KOH
(aquoso a 20%) em uma lmina de microscopia e sobre essa uma poro
da amostra a ser examinada. Cobrir a preparao com uma lamnula e, para
intensificar a clarificao, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico
de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examinar a preparao aps 20 minutos, em microscpio ptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x,
seguida de 40x.

1.3.3

Exame microscpico direto com tinta nanquim (tinta da China)


Utilizado em amostras de lquor, urina, secrees ou exsudatos, para visualizao de leveduras capsuladas do gnero Cryptococcus, que se tornam mais
evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. Colocar uma gota
de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada sobre
uma lmina. Cobrir a preparao com lamnula e observar ao microscpio
ptico (objetivas de 10x e 40 x). Nessa tcnica, um erro bastante frequente
confundir linfcitos com clulas de leveduras. A diferenciao feita pela
refringncia da parede celular e das incluses no citoplasma das leveduras,
alm da presena de brotamentos (Figura 2).

OPAS/OMS Anvisa/MS 17

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Figura 2

Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cpsula polissacardica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim

1.3.4

Exame microscpico com colorao pelo mtodo de Gram


Todos os fungos so Gram-positivos, assim a utilizao da colorao no visa
a diferenciao dos microrganismos, mas possibilita discriminar elementos
fngicos de artefatos existentes em urina, secrees e fezes. A amostra espalhada de modo homogneo, em movimentos circulares, em uma lmina
de microscopia, fixada com calor e submetida colorao.

1.3.5

Exame microscpico com colorao pantica (Giemsa, Leishman ou


Wright)
Essas coloraes so usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em
diversas amostras biolgicas: medula ssea, sangue, aspirados e secreo
cutnea. Nesses casos, faz-se um esfregao semelhante ao usado para colorao de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o mtodo escolhido.
Podem ser usadas ainda para corar imprints de tecidos obtidos por bipsia.
A seguir esto esquematizados os principais aspectos morfolgicos observados ao exame microscpico e os possveis agentes etiolgicos de acordo
com a amostra biolgica.

18 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Quadro 3 Interpretao de aspectos morfolgicos encontrados em exames microscpicos


de amostras biolgicas
Amostra Biolgica

Aspecto Morfolgico

Interpretao

Pelos

a. Hifas hialinas e/ou artrosporos(1)

a. Dermatfitos

Unhas, escamas de
pele

a. Hifas regulares, septadas,


ramificadas, hialinas,
artrosporadas(1)

a. Dermatfitos

b. Leveduras e pseudo-hifas

b. Candida spp

c. Grupo de leveduras e/ou pequenas


hifas tortuosas, hialinas(1)

c. Malassezia sp

Lquor

a. Levedura capsulada(2)

a. Cryptococcus sp

Secreo vaginal

a. Levedura e pseudo-hifa

a. Candida spp

Secrees (trato
respiratrio, nasal, oral,
naso-faringe)

a. Hifas ramificadas, hialinas,


septadas(3)

a. Fungos filamentosos hialinos(5)

b. Levedura capsulada(2)

b. Cryptococcus sp

c. Levedura e pseudo-hifa(1,3)

c. Candida spp

d. Leveduras globosas ou
multiformes, de parede espessa,
incluses citoplasmticas, com
mltiplos brotamentos(1)

d. Paracoccidioides brasiliensis

a. Hifas irregulares, largas,


cenocticas(1,3)

a. Zigomicetos

b. Hifas ramificadas, hialinas,


septadas(1,3)

b. Fungos filamentosos hialinos(5)

c. Hifas septadas de cor castanha ou


marrom(1,3)

c. Feohifomicetos (fungos demcios)

d. Estruturas ovaladas, com ou sem


septos, de cor castanha (estruturas
muriformes)(1)

d. Cromomicetos (agentes de
cromomicose)

e. Levedura e pseudohifa(1,2)

e. Candida spp

f. Levedura capsulada(2)

f. Cryptococcus sp

g. Levedura globosa ou ovide,


de parede espessa, incluses
citoplasmticas, com brotamento
nico ou mltiplos(1)

g. Paracoccidioides brasiliensis

h. Leveduras pequenas, tipo charuto


(achado muito raro)(3)

h. Sporothrix schenckii

i. Leveduras pequenas em
macrfagos(4)

i. Histoplasma capsulatum

Tecidos, pus e
aspirados (subcutneo,
ganglionar, cerebral,
pulmonar, mucosa ou
outro)

(1,3)

OPAS/OMS Anvisa/MS 19

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Amostra Biolgica
Fludos oculares

Sangue e medula ssea

Aspecto Morfolgico

Interpretao

a. Fragmentos de hifas, hialinas,


septadas(1,3)

a. Fungos filamentosos hialinos(5)

b. Leveduras e pseudohifas(1,3)

b. Candida spp

a. Fragmentos de hifas ramificadas,


hialinas, septadas(3,4)

a. Fungos filamentosos(5)

b. Levedura capsulada(2)

b. Cryptococcus sp

c. Leveduras em brotamento(3,4)

c. Leveduras(6)

d. Leveduras pequenas em
macrfagos(4)

d. Histoplasma capsulatum

(1) Exame microscpico com KOH


(2) Exame microscpico com tinta nanquim
(3) Exame microscpico com colorao de Gram
(4) Exame microscpico com colorao de Giemsa ou pantica
(5) So fungos saprfitas que podem se tornar oportunistas, por exemplo Aspergillus, Fusarium, Acremonium, cuja
identificao s possvel pela cultura.
(6) No sangue, leveduras do gnero Candida no formam pseudohifas e a identificao de gnero e espcie possvel
somente, aps isolamento em meio de cultura.

1.3.6

Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos


A amostra, aps o processamento, poder ser usada para isolamento do
agente etiolgico. Para tanto, dever ser semeada em movimentos de estrias
(ziguezague) sobre a superfcie de meios slidos de cultura, distribudos em
tubos de ensaio, tamponados com tampo hidrfilo.

1.3.7

Meios de cultura
O meio de cultura pode ser selecionado segundo tipo de amostra e agente
etiolgico, conforme a suspeita clnica. De acordo com os aspectos observados ao exame microscpico da amostra, pode-se ainda redirecionar o procedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de
meio para semeadura da amostra biolgica, os quais devero ser incubados
temperatura de 30C, usada atualmente para todos os tipos de amostras.
Quando a hiptese diagnstica apontar para um fungo dimrfico, incubar
um dos tubos a 35O C.
Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser
utilizados meios no seletivos, que permitam crescimento de fungos patognicos e bolores de crescimento rpido (< de 7dias). Esses fungos, apesar
de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de micoses
em pacientes suscetveis, ou seja, so potencialmente oportunistas.
O meio bsico em laboratrio de micologia o gar Sabouraud dextrose
(ASD), chamado simplesmente, gar Sabouraud. O ASD o meio mais utilizado, por ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fun-

20 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

gos, com rarssimas excees. Em regra, usa-se um antibitico para impedir o


crescimento de bactrias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos.
O cloranfenicol o mais indicado, pois resiste autoclavao. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos.
Meios ditos seletivos para fungos patognicos contm cicloheximida que
inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemfilos. Esses meios so indicados para cultivo de materiais coletados de leses com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatfitos.
Deve-se ressaltar que essa substncia poder inibir o isolamento de fungos
oportunistas, como Aspergillus sp, alm de Histoplasma capsulatum na fase
leveduriforme e certas leveduras patognicas dos gneros Candida e Cryptococcus.
Existem meios presuntivos que indicam presena de certos grupos de fungos
ou determinados gneros, como por exemplo gar contendo compostos fenlicos para Cryptococcus sp (gar contendo sementes de niger ou Guizzotia
abssinica) ou gar especial para dermatfitos (Dermatophyte Test Medium).
Existem ainda meios presuntivos, por reao enzimtica e colorimtrica, de
espcies de Candida spp (Candida Medium, ChromAgar, Biggy gar, etc). So
meios mais caros que ASD e, alm disso, sua maior aplicao no isolamento
primrio de leveduras, a partir de amostras biolgicas muito contaminadas,
tais como: secreo vaginal, fezes e urina. A identificao, no entanto, feita
somente aps anlise morfolgica e fisiolgica.
Para isolamento ou subcultivo de dermatfitos recomenda-se o gar batata,
encontrado no comrcio, sob forma desidratada, para aumentar a esporulao e facilitar a identificao do gnero e espcie do fungo.
Para fungos dimrficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o
uso de meios enriquecidos como o gar infuso de cerebro-corao (BHI)
para obteno, em menor tempo, de culturas melhor desenvolvidas. Pode
ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibiticos (de preferncia, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina).
1.3.8

Procedimentos para cultura


Os materiais devidamente processados devem ser semeados na superfcie
dos meios de cultura, com ala de nquel-cromo ou pipeta Pasteur, com movimentos em estrias em ziguezague, para permitir separao de eventuais
contaminantes da amostra. O material no deve ser colocado em profundidade no gar, mas apenas aderido superfcie do meio. A temperatura de incubao recomendada para todas as amostras 30C, devido possibilidade
OPAS/OMS Anvisa/MS 21

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

de o agente etiolgico ser oportunista, e desse modo, crescer melhor a 30C


do que a 37C no primo isolamento. Alm disso, pensando em Brasil, em que,
as temperaturas so muito altas nas regies Norte e Nordeste, dificilmente
alcanam 25C, a menos que se utilize estufa BOD (body oxigen demand).
A temperatura de 30C verificada, mais facilmente, durante muitas horas
do dia.

Hemoculturas fazem parte da rotina diagnstica para casos de infeco


hospitalar e merecem algumas recomendaes parte para isolamento
de fungos. Os frascos contendo meio bifsico e sangue ou aspirado de
medula ssea devem ser submetidas agitao manual peridica, para
maior homogeneizao do oxignio na fase lquida do frasco. Exames macroscpicos dirios da superfcie da fase slida so indicados para verificar
aparecimento de colnias de: leveduras dos gneros Candida, Cryptococcus e outros (24 h-7 dias), fungos filamentosos e Sporothrix schenckii (2 a
15 d) e fungos dimrficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma
capsulatum (15 a 30d). Qualquer colnia de fungo deve ser repicada em
ASD, para posterior identificao.
O crescimento de fungos, ao contrrio de bactrias, no resulta em turvao imediata do meio lquido, de modo que a anlise microscpica de
uma gota do meio, abrevia o prazo de resultados positivos. R
ecomenda-se
a pesquisa microscpica do crescimento de fungos corando por Gram,
duas gotas do meio lquido, periodicamente, em cada um dos perodos
acima citados. Alm do exame microscpico da fase lquida, um procedimento que resulta em maior sensibilidade da cultura a realizao de
repiques de 1 ml da fase lquida para tubos contendo ASD ou BHI em dias
alternados: 2, 10 e 30 dia.
Visto que a maioria dos laboratrios brasileiros no trabalha com o meio
bifsico, pode-se inocular a amostra, na mesma proporo de 10%, em
frascos de hemocultura bacteriolgica e fazer a leitura como anteriormente descrito. Entretanto, sistemas automatizados para hemoculturas,
que acusam o crescimento de qualquer microrganismo em at 7 dias,
no permitem identificar a presena de fungos de crescimento mais lento. Nesses casos, a incubao por perodo de at 30 dias, com repiques
do caldo em ASD. O procedimento para sangue e aspirado de medula
ssea, denominado lise-centrifugao, no muito difundido no Brasil,
pelo custo de importao do sistema. O material biolgico inoculado diretamente no frasco do sistema, que contm saponina, que lisa as clulas
liberando assim os microrganismos intracelulares. A seguir, deve-se realizar centrifugao que direcionar os elementos fngicos para o fundo do
tubo que j contm o meio de cultura. O sobrenadante desprezado e,
dessa forma, a cultura foi realizada, evitando-se subcultivos que so ne-

22 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

cessrios quando se inocula o material em meios bifsicos ou lquidos. A


incubao feita a 37C por perodo de at 30 dias.
Abaixo esto os procedimentos recomendados para exame direto e cultura, visando obter melhor rendimento no isolamento primrio de fungos, de acordo com tipo de amostra biolgica.

Quadro 4 Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segundo amostra biolgica
Amostra Biolgica

Processamento

Exame Microscpico

Meio de Cultura*

Secreo respiratria

- Fluidificao
recomendada
- Centrifugao
- Uso do sedimento

- a fresco
- KOH a 20%
- Giensa
- Tinta naquim

- ASD
- BHI

Lquor

- Centrifugao
- Uso do sedimento

- Tinta naquim
- Gram

- ASD

Urina**

- Centrifugao
- Uso do sedimento

- a fresco
- Gram

- ASD

Fluidos corporais
(pleural, asctico,
sinovial, pericrdico,
gstrico, brnquico)

- Centrifugao
- Uso do sedimento

- KOH 20%
- Giemsa

- ASD
- BHI

Pus e secrees de
abscessos

- Nenhum

- KOH 20%
- Giemsa

- ASD
- BHI

Swab embebido
em salina (mucosa
oral, nasal, vaginal,
anal, olhos, conduto
auditivo)

- Centrifugao
- Uso do sedimento

- Gram

- ASD

Pele, pelos e escamas


de unhas

- Nenhum

- KOH 20%

- ASD

Tecidos e peas

- Fragmentao ou
macerao
- Imprint em lmina

- KOH a 20%
- Giensa
- Tinta naquim

- ASD
- BHI

Sangue e medula ssea

- Semeadura em
meio de cultura
- Esfregao ou
distenso em
lmina

- Giemsa

- BHI bifsico ou
lquido
- ASD bifsico ou
lquido

* Todos os meios slidos para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol.


** Para contagem de colnias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribudo em placa de Petri, antes de
centrifugar.

OPAS/OMS Anvisa/MS 23

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.4 Identificao de fungos


O isolamento de um fungo em meio de cultura no significa, necessariamente, que
ele o agente etiolgico da infeco. A presena de fungos na microbiota (flora) de
pacientes, por exemplo Candida sp, e no meio ambiente, por exemplo Aspergillus sp,
pode resultar em cultura positiva. Isso explica o grande nmero de culturas positivas para fungos a partir de uma amostra biolgica. A relao entre o fungo isolado
em meio de cultura e sinais e sintomas critrio clnico-epidemiolgico. No entanto,
deve-se sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de:

Qualquer amostra biolgica que mostrou resultado positivo ao exame microscpico.


Micose cutnea.
Fludos corporais normalmente estreis.
Tecidos obtidos por bipsias ou peas operatrias.
Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independentemente da contagem de
colnias.
Raspado de crnea.
Paciente imunossuprimido (transplantado ou com Aids).
Paciente em uso de antibiticos por longo tempo, internado em unidade de terapia intensiva ou submetido a ventilao mecnica, cateterismo ou outra manipulao.
Paciente de hemodilise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de
doena infecciosa independentemente do tipo de amostra clnica.

Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos:

Dimrficos.
Fungos isolados mais de uma vez do mesmo tipo de amostra biolgica coletada
em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente.
Isolados de ponta de cateter (alimentao parenteral, infuses venosas, etc.).

O profissional de laboratrio deve tentar identificar todas as culturas positivas relevantes e emitir o resultado mais acurado possvel. Muitas vezes, o exame microscpico direto da cultura suficiente para direcionar as medidas de controle da infeco,
outras vezes somente a identificao do fungo pode orientar adequadamente a conduta clnica.
A identificao dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gnero e a espcie; porm, muitas vezes, em especial para os fungos filamentosos, isso no possvel pelo
grau de dificuldade e complexidade desses microrganismos. Nesses casos, a identi-

24 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

ficao do grupo de fungos pode ser suficiente para o diagnstico da micose, por
exemplo, zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatfitos, leveduras, etc.
1.4.1

Identificao de leveduras (morfolgica e bioqumica)


A macromorfologia das leveduras, em especial as do gnero Candida, no
apresenta muita diversidade e, portanto, nem sempre um parmetro suficiente para sua identificao.
Colnias de levedura obtidas de amostra biolgica s devem ser identificadas quando estiverem puras, ou seja, sem contaminao bacteriana ou em
mistura de espcies. Para tanto, deve ser realizado o plaqueamento de cada
colnia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza, por microscopia. De cada colnia deve ser feito um repique em ASD para sua identificao. Para isolamento e identificao presuntiva ao mesmo tempo de algumas espcies de Candida mais frequentes, est disponvel no mercado o
meio comercial Chromagar Candida .
A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus, feita com uma gota de tinta nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, constituda de material polissacardico, aparece como um halo claro ao redor dos
blastocondios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lmina.
As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Candida albicans e Candida sp so: tubo germinativo e filamentao em cultivo
em lmina.
No cultivo em lmina, avalia-se a capacidade de produo de hifas/pseudohifas. Desse modo, a presena de hifas hialinas, ramificadas e sem fragmentao, sugestiva do gnero Candida sp e se, alm disso, desenvolver clamidsporos (clulas de reserva), em adio ao tubo germinativo positivo,
identificada como Candida albicans. A presena de hifas hialinas ramificadas
que podem se fragmentar em esporos, denominados artrocondios, indica
espcies dos gneros Geotrichum e Trichosporon. Assim, gneros tais como
Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporon tambm podem, na
maioria das vezes, serem identificados apenas por sua morfologia caracterstica.
O restante dos gneros e a classificao em espcies, porm, necessita de
provas bioqumicas para sua identificao. No entanto, do ponto de vista
clnico, nem sempre importante a identificao acurada da levedura. Por
outro lado, a simples identificao de C.krusei, intrinsecamente resistente a
fluconazol, extremamente importante.
OPAS/OMS Anvisa/MS 25

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

A prova de urease, disponvel em todo laboratrio de microbiologia, muito


utilizada em micologia. A reao positiva para urease, junto com a anlise
morfolgica, permite identificao presuntiva de Cryptococcus sp. Leveduras
do gnero Rhodotorula so tambm urease positiva, mas, como normalmente, apresentam colnias com pigmento avermelhado ou salmo, so distinguidas de Cryptococcus sp.
A identificao tambm pode ter interesse epidemiolgico. Para leveduras
relacionadas a episdios de infeco hospitalar, por exemplo, h grande preocupao no estudo das espcies dos agentes, como marcador epidemiolgico temporal e espacial de infeces, como no caso de espcies de Candida
que tm menor sensibilidade a antifngicos azlicos.
O esquema a seguir prope um fluxo para identificao das principais leveduras de interesse mdico.
Figura 3

Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras


Tubo Germinativo
Positivo

Cultivo em lmina

Negativo

Candida albicans
Hifas

Artroporadas

Somente blasrocondios

no-artrosporadas
+ blastocondios

Prova da Urease

Candida sp
com blastocondios

sem blastocondios

Trichosporon sp

Geotrichum sp

Positiva
Associar cor da colnia

Laranja, Avermelhada, Salmo

Rhodotorula sp

Negativa

Branca Bege
Associar pesquisa de cpsula

Positiva

Negativa

Cryptococcus sp
Auxanograma e
Zimograma

Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas


de assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de carboidratos (zimograma) devem ser realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste captulo. Um exemplo simplificado o Quadro 5.
26 OPAS/OMS Anvisa/MS

C. tropicafis

C. parapsifosis

C. krusei

C. guilliermondii

C. glabrata

C. neoformans

Geotrichum

Trichosporon

Rhodotorula sp

Saccharomyces

Hifa

Ar

Ur

Sa

Ma

La

Ce

Tr

Ra

Assimilao

NO2

GI

Sa

Ma

La

Fermentao

Ra

Tg = tubo germinativo, Ar = artrsporo, UR = urease, Sa = sacarose, Ma = matose, La = lactose, Ce = celubiose, T = trealose, Ra = rafinose, X = xifose, I = inositol,
NO2 = nitrato, GI = glicose, + = pos, - = neg, V= varivel

Tg

C. albicans

Levedura

Cultivo em
lmina

Quadro 5 Identificao das principais leveduras de interesse mdico

Tr

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

OPAS/OMS Anvisa/MS 27

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.4.2

Figura 4

Prova do tubo germinativo


A partir de uma alada da colnia isolada, fazer uma suspenso em tubo de
ensaio contendo 0,5 ml de soro humano (pode-se usar tambm soro estril
de bovino, cavalo ou coelho). Incubar a 37C durante perodo mximo de 3
horas. Esse prazo importante porque, aps esse perodo, outras espcies
de Candida e de outros gneros formam tambm tubo germinativo. Depositar ento uma gota da suspenso sobre lmina, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio ptico. A presena de tubo germinativo, na forma de
pequeno filamento que brota do blastocondio, sem formar constrio com
a clula-me, permite a identificao presuntiva de Candida albicans (Figura
4).

Prova do tubo germinativo com blastocondios, tubo germinativo e pseudohihas


de Candida albicans

1.4.3

Cultivo em lmina para prova de filamentao e produo de


clamidsporo
Depositar 3 ml de gar-fub fundido sobre uma lmina contida sobre um
suporte dentro de uma placa de Petri. O suporte para a lmina pode ser um
basto de vidro, outra lmina ou apenas dois palitos de madeira. Aps solidificao do meio, semear a levedura, com auxlio de uma agulha em L, fazendo 2 estrias paralelas. Recobrir as estrias com lamnula esterilizada. Fazer
uma cmara mida, acrescentando 2 ml de gua destilada estril na placa,
ou embebendo um algodo estril, para evitar dessecao do meio, durante
o perodo de incubao da prova. Tampar a placa e aps 24 horas, 48 horas
e 72 horas examinar a preparao em microscpio tico. A presena de hifas
hialinas, septadas e ramificadas caracteriza o gnero Candida e se houver
formao de clamidsporos indica Candida albicans. Formao exclusiva de
artrsporos permite identificao de Geotrichum, mas quando so forma-

28 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

dos tambm blastocondios trata-se de Trichosporon. O meio de gar fub


ou farinha de milho pode ser adquirido no comrcio (CornMeal gar) mas
sua formulao simples, ressaltando-se que de todos as maneiras deve-se
acrescentar a substncia tensoativa tween 80, para que a prova d resultados confiveis.
Figura 5

Cultivo em lmina para prova de filamentao e clamidsporo

1.4.4

Prova da urease
Semear uma alada da levedura na superfcie do meio de urease (gar
uria de Christensen).
Incubar a temperatura de 37C.
A mudana da cor do meio para rosa bispo em 24 horas indica reao positiva.

1.4.5

Prova de assimilao de fontes de carbono e nitrognio ou auxanograma


Nessa prova so usados 2 meios, que podem ser adquiridos no comrcio na
forma desidratada (Yeast Nitrogen Base e Yeast Carbon Base) ou formulados.
A levedura semeada pour plate, homogeneizando-se 2 ml de uma suspenso das colnias a cada meio fundido ou semeada na superfcie de cada
um dos meios previamente distribudos em 2 placas de Petri. So ento adicionadas pequenas alquotas de diferentes carboidratos que servem de fonte de carbono sobre a superfcie do meio isento de carbono. Vrias substncias, incluindo lcoois, protenas e aminocidos servem de fontes de nitrognio e so colocadas sobre a superfcie do meio isento de nitrognio. Aps
incubao temperatura ambiente ou 25C, por perodo de uma semana, a
levedura ir assimilar e crescer em volta de determinadas fontes, de acordo
com o metabolismo caracterstico de sua espcie. A leitura feita pelo halo
de turvao resultante do crescimento e indica prova de assimilao positiva
para a respectiva fonte. Os resultados so comparados a tabelas existentes
na bibliografia recomendada (exemplo simplificado consta no Quadro 5).

OPAS/OMS Anvisa/MS 29

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.4.6

Fermentao de acares ou zimograma


A capacidade de fermentar carboidratos, ao lado do auxanograma, ir completar o perfil bioqumico da levedura permitindo a identificao acurada de
gnero e espcie (Quadro 5). As caractersticas morfolgicas so fundamentais para concluir a identificao, desde que diversas espcies tm perfis bioqumicos idnticos, mas morfologias distintas. Para o zimograma, diversas
fontes de carboidratos so colocadas em tubos respectivos contendo meio
bsico lquido. A levedura semeada em cada tubo e, aps um perodo de
at 15 dias a 25C, a fermentao revelada por formao de bolhas de gs,
observadas dentro de tubos de Durhan, colocados previamente durante a
preparao do meio bsico.

1.4.7

Mtodos comerciais para identificao de leveduras


Em se tratando de espcies de Candida, o mercado j dispe de Kits manuais
como API 20C AUX ( BioMerieux), ID 32C (BioMerieux), Candifast (International Microbio) e metodologia semiautomatizada, como os cartes de identificao de fungos Vitek (BioMerieux).

1.4.8

Identificao de fungos filamentosos


Os fungos filamentosos, patognicos ou contaminantes ambientais, potencialmente oportunistas, formam um grupo muito extenso impossvel de ser
tratado neste Manual. Para identificao das diversas espcies ou grupos
existe bibliografia especializada de textos, manuais e atlas, indicados no final
do captulo. Dentro do objetivo deste Manual sero ilustrados apenas aspectos macroscpicos e microscpicos de alguns fungos de interesse mdico,
isolados com maior frequncia no Brasil.
A identificao de fungos filamentosos tem, como fundamento, a observao da morfologia da colnia e aspectos microscpicos. A anlise da colnia
visa observar: cor, textura, superfcie, pigmento difusvel no meio de cultura,
entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primria
do fungo. Porm, o mais adequado a anlise a partir da colnia gigante,
ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de gar Sabouraud Dextrose ou gar batata distribudo em placa de Petri. A velocidade de
crescimento que pode ser rpida (< 7 dias), intermediria (8 a 14 dias) ou
lenta (> 15 dias) fundamental para identificao presuntiva do fungo.
A observao das estruturas microscpicas, tais como: hifa hialina ou demcia, septada ou cenoctica, forma, disposio e formao dos esporos so suficientes, em geral, para a identificao dos gneros, mas nem sempre para
a caracterizao das espcies de fungos filamentosos. Em alguns grupos,

30 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

como o dos fungos demcios, pode ser necessrio tambm uso de provas
bioqumicas.
A morfologia microscpica mais bem visualizada com a tcnica de microcultivo que preserva a disposio original dos esporos sobre as hifas e mantm ntegras certas estruturas formadoras de esporos, por exemplo: os esporngios que so rgos de reproduo de zigomicetos.
1.4.9

Tcnica de microcultivo para fungos filamentosos


Colocar sobre uma lmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estril, um cubo de gar: ASD ou gar batata. A lmina deve estar sobre um
suporte, que pode ser formado por outra lmina, ou um pequeno basto de
vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fsforo. Semear o fungo, a partir
de repique recente, nos 4 lados do cubo de gar. Recobrir com uma lamnula
esterilizada. Fazer uma cmara mida, adicionando 1 a 2 ml de gua destilada estril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumao de algodo
estril, para evitar a dessecao do meio de cultura, durante o crescimento
do fungo. Tampar a placa e deixar temperatura ambiente por 7 a 10 dias,
at que se observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentao (Figura 6).
Aps esse perodo inativar a esporulao, adicionando 1 ml de formol ao
algodo e vedando a placa com fita adesiva durante 24 horas - 48 horas. O
vapor de formol, alm de inativar o fungo, ir auxiliar na fixao das estruturas microscpicas. Retirar a lamnula com auxlio de uma pina, cuidadosamente, uma vez que nela devero estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e
montar sobre uma lmina. Desprezar o cubo de gar e, em seu lugar, pingar
outra gota de corante lactofenol-azul algodo e recobrir com lamnula, para
visualizar esporos e hifas tambm aderidos lmina. Observar em microscpio tico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma, disposio e
formao de esporos.

Figura 6

Tcnica de microcultivo para anlise microscpica de fungos filamentosos

OPAS/OMS Anvisa/MS 31

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Figura 7

Estrutura geral de um fungo filamentoso

1.4.10 Identificao de fungos dimrficos


Dimrficos so fungos filamentosos que podem, sob determinadas condies, assumir forma de levedura, diminuindo a capacidade de filamentao
e dividindo-se por brotamento, conferindo s colnias aspecto cremoso.
Essa fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30C, de preferncia a 37C. So fungos de crescimento lento (>15 dias) no primo-isolamento
(Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis) ou moderado (8 a 14
dias), como Sporothrix schenckii. A identificao feita pela comprovao do
dimorfismo e pelo aspecto microscpico caracterstico de cada fase.

1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil


1.5.1

Micoses superficiais
Dermatofitoses (tineas)
So infeces fngicas limitadas s camadas superficiais queratinizadas da
pele, pelos e unhas, popularmente conhecida como epinge ou frieira, dependendo da localizao das leses que so extremamente pruriginosas. Em
imunodeprimidos podem acometer tecidos subcutneos.

Agentes etiolgicos: Microsporum spp, Trichophyton spp e Epidermophyton floccosum


Ocorrncia: universal, acometendo indivduos de qualquer idade, sexo
ou raa.
Fontes de infeco: contgio direto com animais, solo ou indivduo infectado.
Procedimento laboratorial:
Amostra: escamas de pele, unha e cabelos.

32 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Figura 8

Exame da amostra com KOH a 20% revela hifas regulares, hialinas, septadas, refrigentes, frequentemente artrosporadas.
Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxlio de uma ala
em L, de forma a ficar em perfeito contato com o meio de cultura. As
colnias de dermatfitos geralmente crescem a partir do 10 dia de
incubao temperatura ambiente e os fungos so identificados pela
sua morfologia macroscpica e microscpica. No Brasil, os dermatfitos mais frequentes so T. rubrum e T.mentagrophytes e M. canis.

Caractersticas microscpicas dos gneros de dermatfitos

1.5.2

Micoses subcutneas e profundas


Esporotricose
Infeco crnica cuja forma clnica mais frequente em nosso meio a forma
linfangtica nodular ascendente. Atinge, em geral, uma das extremidades
sob forma de leso ulcerada no ponto de inoculao e acomete a drenagem
linftica regional com formao de gomas no trajeto. As formas disseminadas so raras em pacientes imunocompetentes, mas frequentes em pacientes com Aids.

Agente etiolgico: Sporothrix schenckii


Ocorrncia: doena de distribuio universal que acomete principalmente trabalhadores rurais e floristas.
Procedimento laboratorial:
Amostra: aspirado das leses gomosas ou tecido subcutneo.
Exame microscpico da amostra apresenta baixa sensibilidade, mas
exame de cortes de tecido corados pode revelar leveduras em forma
de charuto ou apenas formas ovaladas com diviso em brotamento
(blastocondios).
Cultura: fungo dimrfico que se desenvolve bem em ASD entre 7 a 12
dias e cuja forma filamentosa (< 30C) apresenta hifas hialinas finas e
septadas com esporos dispostos em arranjo semelhante flor margarida. A forma leveduriforme (> 30C) no caracterstica do gneOPAS/OMS Anvisa/MS 33

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

ro e requer meios ricos acrescidos de sangue, cistena e submetidos


tenso de CO2. O interesse na obteno da fase leveduriforme para
diferenciar o agente da esporotricose do gnero Sporothricum, fungo
filamentoso no-dimrfico e anemfilo de meio ambiente. A forma filamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identificao do agente.
Figura 9

Microscopia em cultura de Sporothrix schenckii cultivado temperatura ambiente (A) e a 37oC (B)

Paracoccidioidomicose
Doena granulomatosa crnica que pode acometer pele, mucosas, linfonodos, sistema respiratrio, trato gastrointestinal, adrenais, fgado, bao e SNC.
Apresenta grande variabilidade de manifestaes clnicas, desde formas
localizadas at formas disseminadas de mau prognstico, na dependncia
da resposta imune do hospedeiro. Existe tambm a paracoccidioidomicoseinfeco, em que o indivduo no apresenta sinais e sintomas mas demonstra por testes intradrmicos positivos que entrou anteriormente em contato
com o fungo. Apresenta muitas semelhanas com a tuberculose.

Agente etiolgico: Complexo Paracoccidioides (P.brasiliensis e P.lutzii)


Ocorrncia: pases da Amrica Latina, principalmente Brasil.
Procedimento laboratorial:
Amostra: raspado de leso e mucosa, secreo do trato respiratrio,
aspirado de linfonodos, tecido obtido por bipsia.
Exame direto com KOH a 20% revela a presena da forma leveduriforme constituda de clulas grandes (10m a 60 m), globosas, com
parede celular dupla e refringente e com mltiplos brotamentos,
semelhana de roda de leme, orelhas de Mickey Mouse ou argolas
entrelaadas.
Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas desenvolvidas a < 30C so filamentosas, de cor branca, cotonosa, com

34 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas, septadas e fragmentadas em esporos multiformes. As colnias incubadas entre 30C a 35C
so de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as
formas caractersticas leveduriformes que permitem a identificao do
agente.
Figura 10 Microscopia em cultura de Paracoccidioides spp cultivado temperatura ambiente (A) e a 37oC (B)

Histoplasmose
Doena que acomete primariamente o sistema retculo-endotelial. A infeco pode ser localizada ou generalizada. A histoplasmose primria afeta o
sistema respiratrio e a histoplasmose progressiva atinge fgado, bao, linfonodos, mucosas, mdula ssea, etc. Em indivduos hgidos, a infeco tem
bom prognstico, porm atualmente importante infeco oportunista associada a Aids, nos quais ocorre a forma grave e disseminada.

Agente etiolgico: Histoplasma capsulatum


Ocorrncia: distribuio universal, principalmente em pases de clima
temperado.
Fontes de infeco: inalao de esporos presentes em aerossis formados por solos contaminados com excretas de galinhas e morcegos.
Procedimento laboratorial:
Amostra: secreo do trato respiratrio, sangue, puno de mdula ssea, tecido obtido por bipsia de mucosas e outros.
Exame microscpico direto, sem colorao, requer muita habilidade
do tcnico. Recomenda-se colorao por Giemsa para melhor visualizao do agente em de cortes histolgicos, onde se evidencia, sob
imerso, pequenas leveduras (2-5 m) intracelulares, dentro de clulas
mononucleares.
Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo
que no primo-isolamento mais fcil obter a forma filamentosa de cor
branca, aspecto cotonoso e sulcado, temperatura < 30C. A confirOPAS/OMS Anvisa/MS 35

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

mao do dimorfismo feita atravs de repique em meio rico (BHI) e


incubao entre 30C e 35C. A transformao da forma filamentosa
ou miceliana fase leveduriforme vista com a formao de pequenas (2-5 m) leveduras em brotamento. A identificao, porm, feita
pela micromorfologia da forma filamentosa, com a observao de esporos grandes macrocondios arredondados e com inmeras espculas
ou granulaes na parede celular, chamados hipnsporos ou esporos
tuberculados.
Figura 11 Microscopia em cultura de Histoplasma capsulatum cultivado temperatura ambiente (A) e a 37C (B)

1.5.3

Micoses oportunistas
Candidase
Candidiase uma doena com manifestaes clnicas variadas. As infeces
aguda e crnica mostram leses na boca, faringe, pele, unhas, sistema broncopulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente, endocardite, meningite,
fungemia ou infeces em outras localizaes podem ser observadas.

Agentes etiolgicos: Candida albicans e outras espcies, que esto frequentemente envolvidas em casos de micoses oportunistas em pacientes
debilitados. So os principais agentes etiolgicos de infeces hospitalares. As espcies de Candida podem ser isoladas de vrios locais do corpo
humano, como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vaginal, regio perianal e trato gastrointestinal.
Ocorrncia: universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para desenvolvimento da doena, tais como: desnutrio, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia, quimioterapia e
uso de corticosterides, manipulao endovenosa inadequada, neoplasias e outras doenas debilitantes.

36 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Procedimento laboratorial:
Amostra: (depender da sintomatologia clnica) fragmentos de pele e
unhas; raspados da mucosa oral, vaginal ou anal; secreo do trato respiratrio, sangue, lquor, urina e fezes.
Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com soluo
de KOH 20%. Secreo do trato respiratrio ou material de mucosa
podem ser examinados pela colorao de Gram. A levedura aparece
como clulas arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pequenas clulas podem ter dimetro de 2-6m, mas formas maiores so
tambm observadas.
Cultura: o crescimento rpido (24-72 horas) entre 25C e 37C. O aparecimento ocorre em torno de 3 a 4 dias, com formao de colnias
com colorao branca bege.

Criptococose
A criptococose uma infeco subaguda ou crnica que envolve primariamente os pulmes, com tropismo pelo sistema nervoso central (meninges),
podendo atingir pele e outros tecidos.

Agente etiolgico: Cryptococcus neoformans


Ocorrncia: no homem, a distribuio da doena universal.
Procedimento laboratorial:
Amostra: lquor, secreo do trato respiratrio ou de leso de pele, aspirado de formao tumoral subcutnea e tecidos obtidos por bipsia.
O exame laboratorial dever incluir urina, de preferncia aps massagem prosttica, para monitorar a presena do agente na prstata que
constitui seu rgo de reserva.
Exame obrigatoriamente com tinta nanquim para observao de clulas capsuladas com dimetro varivel, entre 5 m a 20 m, que sugerem Cryptococcus sp.
Cultura: secreo do trato respiratrio, lquor e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer outro meio, desde que no contenham
cicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce rpido (< 7 dias)
entre 25C e 37C, sob forma de colnias mucides de colorao creme
parda.
A identificao de gnero e espcie feita atravs de provas bioqumicas como teste da urease e auxanograma.

Aspergilose
A aspergilose pode se apresentar em indivduos imunocompetentes, como
leses localizadas em unhas, ps, canal auditivo, olhos e forma bronco-pulmonar alrgica. Em pacientes imunocomprometidos, tende forma dissemiOPAS/OMS Anvisa/MS 37

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

nada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente associada a neutropenia ou


a doenas debilitantes.

Agente etiolgico: Aspergillus fumigatus (o mais comumente isolado)


Ocorrncia: tem distribuio universal. crescente o nmero de relatos
dessa doena como infeco secundria em pacientes em tratamento prolongado com antibitico e corticosterides, doenas debilitantes
como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropnicos, e em leses de
tecidos subcutneos, da pele ou da crnea.
Procedimento laboratorial:
Amostra: secreo do trato respiratrio, material de bipsia e lavado
brnquico.
O exame microscpico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 m
de dimetro e que se ramificam em ngulo de at 45.
Cultura: colnias de Aspergillus fumigatus, a espcie mais associada
doena em humanos, podem ser facilmente isoladas em ASD, em at
7 dias (crescimento rpido) com desenvolvimento, na superfcie do
meio, de filamentos brancos-hifas - que se tornam verde a verde-acinzentado, com a formao de esporos.

Figura 12 Micromorfologia de Aspergillus fumigatus

Fusariose
Hialo-hifomicose com quadros clnicos os mais variados, incluindo processos
generalizados em pacientes com neoplasias. Destaca-se atualmente sua importncia como agente de ceratites e onicomicoses.

38 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Agentes etiolgicos: as espcies de Fusarium mais frequentemente relatadas em casos de infeces humanas so Fusarium solani, F. oxysporum, F.
chamydosporum e F. verticillioides (F. moniliforme).
Ocorrncia: Fusarium spp so ubquos e raramente causam infeco em
indivduos sadios, no entanto, as infeces disseminadas so, na maioria,
relatadas em locais de clima quente.
Procedimento laboratorial:
Amostra: dependente da localizao da leso, bipsia ou raspado de
pele, crnea, fragmento de unha ou, em casos de suspeita de disseminao, sangue.
Cultura: colnia inicialmente branca e coberta por um miclio areo
plumoso que ao maturar produz um pigmento de cor lavanda a vermelho prpura na superfcie e no reverso. Apresentam hifas hialinas,
septadas, microcondios de 2 a 3 mm de dimetro, e macrocondios
com forma de banana ou de foice pela observao em microscopia
ptica.

Figura 13 Micromorfologia de Fusarium spp

Zigomicose
Infeco geralmente subaguda de evoluo rpida que acomete indivduos
debilitados, transplantados, diabticos descompensados ou ainda com Aids.
Pode acometer seios paranasais, tecido subcutneo, pulmo e vasos sanguneos, causando embolia no SNC e trombose. A micose em indivduos imunodeficientes , em geral, fatal se o diagnstico no for rpido e o tratamento
especfico no for prontamente estabelecido.

Agentes etiolgicos: fungos da classe dos Zigomicetos, compreendendo os gneros Mucor, Rhizopus, Absidia, entre outros.
Ocorrncia: distribuio universal.
Procedimento laboratorial:
Amostra: secreo de sinus nasal ou tecidos obtidos por bipsia de
seios paranasais ou leses subcutneas.
OPAS/OMS Anvisa/MS 39

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Exame com KOH a 20% revela hifas hialinas e largas (6-50m), cuja caracterstica principal a ausncia de septos, que caracterizam as hifas
cenocticas desse grupo de fungos.
Cultura: fungos de crescimento rpido (< 72 h) a 25C em ASD, com
hifas ereas abundantes. A identificao feita pela microscopia da
colnia que evidencia hifas cenocticas e esporos contidos dentro de
estruturas fechadas denominadas esporngios.

Figura 14 Micromorfologia de Rhizopus sp

As localizaes topogrficas mais frequentes, relacionadas aos agentes fngicos esto resumidas na Tabela 1.

40 OPAS/OMS Anvisa/MS

Tecidos subcutneo e gnglios

Trato gastrointestinal

Mucosas

Naso-faringe

Trato urinrio

Fgado e Bao

Aspergillus
sp

Olhos
x

S. schenckii

Lquor

P. brasiliensis

Ouvidos

Pelo

Crebro

Pele e Unha

Medula ssea

Osso

Sangue

H.
capsulatum
x

Dermatfitos

Agentes etiolgicos e localizaes topogrficas

Trato respiratrio

Tabela 1

Candida
sp

C. neoforman Zigomicetos

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

OPAS/OMS Anvisa/MS 41

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.6 Corantes e meios de cultura


Esto detalhados aqui apenas os corantes e meios de cultura mais utilizados na rotina
diria e que podem ser preparados facilmente no laboratrio. Para maiores detalhes
e outros meios, recomenda-se a bibliografia no final do captulo.
Corante Azul de lactofenol-algodo
Composio:
cido ltico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g
Cristais de fenol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g
Glicerina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g
Azul algodo*. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20ml
Preparo:
Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar.
Esperar 24 horas e filtrar.
* O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno.
Os meios de cultura utilizados para o isolamento primrio de fungos a partir
de amostras biolgicas podem ser adquiridos no comrcio, sob a forma desidratada, no precisando ser formulados no laboratrio. Aps a hidratao,
conforme instrues do fabricante, o meio deve ser distribudo, de preferncia, em tubos, pois dessa forma h maior resistncia desidratao e contaminao, alm de oferecer menor bio-risco na manipulao da cultura e
esterilizados por autoclavao.
Para gar, recomenda-se a solidificao em tubo (18 x 180mm) inclinado,
deixando espao de 3 cm do final do meio at o tampo, para evitar contaminao via meio externo. O armazenamento dos tubos contendo meios de
cultura deve ser em saco plstico fechado, dentro de armrios, temperatura ambiente. Desse modo, se houver uma contaminao durante o tempo
de armazenamento, as colnias de fungos contaminantes sero facilmente
observadas, ao contrrio do que ocorre, quando se armazena sob refrigerao. O controle de esterilidade deve ser feito por 7 dias, temperatura ambiente, antes do uso de qualquer meio de cultura.
gar sabouraud-dextrose (ASD)
Composio:
Dextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 g
Pepton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 g
gar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml
42 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Preparo:
Dissolver os componentes na gua destilada.
Acertar o pH em 5,6.
Aquecer at a completa dissoluo.
Distribuir cerca de 10 ml por tubo.
Esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.
gar sabouraud-dextrose com cloranfenicol
Dissolver 100 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C.
Adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao.
gar-sabouraud-dextrose com cloranfenicol e cicloheximida
(Meios comerciais mycosel, micobiotic gar ou meio seletivo para fungos)
Diluir separadamente 400 mg de cicloheximida (Actidione) em 10 ml de
acetona.
Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C.
Misturar as solues e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao.
pH= 7,0
Brain heart infusion gar com cloranfenicol (bhi)
Dissolver 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C.
Adicionar em 1 litro de BHI preparado de acordo com as instrues do
fabricante, antes da esterilizao.
gar fub
Composio:
Fub . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g
gar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g
Tween 80. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 ml
Preparo:
Adicionar o fub em 250 ml de gua e ferver at borbulhar. Filtrar o fub
em gaze dobrada em quatro. Dissolver o gar em 250 ml de gua. Restaurar o volume da infuso de fub para 250 ml com gua quente, juntar as
suspenses, ajustar o pH para 6,6 6,8 e adicionar o Tween 80. Distribuir
volumes de 5 ml em tubos e esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.

OPAS/OMS Anvisa/MS 43

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.7 Glossrio

Artrsporo ou artrocondio: esporo formado pela desarticulao da hifa de fungos


filamentosos ou leveduras.
Blastosporo ou blastocondio: esporos formados por brotamento ou gemulao.
Bolor: fungo filamentoso, multicelular, constitudo de hifas.
Brotamento ou gemulao: reproduo com diviso de citoplasma atravs de estrangulamento.
Cenoctica: hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa contnua.
Clamidsporo: estruturas de resistncia, constitudas de reserva nutritiva e membrana bastante espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhante aos
esporos.
Condio: esporo assexuado externo.
Demcio ou demaciceo: fungos negros que tm pigmento melanide (acastanhado), na parede celular.
Dimrfico: que apresenta duas formas: leveduriforme e filamentosa.
Esporngio: rgo de reproduo assexuada interna, geralmente em forma de vescula e contm inmeros esporos denominados de esporangiosporos.
Feo-hifomiceto: fungo filamentoso demceo.
Hialino: que no tem cor, translcido, assumindo a cor do corante utilizado.
Hifa: reunio de clulas justapostas, formando estrutura tubular, filamentosa, que
compe o corpo vegetativo dos bolores e de alguns gneros de leveduras (por ex,
Candida spp.).
Hifomiceto: fungo filamentoso.
Levedura: fungo em regra unicelular que se reproduz geralmente por brotamento.
Pseudohifa: uma srie de blastocondios que permanecem aderidos uns aos outros, formando filamentos semelhantes a hifas.
Tuberculado: com granulaes ou nodosidades.

1.8 Referncias
1. HOOG, G.S, GUARRO, J., FIGUERAS, M.J. and GENE, J. Atlas of Clinical Fungi, 2a Ed., CBS,
Utrecht, Holanda, 2000.
2. KANE, J., SUMMERBELL, R., SIGLER, L., KRAJDEN, S. and LAND, G. Laboratory handbook of
Dermatophytes: a Clinical Guide and Laboratory Manual of Dermatophytes and Other
Filamentous Fungi from kin, Hair and Nails, Star Publishing Co., Belmont, Ca, 1997.
3. KURTZMAN, C.P. and FELL, J.W. (coord.) The Yeasts A taxonomic study, Elsevier Science
B.V., Amsterdam, Holanda, 1998.
4. KWON-CHUNG, K.J. and BENNETT, J. E. Medical Mycology, 1992.
5. LACAZ C.S., Porto, E., MARTINS, J.E.C., HEINS-VACCARI, E.M. and MELO, N.T. Tratado de
Micologia Mdica, 9a ed., Sarvier, So Paulo, 2002.
44 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

6. LACAZ, C. da S., PORTO, E., HEINS-VACCARI, E.M. and MELO, N.T. Guia Para Identificao de
Fungos Actinomicetos e Algas de interesse mdico, 8 ed., ed. Sarvier, So Paulo, 1998.
7. LARONE, D.H. Medically Important Fungi: A guide to Identification, 3 ed., Washington,
DC., 2000.
8. MAZA, Pezzlo and Baron Atlas de Diagnstico em Microbiologia, ed. Artmed, Porto
Alegre, 1999.
9. MENDES-GIANNINI, M.J. and MELHEM, M.S.C. FUNGOS In: FERREIRA, A.W. and VILA,
S.L.M. Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas Infecciosas e Auto-Imunes, 2ed.,
Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, 2001.
10. MIDLEY, G., CLAYTON, Y.M. and HAY, R.J. Diagnstico em cores. Micologia Mdica, Ed.
Manole Ltda., So Paulo, 1998.
11. MINAMI, P.S. Micologia: Mtodos Laboratoriais de Diagnstico das Micoses, Ed. Manole
Ltda, So Paulo, 2003.
12. RIPPON, J.W. Medical Mycology: The pathogenic fungi and the pathogenic
actinomycetes, 2 ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1982.
13. SIDRIM, J.J.C. and MOREIRA, J.L.B. Fundamentos clnicos e laboratoriais da micologia
mdica. Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, 1999.
14. VON NOWAKONSKY, A., SILVA, C.R.N. and MELHEM, M.S.C. Fungos e Aids: diagnstico
de infeces oportunistas, ed. Ministrio da Sade, Coordenao Nacional de Doenas
Sexualmente Transmissveis e Aids, Srie Telelab no22, 2001.
15. ZAITZ, C., CAMPBELL, I., MARQUES, S.A., RUIZ, L.R.B. and SOUZA, V.M. Compndio de
Micologia Mdica, ed. Medsi, Rio de Janeiro, 1998.

OPAS/OMS Anvisa/MS 45

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Prancha 1
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46 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

Prancha I Legenda

Figura 1:
Figura 2:
Figura 3:
Figura 4:
Figura 5:
Figura 6:
Figura 7:
Figura 8:
Figura 9:
Figura 10:
Figura 11:
Figura 12:
Figura 13:
Figura 14:
Figura 15:
Figura 16:
Figura 17:
Figura 18:
Figura 19:
Figura 20:

Macromorfologia de Candida albicans em gar Sabouraud.


Placa de Petri preparada com filamentao.
Aspecto microscpico da filamentao de Candida albicans.
Macromorfologia de Cryptococcus neoformans em gar Sabouraud.
Artrocondios de dermatfitos em exame direto de material clnico.
Macromorfologia de Microsporum canis em gar Sabouraud.
Macromorfologia de Trichophyton mentagrophytes em gar Sabouraud.
Macromorfologia de Epidermophyton floccosum em gar Sabouraud.
Macromorfologia de Paraccocidioides brasiliensis a 37o C.
Micromorfologia de Paraccocidioides brasiliensis a 37o C.
Macromorfologia de Histoplasma capsulatum a 25o C.
Micromorfologia de Histoplasma capsulatum a 25o C.
Placa de Petri preparada com microcultivo.
Macromorfologia de Aspergillus fumigatus.
Micromorfologia de Aspergillus fumigatus.
Micromorfologia de Aspergillus fumigatus evidenciando a clula p.
Macromorfologia de Fusarium solani.
Micromorfologia de Fusarium solani.
Macromorfologia de Rhizopus sp.
Micromorfologia de Rhizopus sp.

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