Cromatografa

La cromatografa es un mtodo de separacin de diferentes componentes de una muestra, este mtodo

logra la separacin de los mismos a travs del paso de una muestra por una fase estacionaria con la
ayuda de la fase mvil, cada componente de la muestra tiene propiedades particulares que permitir su
interaccin en forma diferente entre la fase estacionaria y mvil, de esta forma cada componente se
retrasa en forma particular y si el caudal, las caracterstica de la fase estacionaria y mvil, y la longitud de
la columna son las adecuadas se lograra la separacin completa de todos los componentes de la
muestra.

Clasificacin de los Mtodos Cromatograficos:

Segn como se coloque en contacto la fase mvil y estacionaria:

Cromatografa en columna
Cromatografa plana

Segn el tipo de fase mvil utilizada:

Cromatografa gaseosa
Cromatografa Liquida
Cromatografa de fluidos sper crticos

Tiempo de Retencin
El tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra para que el pico del analito alcance el
detector se denomina tiempo de retencin y se le da el smbolo tR

Tiempo Muerto
Es el tiempo tM para que la especie no retenida alcance el detector. Es el primer pico que sale que no es
retenido por la columna

Factor de Capacidad
Es un parmetro (k) que se utiliza para describir las velocidades de migracin de los analitos en las
columnas y se interpreta considerando que mientras mayor sea el valor de este factor menor es la
velocidad de migracin de los solutos en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad A k se
define como:

Donde KA es la constante de distribucin, VS es el volumen de la fase estacionaria y VM es el volumen de

la fase mvil. Tambin puede ser descrito en trminos experimentales los cuales pueden ser tomados de
un cromatograma:

Donde (tR)A es el tiempo de retencin del componente A y tM es el tiempo muerto obtenido para una
especie no retenida.

Factor de Selectividad
El factor de capacidad de una columna, como su nombre lo indica, es un trmino que define que tan
selectiva es una columna para separar dos picos.
Entonces el factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como:

Donde kB es el factor de capacidad del compuesto B, que es el ms retenido y kA es el factor de

capacidad del compuesto A, que es el menos retenido.
Con esta definicin siempre es mayor que la unidad.
En trminos tomados a partir de un cromatograma se puede calcular como sigue:

Eficiencia de una Columna

Como se dijo anteriormente, si no se toma en cuenta los factores que afectan el ancho de un pico para la
separacin cromatografa no se podra lograr una buena separacin aun cuando se tenga un factor de
selectividad alto para estos picos en una columna particular.
Es decir que mientras mayor es la capacidad de la columna de producir picos ms estrechos mayor es su
eficiencia.
La anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a travs de la columna, debido a que cuanto
ms tiempo transcurre mayor es la dispersin que puede tener lugar. Por ello la anchura de la zona est
relacionada directamente con el tiempo de residencia en la columna, e inversamente con la velocidad a la
que fluye la fase mvil.
Se utilizan dos trminos afines con frecuencia como medida cuantitativa de la eficacia de una columna
cromatografa: (1) la altura equivalente de plato o H y (2) el nmero de platos tericos N. Los dos estn
relacionados por la ecuacin:

Donde L es la longitud (normalmente en centmetros) del relleno de la columna

La eficacia de la columna cromatografa aumenta cuando mayor es el nmero de platos tericos, y
cuando menor es la altura de plato. Existen diferencias en las eficacias por diferencias en el tipo de
columna y/o el tipo de fases mvil y estacionaria. Las eficacias en trminos de nmero de platos varan de
cientos a miles, y las alturas de plato de unas pocas dcimas a milsima de centmetro o menos.
Ecuacin numero de platos tericos

Resolucin de la columna
La resolucin RS de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos
analitos, en este trmino si se toma en cuenta el ensanchamiento de los picos, as que la magnitud de
este valor si permite asegurar la separacin de dos picos.

Donde WA y WB son los anchos de banda de las bandas A y B respectivamente.

La resolucin puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendr una buena
resolucin si los picos no se solapan, y est perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final
de uno con el principio del siguiente.
Si el valor de la resolucin est prximo a 0,7 se obtendr una mala resolucin quedando los picos
solapados, de forma que se distinguen las crestas, pero no la base, y si el valor de la resolucin est
prximo a 1,5 se obtendrn unos picos bien delimitados por lo que se obtendr una buena resolucin.

CROMATOGRAFIA DE GASES
En la cromatografa de gases, la muestra es inyectada en la fase mvil, la cual es un gas inerte (H2, He y
N2) y es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida.
Los componentes abandonan la columna en orden creciente de interaccin con la fase estacionaria.
La columna se encuentra dentro de un horno con programacin de temperatura.
Cada soluto tiene una afinidad diferente con la fase estacionaria, lo que permite su separacin: los
componentes con gran afinidad tardaran ms tiempo en salir que los que tienen menos. Un factor clave
en este equilibrio es la presin de vapor de los compuestos (a mayor P menor tiempo de retencin)

Sistema de inyeccin
El modo estndar es la inyeccin directa, la muestra es inyectada con una jeringa a travs de un septum
de goma a un alineador de vidrio donde es vaporizada y transportada por el gas al interior de la columna.
El bloque de inyeccin, se mantiene a una temperatura tal que permita convertir prcticamente de forma
instantnea la muestra lquida en un tapn de vapor.
El modo de separacin ms extendido en la actualidad se basa en el empleo de columnas capilares.
Estas columnas requieren muy pequeos volmenes de muestra.
Esto se logra empleando un inyector que incorpora un divisor de flujo (split). Normalmente se introduce en
la columna un 1%
Cuando las sustancias a separar se encuentran a muy bajas concentraciones se realiza inyeccin sin
divisor (splitless)

Gas Portador
El gas portador, que acta como fase mvil y transporta los componentes de la muestra a travs de la
columna y hasta el detector, deber ser una especie qumicamente inerte respecto al analito y

relativamente barata, ya que es expulsado a la atmsfera al final del proceso cromatogrfico. En la

prctica, los gases ms utilizados son: helio, nitrgeno, hidrgeno, argn y dixido de carbono,
especialmente los tres primeros.
Los requisitos del gas portador son:

Adecuado a detector a utilizar

Inerte (tanto con la muestra como con la fase estacionaria)
Capaz de minimizar la difusin gaseosa
Alta pureza y facilidad de disposicin
Econmico

Columnas empaquetadas o relleno

Las columnas empaquetadas suelen ser tubos de vidrio o de metal (inerte a ser posible como el acero
inoxidable, Ni, Cu o Al) o de tefln, de longitud de 05 y 5 m y de un dimetro interno de 2 a 4 mm,
van enrolladas en forma helicoidal, con dimetros comprendidos entre los 10 y los 30 cm, que permiten su
emplazamiento en el interior del horno, que permite el control de la temperatura de trabajo.
Se llenan con un soporte slido de grano fino (60-100 mallas, 0.25-0.15 mm) recubierto de una capa
delgada (0.05-1 m) de un lquido no voltil que acta de fase estacionaria. El material empleado como
soporte slido debe ser homogneo y estar formado por partculas pequeas, que sean resistentes y
proporcionen una elevada rea superficial. Es muy frecuente el uso de tierra de diatomeas, que es un
material sedimentario rico formado por esqueletos silceos fosilizados de dichas algas unicelulares y que
posee una estructura porosa que proporciona una gran superficie de contacto con la fase estacionaria (o
con la fase mvil en cromatografa gas-slido).
Cuando estudiamos la ecuacin de van Deemter vimos que el tamao de las partculas del relleno
guardaba relacin con la efectividad de la columna, ya que al disminuir el dimetro de partcula se
minimiza el efecto de la difusin en remolino, por lo que la altura de plato tambin disminuye. Sin
embargo, la diferencia de presin del gas portador vara inversamente con el cuadrado del dimetro de la
partcula. Por lo tanto, existe un lmite inferior en el tamao de las partculas empleadas, en torno a
01 mm, para poder mantener una tasa de flujo aceptable.

Columnas capilares
Las columnas tubulares abiertas o columnas capilares son mucho ms estrechas y suelen ser mucho ms
largas que las columnas empaquetadas.
Hay dos tipos de columnas de capilares:

Las de pared recubierta (WCOT)

Con soporte recubierto (SCOT)

Las columnas de pared recubierta son sencillamente tubos capilares con la pared interna recubierta de
una fina capa de fase estacionaria, mientras que en las columnas SCOT la superficie interna del capilar
est recubierta de una fina capa de un material soporte recubierto a su vez de una fase lquida
estacionaria. En general, la eficacia de una columna SCOT es menor que la de una columna WCOT, si
bien bastante mayor que la de una columna empaquetada. Por ello, las columnas SCOT han sido
sustituidas casi en su totalidad por las WCOT.
Las columnas WCOT se construyen con slice fundida, fabricadas con slice prcticamente exenta de
xidos metlicos y con un recubrimiento externo protector de poliamida, porque si ese recubrimiento son
muy frgiles y no se podran enrollar.
Las columnas FSOT (WCOT de slice fundido) poseen dimetros internos variables de entre 250 y 320
m (para columnas normales) y de 150-200 m (para columnas e alta resolucin).

En estas columnas existe un gran problema que es la absorcin del analito sobre la superficie de slice
fundida, debido a la presencia de grupos silanol (Si-OH), que se soluciona inactivando la superficie con
sililacion con dimetilclorosilano.

Fase Estacionaria
La fase estacionaria tiene en cromatografa de gases un papel fundamental, ya que la fase mvil es
cromatogrficamente inerte y las separaciones son debidas exclusivamente a las interacciones
especficas que se dan entre los componentes de la muestra y la fase estacionaria.
Como en casi todos los casos, las propiedades deseables de una fase estacionaria son con frecuencia
contradictorias, por lo que no existe la fase estacionaria ideal. Las propiedades que debera cumplir una
fase estacionaria son:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Debera tener un rango de temperaturas de utilizacin lo ms amplio posible (idealmente entre

-60 y 400 EC).
Debe tener una presin de vapor lo ms baja posible.
Debe ser trmicamente estable.
Debe ser qumicamente inerte.
Debe tener baja viscosidad en las condiciones de trabajo.
Debe mojar bien el soporte, presentando adems una adherencia suficiente como para que no
sea arrastrada por la fase mvil.

Adems de cumplir estos requisitos generales, la fase estacionaria debe ser selectiva frente a los
compuestos a separar.
Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas, para elegir una debe tenerse
en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito se necesitara una fase
estacionaria con polaridad mayor.
Algunas de las faces estacionarias son las siguientes:

Polidimetilsiloxano: fase no polar de uso general para HC, aromticos, drogas, etc.
Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% de fenilo): para esteres metlicos de cidos grasos,
alcaloides, drogas y compuestos halogenados.
Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo): drogas, esteroides, pesticidas y glicoles
Polietilenglicol: compuesto polares, glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales

SISTEMAS DE INTRODUCCION DE MUESTRAS

En esencia, los dispositivos de inyeccin de muestras para cromatografa de gases tienen la misin de
vaporizar la muestra a analizar e incorporarla a la corriente de gas portador que se dirige hacia la
columna. La vaporizacin e introduccin de las muestras en el sistema, debe realizarse cumpliendo una
serie de requisitos:
1.
2.
3.

La vaporizacin de la muestra debe ser lo ms rpida posible.

La vaporizacin debe realizarse sin discriminar ningn componente de la muestra.
La muestra debe llegar a la columna como una banda lo ms fina posible.

Inyectores para columnas empaquetadas

La inyeccin de muestras en columnas empaquetadas no presenta problemas particulares; este tipo de
columnas admiten cantidades de muestra relativamente elevadas, y la inyeccin de unos cuantos
microlitros de muestra no conduce a una merma apreciable de la eficacia de la columna.
La mayora de los cromatgrafos comerciales utilizan cmaras de inyeccin termostatizadas

Un inyector est formado por un bloque metlico, buen conductor del calor, provisto de un sistema de
calentamiento, un termostato capaz de mantener su temperatura constante y un aislamiento trmico
adecuado; en el interior de este horno, se encuentra alojado el sistema de inyeccin. En ste, el gas
portador, previamente calentado, pasa de forma continua por el sistema; la muestra es inyectada en el
interior de la cmara, por medio de una microjeringa de precisin, a travs de un diafragma perforable
(septum) con capacidad de autosellado en el momento en que se retira la aguja; una vez inyectada la
muestra, sta es vaporizada de forma instantnea, mezclndose con el gas portador en una cmara de
mezcla (liner) construida de un material lo ms inerte posible (acero inoxidable, nquel, vidrio o cuarzo).
La muestra, una vez vaporizada, es arrastrada rpidamente por la corriente de gas portador en direccin
a la columna

Inyectores para columnas capilares

Los sistemas de introduccin de muestras utilizados para trabajar con columnas capilares, estn basados
sobre los mismos principios de los inyectores utilizados para columnas empaquetadas, por lo que las
consideraciones generales sobre ellos siguen siendo vlidas.
La diferencia fundamental entre los sistemas que utilizan columnas empaquetadas y los que utilizan
columnas capilares, radica en que la cantidad de muestra que estas ltimas pueden separar es mucho
menor que en el primer caso; por otra parte, las columnas capilares son muy afectadas por los
disolventes, de forma que los volmenes que se pueden inyectar en ellas son extremadamente bajos.
Dado que no existen jeringas capaces de medir con precisin volmenes inferiores a 0,1 l, los inyectores
utilizados para trabajar con este tipo de columnas, adems vaporizar la muestra y mezclarla con el gas
portador, debern ser capaces de introducir en la columna slo una alcuota de la muestra total inyectada.
Existen muchas ms tcnicas de inyeccin para columnas capilares los cuales son:
1.

Inyeccin con divisin de muestra

El inyector de split, consta bsicamente de los mismos elementos que un inyector normal, con la
nica adicin de un sistema de divisin de flujo a la salida de la cmara de mezcla. Por medio de este
tipo de inyector, el flujo de gas portador que pasa a travs del inyector (y por lo tanto tambin la
muestra vaporizada), se divide en dos; una parte es introducida en la columna y la otra escapa fuera
del sistema a travs de una vlvula de aguja que permite regular la proporcin de gas que es
introducido en la columna.

Dado que en este tipo de inyectores la mayor parte del caudal del gas portador se dirige hacia la
atmsfera, la vlvula de split dispone de un sistema de apertura y cierre automticos para que
nicamente permita la salida de gas hacia la atmsfera durante el proceso de inyeccin. El control del
flujo de gas portador que pasa a travs de la columna, se realiza en este tipo de sistemas manteniendo
constante la presin en la cmara de inyeccin, lo que permite que el caudal de gas que pasa a travs del
inyector pueda variar en funcin de que la vlvula de split est abierta o cerrada.
Los inyectores de este tipo presentan dos inconvenientes; en primer lugar la divisin de la muestra da
lugar a que las cantidades de analito que son separadas y llegan al detector sean muy pequeas y por
otra parte, los inyectores de split pueden en algunos casos dar lugar a discriminacin entre los
componentes de la muestra.
2.

Inyeccin splitless

En la tcnica de inyeccin splitless, la totalidad de la muestra inyectada es dirigida hacia la columna, que
se mantiene durante la inyeccin a una temperatura inferior al punto de ebullicin del componente ms
voltil de la muestra. La totalidad de la muestra inyectada, lgicamente condensa en la cabeza de la
columna, actuando en este caso el disolvente condensado en la columna a modo de trampa donde se
concentran los componentes a analizar (efecto solvente). Transcurrido un tiempo adecuado, se abre en el
inyector una vlvula de purga con el fin de barrer a la atmsfera el disolvente vaporizado que pudiera
quedar en el inyector; al mismo tiempo, se comienza un programa de calentamiento de la columna para
realizar el anlisis.
La utilizacin de la tcnica de splitless supone dos importantes ventajas. En primer lugar, dado que no
existe divisin de muestra, permite un aumento notable de la sensibilidad, por lo que es muy adecuada
para el anlisis de trazas. Por otra parte, la reconcentracin de la muestra en la cabeza de la columna
origina que las prdidas de eficacia debidas a una inyeccin inadecuada sean de mucha menor
importancia que en otras tcnicas de inyeccin.
El diseo de un inyector splitless es bsicamente el mismo que el del inyector de split. La mayora de
los inyectores de split comerciales, estn diseados para poder trabajar tambin en modo splitless.

3.

Inyeccin en columna

Los sistemas de inyeccin en columna (normalmente conocidos por su nombre ingls de on-column),
han sido diseados para posibilitar la introduccin de muestras directamente en el interior de columnas
capilares. Es evidente que la introduccin de una muestra por medio de una jeringa directamente en el
interior de una columna capilar (de 0,23 mm de dimetro interno), requiere la utilizacin de agujas
extremadamente finas (suelen utilizarse agujas de slice fundida de 0,15 mm de dimetro) que, en
consecuencia, son incapaces de perforar un septum; la caracterstica bsica de un inyector on-column,
es la utilizacin de un sistema de vlvulas y tubos de gua que permitan la introduccin en el sistema de
una aguja extremadamente fina.

La muestra es introducida directamente en la columna, mantenindose sta a una temperatura inferior al

punto de ebullicin del componente ms voltil de la muestra. Una vez introducida la muestra, se inicia el
programa de calentamiento de la columna para proceder a la separacin.
La gran ventaja que ofrece el sistema de inyeccin on-column, es que reduce la discriminacin entre los
componentes de la muestra prcticamente a cero, obvindose adems todos los problemas que
presentan las restantes tcnicas de inyeccin.