AGRADECIMIENTO

Esta monografa se empez a realizar en julio del

2008 y se culmin en agosto del 2008. Durante
todo este tiempo fue necesario tener mucha
dedicacin y paciencia para la composicin,
diagramacin y revisin de los contenidos, sin
duda una tarea verdaderamente invalorable, por
lo que nos sentimos agradecidos de la
colaboracin de nuestros profesores:

VICTOR MELNDEZ GUERRERO

As mismos a todos quienes contribuyeron de

alguna u otra forma en la elaboracin de la
monografa, pero muy especialmente quien
figura en la lista de colaboradores.

DEDICATORIA

Dedicamos este trabajo a

nuestro profesor Vctor
Melndez Guerrero, por
iniciarnos
en
la
investigacin y por ser
gua en nuestras primeras
experiencias acadmicas
universitarias.

Dedicamos
el
nuestros padres
nuestros guas
alcanzar nuestros
anhelos.

trabajo
a
porque son
y luz para
ms grandes

NDICE

INTRODUCCIN....

04
CAPTULO I: HISTORIA Y DEFINICIN.
1. Antecedentes histricos.
..
07

2. Premio Nbel........

14
3. Definicin

14
CAPTULO II: CLASIFICACIN DE CROMATOGRAFA
1. Cromatografa de reparto ...

2. Cromatografa de
adsorcin.
3. Cromatografa en
gel.
4. Cromatografa en gel de capa
fina..
5. Cromatografa de intercambio
inico
6. Cromatografa de
afinidad
7. Cromatografa de
penetrabilidad..................................
8. Cromatografa de interaccin hidrofbica..

18
21
24
32
34
42
50
59

CAPTULO III: MTODOS DE CROMATOGRAFA

1. Cromatografa
plana........................................63
1.1. Cromatografa en papel.... ....
......63
1.2. Cromatografa de capa
fina...................................................................67
2. Cromatografa en
columna..............................................................................71
3. Cromatografa de
gases..... 80
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
(HPLC)......................................85
CAPTULO IV:
FUNDAMENTO TEORICO.............................
88
IMORTANCIA DE LA CROMATOGRAFIA.
..90
APLICACIONES AL ANALISIS DE ALIMENTOS...
.91

APLICACIONES
GENERALES
93
CONCLUCIONES..
..95
ANEXOS

..96
GLOSARIO
103
BIBLIOGRAFA
.....107
LINKOGRAFIA.

.108

INTRODUCCIN
Desde el siglo pasado las separaciones analticas se llevaban a
cabo por mtodos clsicos como son la precipitacin, destilacin y
extraccin. Los crecientes esfuerzos por conocer ms sobre la
composicin y funcin de las protenas han obligado a los
cientficos

buscar

tcnicas,

cada

vez,

ms

precisas.

Para elegir una tcnica de separacin, adems de tener en cuenta

los criterios econmicos y de accesibilidad, hay que atender a dos

tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades

fsicas y estructurales de las molculas que se pretende separar, o
de las caractersticas de la matriz en que se encuentran; otras se
derivan de los objetivos del anlisis (sensibilidad, resolucin,
tiempo de anlisis, necesidad de una deteccin especifica).
El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la
obtencin, preparacin y posible fraccionamiento de la muestra, la
aplicacin de la tcnica analtica adecuada y el tratamiento de los
datos obtenidos.
Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden
englobarse en dos grandes grupos: tcnicas de separacin y
tcnicas

espectroscpicas.

Las

tcnicas

espectroscpicas

proporcionan, para cada compuesto analizado, una informacin

compleja,

relacionada

con

sus

caractersticas

estructurales

especficas, por otro lado las tcnicas de separacin se utilizan

para resolver los componentes de una mezcla y la seal obtenida
puede utilizarse con fines analticos cuantitativos o cualitativos.
Actualmente

las

separaciones

analticas

se

realizan

fundamentalmente por cromatografa y electroforesis.

La cromatografa es un proceso de separacin muy comn en

ingeniera qumica y bioqumica. Es un procedimiento altamente
selectivo,

capaz

de

distinguir

separar

componentes

con

caractersticas fsicas y qumicas muy similares. Esta tcnica se

considera importante tanto a nivel de produccin como de anlisis.
La cromatografa no solo permite la separacin de los
componentes de una mezcla, sino tambin su identificacin y

cuantificacin. Se pueden separar molculas en funcin de sus

cargas, tamaos y masas moleculares. Tambin a travs de la
polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El anlisis
cualitativo

est

basado

en

la

medida

de

parmetros

cromatogrficos (tiempos y volmenes de retencin) mientras que

el anlisis cuantitativo est basado en la medida de alturas o reas
de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin.
Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son
cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa
de fluidos supercrticos. Como su nombre lo indica, la fase mvil en
las

tres

tcnicas

son

lquido,

gas

fluido

supercrtico

respectivamente. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un

lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase
fija. Solo la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse
acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto
la de gas como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los
procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la
columna contienen la fase mvil.

CAPITULO
I

HISTORIA Y DEFINICIN
1. ANTECEDENTES HISTORICOS

1848 Way y Thompson: Reconocieron el fenmeno de intercambio

inico en slidos.
1850 Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder: Estudiaron el
anlisis por capilaridad en papel.
1876 Lemberg: Ilustr la reversibilidad y estequiometra del
intercambio inico en minerales como el silicato de aluminio.
1892 Reed: Separacin en columna en tubos de kaoln usados para
la separacin de FeCI3 y el CuSO4.
1906 Tswett: Invent la cromatografa en columna con el uso de
solventes

puros

para

desarrollar

un

cromatograma,

us

adsorventes suaves para resolver una mezcla de pigmentos, (ver

ms detalles abajo).
1930 Karrer, Kuhn, y Strain: Us adsorventes como hidrxido de
calcio activado, aluminio y magnesio
1935

Holmes

Adams:

Sintetiz

resinas

orgnicas

para

intercambio inico.
1938 Reichstein: Introdujo la cromatografa lquida o fluida, as
extendi las aplicaciones de la cromatografa a sustancias sin color.
1938 Izmailov y Schraiber: Describieron el uso de la capa fina de
alumina extendida sobre un vidrio.
1939 Brown: Primero que us la cromatografa circular en papel.
1941 Martin y Synge: Introdujo la cromatografa por particin en
columna.
1944 Consden, Gordon, y Martin: Primeros que describieron la
cromatografa de particin en papel.
1947

Boyd,

Tompkins,

Spedding,

Rieman,

otros:

Cromatografa de intercambio inico aplicada a varios problemas

analticos.
1948 M. Lederer y Linstead: Cromatografa en papel aplicada a
compuestos inorgnicos.
1951 Kirchner: Introdujo la cromatografa de capa fina como es
practicada ahora.

1952 James y Martin: Desarrollaron de la cromatografa de gas.

1956 Sober y Peterson: Prepararon las primeras celulosas para
intercambio inico.
1956 Lathe y Ruthvan: Usaron almidn natural y modificado
como tamiz para la estimacin del peso molecular.
1959 Porath y Flodin: Introdujeron al dextrn entrecruzado como
tamiz molecular
1964 J. C. Moore: Desarroll la cromatografa de permeacin en
gel.
En 1906 el botnico ruso Mikhail Semenovich Tsvett (1872-1919)
emple por primera vez el trmino "cromatografa" (que proviene
del griego y que significan a su vez respectivamente
"color" y "escribir").
A comienzos del ao 1903, Mikhail Tswett us columnas de
adsorcin de lquidos para separar pigmentos vegetales (por
ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacan pasar a travs de
una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que
finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma
diferente con los componentes de la mezcla, de forma que stos se
separaban en distintas bandas a lo largo de la columna.
Tswett recopil y estudi en profundidad la intensa investigacin
existente

sobre

el

tema

realizada

por

sus

predecesores

contemporneos, lo que se tradujo en una revisin de los

principales periodos, mtodos de estudio y descripciones de la
clorofila.
De aquella revisin ya se entrevea que algunos autores de la
poca se planteaban las posibles modificaciones de la clorofila
cuando era extrada de las plantas con la ayuda de reactivos
qumicos para purificar el compuesto en estado slido.
Los esfuerzos de Tswett se encaminaron a eliminar las razones que
podran hacer cambiar la naturaleza del pigmento verde, por lo que
utiliz hojas frescas y elimin la calefaccin. Esta bsqueda de un

mtodo ms racional para la investigacin de los pigmentos de las

plantas llev a Tswett a su principal logro cientfico: el desarrollo de
la cromatografa, que abri una nueva era en el estudio de estos
pigmentos, y sobre todo, de la clorofila. Su trabajo entre 1898 y
1900, con 14 publicaciones en revistas britnicas y rusas, se
recopil en un trabajo titulado Composicin fisico-qumica de la
partcula de clorofila. Investigacin experimental y crtica, que
constituy su Tesis Magistral en 1901.
Durante sus experimentos para intentar extraer la clorofila de las
hojas sin modificar, Tswett justific la falta de resultados cuando se
utilizaba ter de petrleo y los resultados positivos cuando se
aada una pequesima cantidad de etanol a la presencia de
fuerzas de adsorcin entre los pigmentos y la matriz de los
cloroplastos y encamin sus esfuerzos a nuevos mtodos fsicos
que permitieran el estudio de la clorofila en su estado natural.
Esta idea de competir con las fuerzas de adsorcin dio lugar a los
experimentos sobre la identificacin de materiales capaces de
adsorber pigmentos existentes en las hojas verdes, desorbiendo de
forma diferencial los componentes de la mezcla.
En 1901 lleg a la conclusin que los compuestos cristalinos
obtenidos por investigadores del prestigio de Borodin o Monteverde
eran slo artefactos y en realidad consistan en la mezcla de
clorofilas a y b derivatizadas con alcohol etlico. Esta afirmacin fue
considerada insolente y sus datos dudosos.
El 21 de marzo de 1903 fue un da memorable para la historia de la
cromatografa. En la Seccin de Biologa de la Sociedad de Ciencias
Naturales de Varsovia, Tswett present un trabajo titulado Sobre la
nueva categora de fenmenos de adsorcin y sus aplicaciones al
anlisis bioqumico. En ella, por primera vez, se establece una
clara definicin del proceso en el que se basa la nueva tcnica
analtica: En la actualidad, bajo el trmino adsorcin se combinan
varios

fenmenos,

naturaleza,

que,

corresponden

aunque
a

la

posiblemente
siguiente

diferentes

definicin

en

bsica:

10

concentracin de gases, vapores, lquidos o compuestos disueltos

sobre la superficie de cuerpos slidos.
En una posterior publicacin en alemn en 1906, Tswett describi
con detalle cmo obtena los pigmentos de hojas frescas trituradas
con ter de petrleo al que aada pequeas cantidades de alcohol,
que posteriormente eran eliminadas por agitacin con agua
destilada.

El

extracto

de

pigmentos

se

separaba

en

sus

componentes con ayuda del cromatgrafo. En su primera versin

fue tan simple como el que se encuentra en la figura 1 (todava
utilizado en cromatografa preparativa) y despus evolucion al
sistema de la figura 2 para aumentar el nmero de experimentos.
En sus trabajos hasta 1910 Tswett examin hasta 128 adsorbentes
en los que describi diferentes comportamientos.
Tras anunciar la invencin de esta nueva tcnica en 1903, Tswett la
emple para

obtener

muestras

qumicamente puras

de las

clorofilas a y b, y aport la prueba incuestionable de la

heterogeneidad del pigmento verde de las plantas, aunque no fue
el primero en proponer esta heterogeneidad. Adems descubri
una tercera forma de clorofila en algas, la clorofila c.
A Tswett se le ha considerado posteriormente el descubridor de
todas las formas de clorofila, aunque l siempre atribuy al
cientfico ingls Sorby este descubrimiento, realizado treinta aos
antes. De hecho, por este empeo, Tswett entr en polmica con L.
Marchlewski, el principal investigador europeo de la hemoglobina y
la clorofila al principio del siglo XX, quien, junto con C. Schunk, se
arrog el descubrimiento de las dos formas principales. Tswett
afirm que los experimentos de Marchlewski y Schunk no eran sino
meras reproducciones de los experimentos de Sorby, y en defensa
de la novedad de su mtodo y de sus resultados, Marchlewski
declar que Tswett menta e incluso que los artculos de Tswett no
merecan

ninguna

atencin

adems

que

el

mtodo

cromatogrfico sera algo que no tendra ninguna utilidad en el

futuro.

11

En los aos siguientes se mantuvo una agria polmica entre los dos
investigadores, centrada en la existencia de las distintas formas de
las clorofilas, que pareci zanjada cuando Marchlewski acept que
la metodologa de Tswett era adecuada y que Sorby haba descrito
previamente resultados como los suyos.
Las discusiones ms intensas de Tswett fueron con el qumico
orgnico R. Willstter, que sera premio Nobel en 1915, principal
discpulo del fundador de la moderna qumica orgnica alemana, A.
Baeyer, premio Nobel de 1905.
Willstter sigui una aproximacin qumica para el estudio de la
composicin y naturaleza de los pigmentos vegetales, analizando y
estudiando la estructura de varios derivados de esos pigmentos
mediante la accin de determinados reactivos como cidos, lcalis,
etc.
La discusin se mantuvo durante muchos aos, dado que Tswett
mantena que no se poda hacer ese anlisis orgnico puesto que
las sustancias no estaban suficientemente purificadas, porque las
tcnicas empleadas no permitan la total separacin de los
compuestos, mientras que Willstter afirmaba que no se poda
considerar purificacin un proceso que no se basaba en la
cristalizacin para dar lugar a un compuesto slido.
A pesar de estas polmicas, Tswett logr en vida un cierto
reconocimiento a su trabajo, pues le llegaron a conceder en 1912 el
premio Akhmatov (consistente en 1000 rublos), y fue incluso
propuesto para la obtencin del Premio Nobel de 1918. El mentor
destac en su informe los trabajos realizados sobre la adsorcin.
A partir de 1910 su salud, que nunca haba sido muy buena,
empez a deteriorarse y por si ello fuera poco Rusia, en plena
Revolucin, decidi tomar parte en la Primera Guerra Mundial. En
una poca convulsionada por profundos cambios, Tswett perdi
todos sus archivos y fases adsorbentes, ya cuidadosamente
recopiladas por entonces.

12

El 16 de junio de 1919 muri, a los 47 aos, vctima de su

debilitado corazn y de una vida siempre en condiciones de
precariedad econmica.
La actitud enormemente crtica hacia la investigacin de Tswett
sobre clorofilas y carotenoides por parte de sus colegas demuestra
que sus innovaciones no encontraron gran apoyo. Las actitudes
mayoritarias

en

aquellos

aos

fueron

predominantemente

negativas y durante la primera dcada tras la muerte de Tswett el

nmero de publicaciones en los que se usaba la cromatografa
disminuy radicalmente, principalmente porque los resultados
obtenidos

por

el

primer

cromatografista

del

mundo

fueron

ignorados.
Uno de los motivos aducidos para esta falta de reconocimiento fue
que la principal publicacin de Tswett no fue accesible para los
cientficos de la Europa Occidental porque estaba escrito en ruso, y
adems porque era una rareza bibliogrfica, una edicin de su tesis
doctoral. Aunque esto pueda ser cierto, no es menos cierto que
Tswett public numerosos artculos en revistas de otros pases, y
realiz demostraciones de su tcnica en las distintas sociedades
cientficas europeas, pues sus conocimientos de francs, ruso,
ingls y alemn le permitieron estar en contacto con las sociedades
internacionales de mayor prestigio. Tambin se ha aducido para
justificar esta falta de reconocimiento el que las publicaciones de
Tswett fueran mayoritariamente dedicadas al campo de los
pigmentos vegetales en revistas de botnica, pero tambin
present sus resultados en revistas de qumica francesas y
alemanas.
El olvido en el que se mantuvo el descubrimiento de Tswett es
posible que se deba sobre todo a la falta de confianza que alguno
de los principales cientficos de su tiempo mantuvo acerca de la
cromatografa, fundamentalmente Willstter. Mientras vivi, nadie
excepto Tswett se atrevi a desafiar a Willstter cuando afirmaba
que l haba sido el primero en obtener las clorofilas a y b

13

qumicamente puras, y tras la muerte de Tswett en 1919, la

investigacin sobre los pigmentos de las plantas fue prcticamente
monopolizada por la escuela de Willstter. Como Ettre y Horvth
escribieron mucho ms tarde, en este periodo Willstter era el
Papa (sic) en este campo (el de las crorofilas), por lo que Synge
lleg a afirmar en 1970 que el peso de la autoridad cientfica de
Willstter hizo que la sociedad cientfica ignorara las ideas de
Tswett.
En los aos treinta revivi el inters por la tcnica, y fue
redescubierta por Winterstein y Stein en Alemania para separar
los distintos carotenoides de las plantas.
Existe una frase que Tswett escribi varias veces, cuya autora ha
sido atribuida a distintos personajes: Cualquier avance en la
ciencia es un avance del mtodo. Resume muy bien lo que fue su
vida y su principal descubrimiento: una tcnica poderossima para
conocer ms acerca de los pigmentos vegetales.
Varios aos tras su muerte, a su lpida se aadi el siguiente
epitafio: Destinado a descubrir la cromatografa, la ciencia
que separa molculas y une personas
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el
mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los aos
1960, aumentando su importancia en las dcadas siguientes, hasta
convertirse en la tcnica cromatogrfica ms empleada. Sin
embargo esto se ira modificando con el paso de los aos.

14

1.1 ASPECTOS HISTRICOS DE LOS DISTINTOS TIPOS DE

CROMATOGRAFA
Cromatografa en papel
Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa.
Adquiri una gran extensin por su sencillez y presenta la ventaja
de poder utilizar miligramos y microgramos, adems presenta la
opcin de utilizar tanto la tcnica descendente (en columna, etc...)
como la tcnica ascendente.
Cromatografa en capa fina
Fue originada por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y
Schraiberen en 1938 al separar mezclas de tinturas farmacuticas.
En este tipo de cromatografa la fase estacionaria se extiende sobre
un soporte inerte, la dificultad que presentaba el mtodo era el
crear una capa homognea, sin ningn tipo de rugosidad. La
cromatografa en capa fina tuvo valor limitado hasta que Stahl
estandariz el mtodo para elaborar capas finas por mtodos
mecnicos.
Cromatografa de intercambio inico
Esta tcnica apareci durante la II Guerra Mundial y en principio
tena la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de
transicin. En 1938 Taylor y Urey utilizan este mtodo para separar
istopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939
Samuel logra sintetizar resinas de intercambio inico.
Cromatografa de gel-filtracin
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase
estacionaria geles se consigue separar polmeros sintticos de alto
peso molecular.
Cromatografa de afinidad.
Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un pptido o
protena unida covalentemente a un ligando y se utiliza para la
separacin de molculas proteicas.
Cromatografa de gas.

15

Es una de las tcnicas ms utilizadas e importantes, de forma que

ha revolucionado el campo de la qumica analtica.

2. PREMIOS NOBEL EN CROMATOGRAFA

Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografa en el
campo de la qumica orgnica e inorgnica, y obtienen el
premio Nobel por sus trabajos en 1937,

1938, 1939

respectivamente.
En 1952 Archer J. P. Martin y Richard L. M. Synge por la
invencin de la cromatografa de reparto sobre papel.
3. DEFINICIN
La palabra Cromatografa significa "Escribir en Colores" ya que
cuando

fue

desarrollada

los

componentes

separados

eran

colorantes.
La cromatografa es un conjunto de tcnicas basadas en el principio
de retencin selectiva cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si
es que no se conoce su composicin.
Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas
hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido
supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase
estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un
slido.
Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con
la fase estacionaria y con la fase mvil. De este modo, los
componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades
y se van separando. Despus de haber pasado los componentes
por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un detector

16

que genera una seal que puede depender de la concentracin y

del tipo de compuesto.
En 1906 Tswett defini la cromatografa como:
Mtodo en el cual los componentes de una mezcla son separados
en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente.
Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografa de forma
ms amplia como:
Mtodo

usado

principalmente

para

la

separacin

de

los

componentes de una muestra, en el cual los componentes son

distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra es mvil. La fase estacionaria puede ser un
slido o un lquido soportado en un slido o en un gel (matriz).
La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna,
extendida en una capa, distribuida como una pelcula, etc.
Se utiliza el trmino general de lecho para definir las distintas
formas en que puede encontrarse la fase estacionaria. Las
separaciones

cromatogrficas

se

consiguen

mediante

la

distribucin de los componentes de una mezcla entre la fase fija y

la fase mvil. La separacin entre dos sustancias empieza cuando
una es retenida ms fuertemente por la fase estacionaria que la
otra, que tiende a desplazarse ms rpidamente en la fase mvil.
Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos
fenmenos de interaccin que se dan entre las dos fases y que
pueden ser:
1.-La adsorcin, que es la retencin de una especie qumica por
parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando
delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o
superficie interfacial.
2.- La absorcin, que es la retencin de una especie qumica por
parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar
mezcla

con

la

primera,

absorcin

pura,

reaccionar

qumicamente con la misma, absorcin con reaccin qumica,

considerando ambas como un fenmeno msico y no superficial.

17

Segn Keulemans ha definido la cromatografa como:

Un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye
la fase estacionaria, de gran rea superficial, y la otra es un fluido
(fase mvil) que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria.
La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido dispuesto
sobre un slido que acta como soporte, de gran rea superficial.
La fase mvil es un fluido (puede ser gas, lquido o fluido
supercrtico) que se usa como portador de la mezcla.
En la cromatografa ocurren dos fenmenos muy importantes y que
son prcticamente los rectores del proceso de separacin: la
adsorcin y la absorcin.
La adsorcin es la retencin de una especie qumica en los sitios
activos de la superficie de un slido, quedando delimitado el
fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie
interfacial.
Esta retencin superficial puede ser fsica o qumica. La adsorcin
depende de la naturaleza de la substancia adsorbida, de la
temperatura, de la naturaleza y estado de subdivisin del
adsorbente, y de la concentracin.
La absorcin es la retencin de una especie qumica por parte de
una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar
mezcla o reaccionar qumicamente con la misma.

18

19

CAPITULO
II

CLASIFICACIN DE CROMATOGRAFIA
Para

clasificar

globalmente

los

procesos

cromatogrficos

es

necesario atender a dos criterios bsicos:

Fundamento del proceso cromatogrfico, lo que conduce a los

tipos de cromatografas.

20

Forma de realizar el proceso cromatogrfico, es decir, lo que

constituye las distintas tcnicas cromatogrficas.

1. CROMATOGRAFA DE REPARTO
Sustancias muy diferentes, como las limaduras de hierro y las
partculas de vidrio, pueden separarse con facilidad utilizando un
imn; la arena y el azcar; pueden separarse disolviendo el azcar
en agua. No obstante, si las sustancias presentan propiedades
fsicas y qumicas similares, los mtodos de separacin tendrn que
ser ms complejos y sutiles. En la cromatografa de reparto las
sustancias

se

colocan

en

un

sistema

que

consta

de

dos

componentes distinguibles por mtodos fsicos una fase mvil y

otra estacionaria y las diferentes molculas se separan debido a
diferencias (muchas de ellas, pequeas) de distribucin entre las
dos fases citadas. El movimiento relativo de cada molcula es el
resultado de un equilibrio entre la fuerza de transmisin (es decir,
el movimiento de la fase mvil) y las fuerzas que tienden a frenar
este desplazamiento. Las fuerzas de frenado que se van a considerar a continuacin, son el reparto y la adsorcin.
La teora de la cromatografa de reparto se basa en que, en
general, si dos fases se encuentran en contacto una con otra y si
una o las dos fases contienen un soluto, ste se distribuir entre las
dos fases. Este fenmeno recibe el nombre de reparto y viene
descrito por el coeficiente de reparto, o sea, la relacin entre las
concentraciones del soluto en las dos fases.
La cromatografa de reparto se describir en trminos del
funcionamiento de una columna es decir, un tubo lleno de un
sorbente y un disolvente. Una disolucin que contiene el soluto se
coloca en la parte superior del sorbente y puede penetrar en su
interior. A continuacin se permite fluir el disolvente a travs de la
columna. Aunque el sorbente y el disolvente adoptan una
disposicin continua a todo lo largo de la columna, sta puede considerarse formada por un gran nmero de capas individuales

21

(lminas tericas) que contienen, cada una, las dos fases.

Considrense

256

molculas

idnticas

que

se

distribuyen

igualmente entre las dos fases, estacionaria y mvil, y una columna

con dieciocho lminas (figura 8-1). En la placa superior (u origen)
las 256 molculas estn distribuidas de forma que 128 se
encuentran en cada fase. Cuando las 128 molculas mviles de la
lmina 1 entran en la segunda lmina, se redistribuyen en 64 y 64;
de las 128 que permanecen en la lmina 1 tambin se distribuyen
64 y 64 segn se indica en la figura 8-1. Si la fase mvil vuelve a
avanzar otra vez una lmina ms, vuelve a tener lugar una
redistribucin de las molculas. Despus de 20 transferencias
sucesivas se consigue la situacin que se indica en el grfico. Si se
supone que inicialmente tambin haba 256 molculas idnticas de
un tipo diferente al anterior (se indican por nmeros en trazado
fino), que se distribuyen en una proporcin de tres a uno en la fase
estacionaria con respecto a la mvil, la figura 8-1 tambin indica la
distribucin

de

este

tipo

de

molculas

despus

de

20

transferencias. Las distribuciones de estos dos tipos de molculas

son diferentes y a lo largo del proces se separa una fraccin
sustancial de las molculas. A medida que aumenta el nmero de
lminas tericas (es decir, segn aumenta la longitud de la
columna) se conseguir una mayor separacin. Debe observarse
que, segn aumenta el nmero de lminas, el material se extiende
a travs de una zona cada vez mayor de la columna. En una
situacin real en la que el nmero de molculas total sea muy
elevado (es decir, > 1016), el numero final en la lmina 1 no
llegar a cero. Por otra parte, el grado de difusin disminuir en el
sentido de que un porcentaje cada vez mayor del material se
.encuentra en un nmero reducido de lminas. Por ejemplo, en la
figura 8-1, el 40 % de las molculas que se distribuyen en una
proporcin, despus de 8 transferencias se encuentran contenidas
en 4/8 de Tas lminas. Al cabo de las 20 transferencias el 40 % se
encuentra en un 6/16 o en un -3/8 de las lminas. Estas considera-

22

ciones ponen d manifiesto que en un caso ideal en el que la

distribucin venga nicamente determinada por el reparto, la
resolucin de dos sustancias mejorar con el aumento de la
longitud de la fase estacionaria.
1.1 Ejemplos de cromatografa de reparto
Los dos tipos de cromatografa de reparto ms corrientes son la
cromatografa en papel y la de capa fina. En los dos casos la matriz
contiene un lquido, en la cromatografa en papel se trata de las
molculas de agua unidas a la celulosa y en la cromatografa de
capa fina el lquido unido al soporte es el disolvente utilizado para
formar la capa fina (vanse las pginas 195-199). (Estas tcnicas a
veces se consideran como tipos de cromatografa de adsorcin,
porque los efectos de adsorcin entran dentro de la consideracin
de separacin; sin embargo, el principal tipo de accin que tiene
lugar es el reparto.)
La cromatografa de reparto tambin puede realizarse en columnas,
utilizando una matriz que no adsorba los solutos. Los materiales de
soporte ms corrientes son la tierra de diatomeas (p. e., Celita), el
gel de slice, la celulosa en polvo y algunos dextranos que forman
tramas (p. e., Sephadex -LH20). La fase estacionaria se crea
suspendiendo el soporte o lavando la columna con el sorbente
adecuado. De esta forma, el sorbente recubre las partculas del
soporte y es retenido por adsorcin o simplemente penetra en los
intersticios de las partculas y es retenido all por capilaridad. Es
importante notar que la fase estacionaria no ocupa los espacios
situados entre las partculas; este espacio ser ocupado por la fase
mvil. Los materiales tpicos de la fase estacionaria son disolventes
hidrfobos como el benceno, cuando se trate de separar materiales
no polares, o disolventes hidrfilos como un alcohol, cuando se
trabaja con materiales polares. Obsrvese que los materiales de la
fase estacionaria son lquidos.

23

La cromatografa de reparto se utiliza, sobre todo, para molculas

de bajo peso- molecular. Para reducir la extensin por difusin (es
decir, el ensanchamiento de los picos), son necesarias zonas de
iniciacin muy pequeas y una separacin rpida. En los apartados
que tratan de cromatografa en papel y en capa fina, se describir
con detalle cmo se realizan estos procesos.

2. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
Considrese una superficie slida que contenga una amplia
variedad de sitios de unin --por ejemplo, regiones con una
densidad electrnica elevada (cargadas negativamente), con una
densidad electrnica baja (cargadas positivamente), no polares, y
as sucesivamente y un lquido que contiene un soluto, en
contacto con la superficie. Si la unin es reversible, el nmero de
molculas unidas a la superficie depender de la concentracin de
soluto. Esta dependencia (existen tres tipos posibles) se muestra en
la figura 8-2. Las curvas de este tipo reciben el nombre de isolneas
de adsorcin. El tipo ms corriente es la curva convexa, es decir,
los sitios de unin con una afinidad elevada son rellenados en
primer lugar, de modo que las cantidades adicionales de soluto se
unen con menos fuerza. La isolnea de unin es caracterstica de
cada molcula concreta y de cada sorbente. Si se aplica a la
superficie una concentracin dada de una molcula (que en la
prctica es, por lo general, un conjunto de partculas en una
columna o sobre un soporte slido) y se deja fluir un disolvente a
travs de la superficie, una cantidad fija de molculas se unir a la
superficie y el resto se desplazar a lo largo de la misma. El
material que avanza podr volverse a enlazar con dos diferencias:
(1) la fuerza de retraso es la unin o adsorcin y (2) la fraccin que

24

se une no es una fraccin constante, sino que disminuye a medida

que disminuye la concentracin. La velocidad con que se mueve la
sustancia est relacionada con la fuerza de unin, siendo ms lento
el movimiento cuanto ms firme es la unin. En consecuencia, las
molculas pueden separarse si tienen isolneas de adsorcin
diferentes, debido a que sufriran un grado diferente de retraso.
Tabla 1. Materiales de uso corriente en la cromatografa de
adsorcin.
Material
Almina

Sustancias separadas
Pequeas
molculas

Gel de slice
Carbn activado

orgnicas, protenas.
Esteroles, aminocidos.
Pptidos,
aminocidos,

Gel de fosfato clcico

Hidroxiapatito

glcidos.
Protenas, polinucletidos
cidos nucleicos.

2.1 Tipos de cromatografa de adsorcin

La cromatografa de adsorcin utiliza una fase lquida mvil y una
fase estacionaria slida, con la nica excepcin de la cromatografa
de gases.
La separacin puede tener lugar en columnas o en capa fina. La
tabla 8-1 indica los adsorbentes ms comunes y sus diferentes
utilizaciones.
Una importante variacin de la cromatografa de adsorcin, es la
cromatografa de intercambio inico. La diferencia principal estriba
en la composicin de la fase mvil; sta es de tal naturaleza que
cuando el material se aplica al adsorbente, el soluto queda
inmovilizado. La migracin no empieza hasta que se aade una
fase mvil. No hay diferencias de principio, pero ste es un caso
especial en el cual la adsorcin es muy fuerte.
Es importante comprender que las cromatografas de adsorcin y
reparto no son exclusivas entre s, ya que los efectos de adsorcin
pueden estar presentes en la cromatografa en papel, de capa fina
e incluso, a veces, en la cromatografa en gel.

25

2.2 Funcionamiento de las columnas

Probablemente el mtodo ms corriente para contener la .fase
estacionaria

soporte

es

una

columna.

Una

columna

cromatogrfica consiste en un tubo que Se llena con el material de

la fase estacionaria, ms un disolvente. A continuacin se coloca un
pequeo volumen (es decir, una capa delgada) de la muestra sobre
la fase estacionaria, y se le deja penetrar en la columna (lo que
recibe el nombre de carga de la columna). El cromatograma se
desarrolla entonces dejando fluir un disolvente (la fase mvil) a
travs de la columna (figura 8-3). Este ltimo proceso recibe el
nombre de elucin de la columna. Segn se van moviendo las
diferentes sustancias a travs de la columna, se van separando y
aparecen en el efluente cuando han atravesado la columna unos
volmenes determinados de lquido. El volumen total de material
de la columna, tanto slido como lquido, recibe el nombre de
volumen del lecho. El volumen de la fase mvil es el volumen vaco
o de retencin. La cantidad de lquido que debe aadirse para
producir un pico de un soluto concreto en el efluente se llama
volumen de elucin.
La forma en la que se prepara el lecho de una columna se
denomina empaquetamiento. Es muy importante que el lecho sea
homogneo y no presente burbujas, grietas o espacios entre las
paredes. El flujo desigual que resulta de la falta de homogeneidad,
se

denomina

flujo

acanalado.

El

efecto

normal

de

ste

acanalamiento es la distorsin del patrn de elucin, de forma que

una sustancia aparece en picos mltiples. Ello es el resultado del
movimiento' rpido de la fase mvil a travs de la columna en
estas desigualdades, y el restablecimiento del reparto o la
adsorcin en un nuevo punto.
El lquido que abandona la columna (el efluente) se recoge, por lo
general, en fracciones discretas utilizando un colector automtico
como se indica en la figura 8-4. Los componentes que ya estn

26

separados se encuentran e identifican titulando alcuotas de cada

fraccin

haciendo

mediciones

espectroscpicas,

pruebas

qumicas, radiactividad, etc. En los casos en que el anlisis se

realiza

midiendo

la

absorcin

de

la

luz,

se

utiliza

un

espectrofotmetro de registro continuo. La muestra pasa" travs

de un tubo antes del fraccionamiento, se mide la absorbancia en la
longitud de onda apropiada y se representan los valores en un
registrador grfico de forma continua.
Las columnas pueden ser eluidas de tres formas: el mtodo ms
sencillo consiste en un flujo continuo del disolvente a travs de la
columna. Este mtodo es de uso corriente en la cromatografa de
intercambio inico y en la cromatografa en gel.
La elucin por pasos se utiliza, en general, cuando la columna
funciona con propsitos preparativos. La columna es eluida con un
disolvente

hasta

que

se

alcanza

un

volumen

previamente

determinado. A continuacin se aade un segundo disolvente. Este

mtodo tiene la ventaja de que se pueden disponer las condiciones
de forma que un material concreto pueda eluirse en un volumen
bastante pequeo. Considrese, por ejemplo, una mezcla de
sustancias en la que la sustancia X sufre un fuerte retardo cuando
se emplea el disolvente A, mientras que las dems sustancias
experimentan un retraso muy pequeo; adems X experimenta "un
retraso muy dbil con el disolvente B. Por lo tanto, si se lava la
columna con un exceso de disolvente A, la mayor parte del material
es eluido de la columna, mientras que la mayor parte de X
permanece unido a ella. Si a continuacin se lava la columna con el
disolvente B, se eluye X con rapidez y en un volumen relativamente
pequeo.
El tercer mtodo es la elucin en gradiente, que consiste en
cambiar la relacin de dos disolventes o en elevar la concentracin
de uno o ms de los componentes del disolvente (p. e., la
concentracin de sales). Este ltimo mtodo es el ms utilizado en
las columnas de adsorcin y de intercambio inico. Los gradientes

27

se preparan por medio de aparatos del tipo que se muestra en la

figura 8-5. Estos aparatos constan de dos recipientes, un depsito y
una cmara de mezcla, que estn conectados por sus bases. El
depsito contiene el disolvente ms concentrado. El lquido sale de
la cmara de mezcla y entra en la columna. Como los niveles
hidrostticos deben corresponderse (las alturas de los lquidos no
tienen que ser necesariamente iguales, porque las densidades de
los lquidos en ambos recipientes puede variar), el liquido fluye
simultneamente del depsito a la cmara de mezcla. Si las
cmaras tienen la misma forma el gradiente es lineal; tambin
pueden prepararse gradientes cncavos o convexos, segn se
muestra en la figura 8-5.
3. CROMATOGRAFA EN GEL
La cromatografa en gel (que algunas veces recibe el nombre de
cromatografa

de

tamiz

molecular)

es

un

tipo

especial

de

cromatografa de reparto, en la que la separacin se basa en el

tamao molecular.
La base de la cromatografa en gel es bastante sencilla. Se prepara
una columna de partculas muy finas de una sustancia inerte, que
contenga poros muy pequeos. Si se hace pasar una disolucin con
molculas de distintas dimensiones a travs de la columna (figura
8-18), las molculas con un tamao mayor que el de los poros se
movern slo en el espacio que queda entre las partculas y, por lo
tanto, no sufrirn retraso en su recorrido a travs del material de la
columna. Sin embargo, las molculas con un tamao menor que el
de los poros difunden hacia el interior y el exterior de las partculas
con una probabilidad que aumenta a medida que disminuye el
tamao molecular. Debido a ello, su movimiento de descenso a
travs de la columna se hace ms lento. La probabilidad de
penetracin es el factor principal que determina la velocidad de
movimiento a travs de la columna, puesto que el material que
forma las partculas (es decir, el gel) no adsorbe las molculas.

28

Por lo tanto, las molculas son eluidas de la columna por orden de

tamaos decrecientes, o, si la forma es relativamente constante
(por ejemplo, globular o cilndrica), por orden de pesos moleculares
decrecientes.
En un anlisis detallado de la cromatografa en gel, queda claro que
este efecto estrico, aunque es el principal factor, no explica por si
slo el comportamiento cromatogrfico de todas las molculas.
Otro factor importante es la carga de la molcula, aunque sta se
manifiesta slo en condiciones de baja fuerza inica, en las que las
molculas

pequeas,

fuertemente

cargadas,

parecen

quedar

excluidas de los poros, independientemente de que su tamao sea

lo suficiente pequeo. Este efecto se debe, con probabilidad, a la
repulsin electrosttica entre las molculas, que limita el nmero
de molculas en un poro en cualquier momento dado. Cuando la
fuerza inica es muy pequea, tambin parecen existir efectos de
adsorcin, al menos en apariencia y en algunos tipos de geles.
3.1 Materiales para la cromatografa en gel
Un gel es un retculo tridimensional cuya estructura se dispone, por
lo general, al azar. Los geles que se utilizan como tamices
moleculares constan de polmeros entrecruzados, por lo general,
inertes, que no se unen ni reaccionan con el material analizado y
que no presentan carga elctrica. El espacio del interior del gel est
ocupado por un lquido que rellena la mayor parte del gel.
Los geles de uso corriente son de tres tipos: dextrano, agarosa y
poliacrilamida. Se utilizan para disoluciones acuosas.
El dextrano es un polisacrido compuesto por restos de glucosa y
producido a partir de sacarosa por la bacteria Leuconostoc
mesenteroides.
entrecruzamiento

Se
para

prepara
controlar

con
el

diversos
tamao

del

grados
poro

de
y

es

suministrado en forma de granos secos, con diversos grados de

finura, que se dilatan cuando se les aade agua. El proceso por el
que los poros quedan llenos del lquido utilizado como efluente,

29

recibe

el

nombre

de

hinchazn.

El

dextrano

se

obtiene

comercialmente con el nombre de Sephadex (Phannacia Fine

Chemicals, Inc.).
La agarosa (que se obtiene de ciertas algas marinas) es un
polmero lineal de D-galactosa y 3,6-anhidro-1-galactosa y forma un
gel

que

se

mantiene

compacto

sin

necesidad

de

entrecruzamientos, por medio de puentes de hidrogeno.

Se disuelve en agua hirviendo y forma un gel cuando se enfra. La
concentracin del material en el gel determina el tamao de los
poros que son mucho mayores que los de Sephadex. Debido a
ello, es til para el anlisis o la separacin de grandes protenas
globulares o grandes molculas lineales como el DNA. La agarosa
es inservible como gel slido, debido a que la velocidad de flujo es
demasiado baja en esas condiciones; por ello, es suministrada en
forma de granulos hmedos que reciben el nombre de Sepharosa
(Pharmacia

Fine

Chemicals,

Inc.)

de

Bio-gel

(Bio-Rad

Laboratories).
Los geles de poliacrlamida se preparan entrecruzando acrilamida
con N.N-metiln-bis-acrilamida. En este caso el tamao de poro
tambin viene determinado por el grado de entrecruzamiento.
Estos geles se diferencian de los geles de dextrano y de agarosa en
que contienen un grupo carboxilamida polar en tomos de carbono
alternados. Sin embargo, sus propiedades de separacin son casi
las mismas que las de los dextranos, Los geles de poliacrilamida,
los cuales reciben el nombre de Bio-gel A (Bio-Rad Labora-tories),
parecen ser tan tiles como los dextranos, aunque se han usado
con menor frecuencia. Tienen la ventaja sobre los dextranos de
poder obtenerse comercialmente en un amplio margen de tamaos
de poro.
Recientemente

se

han

utilizado,

para

disoluciones

acuosas,

grnulos de vidrio poroso (Bio-Glas, Bio-Rad Laboratorios), pero de

momento los datos experimentales de que se dispone son muy
limitados.

30

Los geles descritos hasta el momento se dilatan en agua y en unos

pocos disolventes orgnicos: glicol, formamida y dimetiisulfxido.
No sufren hinchazn en alcohol puro, hidrocarburos y la mayora de
los disolventes orgnicos, tanto polares como no polares. No
obstante, sustancias como lpidos, esferoides y algunas vitaminas,
se manejan con mayor facilidad en estos disolventes. Se han
desarrollado algunos geles para conseguir este propsito. Existe un
gel entrecruzado de poliestireno (Styragel, Dow Chemical Co.; Biobeads S, Bio-Rad Laboratorios) para cromatografa en gel" con
disolventes orgnicos no polares, que ha sido utilizado con xito.
Para

los

disolventes

orgnicos

polares

existe

un

Sephadex

motilado. Tambin existe un derivado hidroxipropilo de dextrano

entrecruzado (Sephadex LH) que puede utilizarse tanto con
disolventes polares como no polares.
Por lo general, el tamao de poro determina el margen de pesos
moleculares en los que tiene lugar el fraccionamiento. La tabla 8-2
muestra

los

valores

representativos

para

algunos

de

estos

materiales. Normalmente no existen dificultades para seleccionar el

material apropiado. Sin embargo, los grnulos de gel vienen en
diversos tamaos: grueso, medio, fino y superfino. Cuanto mayor
es el tamao, mayor es la velocidad de flujo y menor la resolucin.
Por lo tanto, se utiliza el granulo superfino si se precisa una
resolucin mxima por ejemplo, para un trabajo analtico. El
grnulo fino se recomienda para la mayora de los trabajos
preparativos en los que las columnas son bastante largas y la
velocidad de flujo es de cierta importancia. Las medidas ms
gruesas se utilizan en preparaciones muy extensas, en las que la
resolucin es de menos importancia que el tiempo.
3.2 Ventajas de la cromatografa en gel
La cromatografa en gel es insuperable para la separacin de
molculas que se diferencian en su peso molecular, por las
siguientes razones:

31

1. Debido a que el comportamiento cromatogrfico de casi todas

las sustancias en los geles es independiente de la temperatura, pH,
fuerza inica y composicin de los lampones, se pueden realizar
separaciones prcticamente bajo cualquier condicin. Cuando se
trabaja con materiales muy lbiles (p. e., enzimas) esto significa
que pueden mantenerse las condiciones para una estabilidad
mxima.
2. Muchas

sustancias

lbiles

no

resultan

afectadas

por

la

cromatografa en gel, puesto que no hay prcticamente adsorcin.

Por ejemplo, algunos enzimas resultan inactivados o alterados por
la unin a superficies adsorbentes o resinas de intercambio inico.
3. Existe menos dispersin de las bandas que con otras tcnicas
cromato-grficas (por razones que no estn claras).
4. El volumen de elucin se relaciona de forma sencilla con el peso
molecular.

Tabla 2.
Materiales de uso corriente en la cromatografa en gel.
Material

nombre

Margen

comercial

fraccionamiento

Dextrano

molecular)
700

Sephadex G-10

1 000 5 000

Sephadex G-25

3 000 70 000

Sephadex G-75

5 000 800 000

de
(peso

Sephadex G-200
Poliacrilamida
Bio-gel P-2

200 -2 000

Bio-gel P-6

1 000 6 000

Bio-gel P-150

15 000 150 000

32

Bio-gel P-300
Agarosa

60 000 400 000

Sepharosa 2 B

2 x 106 25 x 106

Sepharosa 4 B

3 x 105 5 x 105

Bio-gel A-0,5 M

30 000 500 000

Bio-gel A-15 M

30 000 15 x 106

Bio-gel A-150 M

5 x 106 150 x 106

3.3 ESTIMA DEL PESO MOLECULAR

Se ha observado, con distintos tipos de geles, que la representacin
de un parmetro K en funcin del log M (peso molecular) da como
resultado una lnea recta, excepto con las molculas demasiado
grandes o demasiado pequeas (vase la figura 8-19). Las nicas
desviaciones son las pequeas molculas aromticas, molculas
fuertemente cargadas en condiciones de fuerza inica muy baja
(<< 0,01) y algunas molculas de forma alargada como el colgeno
y el fibringeno. El parmetro K se define como (Ve V0)/Vs donde
Ve es el volumen del disolvente que se necesita para eluir las
molculas de inters, V0 es el volumen vaco o bien el volumen que
se precisa para eluir una molcula que nunca entra en la fase
estacionaria y V, es el volumen de la fase estacionaria. En la
cromatografa en gel, el volumen del gel (que es principalmente el
volumen de sus poros) es Vs y V0 es el volumen para Una sustancia
completamente excluida por el gel; V0 se mide normalmente
haciendo pasar material de elevado peso molecular, excluido, como
dextrano azul, a travs de la columna, y V, se mide como V tV0donde Vt es el volumen total de la columna.
Para las protenas globulares y para muchos carbohidratos, esta
tcnica es muy fiable cuando se utilizan varios tipos de Sephadex y
Bio-gel P. La estima de M puede realizarse a partir de extractos
celulares no fraccionados, siempre y cuando pueda medirse la
protena; casi todos los dems mtodos requieren muestras muy
puras. Por lo tanto, para determinar M slo hay que incluir algunas
33

molculas de A conocido para definir la lnea recta, calculndose

entonces la M de la muestra por interpolacin. La precisin de estas
determinaciones es de cerca de un 10 %. Una variacin algo ms
precisa de esta tcnica se describe en la seccin de cromatografa
en gel de capa fina.
La determinacin de la distribucin de pesos moleculares es, con
frecuencia, importante en la caracterizacin de polmeros naturales
y sintticos. De nuevo, con mtodos fsicos como la centrifugacin,
se requiere un material relativamente puro. Sin embargo, con la
cromatografa en gel es posible determinar la distribucin midiendo
simplemente la cantidad de sustancia en funcin del volumen de
elucin. Esto se hace preparando una curva de calibracin y
utilizando una correccin matemtica relativamente simple para la
extensin de la muestra en una zona del gel.
3.4 Aplicaciones de la cromatografa en gel
La cromatografa en gel es bsicamente un mtodo de separacin y
se ha utilizado ampliamente en la purificacin de enzimas y otras
protenas, y en el fraccionamiento de cidos nucleicos. Los geles de
dextrano son especialmente tiles para protenas inestables, como
se ha explicado anteriormente. En trabajos preparativos, tanto los
dextranos como las poliacrilamidas se han utilizado en volmenes
que van desde unos pocos mililitros a varios litros.
Para fines industriales se ha llegado a emplear columnas de 1000
litros. Se han fraccionado y purificado con xito diversos tipos de
RNA y virus, utilizando geles de agarosa.
En las purificaciones de macromolculas en gran escala, en las que
se necesitan diversos tipos de fraccionamiento, a menudo es
necesario eliminar sales, cambiar lampones, concentrar y eliminar
sustancias como el fenol y los detergentes utilizados en el
aislamiento

purificacin

de

cidos

nucleicos.

Con

los

procedimientos habituales, es un proceso que consume mucho

tiempo (p. e., por precipitacin o dilisis), y por esta razn puede

34

dar como resultado la prdida de las muestras inestables. No

obstante, la cromatografa en gel proporciona un camino rpido
para realizar este proceso. Por ejemplo, las sales y las molculas
pequeas pueden eliminarse con rapidez debido a que resultan
retrasadas en todos los geles. El intercambio de tampones puede
realizarse haciendo pasar una disolucin de macromolculas a
travs de una columna equilibrada previamente con el tampn
deseado. Como las macromolculas se mueven con ms facilidad a
travs del gel que los componentes del tampn original, podrn ser
eluidas en el tampn en el qu se ha equilibrado el gel. La
concentracin de macromolculas se logra con facilidad aadiendo
partculas secas de gel y utilizando un tipo cuyo tamao de poro
sea menor que el de las molculas con la que se est trabajando. A
medida que se hinchan los grnulos, absorben el agua pero no las
macromolculas, concentrndose stas ltimas. La mayor parte de
los mtodos de concentracin de macromolculas presenta el
problema de que tambin concentran las sales y una concentracin
excesiva de sales puede alterar (e incluso disociar y desnaturalizar)
algunas macromolculas. Este problema no existe si se utilizan
geles que absorban el agua y las sales.
A continuacin se describen algunos ejemplos especficos de
cromatografa en trabajos preparativos:
1. En la sntesis qumica de algunos reactivos es necesario, en
general, separar el producto de las sustancias iniciales. Por
ejemplo, cuando se preparan anticuerpos fluorescentes haciendo
reaccionar los anticuerpos con isotiocianuro de fluorescena, la
protena conjugada debe separarse del colorante que no ha
reaccionado. Esto puede realizarse con Sephadex, utilizando geles
que permitan el paso de grandes protenas por el espacio vacio. Por
supuesto, no se separa la protena que no ha reaccionado de la
protena conjugada, pero ello no es necesario en la tcnica de los
anticuerpos fluorescentes.

35

2. En la titulacin de enzimas o en la determinacin de los

requerimientos de cofactores, la preparacin de enzimas contiene a
veces inhibidores de pequeo tamao molecular o los mismos
cofactores. Tambin en los estudios fsicos de algunas molculas (p.
e., en la espectroscopia de fluorescencia) pueden estar presentes
sustancias de interferencia. Estas molculas pequeas pueden
eliminarse con facilidad utilizando geles de dextrano o de
poliacrilamida.
3. De forma similar, pueden existir contaminantes de gran tamao
molecular en mezclas en las que estn analizando molculas
pequeas. En estos casos pueden utilizarse dextranos de poro
pequeo. Tambin en ocasiones deben separarse cidos nucleicos
de protenas; esto puede hacerse algunas veces mediante el
empleo de geles de agarosa, que impiden el paso a las protenas y
permiten el paso a los cidos nucleicos por el volumen vaco.
4. En la mayora de los anlisis fsicos de cidos nucleicos, la
muestra debe estar libre de protenas. Esto puede hacerse con
facilidad. Un ejemplo de inters en mi propio laboratorio es la
preparacin de DNA a partir de extractos celulares en crudo, para
el anlisis con el microscopio electrnico, utilizando la tcnica del
citocromo c de Kleinschmidt (vase el captulo 3). Se hacen pasar
pequeas muestras de extractos celulares (25-50l) que contienen
DNA a travs de columnas delgadsimas de Sepharosa, que han
sido equilibradas con la disolucin que se necesita para la
microscopa electrnica. El DNA pasa a travs de la columna en el
volumen vaco con el tampn apropiado, mientras que el resto del
material queda retenido. Despus de la adicin de citocromo c, la
muestra queda lista para la preparacin de microscopa electrnica.
5. El uso ms corriente de la cromatografa en gel es en la
purificacin de protenas. Para purificar una protena a partir de un
extracto celular, es necesario, por lo general, utilizar una secuencia
de procedimientos de separacin basada en parmetros como la
solubilidad en ciertas disoluciones, la carga, el peso molecular y

36

dems. El paso en el que tiene lugar la separacin por tamaos

utiliza, casi invariablemente, la cromatografa en gel.
La cromatografa en gel es tambin un valioso instrumento
analtico. La determinacin de pesos moleculares que se ha citado
anteriormente" es un ejemplo importante. Otros ejemplos son:
1. En el estudio del metabolismo del RNA, algunas fracciones del
RNA se distinguen, en general, por centrifugacin zonal, o an
mejor,

por

electroforesis

en

geles

de

poliacrilamida.

La

cromatografa en gel de agarosa es tambin muy utilizada. En la

figura 8-20 se muestra un ejemplo.
2. Las fracciones proteicas del plasma deben ser, a menudo,
determinadas cuantitativamente para- el diagnstico de algunas
enfermedades humanas. Puede hacerse directamente en geles de
dextrano y se ha desarrollado como una prueba de utilidad en la
macroglobulinemia e hipergiobulinemia.
3. El intercambio de tritio para el examen de la estructura de la
protena o el DNA, requiere que la macromolcula sea separada con
rapidez del

H2O. Esto puede hacerse en unos 10 segundos

utilizando geles cargados, debido a que el

H2O sufre grandes

retrasos en todos los geles. Si se utiliza el menor tamao de poro,

la macromolcula atraviesa con rapidez el gel a travs del volumen
vaco. En la figura 8-21 se muestra un ejemplo.
4. La cromatografa en gel puede utilizarse para el estudio de la
unin entre protenas y molculas pequeas, bien por separacin
del producto de las sustancias de reaccin o bien haciendo pasar la
protena a travs de una columna equilibrada con la molcula
pequea. Un clculo sencillo permite la determinacin de las
constantes de unin. La mejor cualidad de la cromatografa en gel
en los estudios de equilibrios qumicos es que puede funcionar bajo
un amplio margen de concentraciones, pH, fuerza inica y
temperatura, debido a que el tamao del poro del gel no es
afectado por esos factores.

37

4. CROMATOGRFIA EN GEL DE CAPA FINA

La cromatografa en capa fina tiene las ventajas de una rpida
separacin, el empleo de un equipo sencillo y una fcil elucin;
como mtodo analtico, est reemplazando a la cromatografa en
papel. La cromatografa en gel de capa fina (TLG, thin-layer gel)
ofrece

las

mismas

ventajas,

adems

de

todas

aquellas

proporcionadas por la utilizacin de geles.

La cromatografa en gel de capa fina es similar a la cromatografa
en capa fina, en la que se extiende una fina capa de material sobre
una placa de vidrio, se coloca una gota de la muestra y una fase
mvil atraviesa la capa fina. Sin embargo, existen diferencias
importantes:
1. En la cromatografa en capa fina el soporte es deshidratado
antes de colocar la muestra. Sin embargo, en la cromatografa en
gel de capa fina, la muestra se coloca sobre una lmina hmeda
equilibrada con el disolvente apropiado, porque los gales no
pueden ser deshidratados y rehidratados con facilidad.
2. La cromatografa en capa fina se realiza con una fase mvil
ascendente

(vase

la

figura

8-11),

mientras

que

en

la

cromatografa en gel de capa fina se utiliza el mtodo descendente.

La lmina se coloca en una cmara cerrada hermticamente y
conectada con dos depsitos; los dos extremos de la conexin
estn formados por puentes de papel de filtro (figura 8-22). El
lquido fluye a travs de la lmina a una velocidad determinada por
el ngulo (normalmente unos 20). Al igual que en la cromatografa
en capa fina, el proceso termina antes de que el material que
interesa llegue al depsito inferior. Sin embargo, hay un flujo
continuo de lquido, de modo, que, a diferencia de la cromatografa
en capa fina, no existe frente del disolvente. Por consiguiente, no
se miden valores de R, y las posiciones deben determinarse
respecto a estndares aadidos.
4.1 Aplicaciones de la cromatografa en gel de capa fina

38

Mientras que la cromatografa en capa fina se utiliza, sobre todo,

con aminocidos, azcares, oligosacridos, lpidos, esferoides y
otras molculas pequeas, la cromatografa en gel de capa fina se
aplica a protenas, pptidos, cidos nucleicos, nucletidos y otras
sustancias hidroflicas de gran tamao.
El principal uso de la cromatografa en gel de capa fina se
encuentra en la determinacin de los pesos moleculares de
protenas y pptidos. Se obtienen representaciones similares a las
que se encuentran en la figura 8-19, en las que se representa en el
eje y la distancia relativa de migracin. stas proporcionan valores
bastante

precisos,

sobre

todo,

si

se

efectan

varias

determinaciones.
La cromatografa en gel de capa fina se utiliza en el diagnstico
clnico para detectar protenas patolgicas en el suero sanguneo,
lquido cerebroespinal y orina. Tambin es de gran utilidad en la
medida de la pureza de las protenas, enzimas, etc. Tambin se
est desarrollando como una modificacin de la inmunodifusin,
inmunoelectroforesis y electroenfoque.
La bibliografa sobre la cromatografa en gel de capa fina es muy
limitada, pero la utilizacin de este mtodo aumenta con rapidez.
5. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
Un intercambiador inico es un slido que tiene enlazados
qumicamente grupos cargados, a los que se unen iones por
fuerzas electrostticas; puede intercambiar estos iones por iones
de una disolucin acuosa. Los intercambiadores inicos pueden
utilizarse en columnas de cromatografa para separar molculas de
acuerdo con su carga.
El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que
las molculas cargadas se adsorben a los intercambiadores de
forma reversible, de modo que dichas molculas pueden ser unidas
o desunidas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante
intercambiadores inicos se realiza, por lo general, en dos fases: en

39

la primera, las sustancias a separar se unen al intercambiador

utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a
continuacin, se eluye la columna con tampones de diferente pH o
diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn
con el material, por los sitios de unin.
5.1 Propiedades de los intercambiadores inicos
Un

intercambiador

inico

es,

por

lo

general,

un

retculo

tridimensional o matriz que tiene grupos cargados unidos. Si un

grupo est cargado negativamente, podr intercambiar iones
positivos y ser un intercambiador de cationes o catinico. Un
grupo tpico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el
grupo sulfnico, SO3- . Si se une un H+ al grupo, se dice que el
intercambiador se encuentra en forma acida, y puede, por ejemplo,
intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca2+. El grupo cido
sulfnico es un intercambiador de cationes -fuertemente cido.
Otros grupos -de utilizacin corriente son el carboxilo y el hidroxilo
fenlico, dos nter-cambiadores catinicos dbilmente cidos. Si el
grupo cargado es positivo por ejemplo, un grupo amino
cuaternario

es

un

intercambiador

de

aniones

amnico

fuertemente bsico. Los intercambiadores aninicos dbilmente

bsicos ms corrientes son grupos amino alifticos o aromticos.
La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso
ms corriente son el dextrano, la celulosa y copolmeros del
estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno contiene los
grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de poliestireno.
La tabla 8-3 da la composicin de varios intercambiadores inicos
de uso corriente.
La capacidad total de un intercambiador inico es una medida de la
captacin de iones intercambiables y se expresa, por lo general,
como miliequivalentes de grupos intercambiables por miligramo de
peso seco. Este nmero es suministrado por el fabricante y es

40

importante debido a que, si se excede en su capacidad, los iones

pasarn a travs de la columna sin unirse.

Tabla 3
Propiedades de algunos intercambiadores inicos.
Matriz
Dextrano

Intercambiad

Grupo funcional

Nombre

or*
FC

Sulfopropilo

comercial
SP-Sephadex

DC

Carboximetilo

CM-

FA

Dietil-(2-

Sephadex

hidroxipropil)

QAE-

aminoetilo

Sephadex

Dietilaminoetilo

DEAE_Sepha

DA

41

Celulosa

Carboximetilo

dex
CM-celulosa

Fosfo

P-cel

Dietilaminoetilo

DEAE-

Poliletilenimina

celulosa

Dietilaminoetilo,

PEI- celulosa

benzoilado-

DEAE (BND)-

naftolilado

celulosa
PAB

Estireno-

FC

cido sulfnico

celulosa
AG50

DC
FC
DA

Carboxlico
cido sulfnico
Amino terciario

Bio-Rex 70
Bio Rex 40
AG-3

divinilbenceno
Acrlica
Fenlica
Epoxiamina

La capacidad aprovechable es la capacidad bajo unas condiciones

experimentales determinadas (es decir, pH, fuerza inica). Por
ejemplo, la extensin con la que un intercambiador inico est
cargado depende del pH (el efecto del pH es menor con los
intercambiadores inicos fuertes). Otro factor es la fuerza inica,
debido a que los iones pequeos situados cerca de los grupos
cargados compiten con las molculas de la muestra por estos
grupos. Esta competicin es bastante eficaz si la muestra es una
macromolcula, debido a que el elevado coeficiente de difusin del
ion implica un mayor nmero de encuentros. Por lo tanto, conforme
aumenta la concentracin del lampn, la competicin se hace, ms
intensa.
La porosidad de la matriz es una caracterstica importante, debido
a que los grupos cargados se encuentran dentro y fuera de la
matriz. Las molculas mayores pueden ser incapaces de penetrar
en los poros, de forma que la capacidad disminuye segn
aumentan las dimensiones moleculares. La porosidad de las resinas
basadas en el poliestireno se determina por la cantidad de

42

entrecruzamientos producidos por el divinilbenceno (la porosidad

disminuye segn aumenta la cantidad de divinilbenceno). Con las
series Dowex, el porcentaje de divinilbenceno viene indicado por un
nmero situado despus de una X; por lo tanto, Dowex-50-X8
significa que contiene un 8 % de divinilbenceno.
Los intercambiadores inicos vienen en distintos tamaos de
partcula que reciben el nombre de tamao de malla. Las mallas
ms finas presentan una mayor relacin superficie-volumen y, por
lo tanto, aumentan la capacidad del intercambiador. Por otra parte,
las mallas finas implican una velocidad de flujo menor, con lo que
puede aumentar la extensin por difusin.
De entre tal conjunto de intercambiadores inicos con propiedades
tan diferentes carga, capacidad, porosidad, malla se puede
hacer la seleccin del ms apropiado para realizar una separacin
particularmente difcil. En los siguientes apartados se describe
cmo decidir el tipo de material de la columna y las condiciones
para la unin de los iones y la elucin de los mismos.
5.2 Eleccin del intercambiador inico
La primera eleccin que se debe hacer es si el intercambiador ser
aninico o catinico. Si los materiales que se deben unir a la
columna tienen una nica carga (es decir, ms o menos) la eleccin
es clara. No obstante, muchas sustancias (p. e., protenas)
presentan cargas positivas y negativas y su carga neta depende del
valor del pH. En tales casos el factor principal es la estabilidad de la
sustancia a diversos valores de pH. La mayora de las protenas son
estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay un
margen en el que no se desnaturalizan), en el que estn cargadas
positiva o negativamente.
Por lo tanto, si una protena es estable a valores de pH por encima
del punto isoelctrico, se debe utilizar un intercambiador aninico;
si es estable a valores de pH Situados por debajo del punto isoelctrico, debe utilizarse un intercambiador catinico. La eleccin entre

43

intercambiadores fuertes o dbiles tambin est basada en el

efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a
cromatografiar una sustancia dbilmente acida que necesita pH
muy altos o muy bajos para su ionizacin, se requiere un
intercambiador fuerte debido a que ste funciona a pH extremos.
No obstante, si la sustancia es lbil, es preferible la utilizacin de
intercambiadores

dbiles.

Los

intercambiadores

dbiles

son

tambin excelentes para la separacin de molculas con una carga

elevada de aquellas con poca carga, debido a que los iones
dbilmente cargados no se unen, por lo general, al intercambiador.
Los intercambiadores dbiles permiten, asimismo, una mayor
resolucin de las sustancias si las diferencias de carga son muy
pequeas.
Los intercambiadores Sephadex y Bio-gel ofrecen particulares
ventajas para su utilizacin con macromolculas inestables en
condiciones de baja fuerza inica. Como los entrecruzamientos en
estos materiales mantienen la insolubilidad de la matriz aunque
sta sea muy polar, la densidad de los grupos ionizables puede
hacerse varias veces mayor en estos intercambiadores que en los
de celulosa. El aumento de la densidad de carga significa un
aumento de la afinidad, de modo que la adsorcin se puede realizar
a valores ms elevados de la fuerza inica. Por otra parte, estos
intercambiadores retienen parte de sus propiedades de tamizado
molecular, de modo que algunas veces las diferencias de peso
molecular anulan la distribucin ocasionada por las diferencias de
carga.
5.3 Eleccin de la porosidad y el tamao de malla
Las molculas pequeas se separan mejor sobre matrices con
tamao

de

poro

pequeo

(o

sea,

un

elevado

grado

de

entrecruzamientos) debido a que la capacidad disponible es

grande, mientras que las macromolculas necesitan un tamao de
poro mayor. No obstante, excepto con el Sephadex, la mayora de

44

los intercambiadores no deparan la oportunidad de aparejar la

porosidad con el peso molecular.
Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para
la

purificacin

de

molculas

grandes

como

protenas,

polinucletidos. Ello es debido a que la matriz es fibrosa, por lo que

todos los grupos funcionales se encuentran en la superficie y
disponibles, incluso, para las molculas mayores.
La seleccin del tamao de malla es dificultosa. Los tamaos de
malla pequeos mejoran la resolucin pero disminuyen la velocidad
de flujo, lo que incrementa la dispersin zonal y disminuye la
resolucin. Por lo tanto, el tamao de malla se determina, por lo
general, de forma emprica.
5.4 Eleccin del pH, tampn y condiciones inicas
Debido a que los lampones estn formados por iones, tambin
pueden intercambiar y como resultado puede afectarse el equilibrio
del pH. Para evitar estos problemas se adopta la llamada regla de
los tampones: se deben utilizar tampones catinicos con los
intercambiadores

amnicos

tampones

amnicos

con

los

intercambiadores catinicos. Debido a que la fuerza inica es un

factor a tener en cuenta para la unin, debe escogerse un tampn
con elevada capacidad de tamponacin, de modo que su fuerza
inica pueda ser lo suficientemente baja. Adems, para obtener
una buena resolucin se ha encontrado que, por lo general, las
condiciones inicas utilizadas para col-' car la muestra en la
columna

(las

denominadas

condiciones

iniciales)

deben

ser

aproximadamente las mismas que las que se utilizan para la

elucin de la columna.
5.5 Equilibrio de intercambio de iones
Cualquier intercambiador de iones tendr sus grupos cargados
unidos electrostticamente a contratnos, de forma que el conjunto
sea elctricamente neutro. Los distintos intercambiadores pueden

45

mostrar diferente afinidad por unos contraiones u otros. As, un

conjunto de contraiones de uso frecuente en bioqumica, ordenados
de mayor a menor afinidad, para un intercambiador de aniones
genrico, es cfralo > oxalato > Cl- > formiato > acetato > OH-, o,
para un intercambiador de cationes genrico, Ca2+ > Mg2+ > K+
> NH4+ > Na+ > H+. Los otros iones a tomar en cuenta en el
proceso de intercambio son los propios solutos de la mezcla
separar. La mayor parte de las biomolculas son de naturaleza
inica. Los grupos cidos desprotonados aportarn carga negativa,
mientras que la protonacin de los bsicos dar carga positiva. En
el caso particular de los biopolmeros, la presencia de varios grupos
funcional de uno u otro tipo, da cuenta de su carcter de
polielectrlifos, por lo que se podrn comportar como cationes o
como aniones, segn que el pH del medio sea inferior o superior a
su pI, respectivamente.
Supuesto un soluto S de estas caractersticas, a un valor de pH tal
que presente una carga neta, por ejemplo positiva, se podr
escribir para el mismo la siguiente ecuacin de intercambio inico:
Resina - Na + S

Resina - S + Na

donde se ha considerado que el soluto catinico viaja a travs de

una resina intercambiadora de cationes, cuyo contrain es Na+.
El equilibrio anterior vendr gobernado por una constante

Re sin a S Na
Re sin a Na S

cuyo valor concreto estar dictado por las afinidades de la fase

estacionaria por cada uno de los iones en juego, S + y Na+. En estas
afinidades intervienen factores como la carga del ion, su radio de
solvatacin o su polarizabilidad. Considerando constantes estos dos
ltimos factores (sobre los que se tiene poco control), la conclusin

46

primera es que las variaciones del pH del medio que alteren la

carga del soluto, modificarn la posicin del equilibrio anterior,
desplazndolo a la derecha o a la izquierda segn que adquiera
ms o menos carga. Por otra parte, dicho equilibrio podr ser
desplazado en un sentido u otro segn sea la concentracin de Na +
en el medio (ley de accin de masas). As, si el valor de K fuese
muy elevado, el soluto S quedar unido a la resina desplazando a
los iones Na+. Si establecido este equilibrio, se pasa por la columna
una fase mvil con una concentracin muy elevada de Na+ (fuerza
inica elevada), el anterior equilibrio se desplazar a la izquierda,
con el resultado de liberacin del soluto antes retenido.
Para que esta liberacin se produzca, no es imprescindible que el
eluyente contenga una concentracin elevada del mismo ion que
actuaba como contraccin cuando se aplic el soluto. Bastar con
pasar un eluyente con una concentracin suficientemente elevada
de otro ion (ej.: K+), tal que el nuevo equilibrio que se establezca,
Resina - S + K

Resina _ K + S

est desplazado a la derecha. En definitiva, el equilibrio de

intercambio inico puede ser considerado como una competencia
entre los iones que se desplazan por la fase mvil por unirse a los
grupos

cargados

del

intercambiador.

Cuanto

mayor

sea

la

concentracin de un ion dado en la fase mvil, ms grupos

cargados del intercambiador ocuparn, desplazando al ion que se
encuentra en minora.
De lo expuesto se deriva que el pH y la fuerza inica de los
eluyentes son las dos variables experimentales a considerar con
vistas a controlar el equilibrio de cambio de ion. As, aumentando la
fuerza inica del eluyente, van disminuyendo los factores fe de
todos los solutos retenidos. Se puede comprobar que hay una relacin lineal entre fe y la recproca de la fuerza inica, siendo esta
relacin caracterstica de cada uno de los solutos retenidos en un

47

intercambiador. En el lmite, cuando la fuerza inica sea muy

elevada, todos los solutos tendrn fe = O (exclusin de la fase
estacionaria), por lo que no podrn ser resueltos, pero, si se
emplean fuerzas inicas compatibles con la retencin, ser posible
resolver los distintos solutos sin ms que ir modificando la fuerza
inica. En suma, que la elucin con fuerzas inicas programadas
(elucin en gradiente), permite al experimentador un control fino
de la resolucin. De hecho, se pueden separar biopolmeros con
muy pocas diferencias en su carga neta (ej.: resolucin de dos
protenas que difieran slo en uno de sus aminocidos ionizables).
5.6 Aplicaciones de la cromatografa de intercambio inico
En

principio,

cromatografiada

cualquier
con

un

sustancia

cargada

intercambiador

inico.

puede
Las

ser

resinas

intercambiadoras son las ms tiles para las molculas orgnicas

pequeas y pueden utilizarse incluso para separar iones metlicos
(p. e., Ca2+ de Mg2+). Las protenas y los polisacridos se separan
mejor

con

los

intercambiadores

da

celulosa,

dextrano

poliacrilamida. Los intercambiadores de dextrano y poliacrilamida

se han utilizado tambin extensamente en la separacin de
nucletidos,

aminocidos

otras

molculas

pequeas

de

importancia biolgica.

6. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
La

cromatografa de afinidad es un tipo de cromatografa que

utiliza la afinidad especfica entre la sustancia que debe aislarse y

una molcula a la que sta puede unirse de forma especfica (un
ligando). El material de la columna se sintetiza por unin covalente
del ligando (que puede ser una macromolculas o una molcula
pequea) con una matriz insoluble. A partir de este momento la
columna es capaz de adsorber de manera especfica, a partir de la
disolucin, la sustancia que va a ser aislada. La elucin se realiza

48

cambiando las condiciones, de forma que la unin ya no tenga

lugar.
Para poder llevar a cabo la cromatografa

de afinidad deben

comunicarse varias condiciones: (1) la matriz no debe adsorber por

s misma molculas de forma significativa; (2) el ligando debe
unirse a la matriz sin alteracin de sus propiedades de unin; (3)
debe escogerse un ligando cuya unin se fuerte, porque aunque
una unin dbil consiga retrasar la elucin puede no resultar
adecuada para la separacin; (4) debe ser posible elucin la elucin
sin destruccin de la muestra. La matriz ms til es la agasa
(Sepharosa, Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), debido a que presenta
una adsorcin mnima, mantiene unas buenas propiedades de flujo
despus del enlace qumico con el ligando y tolera los extremos de
pH y fuerza inica, as como el cloruro de guanidinio 7M y la urea,
que se necesitan a menudo para una elucin efectiva. Es posible
adquirir agarosa a la cual estn unidos covalentemente reactivos
que

puedan

enlazar

protenas,

membranas

esteroides;

concavalina A, un adsorbe; que preparado para polisacridos y

glucoprotenas

que contengan

residuos

-D-manosilo

y a-D-

glucosilo (p. e., membranas celulares y clulas enteras), lo cual es

una ayuda adicional.
El principal uso de la cromatografa de afinidad hasta el momento
ha sido la purificacin de protenas, membranas y polisacridos. A
continuacin se indican algunos ejemplos:
Purificacin de enzimas: Se puede acoplar a la matriz el
sustrato, un inhibidor que se una con fuerza o un cofactor. Si se
hace pasar a travs de la columna una mezcla de protenas o un
extracto celular crudo, slo permanecern en la columna los
materiales que se unan al ligando. En algunos casos los enzimas
pueden purificarse sustancialmente a partir de mezclas muy
complejas. Sin embargo, debido a que muchos enzimas pueden
unirse al mismo sustrato, slo se consigue una purificacin parcial.

49

Purificacin de anticuerpos: Se ha realizado principalmente con

bromuro de ciangeno-Sepharosa, a los que se han enlazado
diversos antgenos como protenas, virus o albmina de suero
bovino unida a haptenos; ste es el mtodo de eleccin para la
purificacin de anticuerpos.
Purificacin de protenas de transporte: Se utiliza Sepharosa a
la que se acopla la sustancia transportada (p. e., globulinas que
enlazan tiroxina, protenas que enlazan estradiol y receptores de
hormonas y drogas).
Purificacin de membranas y partculas que contienen
sustancias conocidas: Las membranas a las que se une una
hormona

pueden

purificarse

utilizando

Sepharosa

con

dicha

hormona unida; el virus de la gripo, que contiene neuraminidasa,

ha sido purificado utilizando Sepharosa, a la cual se han unido los
inhibidores qumicos de la neuraminidasa.
Purificacin de glucoprotenas: El proceso es eficiente utilizando
concavalina A-Sepharosa.
Separacin de clulas animales especficas: Se ha realizado
utilizando aglutininas unidas a la matriz como concavalina A,
aglutina del germen de trigo o fitohemaglutinina. Por ejemplo,
algunas clulas tumorales inducidas por virus pueden separarse de
las clulas normales debido a que las clulas tumorales se unen
con ms fuerza a la concavalina A-Sepharosa.

6.1 Preparacin de la fase estacionara

La operacin de anclar covalentemente un ligando a una matriz
cromatogrfica consiste bsicamente en los siguientes pasos: a)
Activacin de la matriz o soporte; b) anclaje covalente del ligando;
y c) bloqueo de los grupos reactivos remanentes. En ocasiones,
sobre todo cuando el ligando es de pequeo tamao, su anclaje
covalente a la matriz puede dejarlo poco accesible a los solutos que

50

viajan en la fase mvil. En esos casos es conveniente que el ligando

no se ancle directamente, sino que quede separado de la matriz
por un brazo espaciador. Se da este nombre a una cadena
carbonada

(normalmente

de

seis

carbonos)

que

se

une

covalentemente a la matriz por un extremo, y por el otro al ligando.

Es conveniente que este brazo espaciador tenga suficientes grupos
polares, a fin de no aportar hidrofobicidad a la fase estacionaria. Su
introduccin ha de ser, lgicamente, un paso intermedio entre el a
y el b.
Aun cuando todos los pasos en la preparacin de la fase
estacionaria pueden ser llevados a cabo en el laboratorio, lo ms
cmodo es adquirir soportes cromatogrficos ya activados, y, si se
precisa,

provistos

de

brazo

espaciador.

De

esta

forma,

la

preparacin de la fase estacionaria se limita a los pasos b y c antes

mencionados. Si se decide preparar la fase estacionaria desde el
paso de activacin, lo normal es seguir las instrucciones detalladas
que proporcionan los fabricantes de los soportes.
Los soportes ya activados son, bsicamente, el resultado de una
reaccin qumica por la que se introducen en la matriz grupos
funcionales suficientemente reactivos. Tal reactividad ayuda a que
el posterior anclaje covalente del ligando se pueda realizar en
condiciones suaves, compatibles con el mantenimiento de la
funcionalidad biolgica. A este nivel, se utiliza mucho la activacin
de la agarosa con bromuro de ciangeno (Figura 6.29). En
ocasiones, ms que una activacin como la comentada, lo que se
hace es introducir en la matriz grupos funcionales menos reactivos
(ej.:
amino o carboxilo). En esos casos, la formacin de un enlace
covalente con el ligando en condiciones suaves de reaccin,
requiere el empleo de agentes condensantes del tipo de las
carbodiimidas (Figura 6.29). En el Cuadro 6.7 se muestran los
grupos de activacin o funcionalizacin ms frecuentes en las

51

matrices para cromatografa de afinidad, as como los tipos de

ligandos unibles a cada una de ellas.
El anclaje consiste bsicamente en incubar, bajo agitacin suave, la
suspensin formada por la matriz activada y una disolucin del
ligando. A esta suspensin se le aade la carbodiimida si se precisa
de un agente condensante. Las variables experimentales a
controlar son, pH, fuerza inica, temperatura y tiempo de
incubacin;
estas dos ltimas suelen estar inversamente relacionadas (ej.: para
agarosa activada con CNBr, 2-4 horas a temperatura ambiente o 16
horas en cmara fra a 4 C).
Es imprescindible que en la unin covalente del ligando no queden
involucradas regiones de su molcula que sean cruciales para la
interaccin biolgica, o que, por encontrarse tan prximas al centro
de interaccin, dejen a ste inaccesible. Muchas veces, este
objetivo no se consigue, lo que impide la realizacin de este tipo de
cromatografas. Otras veces, para preservar la capacidad de
interaccin del ligando, se hace preciso reducir su concentracin en
la mezcla de incubacin con la matriz activada. En el mismo
sentido

suele

resultar

efectivo

trabajar

con

matrices

cuya

proporcin de grupos activos sea reducida, bien porque se

adquieren con un bajo ndice de activacin, bien porque se
someten a un proceso previo de desactivacin lenta y controlada.
Cualquiera que sea la opcin, el objetivo es reducir la extensin del
anclaje covalente, fundamentalmente para evitar las uniones del
ligando por mltiples sitios. Estas uniones multipunto suelen ser las
principales responsables de la inactivacin de los ligandos, en
especial cuando se trata de ligandos macromoleculares.
Terminada la incubacin entre el ligando y la matriz cromatogrfica,
se procede a eliminar el exceso de ligando y reactivos por
decantacin o filtracin del sobrenadante, seguido de lavado con
lampn. Ser inevitable que una proporcin indeterminada de
grupos activos de la matriz hayan permanecido sin reaccionar.

52

stos deben ser eliminados para evitar interacciones inespecficas

con los solutos de la muestra. Para ello se suelen bloquear con
aminas o cidos en concentraciones suficientemente altas (0,1 a
1,0 M). La incubacin con lampones catinicos basados en Tris, o
amnicos basados en cido actico, suele ser suficiente. En
esencia, se trata de unir en los sitios remanentes otros NH2
COOH distintos a los del ligando. Tras el bloqueo, un lavado
eficiente, seguido de equilibrado en el lampn adecuado, dejar a
la fase estacionaria lista para ser empaquetada en la columna.
6.2 Aplicacin de la muestra y elucin
Por

regla

general,

el

volumen

de

lecho

cromatogrfico

empaquetado es el necesario para trabajar segn la modalidad 1

descrita en el apartado 6.7.2, o en una modalidad intermedia entre
1 y 2. Cuando se emplean fases estacionarias basadas en ligandos
especficos de grupo (Cuadro 6.6) puede ser necesario trabajar con
columnas ms largas, a fin de resolver diferentes solutos del mismo
grupo que muestren afinidades parecidas por la fase estacionaria.
El lampn de equilibrado se habr escogido de forma que se
favorezca la interaccin biolgica de inters, a la vez que se
reduzcan al mnimo otras interacciones inespecficas. Dada la
elevada

afinidad

interaccionantes,

lo

que
normal

suelen
es

mostrar

trabajar

con

las

molculas

fuerzas

inicas

relativamente elevadas (ej.: NaCl 0,2 M). Una vez aplicada la

muestra, se continuar pasando tampn de equilibrado hasta lavar
todos los contaminantes. El flujo de la columna, durante la
aplicacin de la muestra y su posterior elucin, puede ser una
variable crtica en aquellos casos en que las constantes de
velocidad de las reacciones de asociacin y disociacin sean bajas.
Con carcter general, es recomendable emplear flujos bajos
durante la aplicacin y la elucin, mientras que en los lavados se
podrn utilizar flujos altos.

53

En ocasiones, la unin del soluto de inters es tan fuerte que su

elucin slo es posible bajo condiciones incompatibles con la
funcionalidad biolgica, con lo que habr que excluir el empleo de
este tipo de cromatografa. En situaciones menos extremas, se
podr acudir a eluciones especficas o inespecficas.
Una elucin especfica es la que se consigue cuando la fase mvil
tiene algn agente que compite por unirse al ligando anclado.
Como ejemplo se puede citar la frecuente utilizacin de eluyentes
basados en -alquilglucsidos para la elucin de glicoprotenas
purificadas mediante cromatografa en Con A-agarosa. Este tipo de
elucin especfica ser el preferido siempre que resulte factible.
Obviamente, la columna quedar contaminada por el agente
eluyente empleado, pero ste se podr eliminar por medios ms
drsticos, cuando ya la funcin biolgica no sea una limitacin.
En las eluciones inespecficas se suele acudir a alterar la fuerza
inica del eluyente, o el pH, o incluso la temperatura. A veces es
necesario combinar estos tres recursos, o siendo ms drstico,
alterar la conformacin del ligando, en caso de que ste sea
macromolecular. Como ltima opcin, en caso de que todo lo
anterior fallase, se puede acudir al empleo de agentes caotrpicos
(ej.: KSCN o urea), buscando la desnaturalizacin del sistema
biolgico.

Ello

estar

indicado

en

los

casos

en

que

esta

desnaturalizacin sea reversible, o cuando la conformacin nativa

no sea un requisito para los estudios posteriores.
En resumen, son pocas las reglas generales sobre cmo disminuir
la afinidad entre dos biomolculas interaccionantes. ste es un
terreno dominado por el empirismo, que requerir tomar en
consideracin las peculiaridades de cada sistema biolgico. Para
ilustrar lo expuesto, en la Figura 6.30 se recoge un ejemplo de
purificacin de una protena inhibidora de una enzima, la cual se
utiliz como ligando anclado covalememente.
6.3 Tipos especiales de cromatografa de afinidad

54

A continuacin se describen tres sistemas cromatogrficos que

presentan peculiaridades suficientes para recibir un tratamiento
conceptual diferenciado.
Cromatografa de afinidad sobre metales inmovilizados. Esta
variedad

cromatogrfica

no

se

basa

en

el

concepto

de

funcionalidad biolgica que subyace en otras cromatografas de

afinidad; de ah que muchos autores prefieran englobarla dentro de
otros tipos cromatogrficos, en concreto, dentro del intercambio
inico, en una subvariedad que podra llamarse intercambio de
ligandos. Lo cierto es que la denominacin que aqu se emplea es
la ms aceptada en Bioqumica, y justifica la abreviatura por la que
tambin se la conoce: IMAC (del ingls Immobilized Metal Affinity
Chromatography; tambin conocida como MCAC de Metal Chelate
Affinity Chromatography).
Conviene mencionar que se trata de una cromatografa indicada
para la separacin de protenas. As, explota las propiedades
quelantes de muchas protenas, capaces de formar compuestos de
coordinacin con metales de transicin (ej.: Cu2+, Zn2+, Ni2+,
Co2+). Son las cadenas laterales de histidina, cistena, y triptfano,
actuando como dadores de electrones, las principales responsables
de la capacidad quelante que se comenta.
La puesta a punto de estos sistemas cromatogrficos consiste en
inmovilizar cationes como el Zn2+, el Cu2+ o el Ni2+ en fases
estacionarias provistas de agrupaciones quelantes muy potentes.
Para ello se emplean matrices cromatogrficas con grupos como el
cido iminodiactico (IDA) o el nitrilotriactico (NTA) (Figura 6.31).
El empaquetado de una matriz de este tipo, seguida del paso de un
eluyente conteniendo alguno de los cationes anteriores, deja la
columna cargada con el metal de transicin. La posterior aplicacin
de la muestra conteniendo las protenas de inters se traducir en
la retencin de stas, siempre que la afinidad del metal por el
grupo quelante de la matriz sea superior que por las protenas. Tal
retencin

se

muestra

muy

dependiente

del

pH,

debiendo

55

asegurarse un pH en torno a la neutralidad. A pH alcalinos los

grupos amino de las protenas se encontrarn desproto-nados,
convirtindose en los principales responsables de la unin al metal.
Esta situacin ha de evitarse en IMAC, ya que se trata de favorecer
a las histidinas como principales responsables de la interaccin.
Adicionalmente,

como

forma

de

eliminar

interacciones

electrostticas inespecficas, los lampones de aplicacin y lavado

suelen tener fuerzas inicas elevadas (0,5-1,0 M de NaCl).
La elucin de las protenas retenidas puede llevarse a cabo como
en cromatografa de afinidad, de forma especfica o inespecfica. En
el primer caso, el lampn eluyente ha de contener un agente que
compita con la(s) protefna(s), desplazando-la(s); por ejemplo,
imidazol, histamina o glicocola. Con vistas a separar diferentes
protenas se puede emplear un gradiente de concentracin de
estos agentes, que introduzca la selectividad adecuada. El pH del
lampn de elucin se suele mantener constante a lo largo de todo
el proceso. En el caso de elucin inespecfica, se emplean
gradientes de pH decrecientes, que irn protonando los residuos de
histidina. La selectividad vendr entonces determinada por los
particulares valores de pK de las histidinas. Se puede conseguir una
elucin inespeetfica rpida aadiendo agentes quelantes a los
lampones de elucin. En este caso la selectividad ser nula, y
eluirn conjuntamente todas las protenas retenidas, quedando la
conmina descargada del metal.
Con la adecuada seleccin del metal con que se carga la columna,
y de las condiciones de elucin, se pueden conseguir separaciones
excelentes de mezclas complejas de protenas. Una aplicacin muy
prctica

es

en

el

terreno

de

la

purificacin

de

protenas

recombinantes. stas pueden expresarse con una secuencia

apndice de seis histidinas consecutivas ("6 x His tag"), sin afectar
a sus propiedades funcionales o de secrecin. Esta cola de histidina
muestra

una

elevada

afinidad

en

IMAC-Ni2+,

que

puede

56

aprovecharse para purificar protenas recombinantes en un solo

paso.
Cromatografa de afinidad por unin covalente. A diferencia de las
cromatografas de afinidad, y en general de interaccin, sta se
caracteriza por la retencin de los solutos mediante unin
covalente a la fase estacionaria. A pesar de ello la reversibilidad de
la retencin queda asegurada, ya que se trata de uniones por
puentes disulfuro. Bajo condiciones reductoras suaves (ej.: 2mercaptoetanol o DTT 5-20 mM) se puede conseguir la elucin.
Generalmente, la fase estacionaria est constituida por una matriz
cromatogrfica a la que se ha anclado covalentemente un grupo
tiopropilo o glutation (Figura 6.32). Estas columnas estn indicadas
para la purificacin de protenas con grupos SH, y en general,
compuestos tilicos. La aplicacin de la muestra ha de llevarse a
cabo a un flujo lento, compatible con la cintica de formacin de
puentes disulfuro.
Cromatografa de afinidad de clulas. La misma filosofa que se
aplica a la cromatografa de afinidad de molculas en disolucin, es
aplicable a clulas en suspensin; con las limitaciones inherentes a
la viabilidad celular. Se trata en este caso de trabajar con matrices
cromatogrficas

que

tengan

anclados

ligandos

capaces

de

interaccionar con receptores de membrana, o con glicoprotenas de

membrana (ej.: ConA), o con anticuerpos unidos a la superficie
celular (ej.: Protena A). El grado de divisin de estas fases
estacionarias ha de ser menor que el que se emplea para
cromatografa de molculas; as, se suele trabajar con partculas de
dimetros comprendidos en el intervalo 250-350 m. De esta
forma, se asegura que el tamao de los intersticios sea adecuado
para el paso de las clulas. Los flujos de elucin han de ser
significativamente menores que los empleados con molculas, a fin
de disminuir las fuerzas de cizalla. Generalmente se emplean
eluciones especficas, ya que las variaciones de pH, fuerza inica o

57

temperatura pueden ser incompatibles con la viabilidad de las

clulas.

7. CROMATOGRAFIA DE PENETRABILIDAD
ste es el ms simple, conceptual y metodolgicamente, de todos
los tipos de cromatografa. El nombre que se le ha dado es una
propuesta ms entre las muchas existentes; algunas de ellas son:
cromatografa de filtracin en gel, cromatografa de permeacin en
gel, cromatografa de tamizado molecular y cromatografa de exclusin por tamao. Cuando este tipo de cromatografa se lleva a cabo
en sistemas de alta presin, parece que existe un consenso en
denominarla

como

cromatografa

de

exclusin

por

tamao

(abreviado SEC, del ingls Size Exclusin Chromatography). Sin

embargo, en cromatografa convencional a baja presin, los
nombres mencionados siguen usndose, en especial el de filtracin
en gel. Tal denominacin se considera inadecuada, conceptual e
intuitivamente.

No

es

una

filtracin,

sino

una

autntica

cromatografa lo que tiene lugar. Adems, al pensar en filtracin se

tiende a imaginar que lo ms pequeo es lo primero que se filtra, y
esto es justo lo contrario de lo que ocurre.
La mayor parte de los soportes para esta cromatografa estn
basados en polmeros fuertemente hidroflicos, que, al ser puestos
en contacto con agua, adquieren el aspecto de un gel. En los
soportes que se usan en Bioqumica, tales polmeros suelen ser
polisacridos (dextranos o agarosa) o poliacrilamida, o mezclas de
ellos/ Los fabricantes de estos soportes someten a estos polmeros
a reacciones con agentes bifuncionales que entrecruzan las fibras
individuales/El slido resultante lo fragmentan hasta quedar en
forma de micropartculas esfricas. Finalmente, mediante una
operacin de criba, clasifican las micropartculas por intervalos de
dimetro. En el Cuadro 6.4 se detallan los soportes de este tipo

58

ms empleados en Bioqumica, especificando el nombre comercial

por el que normalmente se los conoce.
Las micropartculas en que estn divididos estos soportes son
esferas

formadas

por

enrejados

de

fibras

del

polmero

correspondiente. Los huecos o poros de estos enrejados tendrn un

tamao determinado por la concentracin de fibras y su grado de
entrecruzamiento. En suma, las micropartculas esfricas son como
esponjas. Este smil es especialmente vlido, ya que, adems de
ser huecas, al ponerse en contacto con el agua se hinchan
considerablemente. En un lecho cromatogrfico empaquetado con
un soporte de estas caractersticas, habr que considerar que hay
lquido, no slo en los intersticios entre partculas, sino tambin en
el Interior de las mismas. Al abrir la salida del eluyente, el lquido
en los intersticios se desplazar con la velocidad de la fase mvil. El
lquido atrapado por las partculas del gel no, sufrir este arrastre,
protegido como se encuentra por el entramado de fibras que acta
como matriz de contencin. En esencia, este lquido intern se
comporta

como

la

fase

estacionaria

en

cromatografa

de

penetrabilidad.
Para formarse una buena idea de la oquedad de las partculas,
basta considerar que con ciertos tipos de geles, ms del 85% del
lecho empaquetado es lquido. En otras palabras, que el volumen
ocupado por las fibras de polmero (lo nico slido dentro de la
columna) es muy pequeo en comparacin con el volumen total del
lecho

cromatogrfico

(Figura

6.15).

Este

volumen

total,

V T,

calculable a partir del dimetro de la columna, , y de la altura del

lecho, L, ser
. 2
. L V0 Vi V g
4

Donde: V0, volumen de los intersticios entre partculas o volumen

de exclusin; Vb, volumen interno de las partculas de gel, o

59

volumen de fase estacionaria; Vg, volumen ocupado por las fibras

del polmero. Dado que Vg, es considerablemente menor que VT, es
fcil intuir la gran esponjosidad de estos geles. En consecuencia,
son geles blandos que slo pueden emplearse con bajas presiones
hidrostticas, so pena de colmatacin y deterioro de la matriz.
En cromatografa de penetrabilidad hay que cambiar un poco los
conceptos que se venan manejando. As, no hay que considerar
que la fase estacionaria permanece completamente esttica
durante el proceso cromatogrfco. El eluyente puede acceder al
interior de las micropartculas; a fin de cuentas, la composicin de
la fase estacionaria y el eluyente es la misma. Pero, este acceso del
eluyente al volumen interno, Vi, no es la consecuencia del flujo
dictado por la presin hidrosttica o el bombeo peristltico. Es la
difusin de las molculas del eluyente hacia el interior de las
partculas del gel la que da cuenta de la progresiva renovacin de
la fase estacionaria. Por tal motivo, si se pretende desplazar todo el
volumen interno o fase estacionaria de un lecho cromatogrfico de
este tipo, y para ello se empieza a pasar eluyente, caben dos
opciones: o que el flujo de eluyente sea muy rpido en comparacin con la velocidad de difusin al interior de las partculas, o
que sea lento. En este segundo caso, es fcil ver que la renovacin
completa de la fase estacionaria se habr producido cuando el
volumen de eluyente pasado por la columna sea igual a
V0 + Vi = Vt
donde V, es el smbolo empleado para hacer referencia al volumen
total de lquido contenido en el lecho cromatogrfico. Obviamente,
Vt = VT Vg
En el caso de que el flujo de eluyente sea muy rpido en
comparacin con la difusin de sus molculas, puede resultar que
la cantidad de eluyente necesaria para la renovacin completa de
la fase estacionaria sea superior a la calculada a partir de (6.23).
En la prctica esto no es deseable, y obliga al empleo de flujos rela-

60

tivamente bajos, como corresponde a una tcnica donde la

distribucin de los solutos en V, viene gobernada por la difusin.
En efecto, pinsese en el caso de un soluto cuyas molculas fuesen
de un tamao tan grande que no pudieran penetrar por el
entramado de fibras de las partculas del gel. Tales molculas no se
distribuiran en absoluto en la fase estacionaria, vindose en todo
momento obligadas a viajar por los espacios intersticiales. Esta
situacin sera radicalmente distinta a la de un soluto de molculas
tan pequeas que no encontraran restriccin alguna, no slo para
desplazarse por los espacios intersticiales, sino tampoco para
difundir a los espacios internos. En todo momento, la concentracin
de estas molculas pequeas seria la misma dentro y fuera de las
partculas, sto es, en los volmenes V0 y Vi.
Para diferenciar estas dos situaciones extremas se suele utilizar el
coeficiente de reparto, Kav, definido como la proporcin del volumen
interno que le resulta accesible a una molcula de soluto:

K av

Vacc
Vi

donde Vacc es el volumen interior de las partculas de gel al que

puede acceder un soluto dado. En el caso del soluto de gran
tamao antes mencionado, Vacc = 0 (Kav=0), mientras que para el
soluto pequeo, Vacc =Vi (Kav = 1).
En

la

prctica

podrn

encontrarse

situaciones

como

las

comentadas, o intermedias entre ellas. Por tanto, con carcter

general, 0 Vacc Vi y 0 Kav < 1. Es fcil ver que el volumen de
elucin de un soluto vendr dado por
Ve =V0 + Vacc
y, de acuerdo con (6.25),
Ve=V0 +Kav Vi
El soluto excluido de la fase estacionaria (Kav = 0) presentar un
volumen de elucin igual a V0, lo que explica que a este volumen

61

se le conozca como volumen de exclusin. Por su parte, un soluto

tan pequeo que Kav = 1, eluir con Ve = V0 + Vi=Vt.
Para geles muy porosos Vg << VT, y, de acuerdo con la expresin
(6.24), se puede asumir que V t VT. Lo anterior tiene una inmediata
aplicacin prctica: en cromatografa de penetrabilidad se ha de
cumplir que, una vez aplicada la muestra, el paso de un volumen
de eluyente igual al volumen geomtrico del lecho cromatogrfico,
debe traducirse en la elucin de todos los solutos presentes en la
muestra (Figura 6.16). Si tal circunstancia no se cumple, y se
observa la aparicin de picos con V e > Vt cabe pensar que alguno
de los solutos se ha visto retrasado por factores ajenos a su
penetrabilidad (ej.: adsorcin sobre las fibras del polmero).
A partir de las expresiones (6.23) y (6,26), la (6.25) se transforma
en

K av

Ve V 0
Vt V0

que permite el clculo del coeficiente de reparto de un soluto cuyo

pico de elucin se centre en el volumen V, (Figura 6.17), siempre
que se conozcan los valores de V0 y Vt. Tanto uno como otro
dependen de las dimensiones del lecho cromatogrfico, y habrn
de ser determinados experimentalmente para cada columna. Una
vez determinados, se puede asumir que sus valores permanecen
constantes durante el tiempo de vida til de la columna, con tal de
que no se produzca ninguna alteracin en el empaquetado, ni
deterioro del soporte. Peridicamente convendr reevaluar V g como
forma de asegurar lo anterior.
7.1 Coeficiente de reparto y tamao molecular
En el apartado anterior, para explicar las diferencias en los
coeficientes de reparto de diferentes solutos se ha acudido a los
conceptos de exclusin o penetrabilidad en relacin con el tamao

62

de las molculas. Un anlisis en mayor profundidad obligara a

tratar la penetrabilidad como una funcin, no slo del tamao, sino
tambin de la forma molecular. Ambos parmetros estn presentes
en lo que se conoce como dimetro hidrodinmico de una
molcula.
Para entender el concepto que hay detrs de este parmetro hay
que recordar que las molculas en disolucin estn en continuo
movimiento traslacional y rotacional. Como consecuencia de sus
rpidos movimientos rotacionales en las tres direcciones del
espacio, las molculas se comportan como si ocuparan ms
volumen que el definido por sus dimensiones geomtricas. En
concreto, ese volumen de influencia descrito por el volteo continuo
tendra

forma

esfrica,

cuyo

dimetro

seria

el

dimetro

hidrodinmico. Si una molcula fuese esfrica, su dimetro sera el

propio dimetro hidrodinmico, pero si la molcula fuese alargada
el dimetro hidrodinmico seria tanto mayor cuanto mayor fuera el
tamao de la .molcula y/o cuanto ms alargada fuese. Se entiende
pues, que el dimetro hidrodinmico informa sobre el tamao y la
forma.
Cuando una molcula de soluto se acerca al enrejado de las
partculas del gel para penetrar en su interior, lo har con ese
rpido movimiento de volteo en todas las direcciones. Si consigue
traspasar el enrejado ser porque su dimetro hidrodinmico es
menor que el del poro. En suma, es el dimetro hidrodinmico el
parmetro molecular que determina el coeficiente de reparto de un
soluto.
En el caso de muestras cuyos solutos constituyentes tuvieran todos
la misma forma (ej.: una disolucin de protenas globulares, cuyas
formas redondeadas fuesen similares a esferas), el dimetro
hidrodinmico

de

cada

uno

de

ellos

estara

directamente

relacionado con su tamao. En otros trminos, el coeficiente Kav

estara inversamente relacionado con la masa molecular de cada
soluto. Se comprueba empricamente que tal relacin muestra un

63

perfil sigmoidal en las representaciones semilogartmicas de masa

molecular frente a Kav. (Figura 6.18)
Sera predecible que el perfil fuese lineal en todo el intervalo
definido por dos valores extremos de masa molecular; un valor
mximo por encima del cual los solutos eluyesen a V 0 (Kav = 0), y
un valor mnimo, por debajo del cual eluyesen a V t (Kav = 1). Este
comportamiento terico es el que se muestra en lnea discontinua
en la Figura 6.18. Los vrtices de esta representacin terica
definen el llamado intervalo de fraccionamiento de un gel. Es sta
una propiedad intrnseca de cada gel, que depende de cul sea el
tamao promedio de sus poros y la distribucin de tamao de
stos.

En

el

Cuadro

6.4

se

muestran

los

intervalos

de

fraccionamiento de soportes comerciales para cromatografa de

penetrabilidad.
En la prctica, los perfiles sigmoidales como el de la Figura 6.18
tienen una porcin central (Kav = 0.2 - 0.8) que puede ser
considerada lineal. Ello tiene utilidad en la estimacin de masas
moleculares mediante cromatografa de penetrabilidad.
7.2 Estimacin de masas moleculares
La metodologa a seguir es bien sencilla. Se procede primero a
calibrar la columna, operacin que consiste en aplicar una mezcla
de solutos de masas moleculares conocidas, y que se encuentren
dentro del intervalo de fraccionamiento de la columna a calibrar. El
perfil de elucin obtenido para esta mezcla conocida proporcionar
los Ve de cada uno de los solutos. A partir de estos valores ser
posible calcular los respectivos coeficientes Kav (expresin 6.28),
supuestos conocidos V0 y Vt. La representacin semilogartmica de
los masas moleculares de los solutos frente a sus respectivos Kav
proporcionar la recta de calibrado. El resto es sencillo; se aplica la
muestra problema que contiene el soluto cuyo masa molecular se
desea estimar, se determina su Ve, y a partir de l, Kav; se interpola
este valor en la recta de calibrado, con lo que se determina la masa

64

molecular buscada. El conjunto de operaciones a realizar se

resumen en el ejemplo prctico que se recoge en la Figura 6.19.
Con frecuencia, estos anlisis se llevan a cabo sin calcular los
valores de

Kav, sino utilizando en su lugar los cocientes V e/V0, o

incluso utilizando slo Ve. Tal forma de operar obliga a trabajar

siempre con la misma columna (mismo V0, mismo Vt).
La mxima utilidad de esta evaluacin cromatogrfica de masas
moleculares de protenas se obtiene cuando se combina con la
correspondiente

determinacin

mediante

PAGE-SDS).

La

comparacin entre la masa molecular de la protena nativa y la de

la protena desnaturalizada permite obtener conclusiones sobre su
estructura cuaternaria.
7.3 Aplicaciones preparativas
La cromatografa de penetrabilidad presenta una baja capacidad
resolutiva. Ello se debe a que la difusin es la causa ltima de la
separacin, y, por tanto, la difusin axial (apartado 6.15) reviste
una

importancia

considerable,

que

se

llega

traducir

en

ensanchamientos de las zonas de elucin de hasta diez veces o

ms respecto al tamao de la zona de aplicacin. Frente a estas
desventajas,

una

gran

ventaja

de

la

cromatografa

de

penetrabilidad es que impone muy pocas restricciones en cuanto a

la composicin de la fase mvil. Concretamente, las nicas de
obligado cumplimiento son las relativas a los pH y temperaturas
compatibles

con

la

estabilidad

del

gel.

As,

la

elucin

en

cromatografa de penetrabilidad se suele llevar a cabo en

condiciones suaves (las ms suaves de entre todos los tipos de
cromatografa), lo que hace que sea la ms compatible con la
preservacin del estado conformacional de los biopolmeros.
La seleccin del soporte y de la longitud del lecho cromatogrfico,
vendr determinada por la naturaleza del problema, esto es, por el
dimetro hidrodinmico del soluto que se pretende purificar. Puesto
que tales factores no se suelen conocer a priori, puede ser
necesario llevar a cabo eluciones exploratorias, utilizando columnas

65

cuyo intervalo de fraccionamiento sea muy amplio, y a ser posible

calibradas. El perfil de elucin que se obtenga (ej.: A 280 de las
fracciones recogidas, en el caso de mezclas de protenas),
informar sobre la distribucin de tamao de los componentes en
la mezcla problema. Ser de gran utilidad disponer de algn ensayo
especifico (ej.: ensayo enzimtico) para el biopolmero cuya
purificacin se pretende. Ello permitir dilucidar qu relacin
guarda con el resto de componentes contaminantes (Figura 6.20).
Finalmente, una precaucin de tipo prctico a tener en cuenta, no
slo en cromatografa de penetrabilidad, sino en todos los tipos de
cromatografas, es que el eluyente no absorba intensamente en el
intervalo de longitudes de onda a emplear para la deteccin y
cuantficacin espectrofotomtrica de los solutos.

7.4 Criterio de pureza

La forma del pico de elucin de un soluto es el primer criterio para
valorar la calidad con que se ha separado. sta ha de mostrar un
perfil gaussiano simtrico, como corresponde a una distribucin
zonal ideal.
Para un soluto puro, la falta de simetra en su pico de elucin indica
una baja calidad del empaquetado. La asimetra de un pico se suele
cuantificar midiendo la separacin de cada rama de la gaussiana
respecto al eje central. Esta medida se lleva a cabo a una altura,
desde la lnea base, del 10% de la altura total. Si el cociente de las
dos distancias (derecha/izquierda) es superior a 1,5, la columna
debe ser reempaquetada.
Si esto se puede descartar y, sin embargo, el pico es asimtrico,
cabra pensar en la existencia de dos o ms solutos eluyendo tan
prximos que sus mximos no aparecen resueltos. Lo ms normal
es que estos solutos estn presentes en distintas concentraciones,

66

por lo que el perfil de elucin que englobe sus distribuciones

zonales podr resultar asimtrico (Figura 6.21). En el supuesto de
que casualmente dos solutos no resueltos estn presentes en la
misma concentracin, el perfil de elucin conjunto podra resultar
simtrico, pero probablemente presentar una anchura superior a
la esperable.
La cromatografa de penetrabilidad proporciona un criterio de
pureza negativo ms severo que otros tipos de cromatografa. Ello
tiene que ver con la ausencia de interacciones entre solutos y fase
estacionaria. En el resto de tipos cromatogrficos, el pico de
elucin de un soluto puro puede presentar cierta asimetra (lo que
se

conoce

atendiendo
estacionaria

como
a

la

con

cabeceo

dependencia
la

coleo),

que

de

interaccin

concentracin

la
de

puede

soluto.

explicarse
soluto-fase

Cuando

esta

dependencia es lineal, el perfil de elucin suele ser simtrico y

resulta vlido lo expuesto; sin embargo, para dependencias no
lineales (lo que suele ocurrir con cierta frecuencia), la asimetra de
los picos de elucin est asegurada, tanto ms cuanto mayor sea la
concentracin del soluto en la muestra aplicada. La conclusin es
inmediata, la asimetra de un pico no puede emplearse como
criterio para negar la pureza de una muestra, salvo que se pueda
asegurar una interaccin lineal en las cromatografas de adsorcin,
o cuando se trate de un pico de elucin de cromatografas de
penetrabilidad, donde la adsorcin no ha de jugar ningn papel.
Analizar la forma de los picos requiere disponer de un registro
grfico, por ejemplo medidas de absorbancia del eluido. Si este
registro, que mide una propiedad general de los solutos (ej.: A280 de
las protenas), se combina con otro registro ms especfico (ej.:
ensayo de una actividad enzimtica en las diferentes fracciones del
eluido), se podr obtener un criterio de pureza ms estricto. La
Figura 6.22 ilustra la utilidad de estos registros combinados.
7.5 Desalado de muestras. Cambio de disolvente

67

Una til aplicacin de la cromatografa de penetrabilidad en el

terreno preparativo es el desalado y/o cambio de disolvente. Aqu,
el papel que ejerce el gel cromatogrfico no es separar diferentes
biopolmeros entre s, sino separarlos del disolvente o las sales que
le(s) acompaen.
Determinados

geles

(Cuadro

6.4),

estn

formados

por

un

entramado de fibras tan tupido, que slo los solutos de pequeo

tamao podrn acceder al Vi. Casi cualquier biopolmero presentar
un Kav = 0 en una columna empaquetada con estos geles. Si, en
una columna de estas caractersticas, se aplica una disolucin de
biopolmeros

cuyo

disolvente

sea

un

tampn

salino,

los

biopolmeros eluirn con Vt, mientras que las sales (Kav = 1) eluirn
con Vt. Los biopolmeros quedarn disueltos en la fase mvil en que
se encontraba equilibrada la columna en el momento de la
aplicacin.
Un efecto similar de desalado se habra conseguido mediante la
clsica operacin de dilisis, slo que en sta el tiempo requerido
habra sido mayor. En efecto, la columna cromatogrfica que se ha
de emplear para un desalado como el descrito no ha de ser muy
larga, pues se trata de separar dos componentes con K av, extremos.
En la prctica basta con emplear columnas de unos pocos cm, cuya
elucin se produce en unos pocos minutos (5-10 min).
Una lgica extensin de la aplicacin anterior es el cambio de
disolvente o tampn en el que est disuelto un biopolmero, o una
mezcla de ellos.

8. CROMATOGRAFIA HIDROFBICA
Tanto sta, como el resto de cromatografas de interaccin que se
comentan

en

los

siguientes

apartados,

comparten

con

la

68

cromatografa de intercambio inico los mismos planteamientos

experimentales: retencin de los solutos en la columna y posterior
elucin mediante cambios en la composicin de los eluyentes.
La interaccin hidrofbica no es una interaccin en s misma, sino
el resultado de la asociacin entre regiones apelares promovida por
entornos acuosos. Esta agregacin hidrofbica est favorecida
termodinmicamente por el aumento de entropa que supone. En
efecto, la solvatacin de las superficies hidrofbicas requiere que
las molculas de agua implicadas adopten un orden estricto. Al
interaccionar las regiones hidrofbicas entre s, su superficie
expuesta disminuye, y con ello el nmero de molculas de agua
ordenadas; en suma, disminuye el orden global. De aqu se derivan
dos conclusiones de importancia prctica: a) La solvatacin inica
disminuye el nmero de molculas de agua disponibles para
solvatar

las

superficies

hidrofbicas;

la

consecuencia

es

el

favorecimiento de las interacciones hidrofbicas por las fuerzas

inicas altas, b) El carcter entrpico de las interacciones
hidrofbicas, justifica que se vean favorecidas por aumentos en la
temperatura.
En una columna de interaccin hidrofbica las muestras que se
apliquen han de contener iones en suficiente cantidad para
favorecer la retencin de los solutos. Ahora bien, no todos los iones
favorecen por igual las interacciones hidrofbicas;
incluso, determinados iones las desfavorecen. A continuacin, se
listan diferentes aniones y cationes en orden decreciente de su
capacidad favorecedora de las interacciones hidrofbicas:
(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+
En estas series, los iones ms a la izquierda son los que mayor
orden inducen en la estructura del agua (anticaotrpcos o
cosmotrpicos), mientras que los de la derecha provocan desorden

69

(caotrpicos). Se entiende que cuanto menos caotrpico sea un ion

ms favorezca las interacciones hidrofbicas, como forma de disminuir el urden molecular global de la disolucin.
En general, todos los biopolmeros tendrn un mayor o menor
grado de hidrofobicidad, lo que hace que este tipo de cromatografa
pueda ser utilizado para muy diversos problemas experimentales.
Centrando

la

discusin

en

el

caso

de

las

protenas,

su

hidrofobicidad global vendr determinada por el nmero de

aminocidos apelares que tengan. Para una protena plegada en su
conformacin nativa, la mayor parte de estos aminocidos se
encontrarn interaccionando hidrofbicamente en el interior del
glbulo proteico. Sin embargo, siempre pueden quedar aminocidos ms o menos hidrofbicos en la superficie, expuestos al
medio acuoso. La hidrofobicidad de estos aminocidos expuestos
es la que da cuenta de la interaccin en cromatografa hidrofbica.
En

otras

palabras,

se

trata

de

una

cromatografa

no

desnaturalizante, en la que se preservan las estructuras terciaria y

cuaternaria de las protenas.
Uno de los factores que permiten hablar de la cromatografa
hidrofbica como una cromatografa no desnaturalizante, es el
empleo de fases estacionarias de moderado carcter hidrofbico,
en

contraste

estacionarias

con

la

elevada

empleadas

en

hidrofobicidad

cromatografa

de

de

las

fase

fases
inversa

(apartado 6.14.3). En cromatografa hidrofbica se suele trabajar

con fases estacionarias basadas en polmeros hidroflicos (ej.:
agarosa,

polmeros

acrlicos),

los

que

se

han

unido

covalentemente grupos hidrocarbonados como metilo, butilo o

fenilo. Cuanto mayor sea la longitud de la cadena hidrocarbonada,
mayores sern los factores k de los solutos. En el caso del grupo
fenilo, ste puede afectar a la retencin de los biopolmeros, no
slo por hidrofobicidad, sino tambin por interacciones - con sus
residuos

aromticos,

lo

que

puede

producir

inversiones

de

selectividad.

70

En cromatografa de interaccin hidrofbica, gran parte de las

veces, las muestras que se aplican proceden de un paso previo de
precipitacin con sulfato amnico; de este modo se asegura que la
muestra se encuentre en condiciones idneas para su retencin. Si
no es as, se aadir a la muestra dicha sal o NaCl, hasta alcanzar
una fuerza inica suficientemente alta y compatible con la
solubilidad de los componentes (ej.: (NH4)2SO4 2M NaCl 4M).
El pH, tanto de la muestra como de los tampones de equilibrado y
elucin suelen fijarse en torno a la neutralidad, como forma de
preservar la conformacin nativa.
La elucin se puede llevar a cabo mediante gradientes continuos o
discontinuos de fuerza inica decreciente, en general a base de
(NH4)2SO4 (Figura 6.28). Alternativamente se puede acudir al
empleo de sales caotrpicas (ej.: KSCN), si bien ello puede conducir
a desnaturalizaciones. El empleo de gradientes de pH es otra
alternativa. Se tratar entonces de variar el pH en el sentido de
aumentar la carga neta de los solutos, hacindolos ms hidroflicos.
Finalmente,

la

disminucin

de

temperatura

tambin

puede

emplearse con vistas a favorecer la elucin.

Las elevadas concentraciones salinas de los eluyentes introducen
ciertos inconvenientes en cromatografa hidrofbica. A saber: a)
dificultad de deteccin mediante medidas de absorbancia en el UV;
b) desviaciones en las lneas bsales de los cromatogramas por las
importantes variaciones en el ndice de refraccin de los eluyentes
al pasar de alta a baja fuerza inica; c) elevada viscosidad de los
eluyentes, que se traduce en ensanchamiento de los picos
(apartado 6.15); d) ensanchamientos adicionales por cambios en
los estados de agregacin y conformacin de los biopolmeros al
variar la fuerza inica; e) necesidad de emplear sales de muy
elevada pureza, dadas las elevadsimas concentraciones en que se
manejan.

71

CAPITULO
III
72

TECNICAS CROMATOGRAFICAS

1. CROMATOGRAFIA PLANA
La cromatografa plana, la integran un conjunto de tecnicas
ampliamente difundidas por la sencillez del equipo experimental
requerido, que pueden considerarse incluidas dentro de la
cromatografa liquida (LC) debido a que la fase mvil es liquida.
En ella, la fase estacionaria no se encuentra en el interior de una
columna sino extendido en una superficie plana y la fase mvil
liquida se desplaza por capilaridad o por adsorcin.
En funcin del tipo de superficie que actue como soporte, e pueden
distinguir dos tipos fundamentales de cromatografa plana:

La cromatografa de papel

La cromatografa en capa fina

73

1.1 CROMATOGRAFA EN PAPEL

La cromatografa de reparto puede realizarse en columnas de
celulosa. La cromatografa en papel es una variante de este
mtodo, en la que el soporte de celulosa adopta la forma de' una
hoja de papel. La celulosa contiene una gran cantidad de agua
enlazada, incluso cuando ha sufrido procesos de deshidratacin. El
reparto tiene lugar entre el agua y el disolvente de revelado. A
menudo este disolvente es tambin agua, por lo que cabe preguntarse si realmente el modo de accin en este caso es por
adsorcin o no. Seguramente existen efectos de adsorcin pero,
debido a que la estructura fsica del agua enlazada es muy
diferente de la del agua libre, todava puede producirse un
reparto.

Mtodo experimental de la cromatografa en papel

Acompaando al cambio en la forma del soporte (de columna a
papel) tambin tiene lugar un cambio en la metodologa. En la
cromatografa en papel no hay efluente y las sustancias se
distinguen entre s por sus posiciones relativas en l papel despus
de que el disolvente ha recorrido una distancia dada.
Se coloca un volumen diminuto (aproximadamente de 10 a 20 A)
de la disolucin de la mezcla que se debe separar, en un punto
marcado en una tira u hoja de papel (figura 8-6) y se seca. El punto
define el origen. A continuacin, el papel se coloca en una cmara
cerrada y uno de sus extremos se sumerge en un disolvente
apropiado (la fase mvil): La capilaridad arrastra al disolvente a
travs del papel y disuelve la mezcla cuando pasa por el origen,
con lo que los componentes se mueven en la direccin del flujo del
disolvente. (Obsrvese que, debido a la disolucin previa de la

74

muestra al comienzo de la migracin de sus componentes, uno de

los factores que determina la separacin de los componentes es la
velocidad de solubilizacin de los mismos dentro de la fase mvil.)
Despus de que el frente del disolvente haya alcanzado un punto
situado cerca del otro extremo del papel (vase la figura 8-6), se
saca la hoja de la cmara y se seca. Las manchas, que pueden ser
visibles o no, se detectan a continuacin y se marcan sus
posiciones. La distancia relativa recorrida por una mancha con
respecto a la distancia recorrida por el frente del disolvente, se
denomina Rf. Los valores que adopta Rf dependen de la sustancia,
del papel y del disolvente utilizado. Los cromatogramas en papel
pueden ser revelados por flujos ascendentes o descendentes del
disolvente. En la figura 8-7 se muestra la disposicin experimental
para cada uno de los dos tipos. Hay muy poca diferencia en la
calidad de los cromatogramas y la eleccin, por lo general, es
cuestin de preferencias personales. La cromatografa con flujo
descendente tiene dos ventajas:
(1) es ms rpida debido a que la .gravedad ayuda al flujo.
(2) en las separaciones cuantitativas de materiales que poseen
valores de Rf muy pequeos y que, por lo tanto, requieren
recorridos largos, el disolvente puede recorrer todo el papel.
Presenta la desventaja de que el aparato debe montarse con
cuidado, ya que la existencia de suciedad o un mal contacto en la
zona en la que el papel pasa al otro lado de la varilla soporte,
puede ocasionar un flujo no homogneo y el subsiguiente flujo
acanalado.
Una variante muy til es la cromatografa bidimensional en papel.
En este mtodo, despus de haberse realizado la cromatografa en
una direccin, se seca el papel y se vuelve a cromatografar en
ngulo recto con respecto a la direccin original del flujo, utilizando
un disolvente diferente (figura 8-8). De esta forma las sustancias

75

que no se separan en el primer disolvente, pueden separarse en el

segundo disolvente.
Deteccin e identificacin de las manchas
Las manchas en los cromatogramas de papel pueden detectarse
por su color, fluorescencia, por las reacciones qumicas que tienen
lugar tras pulverizar el papel con distintos reactivos, o por la
radiactividad de las manchas (figura 8-9). La deteccin de las
manchas por medio de la autorradiografa utilizando pelcula de
rayos X, se ha descrito en el captulo 6. La identificacin se basa,
por lo general, en la comparacin con estndar de R, conocido o
por elucin. La elucin se realiza recortando la mancha y
sumergiendo el papel en el disolvente apropiado; esto puede
hacerse a menudo de una forma cuantitativa.
Huellas

dactilares:

una

aplicacin

especial

de

la

cromatografa en papel al estudio de las protenas

Un problema importante de la biologa molecular consiste en
identificar una protena una vez aislada o en identificar el lugar
donde ha cambiado un aminocido en una protena mutante. La
tcnica de la huella dactilar, desarrollada por Vemon Ingram,
permite realizar identificaciones de una forma relativamente
sencilla.
Si se digiere una protena bajo condiciones definidas con varias
proteasa

(enzimas

que

rompen

los

enlaces

peptdicos),

se

producen pptidos pequeos. El nmero y los tipos de pptidos

dependen de la protena y de la proteasa utilizadas (p. e., una
proteasa dada hidroliza los enlaces slo junto a un aminocido o
una

clase

de

aminocidos

concreta).

Los

pptidos

pueden

separarse por cromatografa bidimensional en papel dando una distribucin de manchas, que raramente puede estar duplicada por
una protena distinta. Estos mapas de pptidos reciben el nombre
de huellas dactilares en la figura 8-10 se muestra un ejemplo.
76

La huella dactilar de una protena mutante con un nico cambio de

aminocidos se diferencia de la huella de la proteina normal (figura
8-10). Si el cambio de aminocido no afecta al lugar de rotura de
enlaces por la proteasa, puede desaparecer una mancha en la
huella dactilar y aparecer una nueva mancha. Si el cambio afecta
al lugar de rotura de los enlaces, pueden sufrir alteraciones varias
manchas. Por elucin de las manchas original y mutante y por
determinacin de la composicin de aminocidos de cada una (que
puede realizarse mediante una hidrlisis enzimtica seguida por
cromatografa en papel), pueden determinarse los aminocidos
intercambiados.
La tcnica de huellas dactilares ha tenido aplicaciones
importantes en la biologa molecular; entre ellas, pueden
mencionarse las siguientes:
Prueba de que una protena es un producto de la degradacin de
otra protena mayor. Si todas las manchas de la huella dactilar de
la protena A se encuentran en la de la protena B, es probable que
la protena A sea una parte de la secuencia de aminocidos de la
protena B. Por lo tanto, o la protena B se origina a partir de la A
por adicin de aminocidos o la protena A aparece por hidrlisis de
la protena B. En general, los estudios de la cintica "de la sntesis
de A y B permiten distinguir entre estas posibilidades.
Identificacin de los aminocidos insertados por diversos
RNA de transferencia supresores.
Algunas mutaciones ocasionan una terminacin prematura de la
secuencia de aminocidos en las protenas. Tal terminacin puede
ser revertida por la presencia de molculas de tRNA-supresoras.
Estas molculas insertan un aminocido en el lugar de terminacin
y permiten, por lo tanto, la continuacin de la sntesis hasta su
final natural. El resultado es una protena con un cambio en un
aminocido. Las huellas dactilares de .tales protenas permiten la

77

identificacin del aminocido insertado por cada i uno de los tRNA

supresores conocidos.
Identificacin de los cambios de bases producidos por mutgenos
determinados. Debido a que se conoce la clave gentica, es
posible identificar los cambios de bases que producen una
mutacin en particular. Supngase que se sabe que un mutgeno
produce con frecuencia cambios de fenilalanina a isoleucina. Los
tripletes que corresponden en el DNA a la fenilalanina son AAA y
AAG y los de la isoleucina son TAA, TAG y TAT. Debido a que la
mayora de las mutaciones cambian slo una base, este mutgeno
particular debe producir cambios frecuentes de A y T.
1.2 CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
Este

modo

cromatogrfico

(TLC,

del

ingls

Thin

Layer

Chromatography) se puede considerar como una optimizacin de

la cromatografa en papel. La idea subyacente es la misma: hacer
avanzar,

por

capilaridad,

una

fase

mvil

sobre

una

fase

estacionaria plana, de forma que los solutos de la muestra aplicada

se separen por su diferente Rf. El soporte de la fase estacionaria ya
no es una estructura fibrosa, como la del papel, sino un slido
pulverizado, el cual se encuentra extendido en forma de una fina
capa (0.15-0.5 mm de espesor) sobre una plancha de vidrio, plstico o metal. Para conseguir la cohesin del conjunto, el slido
pulverizado suele incluir un agente cementante, normalmente
sulfat clcico alcohol polivinflico.
En comparacin con la cromatografa en papel, las ventajas
derivadas del uso de slidos pulverizados y extendidos en capas
finas

son

mltiples

(Cuadro

6.2).

Al

trabajar

con

slidos

pulverizados se asegura que la superficie especfica (m 2/g) sea

muy elevada, y, por tanto, tambin la interfase de contacto entre
fases mvil y estacionaria. Es frecuente trabajar con slidos
pulverizados en los que el dimetro promedio de las partculas se

78

sita en el intervalo de 10-45 m, con lo que se pueden conseguir

superficies especificas de hasta 400 m2/g. Adems, mientras en
cromatografa en papel el soporte es normalmente un papel de
filtro, o lo que es lo mismo, las fibras de celulosa que lo forman, en
TLC son muchos los slidos que pueden actuar como soporte, una
vez pulverizados y extendidos: celulosa, poliamida, almina o gel
de slice. Este ltimo, tambin llamado slica-gel o slica, es, con
diferencia, el que ms se utiliza. Se obtiene a partir de silicato
sdico, y debe su nombre al aspecto de gel que toma cuando se
suspende en medios acuosos. En la rnanufacturacin de este
soporte

cromatogrfico

se

le

somete

un

proceso

de

fragmentacin y criba, de forma que el gel de slice comercial se

caracteriza por estar formado por partculas de forma y tamao
muy homogneos (ver Cuadro 6.11).
Cuadro 1.
Cromatografa en capa fina versus cromatografa en papel
Caractersticas
de
la
cromatografa
en capa fina

Efecto
Elevada accin capilar

Soporte/Fase
estacionaria
finamente dividido

Ausencia
de
estructura fibrosa

Elevada superficie de
contracto entre fase
mvil
y
fase
estacional.
Reducida dispersin
de los solutos en la
aplicacin
de
la
muestra y durante el
desarrollo
cromatogrfico.

Ventajas frente a
la cromatografa
en papel
Mayor rapidez de
desarrollo
Mayor
eficiencia
cromatografa
Mayor sensibilidad
en la deteccin
Mayor versatilidad

Vlida cualquier fase

estacionaria
que
pueda ser finamente
dividida.

79

La estructura qumica en la superficie de estas partculas se

caracteriza por presentar grupos silanoles (SiOH), que son los que
confieren a la slica su carcter fuertemente polar. Ello posibilita la
utilizacin de la slica para la cromatografa de adsorcin de solutos
polares. Para este uso es preciso eliminar el agua que normalmente tiene retenida la slica, precisamente por interacciones
polares con sus grupos silanoles. De no tomar esta precaucin, la
separacin cromatogrfica de los diferentes solutos sera la
consecuencia de un doble proceso. Por una parte se producira un
reparto por solubilidad, similar al comentado para cromatografa en
papel, y por otra un proceso de adsorcin sobre superficies polares.
La extensin con que se daran uno y otro dependera de la
humedad

de

la

placa,

y,

en

definitiva,

los

resultados

cromatogrficos seran poco reproducibles.

Para eliminar este inconveniente, se procede a activar las placas
de slica-gel antes de la aplicacin de la muestra. Esto consiste en
someterlas a temperaturas superiores a 100 C durante ms de
una hora.
La aplicacin de muestras y el desarrollo cromatogrfico en TLC es
algo similar a lo descrito para la cromatografa en papel, con la
diferencia de que la TLC siempre se desarrolla en sentido
ascendente. En el caso de muestras complejas, puede ser difcil o
imposible encontrar una nica fase mvil que permita la adecuada
separacin de todos los solutos. En estos casos se puede acudir a
desarrollos bidimensionales (Figura 6.2). Tras emplear una fase
mvil en una direccin, se utiliza Otra para el segundo desarrollo
en direccin perpendicular a la del primero. En estos casos la placa
ha

de

secarse

antes

de

proceder

al

segundo

desarrollo

cromatogrfico.
Cuando la TLC se utiliza con fines preparativos, los solutos se han
de extraer de la capa fina despus del desarrollo cromatogrfico.
Ello es tan simple como raspar la capa fina (normalmente con la
80

punta de una esptula) en la posicin donde se encuentre un

soluto que se desee extraer. El polvo, o fase estacionaria, raspado
se suspende en algn disolvente adecuado, con lo que el soluto
embebido en l se disolver. Mediante una simple filtracin o
centrifugacin se dispondr de una disolucin de tal soluto,
separado del resto de contaminantes que le acompaaban en la
muestra

inicial.

Para

esta

utilizacin

de

la

TLC

con

fines

preparativos suele ser deseable cromatografiar un volumen de

muestra mayor (" 200 /I) al que se cromatografa en aplicaciones
analticas (1-10 jid). Se hace preciso, entonces, trabajar con capas
ms gruesas (de hasta 2 mm de espesor), as como aplicar la
muestra en bandas en lugar de en puntos discretos (mltiples
aplicaciones puntuales de la misma muestra, una al lado de otra,
hasta formar una banda).
Para que lo anterior sea vlido, el soluto debe ser visible, bien
porque sea coloreado, bien porque se haya aplicado algn mtodo
de deteccin. Uno sencillo, utilizado con frecuencia, y que permite
la inmediata visualizacin de muchos solutos, se basa en el empleo
de placas de TLC cuya fase estacionaria contenga un agente
fluorescente. Al finalizar la separacin cromatogrfica, se coloca la
placa bajo una fuente de luz UV, observndose cmo toda ella
emite radiacin visible (generalmente de color verde), salvo en las
posiciones donde se encuentran los solutos. Esas zonas aparecen
oscuras por haberse producido un proceso de desactivacin de
fluorescencia, o uno de absorcin de la luz UV por los solutos.
Si este procedimiento no resulta aplicable, se acudir a otros
mtodos ce oeicc-cin, que podrn ser inespecficos, cuando se
persiga la deteccin de todos los solutos presentes en la muestra,
o especficos, basados en la reaccin coloreada de determinados
grupos funcionales (Cuadro 6.3). Estos mtodos de deteccin tambin se pueden utilizar en cromatografa de papel, con la lgica
excepcin del mtodo del cido sulfrico.

81

Con carcter general, el procedimiento a seguir ser el de rociar la

placa con un lquido que provoque la reaccin de deteccin. Si sta
modifica la naturaleza qumica de los solutos se dice que la
reaccin es destructiva y, obviamente, no estar indicada en
aplicaciones preparativas. En estos casos, lo que se suele hacer es
rociar slo un extremo de la placa con el lquido de deteccin. As
se detectarn los solutos de inters en una parte de la placa,
infiriendo de ah su localizacin en el resto, de donde podrn ser
recuperados. Finalmente, conviene recordar que si las muestras
sometidas a TLC se encuentran marcadas radiactivamente, sern
de aplicacin los mtodos autorradiogrficos ya descritos (Captulo
1).

CUADRO 2 Mtodos de Deteccin en Cromatografa de Capa

Fina

Mtodo

Aplicacin

Color

Compuestos
orgnicos

Pardo

amarillento(reversibl
e)

Inespecfico
Vapores de yodo
c.
Sulfrico
conc. +calor
Especfico
2,4dinitrofenilhidraz

Compuestos
orgnicos

Negro
(carbonizacin)

Compuestos

82

ina

carbonlicos

Naranja

AgNO3/OH-

Compuestos
carbonlicos

Marrn

cido
iodoplatnico
Verde
bromocresol
Ninhidrina

Bases
de

cidos
Aminas
primarias
(aminocidos)
Aminas secundarias

Rodamina G

Lpidos

Prpura negro
Azul violceo
Marrn
Fluorescencia
amarillo roscea
(exc = 366 nm)

2. CROMATOGRAFA EN COLUMNA
En este modo cromatogrfico la fase estacionaria se dispone como
el relleno de un recipiente cilndrico, de vidrio, plstico o metal,
abierto por ambos extremos, que se denomina columna. Dicho
relleno, tambin llamado lecho cromatogrfico, ha de tener una
estructura porosa a fin de que pueda fluir la fase mvil. El flujo
estar propiciado por la accin de la gravedad (cromatografa
convencional; apartado 6.5) o por sistemas de bombeo de alta
presin (cromatografa lquida de alta resolucin; apartado 6.14).
La esencia misma de la cromatografa se encuentra en el ntimo
contacto entre fase mvil y estacionaria. Para conseguirlo es
necesario evitar la formacin de grietas y acanaladuras en el lecho,
ya que de existir, la fase mvil circulara ms fcilmente por ellas,
en lugar de por los intersticios entre partculas, disminuyendo el
contacto entre fases. La operacin de preparacin de un buen
lecho cromatogrfico recibe el nombre de empaquetado, y es
crucial para unos buenos resultados croma-togrficos (apartado
6.5).
Al igual que en TLC y cromatografa en papel, tambin en
cromatografa en columna lo normal es llevar a cabo una
aplicacin zonal de la muestra. En cromatografa en columna esto

83

se consigue depositando la disolucin problema sobre la parte

superior del lecho cromatogrfico (Figura 6.3). Una vez aplicada la
muestra, se abre la columna por el extremo opuesto y se deja que
la disolucin problema vaya fluyendo hacia el interior del lecho.
Antes de que la parte superior de ste se seque, se aporta nueva
fase mvil, y as se sigue de modo continuado hasta el fin del
proceso. El ir pasando fase mvil hasta la salida de los solutos se
llama elucin, y el trmino eluido hace referencia a la fase mvil
que se. recoge desde la aplicacin de la muestra hasta la salida de
todos los solutos. Con carcter general, a la fase mvil se la suele
llamar tambin eluyente.
En su viaje a travs de la fase estacionaria, los solutos no slo se
irn separando cromatogrficamente sino que tambin difundirn,
por lo que la zona en la que viaja cada uno se ir ensanchando y
sus lmites difuminando. De este modo, la distribucin de cada
soluto en el eluido de la columna ser de tipo gaussiano. El perfil
de elucin, perfil cromatogrfico o cromatograma es la sucesin de
curvas gaussia-nas que informa sobre la salida de los diferentes
solutos (Figura 6.4).
Para

cada

soluto,

correspondiente

la

pico

posicin

en

gaussiano,

el

eje

informa

de
sobre

abscisas
el

del

tiempo

transcurrido desde que se aplic la muestra hasta que se produjo

la elucin de la columna. A este tiempo se le llama tiempo de
retencin, tR.

Normalmente, el caudal aflujo de fase mvil (F; ml/min) se

mantiene constante durante la elucin cromatogrfica, luego,
V R F .t R

84

siendo VR el volumen de retencin, tambin llamado volumen de

elucin, Ve, que es el volumen de fase mvil que ha de pasar a
travs de la columna para que eluya un soluto dado.
Un soluto que no sufra retraso alguno por la fase estacionaria
(soluto a en la Figura 6.4), viajar en todo momento con la
velocidad de la fase mvil, u. Para una columna de longitud L el
tiempo que tarda en eluir este soluto vendr dado por:
tM

L
u

donde el subndice M hace referencia a la fase Mvil. El volumen de

elucin de este soluto no retrasado ser:
V M .F . t M

Con frecuencia tM y/o VM se designan tambin como (o y V0,

respectivamente, dndoles los nombres de tiempo o volumen de
exclusin, pues corresponden a un soluto que ni interacciona ni se
reparte con la fase estacionaria, esto es, que queda excluido
completamente de ella. Al volumen VM tambin se le suele llamar
volumen

vacio

hueco

(en

ingls

void

volume),

ya

que

corresponde al volumen del lecho cromatogrfico no ocupado por

las propias partculas de la fase estacionaria (fraccin de volumen
de lecho cromatogrfico ocupado por la fase mvil).
Cuando un soluto se encuentra en la fase mvil se desplaza con la
velocidad de sta, u, pero cuando interacciona o se reparte con la
fase estacionaria su velocidad es nula. Por tanto, se puede afirmar
que el tiempo (de un soluto es la suma del tiempo durante el cual
sus molculas viajan en la fase mvil (tM), ms el tiempo neto que
permanecen inmviles en la fase estacionaria (t R; tiempo de
retencin ajustado):

85

t R tM t'R

De la anterior expresin se deduce que el tu de un soluto que

experimenta un retraso cromatogrfico (soluto b en la Figura 6.4),
se calcula como la diferencia entre su tiempo de retencin (t R), y el
tiempo de elucin de un soluto no retrasado (tM). Este tiempo
ajustado da una idea directa de la mayor o menor intensidad de la
interaccin o reparto del soluto con la fase estacionaria, "nene
sentido utilizar este tR, no en trminos absolutos, sino referido al
tiempo de exclusin, tM.

t R'
t t
R M k
tM
tM

Este cociente, que se designa con la letra k, recibe el nombre de

factor de capacidad, y es caracterstico de cada soluto para unas
fases mvil y estacionaria dadas, independientemente de cules
sean los valores del flujo, F, y de la longitud de la columna, L.
Reordenando la ecuacin (6.6) se llega a

t R t M 1 k

o en trminos de volumen de eluido,

VR Vm 1 k

86

En la puesta a punto de un mtodo cromatogrfico, el objetivo es

alcanzar un perfil de elucin en el que la separacin entre los picos
cromatogrfcos de dos solutos, 1 y 2, que eluyan uno detrs de
otro, sea ptima. De acuerdo con las ecuaciones (6.7) y (6.8), estas
diferencias vendrn dadas por
t R , 2 t R ,1 t M k 2 k1

V R , 2 V R ,1 VM k 2 k1

donde tR,1, tR,2, VR,1 y VR,2,

son los tiempos/volmenes de retencin

o elucin de los solutos 1 y 2, y k1 y k2 son sus respectivos factores

de capacidad. Con vistas a la separacin efectiva de ambos
solutos, es preciso asegurar que las diferencias entre sus valores
de k sean adecuadas; pero, adems, el ensanchamiento de sus
picos cromatogrficos no ha de ser tan acusado que arruine los
efectos de una buena separacin entre los mximos. En la Figura
6.5 se presentan dos situaciones bien distintas en cuanto a
separacin y anchura de dos picos cromatogrfcos. El caso A
representa un resultado cromatogrfico peor que el caso B;
mientras en este ltimo los dos picos estn perfectamente
separados, en el caso A hay solapamiento entre ellos, lo que se
pone de manifiesto en que no se alcanza la lnea basal entre la
salida del primer soluto y la del segundo. En definitiva, adems de
la separacin entre picos, hay que tener en cuenta su anchura.
Para un par de solutos, 1 y 2, un sistema cromatogrfico
proporcionar un factor de separacin o selectividad, a, que vendr
dado por

k2
k1

siendo k 2

k1

Modificar la separacin entre esos dos solutos implicar, por tanto,

la modificacin en la selectividad de la columna; en suma, alterar
la termodinmica (valores de k) del sistema.
87

A diferencia de la separacin entre picos, la anchura de stos no

viene determinada por factores termodinmicos, sino por factores
cinticos (apartado 6.15). Son stos los que daran cuenta de la
mayor eficiencia observable en el cromatograma B de la Figura.
6.5, en comparacin con el A; y ello, a pesar de su menor
selectividad. En trminos cualitativos, una columna cromatogrfica
ser ms eficiente cuantos ms estrechos sean los picos de elucin
que genere.
En cromatografa se utiliza el concepto de plato terico, para hacer
referencia a cada una de las lminas en que "imaginariamente" se
puede considerar dividida una columna cromatogrfica. Se trata de
suponer que las molculas de un soluto van alcanzando, en cada
una de esas lminas o platos tericos, un equilibrio de interaccin
con la fase estacionaria, o un equilibrio de reparto entre sta y la
fase mvil. El retraso que finalmente experimente el soluto en su
elucin depender del nmero de estas etapas de equilibrio, en
suma, del nmero de platos tericos, n, de la columna. Pero, no
slo el tR de un soluto est relacionado con n, tambin la anchura
de su pico de elucin se ve afectada por este nmero. No en vano,
cuanto mayor sea el tR, ms tiempo tendrn las molculas de
soluto para irse dispersando.
Asi, la eficiencia de una columna se cuantifica a partir de su
nmero de platos tericos, calculando este nmero segn la
siguiente expresin
tR

donde a hace referencia a la desviacin estndar de la curva

gaussiana que representa el pico de elucin de un soluto (Figura
6.6).

88

En la prctica, para el clculo de n se mide la anchura total del pico

gaussiano a la mitad de su altura, lo que se conoce como wh (del
ingls,"width at half-height"). Para un pico gaussiano perfecto,
wh =2.354 -
con lo que la expresin (6.11) se transforma en
t
n 5.54 R
wh

V
n 5.54 R
wh

o en trminos de volumen,

donde ahora w,, tambin se medira en unidades de volumen.

El valor de n es independiente del pico cromatogrfico escogido
para su evaluacin. Cuanto mayor sea el tR o el VR, de un soluto,
mayor ser la anchura de su pico de elucin; pero el cociente de
ambos se mantendr constante. Lgicamente, n depende de la
longitud de la columna. Por ello, es frecuente hablar de platos
tericos

por

unidad

de

longitud

de

lecho

cromatogrfico.

Alternativamente, se puede especificar la altura del plato terico,

h, que ser el resultado de dividir la longitud de la columna, L, por
su nmero de platos tericos, n:
h

L
n

La altura del plato terico se expresa

(generlamente

milmetros)

su

en unidades de longitud

valor

est

inversamente

relacionado con la eficiencia de la colulmna, siendo adems

89

independiente de la longitud del lecho cromatogrfico. Desde un

punto de vista prctico, la determinacin de n o de h permite tener
una medida de la calidad del empaquetado de una columna.
Hasta

aqu

se

cromatografa;

han

introducido

selectividad

dos

conceptos

eficiencia.

Los

claves

en

respectivos

parmetros y n se han de optimizar con vistas a conseguir que

los diferentes solutos de la mezcla inicial eluyan como picos
independientes. Se dice entonces que los componentes de la
mezcla han quedado resueltos. Pero,

aparte de este significado

cualitativo, el trmino resolucin tienen en cromatografa un

significado cuantitativo. La resolucin, Rs, de dos cromatograficos
se define como,
Rs

t R , 2 rR ,1
1
wb, 2 wb,1
2

Donde wb se refiere a la anchura de los picos guassianos en su

base.
El clculo de RS a partir de la expresin se suele llevar a cabo con
pares de picos que se encuentren relativamente prximos en el
cromatograma.

Cabe

esperar

entonces

que

las

respectivas

anchuras wb,1 y wb,2 sean muy parecidas, por lo que la expresin

(6.16) se puede reducir a

Rs

R,2

t R ,1
wb

siendo wb la anchura en la base de cualquiera de los picos en

consideracin. Asumiendo la forma gaussiana para estos picos, es
posible expresar esta anchura en. funcin de la desviacin
estndar:
wb 4.

90

Sustituyendo en (6.17) el valor dado por esta ltima, queda,

RS

t R .2 t R .1
4.

A partir de la anterior es fcil llegar a la siguiente, sin ms que.

considerar las expresiones (6.7), (6.9)-(6.11) aplicadas al soluto 2,
RS

n k2 1
.
.
4 1 k2

Dado que los dos solutos en consideracin eluirn relativamente

prximos

(k2 k1), la fraccin k2l(1 + k2) que aparece en el

segundo trmino de la expresin anterior podr ser reemplazada

por kl(1 + k), siendo k el factor de capacidad de cualquiera de
ellos,
RS

n k 1
.
.
4 1 k

Queda claro de esta expresin que la resolucin cromatogrfica

depende de factores cinticos

n /4

y factores termodinmicos

k / 1 k . 1 /
Mejorar la resolucin actuando sobre los factores cinticos obliga a
aumentar el nmero de platos tericos de la columna. Dado que
este nmero es proporcional a la longitud del lecho cromatogrfico,
una posibilidad seria la de aumentar esta longitud. Sin embargo,
tal solucin puede no ser rentable, ya que Rs depende de n1/2, y por
tanto de L1/2. As, para duplicar la resolucin cromatogrfica habra
que cuadruplicar la longitud de la columna, y ello puede o ser
impracticable o imponer tiempos de elucin exageradamente

91

largos. La mejor forma de mejorar este factor cintico es

empaquetar lo mejor posible el lecho cromatogrfico, y utilizar
fases estacionarias con un tamao de partcula pequeo y
homogneo (apartado 6.15).
Por su parte, los factores termodinmicos a considerar son dos,
capacidad, k/(1+k), y selectividad,(-1)-. En cuanto al primero, el
margen de maniobrabilidad es relativamente estrecho. En efecto, k
puede variar desde O hasta , sin embargo el cociente k/(1+k)
tiene un valor lmite de 1 (Figura 6.8), y ste se alcanza
relativamente pronto. As, utilizar sistemas cromatogrficos que
proporcionen valores de fe superiores a 10 no aporta grandes
ventajas,

considerables

inconvenientes

en

cuanto

al

alargamiento de los tiempos de elucin. Se ha comprobado que un

valor de 2 para fe proporciona la mejor situacin de compromiso en
el binomio resolucin-tiempo de elucin. En la prctica, lo ms
adecuado

es

trabajar

con

sistemas

cromatogrficos

que

proporcionen fe comprendidas entre 1 y 10; en otras palabras, que

la elucin de los solutos se produzca en el intervalo 2 . VM - 11 . VM
(expresin 6.8).
Finalmente, el trmino (a -1)1 a de la expresin (6.21) es el que
resulta ms til para mejorar la resolucin. El intervalo en que
normalmente suele encontrarse a es entre 1 y 2, donde 1
correspondera a un par de solutos cuya separacin en el
correspondiente sistema cromatogrfico sera imposible, mientras
que en el otro extremo ( = 2), la separacin cromatogrfica sera
ciertamente fcil. Con a variando en el intervalo mencionado, es
fcil ver que el trmino ( -1)l puede llegar a variar hasta en tres
rdenes de magnitud (Figura 6.8).
Mejorar la relacin (- 1)/ se limita, en esencia, a encontrar el par
fase estacionaria/fase mvil ms adecuado. Tambin se es el
camino para mejorar en lo posible el otro factor termodinmico que

92

influye en la resolucin, k/(1+k). En la prctica, la seleccin de la

fase estacionaria est muchas veces limitada por el tipo de
muestra problema. En tales casos slo queda como variable la
modificacin de la fase mvil. Afortunadamente en CL se puede
llevar a cabo la elucin de los solutos con fases mviles cuya
composicin qumica vaya variando durante la propia elucin, lo
que se conoce como elucin en gradiente. De esta forma se puede
ejercer un buen control sobre la resolucin de dos solutos, al poder
modificar los factores termodinmicos sobre la marcha.

4. CROMATOGRAFA DE GASES
En los tipos de cromatografa de reparto descritos hasta ahora, la
muestra es arrastrada por una fase mvil lquida sobre una fase
estacionaria lquida, en la que el lquido est inmovilizado por
adsorcin o absorcin a un soporte slido. En la cromatografa de
gases (GLC, gas-liquid chromatography) la fase mvil es un gas;
la fase estacionaria es un lquido adsorbido a la superficie interna
de un tubo o columna (funcionamiento tubular o capilar) o a un
soporte slido (funcionamiento en columna empaquetada) como la
tierra de diatomeas, Teflon en polvo o finas cuentas de vidrio. En
general, el lquido se aplica como un slido disuelto en un
disolvente voltil, como el ter. Por ejemplo, las cuentas de vidrio
se sumergen en una disolucin de polietilenglicol en ter. Cuando
el

ter

se

evapora,

cada

cuenta

queda

recubierta

de

polietilenglicol. A la temperatura utilizada para la cromatografa de

gases, el polietilenglicol funde y permanece en las cuentas como
una pelcula lquida. La muestra, que puede ser cualquier
compuesto capaz de ser volatilizado sin sufrir descomposicin, se
introduce como lquido con un gas inerte helio, argn o nitrgeno
y a continuacin se calienta. Esta mezcla gaseosa pasa a travs
del tubo que est dispuesto segn se muestra en la figura 8-13.

93

En el funcionamiento en columna empaquetada el tubo tiene de 1

a 20 metros de longitud y 0,5 cm de dimetro. En el mtodo capilar
la longitud es de 30 a 100 metros. Para conseguir resoluciones muy
elevadas, se utilizan sistemas capilares de dos kilmetros de tubo.
Los compuestos vaporizados se redistribuyen continuamente entre
la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria lquida, de acuerdo con
sus

coeficientes

de

reparto

son,

en

consecuencia,

cromatografiados. Al final de la columna se usa un detector

apropiado.

Deteccin de sustancias en el efluente

En el trabajo analtico se utilizan, por lo general, tres tipos de
detectores:
La

clula

de

conductividad

trmica

(con

una

sensibilidad

aproximada de 10 pg), el detector de ionizacin de argn

(sensibilidad de 10-5 g) y el detector de ionizacin de llama
(sensibilidad de aproximadamente 10-5 g). La accin de la clula
de conductividad trmica est basada en el hecho de que la
resistencia elctrica de un alambre es dependiente de la temperatura. Si un gas fluye con una velocidad constante a travs de un
alambre caliente, ste puede ser enfriado a una temperatura
determinada-por la velocidad de flujo y la conductividad trmica
del gas. Por lo tanto, a una velocidad de flujo constante, la
temperatura

y,

por

consiguiente,

la

resistencia,

es

una

caracterstica de cada gas. Si la composicin del gas cambia,

tendr lugar un cambio en la conductividad trmica del gas y, por
lo tanto, de la resistencia del alambre; sta se presenta, por lo
general, como un registro grfico en funcin del tiempo de flujo del
gas.
Con un detector de ionizacin de argn, ste (el gas portador) pasa
a travs de una cmara de deteccin (en el agujero de salida de la

94

columna) similar a un contador de Geiger-Mller y es ionizado

mediante bombardeo con partculas . Segn se explica en el
captulo 5, cuando el ion argn positivo se acerca al ctodo,
captura un electrn y se neutraliza. Esta recombinacin produce
rayos X que ionizan ms tomos de argn. Esto causa una
ionizacin continua autogenerada, de forma que se produce una
corriente constante en el tubo de Geiger-Mller.
Si se encuentra presente un compuesto con un potencial de
ionizacin menor que el del argn, puede choca." con los iones del
argn y transferir un electrn. El compuesto queda cargado
positivamente. Cuando se acerca al ctodo, capta un electrn y
queda

neutralizado.

No

obstante,

con

muchos

compuestos

orgnicos el exceso de energa resultante de la recombinacin no

conduce a la produccin d& radiacin electromagntica, sino que
determina la rotura de enlaces qumicos. Por lo tanto, cuando se
encuentra presente un compuesto de este tipo, la corriente entre
los electrodos disminuye. Esta corriente se mide y se representa en
funcin del tiempo. Se hace necesaria una calibracin, al igual que
en el detector trmico. La sensibilidad de este tipo de detector es
de 0,1 g.
El detector de ionizacin de llama viene esquematizado en la figura
8-14. Se quema gas hidrgeno con aire en presencia del efluente
de la columna. Todo el carbono presente en la muestra se quema y
se convierte en dixido de carbono. Por razones que todava no
estn muy claras, se producen electrones e iones negativos que se
detectan en forma de corriente, la cual es convertida en diferencias
de voltaje. Este detector opera linealmente desde 0,01 g hasta 5
mg y cuenta esencialmente los tomos de carbono. En la figura 815 se muestra un cromatograma de gases tpico.
Identificacin de componentes a la salida del detector

95

Cada uno de los detectores indica la cantidad de material que sale

de la columna en funcin del tiempo. No obstante, no hay una
indicacin directa de la identidad- del material que produce un pico
concreto ni de la cantidad de ste que existe en el pico. Por
ejemplo, si las sustancias presentes en una mezcla se conocen por
adelantado (y el propsito de la cromatografa es determinar la
cantidad de cada una de ellas), los picos suelen identificarse
preparando una muestra duplicada que contenga una pequea
cantidad de una sustancia conocida que se ha aadido, y volviendo
a cromatografiar. Si esta sustancia conocida es alguna de las que
componen,

la

mezcla,

aumentar

el

tamao

del

pico

correspondiente (figura 8-16). Si los picos son parte de una serie

homologa (p. e., etilsteres de cidos grasos), puede representarse
grficamente el logaritmo del tiempo de retencin (es decir, el
tiempo que transcurre entre la inyeccin de la muestra y su
aparicin en el detector) en funcin del nmero de tomos de
carbono (figura 8-17), y, en general, el resultado ser una lnea
recta. La adicin de uno o dos de los estndares de la serie
homologa,

proporciona

entonces

una

calibracin

para

el

cromatograma. Por supuesto, este mtodo slo puede utilizarse si

se sabe que todas las sustancias forman parte de una serie
homologa.
La identificacin de sustancias desconocidas es difcil y no existe
un mtodo general para hacerlo. A veces se burbujea el gas
efluente a travs de disoluciones de control que dan lugar a colores
determinados con grupos funcionales especficos (p. e., aldehdo,
alcohol, etc.). Otro mtodo consiste en la alteracin qumica y
repeticin de la cromatografa de, la muestra frente a varios
estndares o bien el anlisis mediante otras tcnicas fsicas.
Esto se hace a menudo si se sospecha qu tipos de sustancias
pueden ser. Por supuesto, para identificar sustancias se debe

96

utilizar un detector no destructivo (p. e., la clula de conductividad

trmica).
La determinacin cuantitativa de la cantidad de material en un pico
no es un procedimiento directo. Para cualquier compuesto, la
cantidad de material es directamente proporcional al rea del pico.
No obstante, la constante de proporcionalidad vara con las
sustancias. Por tanto, lo primero que se necesita es identificar el
material que se encuentra en un pico determinado. La
cuantificacin requiere la preparacin de una curva estndar; es
decir, deben cromatografiarse diferentes cantidades de la
sustancia y hacer una grfica que relacione el rea del pico con la
cantidad de material.

Ventajas de la cromatografa de gases

Con

la

cromatografa

de

gases

se

consiguen

excelentes

separaciones. La velocidad y la sensibilidad son extraordinarias,

siendo detectables cantidades del orden de 10 -12 gramos para
muchas sustancias. Debido a que la rapidez del revelado de los
cromatogramas depende de la velocidad de difusin entre las fases
mvil y estacionaria, y debido a que la velocidad de difusin de los
gases es mucho mayor que la de los lquidos, el cromatograma de
gases puede ser realizado unas mil veces ms rpido que el
equivalente

en

la

cromatografa

lquida

en

columna.

Por

consiguiente, las separaciones pueden obtenerse, con frecuencia,

en menos de un minuto. Adems, utilizando un detector no
destructivo y condensando la muestra en la recogida final, es
posible utilizar la cromatografa de gases de- forma preparativa.
Los instrumentos de preparacin en masa pueden purificar
cantidades importantes del material que se est tratando, hasta
llegar a gramos.
La cromatografa de gases puede utilizarse con cualquier sustancia
que pueda volatilizarse. Por lo tanto, hay miles de compuestos
97

orgnicos que pueden separarse con este tipo de cromatografa.

Las sustancias no voltiles pueden examinarse, si es posible,
convirtindolas en derivados voltiles por oxidacin, acilacin,
alquilacin u otros procesos.
Su principal utilizacin con muestras biolgicas es la separacin de
alcoholes, esteres, cidos grasos y aminas. Por lo tanto, es de una
gran utilidad en el estudio del metabolismo intermediario y en el
anlisis del mecanismo de accin de los enzimas. Se ha utilizado
en gran escala para identificar los componentes aromatizadores de
los alimentos y vinos y para la deteccin de pesticidas en
materiales biolgicos.
La cromatografa de gases juega tambin un papel muy importante
en el anlisis orgnico. Por ejemplo, el carbono y el. hidrgeno
pueden determinarse con una precisin del 0,5 % y el 0,1 %,
respectivamente, por combustin de la muestra en un flujo seco de
oxgeno, libre de CO2 y H2O, y determinando la cantidad de CO2 y
H2O

que

forma.

Tambin

pueden

identificarse

los

grupos

funcionales p. e., los grupos alcoxi se detectan por iodacin para

formar ioduro del alquilo correspondiente, que puede identificarse
con facilidad Tambin puede determinarse la posicin de un doble
enlace,

rompiendo

el

enlace

por

oxidacin

ozonlisis

cromatografiando los productos.

5. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN

(HPLC)
En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se realizaba en
columnas de vidrio con dimetros comprendidos entre 1 y 5 cm. y
98

longitudes entre 50 y 500 cm. Los tiempos de separacin de las

distintas muestras, eran largos y frecuentemente duraban varias
horas.
Los primeros intentos para acelerar el procedimiento clsico
mediante la aplicacin de vacio o por bombeo, no resultaron
efectivo.
Los avances tecnolgicos de los ltimos aos han permitido poner
en funcionamiento una serie de mtodos cromatogrficos para los
que se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de
alta resolucin (HPLC)que son los ms utilizados en la actualidad, y
se caracterizan por:
Su gran sensibilidad.
Su capacidad para proporcionar determinaciones cuantitativas
exactas.
Su gran utilidad a la hora de separar sustancias no voltiles, o
termolbiles.
Por ser utilizados para sustancia de gran inters en la industri,
en muchos campos de la ciencia, etc.
La cromatografa de lquidos de alta resolucin, puede ser utilizada
como mtodo d e separacin de sustancias tan variadas como:
- Plaquicidas
- Hidrocarburos.

- cidos nucleicos.
- Azcares.

- Aminocidos.

- Drogas.

- Protenas.

Terpenoides.

Es una Cromatografa de alta presin es decir se aplica el flujo a

presin (entre 1500 a 2200 psi). El tamao de partcula es entre 3
y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y
requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras
proteicas. La reduccin del tiempo en que la sustancia se
encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento
por difusin de las bandas, aumentando por tanto la resolucin.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un
inyector, y una bomba que inyecte el lquido a la columna.
Generalmente las columnas de slica requieren alta presin para
que el flujo de lquido sea adecuado, la mezcladora se requiere
para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector

99

permite la aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se

coloca un detector generalmente de absorcin ultravioleta o de
fluorescencia y si se desea recuperar las molculas que eluyen de
la
columna,
se
requiere
un
colector.

En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se

realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que
permite estandarizar la cromatografa, identificar la naturaleza los
picos eludos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan
segn su "tiempo de retencin" con estndares, que permiten
identificar los aminocidos presentes en la mezcla. La cantidad
relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la
curva del pico correspondiente.

100

CAPITULO
IV

101

FUNDAMENTO TERICO
La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos
basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos
que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (liquida o
gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase
estacionaria, la cual puede ser slida o lquida.
Hay que indicar que el nombre de la tcnica es incorrecto, ya que no
consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la primera
experiencia cromatogrfica realizada, la cual se utilizo para separar
pigmentos coloreados de plantas. La cromatografa fue descubierta
por el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett
separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de
hojas verde en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de
calcio en polvo en el interior de una probeta. No obstante, no existen
datos sobre la utilizacin de esta tcnica hasta 1930 cuando khun y
Lederer separaron tambin pigmentos de las plantas usando como
adsorbentes almina y carbonato de calcio. Fue a partir de ah cuando
se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografia.
Para explicar el fenmeno cromatogrfico es necesario establecer dos
tipos de fundamento: uno remoto y otro prximo
Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o
algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los analitos:
solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente

102

divididos),

volatilidad,

tamao,

carga,

reactividad

qumica

bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una

situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas
propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la
solubilidad en dos lquidos diferentes como ocurre en cromatografa
liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:
- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo
contacto entre si.
- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas
completo posible.
Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy
improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo
par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema
cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser
muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica.
Si se transforma la idea del equilibrio esttico establecido entra las
dos fases en un equilibrio dinmico, se tiene la realidad del fenmeno
cromatogrfico. Como se ha
indicado anteriormente, una de las fases, denominada fase mvil,
fluye a travs de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que
permanece inmvil, y que, al menos en una extensin esta en
equilibrio con la fase mvil.
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so
movilidad entre si y con respecto a la fase mvil. Se eligen las
condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los
componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base
de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la
velocidad de migracin de los mismos.
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de
separacin: es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho
las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos grandes grupos:
cromatograficas y no cromatograficas. La eleccin de una tcnica

103

cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de la

muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del
tiempo y equipo asequible.
Puede

hacerse

una

primera

distincin

entre

las

tcnicas

cromatogrficas atendiendo a la integracin continua o no del

sistema de deteccin. As, la cromatografia no conlleva a un sistema
de deteccin, mientras que cualquier cromatgrafo de lquidos o
gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, autnticos
instrumentos.

IMPORTANCIA DE LA COMATOGRAFA
Purificacin de la penicilina.
Purificacin de las protenas terapeticas.
La tcnica cromatogrfica con un enfoque al rea clnica nos sirve
para identificar bacterias mediante la comparacin obtenida del
cromatograma

obtenido

con

un

patrn

predispuesto,

para

identificar distintos tipos de: aminocidos, protenas, nucletidos,

hemoglobina, esteroides etc.
Separaciones de componentes de plantas medicinales.
Separacin de componentes de una sntesis orgnica.
Separacin de colorantes.
Separacin e identificacin de hioscina y de morfina.
Separacin de acEido acetico,alcohol cetilico y metil-etil cetona.

104

 Separacin e identificacin de los compuestos intermedios de una

sntesis organiza, por ejemplo en la sntesis del naftaleno,
identificacin de acido ftalico, anhidrido ftalico, benceno.
En la produccin sinttica de acetaminofen, identificacin de la
imina de la N-acetilbenzoquinona.
Identificacin de levo-alfa-acido aminoadipico, durante la
biosintesis de penicilina.
Identificacin de 8-nitroisoquinolina, durante la sntesis de
Ciprofloxacina, un antibitico.

APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS

Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC
con un detector colorimtrico para medir simultneamente los
nueve antioxidantes ms comunes.
Anlisis de carbohidratos en bebidas: la adicin de mono y
disacridos a bebidas y zumos sirve como propsito de
enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad aadida es
correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio
inico con deteccin de pulso amperomtrico con detectores de
refraccin o ultravioletas.
Ismeros de carotenoides: el HPLC en combinacin con
detectores calorimtricos permite el anlisis de los carotenoides
dietticos en tejidos animales y vegetales.

105

 Flavonoides y fenoles: en el vino la medicin de estas

sustancias permite la determinacin del color, la edad y las
variedades de uva usadas. El HPLC en combinacin con
colormetros,

permiten

la

determinacin

de

hasta

22

compuestos diferentes simultneamente.

Lpidos: la determinacin de lpidos animales y vegetales
como: colesterol, triglicridos, glicridos y esteroles, se basa en
el uso del HPLC y un detector de Dispersin de Luz Evaporativa
(ELS).
Acidos lipoico y cido dihidrolipoico en suplementos
alimenticios: aun en estudio pero su deteccin combinando
HPLC con detectores colorimtricos es importante ya que estos
dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y
reguladores del ciclo celular.
Medicin

de

nutrientes

liposolubles

en

tabletas

multivitamnicas: el uso del HPLC permite la deteccin de

mltiples

vitaminas

en

alimentos

suplementarios

para

neonatos.
4-Hidroxinonenal y otros aldehdos: se forman como
resultado de peroxidacin de lpidos, durante la coccin o
podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia
para detectar estas sustancias que son citotxicas.
Surfactantes no inicos: la deteccin de estas sustancias es
crucial puesto que estn altamente reguladas debido

problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con

dispersin de luz evaporativa.
Carbohidratos simples: usar HPLC con ELSD elimina la
necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtindose en un
mtodo no destructivo.
Catequinas del t: las catequinas son flavonoles del t,
posiblemente anticancergenos. Se usa HPLC con hidrlisis
enzimtica para detectar estas sustancias tan beneficiosas.

106

 Triglicridos:

HPLC

con

ELSD

permite

la

separacin

caracterizacin de todos los tipos de triglicridos.

Contaminantes triptfanos: el HPLC con ELSD y detectores
colorimtricos permiten la deteccin de esta sustancia txica
proveniente de plaguicidas.

APLICACIONES GENERALES

Aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de

alimentacin : edulcorantes artificiales, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos, colorantes, aminocidos, protenas,
carbohidratos, lpidos.

107

Aplicaciones de la cromatografa inica : el anlisis de drogas y

sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas

para vitaminas, azcares, y preparaciones farmacuticas.
Aplicaciones referidas a productos alimenticios en

cromatografa por exclusin de tamaos: separacin de cidos

grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en zumos
enlatados.
Aplicaciones de La cromatografa de Gases. Se pueden destacar

las siguientes aplicaciones o ejemplos:

Aminas aromticas heterocclicas (HAA) formadas durante la

coccin de alimentos proteicos (carne y pescados). Donde estos
compuestos son mutagnicos potentes bien conocidos y
algunos de ellos son carcingenos. Se han formado en
alimentos cocinados, y tambin se han detectado en las
muestras ambientales (aerotransportadas partculas, aire de
interior, humo del cigarrillo...) y en las muestras biolgicas
(orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA
son muy importantes para el gravamen de riesgo para la salud
humana.

Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala

industrial: Se identifica y cuantifica, mediante cromatografa en
fase gaseosa aquellos componentes que definen la calidad
bsica de los orujos y cuyo control exige la administracin:
grado alcohlico, acidez total, acetato de etilo, metanol,
acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.

Determinacin de enantiomeric de compuestos chiral en

aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana, cacahuete y nuez)
haciendo uso de HPLC inversa y CG.

Estudio de vinos monovarietales.

Caracterizacin de avellanas por su composicin en cidos

grasos.

Identificacin d compuestos voltiles en granos de cacao.

108

Determinacin del perfil del cido graso, acidez y valor del

perxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacenaje.

Determinacin cuali y cuantitativa de componentes voltiles en

hierbas y especias.

Separacin de compuestos voltiles del queso.

Anlisis de compuestos terpnicos de la uva de la variedad

albario.

Estudio de compuestos azufrados voltiles pesados es vinos

tintos de la denominacin de origen ribeira sacra.

CONCLUSIONES
109

Se puede concluir que la cromatografa es en la actualidad una

tcnica ampliamente utilizada en la resolucin de macromolculas de
inters en la industria biotecnolgica, biolgica y bioqumica. Muestra
de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra
en la literatura especializada.
Se destaca en las ltimas dcadas un mayor uso de la cromatografa.
Esta versin instrumental de la cromatografa convencional resulta
ms ventajosa debido a los pequesimos volmenes que se
necesitan para el estudio en cuestin y los resultados se obtienen en
un tiempo mnimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las
tcnicas de separacin.

110

ANEXOS
CROMATOGRAFIA DE REPARTICION

Figura 8-3

Figura 8-4

CROMATOGRAFIA EN GEL

111

Figura 8-1

Figura 8-20

112

Figura 8-22

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO

113

114

CROMATOGRAFIA DE PENETRABILIDAD

115

GLOSARIO

116

 Cromatografa: La cromatografa es un mtodo fsico de

separacin en el que los componentes a separar se distribuyen
entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase
estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve en una
direccin definida.
Cromatgrafo: El instrumento empleado para realizar una
separacin cromatogrfica.
Cromatgrama: Una grfica u otro tipo de presentacin de la
respuesta de un detector, la concentracin de un analito en el
efluente u otra magnitud usada como medida de la
concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o al
tiempo. En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede
referirse al papel o capa con las zonas separadas.
Fase Ligada: Una fase estacionaria que est unida de forma
covalente a las partculas de soporte o a la pared interior de la
columna.
Fase Inmovilizada: Una fase estacionaria que est
inmovilizada sobre las partculas del soporte o sobre la pared
interior de la columna, por ejemplo por polimerizacin in situ
(entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento.
Fase Mvi: Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho
estacionario, en una direccin definida. Puede ser un lquido
(Cromatografa Lquida), un gas (Cromatografa de Gases) o un
fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido Supercrtico). En la
cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas Portador
para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa
tambin para la fase mvil la expresin Eluyente.

117

 Eluir: Aplicar la cromatografa de elucin. El proceso de elucin

se puede detener mientras todos los componentes de la
muestra estn an en el lecho cromatogrfico, o continuarse
hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el trmino
"Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas
anteriores de cromatografa plana.
Efluente: La fase mvil que abandona la columna.
Muestra: Mezcla consistente en cierto nmero de
componentes, cuya separacin se pretende en el lecho
cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil.
Componentes de la Muestra: Los constituyentes
qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por
la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos
parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos
permanentemente. Se aceptan tambin los trminos Eluito y
Analito para un componente de la muestra.
Soluto: Trmino que se refiere a los componentes de la
muestra en la cromatografa de reparto.

Disolvente: Trmino que en ocasiones se refiere a la fase

estacionaria lquida en la cromatografa de reparto.

Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de

reparto.
Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica en los sitios
activos de la
118

superficie de un slido, quedando limitado el fenmeno a la

superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta
retencin superficial puede ser fsica o qumica.
C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y
una fase mvil polar.
C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una
fase mvil no polar.
Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna.
Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio.
Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por
medio de cromatografa.
Soporte: El material slido inerte que en la Cromatografa de
reparto sirve para sostener la fase estacionaria lquida en su
sitio.
Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

Contrain: (Termino usado en HPLC, cromatografa inica), Un

contrain es un in que se combina con el in analito para
formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es
retenida por el relleno de la fase inversa.
Efectividad o selectividad de una columna
cromatogrfica: Se dice que una columna es efectiva cuando
las especies a separar se eluyen a velocidades relativas

119

suficientemente diferentes (los picos estn suficientemente

separados).
Eficacia de una columna cromatogrfica: Se dice que una
columna es tanto ms eficaz cuanto menos sea el
ensanchamiento de los picos. La eficacia ser mayor cuanto
ms pequea sea la altura de plato y mayor sea el nmero de
platos.
Resolucin de una columna: Parmetro que proporciona una
medida cuantitativa de su capacidad para separar dos solutos.
Debe ser mayor a 1,5 para que se considere buena.
Tiempo de retencin:( tr ) Es el tiempo entre la inyeccin de
una muestra y la aparicin de un pico de soluto en el detector
de una columna cromatogrfica.
Tiempo muerto: ( tm ) Es el tiempo que tarda en salir de la
columna una sustancia no retenida.

120

BIBLIOGRAFA

DOCON NAVAZA, Carmen; GARCA SAAVEDRA, Jos; VICENTE

GARCA,

Jos,

FUNDAMENTOS

TECNCAS

DE

ANALISIS

BIOQUMICO, (1999) Paraninfo, Espaa.

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POZO,

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OADERRA,

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LINCKOGRAFA

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unidad_ix.htm
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