Relatrio Interno

Princpios Gerais de Culturas de Clulas

e Citometria de Fluxo para Avaliao dos
Efeitos da Radiao Ionizante

Adriana Alexandre dos Santos Tavares

Joo Manuel R. S. Tavares

Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

Julho de 2009

Agradecimentos
A primeira autora deseja expressar os seguintes agradecimentos:
- Ao Professor Joo Manuel R. S. Tavares pelo apoio fornecido ao longo do meu
projecto de Mestrado, em particular pela orientao, disponibilidade e apoio fornecido ao longo
de todo este projecto.
- Aos meus pais e irmo por terem demonstrado, como sempre, um apoio incondicional.
- A todos os que possibilitaram o desenvolvimento do meu projecto de Mestrado.

Sumrio:

Este relatrio tem por objectivos expor em os princpios gerais de cultura de clulas e da
citometria de fluxo para anlise dos efeitos da radiao ionizante em culturas de clulas. Assim,
conceitos relacionados com culturas de clulas, incluindo tipos de culturas e vantagens e
desvantagens, so expostos no presente relatrio. Adicionalmente, o princpio da tcnica de
citometria de fluxo, bem como, o seu uso em estudos dos efeitos da radiao ionizante em
culturas de clulas, so igualmente apresentados.

Summary:
This report aims to explain in the basic principles of cells culture and flow citometry for the study
of ionizing radiation effects on cells culture. Thus, subjects such as cells culture type and
advantages/disadvantages of cells culture are explained. Additionally, basic principles of flow
citometry, as well as, its applicability for the study of ionizing radiation effects on cell culture are
also presented.

ndice
Captulo I. Princpios Gerais de Culturas de Clulas ..................................................................... 1
1.1 Introduo ................................................................................................................................ 2
1.2 Tipos de Culturas ..................................................................................................................... 3
1.3 Morfologia e Caractersticas Funcionais .................................................................................. 5
1.4 Meios de Cultura ...................................................................................................................... 7
1.5 Avaliao e Contaminao da Cultura ..................................................................................... 9
1.6 Sumrio ................................................................................................................................. 14
Captulo II. Citometria de Fluxo e Avaliao dos Efeitos da Radiao em Culturas de Clulas .. 15
2.1 Introduo .............................................................................................................................. 16
2.2 Citmetro de Fluxo: Principais Caractersticas ...................................................................... 17
2.3 Vantagens e Desvantagens da Citometria de Fluxo .............................................................. 19
2.4 Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da Radiao em Culturas de Clulas.......... 21
2.5 Sumrio ................................................................................................................................. 24
Captulo III. Concluso................................................................................................................. 26
Bibliografia ................................................................................................................................... 28

Captulo I. Princpios Gerais de Culturas de Clulas

Princpios Gerais de Culturas de Clulas e Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da Radiao Ionizante

1.1 Introduo
A cultura de clulas tem vindo a afirmar-se como uma ferramenta muito til em mltiplas
reas de investigao das cincias da sade.
O termo cultura tecidular refere-se ao processo de extraco de tecidos ou rgos de um
animal ou planta, com consequente colocao num ambiente artificial capaz de sustentar e
proporcionar o crescimento destes. Este ambiente , geralmente, criado num receptculo de
plstico ou vidro com um meio de cultura lquido ou semi-slido capaz de fornecer nutrientes
essenciais para a sobrevivncia e crescimento do tecido ou rgo. Quando se removem clulas
de fragmentos de rgos antes ou durante a cultura, com concomitante separao das clulas
vizinhas, diz-se que se est a realizar uma cultura de clulas.
Apesar das culturas de clulas animais terem sido realizadas com sucesso por Ross
Harrison em 1907, s na dcada de 40 e 50 do sculo XX, e aps vrios desenvolvimentos,
que ocorrem as primeiras culturas de clulas amplamente disponveis como ferramenta de
pesquisa para os cientistas, (Ryan 2008). As principias razes para isso incluem: primeiro, o
desenvolvimento de antibiticos, que facilitaram o processo de cultura celular e evitaram muitos
dos problemas inerentes a contaminaes da cultura celular; segundo, verificou-se a melhoria
das tcnicas, nomeadamente, aquelas relacionadas com o uso de tripsina para remoo de
clulas dos vasos de cultura e fundamentais para a obteno de linhas celulares em crescimento
contnuo (tais como, clulas HeLa); finalmente, como terceira razo, surgem as linhas de
culturas de clulas padronizadas, com meios de cultura quimicamente definidos, o que facilitou o
trabalho padronizado entre diferentes grupos de cientistas, bem como, facilitou o processo de
cultura celular, tornando-o mais gil, (Ryan 2008).
O presente captulo tem como principais objectivos abordar os principais conceitos de
culturas de clulas; nomeadamente, o conceito de linha celular, meio de cultura, avaliao da
cultura e morfologia celular. Para tal, estruturou-se o mesmo da seguinte forma: primeiro,
aborda-se os principais tipos de clulas; depois, algumas das caractersticas funcionais e
morfolgicas das culturas; de seguida, expe-se tcnicas para avaliao da cultura; e finalmente,
apresenta-se um sumrio.

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1.2 Tipos de Culturas

As culturas primrias derivam directamente de tecido animal normal excisado, o qual
posteriormente transplantado para uma cultura ou, aps dissociao por enzimas digestivas,
colocado sob a forma de clulas nicas em suspenso. Estas culturas so inicialmente
heterogneas, contudo com o passar do tempo tornam-se dominadas por fibroblastos. A
preparao destas culturas ditas primrias um processo que requer trabalho minucioso e
demorado, apresentando como principal desvantagem um tempo de sobrevivncia in vitro
limitado. Apesar desta desvantagem, durante o seu curto perodo de vida, estas clulas tm
como vantagem a capacidade de reter muitas das caractersticas de diferenciao observveis
em clulas in vivo, (SIGMA 2008). As culturas primrias obtidas pelo mtodo de explantao so
obtidas pela recolha cirrgica de pequenas peas de tecido, que so posteriormente colocadas
no vaso de cultura (de plstico ou vidro) emergido num meio de cultura. Alguns dias aps, as
clulas individuais so transferidas do tecido explantado e colocadas num outro vaso de cultura
com substrato, onde se dividiro e crescero. O segundo mtodo para realizao de culturas de
clulas primrias, que o mais amplamente utilizado, acelera o processo pela adio de
enzimas digestivas (enzimas proteolticas), como o caso da tripsina e da colagenase, que vo
fragmentar o tecido e clivar as ligaes entre as clulas. Desta forma, cria-se uma suspenso de
clulas nicas que depois colocada num vaso de cultura com meio de cultura adequado para
crescimento e diviso celular. Este mtodo denominado dissociao enzimtica, Figura 1.1.
Remover tecidos

Separar tecidos

Digesto com
enzimas
proteolticas

Colocar no meio cultura

Figura 1.1. Representao do processo de dissociao enzimtica em culturas primrias de clulas
(adaptado de (Ryan 2008)).

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Quando as clulas resultantes de culturas primrias desenvolvem-se e utilizam todo o

substrato disponvel na cultura, estas devem ser subculturadas para que possam continuar a
crescer. Este processo geralmente realizado com recurso a enzimas que gentilmente separam
as clulas do substrato da cultura. Estas enzimas so similares s utilizadas durante o processo
de dissociao enzimtica a que as culturas primrias so submetidas e, uma vez, terminado o
processo, a suspenso de clulas pode ser subdividida e colocada em novos vasos de cultura,
(Ryan 2008).
Dado que as culturas primrias de clulas so isoladas de seres vivos, em particular
para as cincias da sade, de seres humanos ou de animais, estas apresentam populaes
heterogneas, por exemplo, apresentam diferentes populaes celulares e diferentes estados de
diferenciao celular. Cada amostra removida do dador , por isso mesmo, nica e impossvel
de reproduzir exactamente. O processo de diferenciao deste tipo de clulas inicia-se no
momento em que estas clulas so removidas do dador, pelo que tais culturas so dinmicas e
esto em constante alterao. Assim, as culturas primrias de clulas requerem comummente
meios de cultura complexos e so sistemas extremamente difceis de padronizar, (Hartung
2002).
Culturas de clulas contnuas so constitudas por um nico tipo de clulas que se
propagam em srie durante um nmero limitado de divises celulares (geralmente cerca de
trinta) ou, em alguns casos, de forma ilimitada. O primeiro grupo (divises celulares limitadas)
usa, geralmente, clulas diplides e mantm, habitualmente, um certo grau de diferenciao. O
facto destas linhas celulares apresentarem senescncia ao fim de trinta divises celulares
significa que prticas rigorosas de trabalho devem ser empregues para que estas consigam
sobreviver perodos de tempo considerveis. Por outro lado, o grupo das clulas que se
propagam indefinidamente possui, frequentemente, esta capacidade devido ao facto de terem
sido transformadas em clulas tumorais. As linhas de clulas tumorais derivam, frequentemente,
de tumores reais, contudo, podem ser criadas por induo, utilizando oncogenes virais ou
tratamentos qumicos. Estas linhas apresentam como vantagem a disponibilidade quase
ilimitada, contudo, retm muito poucas caractersticas das clulas originais in vivo, (SIGMA
2008). Para alm disso, as linhas celulares contnuas, por serem mais homogneas e mais
estveis so, portanto, mais reprodutveis que as populaes de clulas primrias. Estas
caractersticas advm do facto de ocorrerem alteraes fundamentais no fenotipo das clulas,
logo aps o isolamento do tecido do dador, (Hartung 2002).
Em suma, pode-se definir cultura de clulas como um tipo de cultura de tecidos que
envolve um conjunto de tcnicas que permitem cultivar e/ou manter clulas isoladas fora do
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organismo de origem. Existem basicamente dois grandes grupos de culturas celulares: culturas
primrias, as quais so obtidas directamente de tecidos, so heterogneas, mantm-se pouco
tempo em cultura e so mais propcias ao desenvolvimento de contaminaes; e linhas
celulares, que so obtidas a partir de culturas primrias, podem ser clulas imortalizadas (devido
a alteraes genticas), apresentam crescimento rpido e contnuo e proliferao ilimitada ou
limitada a um nmero elevado de divises celulares, Figura 1.2, (Coimbra 2008).

Figura 1.2. Clulas de culturas primrias ( esquerda) e linhas celulares ( direita) (retirado de (Coimbra
2008)).

As principais vantagens do uso de culturas de clulas incluem o controlo de condies

ambientais, a anlise independente de parmetros, elevado nmero de testes num reduzido
intervalo de tempo, reduo dos ensaios com animais e tcnica menos dispendiosa que a
experimentao animal. Por outro lado, as principais desvantagens incluem: perda de
caractersticas fenotpicas, sistema biolgico fora do ambiente natural e ausncia de sinais
importantes, (Coimbra 2008).
O processo de criao de uma cultura de clulas in vitro envolve, de forma sucinta, o
dador, as clulas ou tecido, o meio de cultura e o substrato. Estes componentes interagem e as
propriedades do sistema na sua totalidade, bem como as suas variaes, so o resultado
indubitvel de tais interaces, (Hartung 2002).

1.3 Morfologia e Caractersticas Funcionais

As culturas de clulas podem apresentar-se em duas formas: em suspenso e em
monocamada aderente. A forma como estas se dispem reflecte o tecido no qual tiveram origem,
pelo que, culturas de clulas derivadas do sangue tendem a crescer em suspenso, enquanto

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clulas derivadas de tecidos slidos (como por exemplo: pulmo e rim) tendem a crescer em
monocamadas aderentes, (SIGMA 2008).
As culturas celulares podem ser descritas com base na sua morfologia (forma e aspecto)
ou com base nas suas caractersticas funcionais. Assim, podem ser dividias em trs grandes
grupos, (Ryan 2008):
Epiteliais: clulas que aderem ao substrato e apresentam forma achatada e
poligonal;
Linfoblsticas: clulas que, normalmente, no aderem ao substrato, permanecendo
em suspenso com uma forma esfrica;
Fibroblsticas: clulas que esto aderidas ao substrato e apresentam-se alongadas,
bipolares e frequentemente formam remoinhos.
O uso de tcnicas de fuso tornou possvel o desenvolvimento de clulas hbridas pela
juno de dois tipos de clulas diferente. Estas podem exibir caractersticas de uma das clulas
me ou das duas. Esta tcnica foi utilizada em 1975 para criar clulas capazes de produzir
anticorpos monoclonais especficos, (Ryan 2008). As referidas clulas, denominadas hibridomas,
so formadas pelo uso de duas clulas diferentes, mas relacionadas entre si. A primeira um
linfcito derivado do bao com capacidades de produzir o anticorpo desejado; enquanto, a
segunda uma clula de melanoma com grande capacidade de proliferao, a qual
programada para produzir grandes quantidades de anticorpos, mas no para produzir o
anticorpo.
As caractersticas das culturas de clulas resultam da relao entre a sua origem e a
forma de adaptao destas s condies da cultura celular. Marcadores bioqumicos podem ser
utilizados para determinar se as clulas continuam a desempenhar funes especializadas, da
mesma forma que enquanto presentes nos tecidos in vivo. Marcadores morfolgicos e
ultraestruturais podem tambm ser examinados. Frequentemente, estas caractersticas so
perdidas ou alteradas como resultado do processo de colocao no ambiente artificial da cultura
de clulas. Algumas linhas celulares podem, eventualmente, parar a sua diviso celular,
demonstrando sinais de envelhecimento contnuos. Estas clulas so denominadas finitas.
Outras linhas, ditas imortais continuam a dividir indefinidamente, sendo denominadas linhas
celulares contnuas. Quando uma linha celular dita normal se transforma numa linha imortal,
realizando deste modo, uma alterao irreversvel ou transformao, quer intencionalmente (pela
utilizao de frmacos, radiao ou vrus) quer de forma espontnea, diz-se que so clulas
transformadas. Como caractersticas principais, estas clulas apresentam um crescimento,
geralmente, mais fcil e rpido; contudo, apresentam, frequentemente, cromossomas anormais e
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extranumerrios. As clulas que apresentam nmero normal de cromossomas so denominadas

clulas diplides, enquanto aquelas que apresentam nmero alterado de cromossomas so
denominadas aneuplides, (Ryan 2008).

1.4 Meios de Cultura

Um meio de cultura consiste numa soluo base definida, normalmente constituda por
sais, acares e aminocidos, bem como, alguns suplementos misturados, dependendo do tipo
de clulas, (Hartung 2002).
Para muitos investigadores, um ambiente saudvel para a sobrevivncia das clulas em
cultura deve ser aquele que permita, pelo menos, um aumento do nmero de clulas devido
diviso celular (mitose). Adicionalmente, quando as condies do meio de cultura so as ideais,
as clulas podem apresentar funes fisiolgicas e bioqumicas similares s que apresentam in
vivo, tais como, contraco muscular ou secreo de enzimas ou hormonas. Para alcanar este
meio de cultura ideal importante considerar a temperatura, o substrato para adeso da camada
de clulas e o meio de cultura.
A temperatura do meio , geralmente, colocada temperatura corporal do dador de
onde foram retiradas as clulas; atendendo a que, vertebrados de sangue frio apresentam
temperaturas entre 18 e 25 C, enquanto os mamferos exibem uma temperatura entre 36 e 37
C. A manuteno da temperatura na cultura de clulas conseguida pelo uso de incubadoras
bem calibradas e ajustadas.
Para clulas que necessitam de um substrato para suporte este deve ser capaz de
fornecer capacidade de suporte, mas tambm crescimento. Os substratos mais comuns so o
vidro e alguns tipos de plstico tratados. Para alm disso, devem ser adicionados factores de
adeso, tais como, o colagnio, gelatina, fibronectina e laminina, que melhoraro o crescimento
e funo normal de clulas derivadas do crebro, vasos sanguneos, rins, fgado, pele e muitos
outros. Muitas vezes, as clulas que aderem podem funcionar melhor quando a superfcie de
adeso permevel ou porosa, pois deste modo podem polarizar de forma similar ao que
sucede no interior do corpo.
Como referido, o meio de cultura um factor importante e complexo em termos de
controlo para alcanar um meio de cultura desejado pois, para alm dos requisitos nutricionais, o
meio de cultura necessita de factores de crescimento, regulao do pH e osmolalidade e
fornecimento de gases essenciais (como oxignio e dixido de carbono). Os nutrientes

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fornecidos possibilitam s clulas a produo de protenas e outros componentes essenciais

para o crescimento e funcionamento, bem como, a produo de energia necessria para o
metabolismo. Por outro lado, os factores de crescimento e as hormonas auxiliam na regulao e
controlo da taxa de crescimento celular e das caractersticas funcionais. comum, em vez de se
adicionarem estes componentes directamente ao meio de cultura, adicionar-se 5 a 20% de soro
animal ao meio. Contudo, tal procedimento acrescenta variabilidade, dado que, os soros so
fornecidos por diferentes produtores e dentro do mesmo produtor por diferentes animais, pelo
que muitas vezes surgem problemas em controlar o crescimento e funo celular. Quando as
clulas normais funcionais esto em crescimento, o soro geralmente substitudo por factores
de crescimento especficos.
No meio deve-se tambm controlar o pH, para evitar alteraes abruptas deste.
Usualmente um buffer (soluo tampo) de CO2-bicarbonato ou um buffer orgnico so
utilizados para manter o pH do meio num intervalo de 7.0 a 7.4, dependendo do tipo de clulas.
Quando se utiliza o buffer CO2-bicarbonato necessrio controlar e regular a quantidade de CO2
dissolvida no meio. Tal procedimento , geralmente, realizado pelo incubador com controlos de
CO2 e deve fornecer uma atmosfera com cerca de 2 a 10% de CO2. Por outro lado, alguns meios
com CO2-bicarbonato no necessitam de CO2 adicional; contudo, nestes casos deve-se utilizar
um vaso de cultura selado, (Ryan 2008). A maioria dos meios de cultura disponveis
comercialmente inclui fenol vermelho como indicador de pH, cuja funo monitorizar
constantemente o estado do pH em culturas celulares pela mudana de cor. Geralmente, o meio
de cultura deve ser mudado quando a cor muda para amarelo (meio cido) ou prpura (meio
alcalino), (SIGMA 2008).
Por ltimo, a osmolalidade (presso osmtica) do meio de cultura importante, pois
auxilia a regular o fluxo de substncias do interior para o exterior das clulas. Assim, a
evaporao observada em meios de cultura em vasos abertos vai diminuir rapidamente a
osmolalidade resultando em clulas danificadas, mortas ou em stress. Nestes casos os
incubadores com altos nveis de humidade podem reduzir a evaporao ao estritamente
essencial, (Ryan 2008).
Os constituintes bsicos de um meio de cultura incluem: sais inorgnicos, carbohidratos,
aminocidos, vitaminas, cidos gordos e lpidos, protenas e pptidos e soro. As principias
funes destes constituintes so descritas em seguida.
Os sais inorgnicos ajudam a manter o equilbrio osmtico entre clulas e regulam o
potencial de membrana pelo fornecimento de ies clcio, sdio e potssio. Todos estes ies so
igualmente requeridos pela matriz de adeso celular, assim como co-factores enzimticos.
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Os carbohidratos, geralmente na forma de acares, so a maior fonte de energia das

culturas de clulas. Os acares mais utilizados em culturas celulares incluem a glucose e a
galactose, contudo alguns meios podem necessitar de maltose ou frutose. A concentrao de
acares no meio basal varia entre 1 e 4.5 g/L em meios mais complexos. Um meio com
elevadas concentraes de acares capaz de sustentar o crescimento de um vasto espectro
de tipos de clulas.
O soro da cultura de clulas frequentemente a fonte de vitaminas para a cultura de
clulas; contudo, muitos meios podem ser enriquecidos com vitaminas de forma a tornarem-se
mais capazes de suportar um vasto nmero de clulas. As vitaminas so precursoras de
inmeros co-factores, sendo que vrias vitaminas, particularmente as do grupo B, so essenciais
para o crescimento e proliferao celular e, nalguns tipos de clulas, a vitamina B12 primordial.
Alguns meios de cultura apresentam tambm nveis aumentados de vitamina A e E, mas as
vitaminas mais utilizadas num meio de cultura so a riboflavina, tiamina e biotina.
As protenas e os pptidos so utilizados para repor aqueles que estavam normalmente
presentes no ambiente celular normal. As protenas e pptidos mais comuns incluem a albumina,
a transferrina, a fibronectina e a fetuna. semelhana das protenas e pptidos, os cidos
gordos e lpidos so importantes constituintes do soro e os mais comuns incluem o colesterol e
os esterides essenciais para clulas especializadas.
Alguns elementos vestigiais podem ser encontrados no soro, tais como, zinco, cobre,
selnio e cido tricarboxlico, que apresentam as mais variadas funes. O selnio, por exemplo,
um desintoxicante que ajuda na remoo dos radicais livres do oxignio.
O soro uma mistura complexa de albumina, factores de crescimento e inibidores de
crescimento, sendo muito provavelmente um dos componentes mais importantes nos meios de
cultura celulares. O mais comummente utilizado o soro fetal bovino. Como principais funes
apresenta: proteco mecnica, capacidade tampo em culturas com taxas de proliferao
reduzidas e ligao e neutralizao de toxinas, (SIGMA 2008).

1.5 Avaliao e Contaminao da Cultura

A avaliao do desempenho da cultura de clulas geralmente baseada em quatro
caractersticas celulares importantes: morfologia, crescimento celular, eficcia da cultura e
expresso de funes especiais, (Ryan 2008).

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A morfologia ou forma da clula o mais fcil de determinar, porm frequentemente de

pouca utilidade. Apesar de alteraes da morfologia celular serem muitas vezes observadas em
culturas de clulas, contudo difcil relacionar essas observaes com as condies que as
causaram. Por outro lado , igualmente, difcil quantificar ou medir precisamente essa alterao.
O primeiro sinal de que algo no est bem na cultura de clulas ocorre, quando, ao serem
examinadas ao microscpio, as clulas apresentam padres de adeso ou crescimento pobres
ou pouco usuais. Quando existem suspeitas de problemas, pulverizar o vaso de cultura com
violeta cristal ou outro corante histolgico demonstra qual o padro de crescimento e, deste
modo, indica o possvel problema.
A contagem de clulas ou qualquer outro mtodo para estimar o nmero de clulas
permite determinar a taxa de crescimento celular. Esta determinao possibilita um desenho da
experincia mais detalhado para determinar quais as condies (meio de cultura, soro, substrato,
entre outras caractersticas) so melhores para as clulas; isto , as condies que produzem
uma maior taxa de crescimento. Esta tcnica de contagem de clulas pode tambm ser utilizada
para medir a sobrevida celular ou a morte celular, sendo frequentemente utilizada nos ensaios
citotxicos in vitro, (Ryan 2008).
De forma a analisar as caractersticas de crescimento celular de um tipo particular de
clulas, pode-se traar uma curva de crescimento a partir da qual se pode obter o tempo de
duplicao da populao, o tempo em lag fase e a densidade de saturao. Esta curva de
crescimento demonstra a lag fase, que representa o tempo que a clula demora a recuperar da
subcultura, juntamente com o tempo de aderncia e de disseminao celular (cerca de 48 horas,
embora em 12 a 24 horas as clulas j recuperaram da tripina e reconstruram o seu
citoesqueleto, segregaram matriz para adeso e espalharam-se pelo substrato); a log fase o
momento do grfico em que o nmero de clulas comea a aumentar exponencialmente; e
finalmente, a fase de plateau na qual a cultura se torna mais densa e diminui ou interrompe a
sua taxa de crescimento. Apesar das curvas de crescimento, Figura 1.3, apresentarem muita
informao, estas so muito morosas e trabalhosas para serem utilizadas na monitorizao da
cultura de clulas. Assim, o uso de um hemocitmetro ou um contador de partculas electrnico
fornece uma medio mais directa e simples do nmero de clulas e, portanto, do crescimento
celular. As clulas podem ser contadas antes, durante e aps a experincia para, de uma forma
eficaz e precisa, quantificar e padronizar as condies experimentais. Adicionalmente, o uso de
azul tripano quando se utiliza do hemocitmetro, Figura 1.4, fornece ao investigador uma
avaliao quantitativa da viabilidade celular pelo clculo das contagens diferenciais das clulas
que excluem o azul tripano (clulas doentes ou normais) das que captam (clulas
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indubitavelmente mortas). Esta tcnica a menos dispendiosa, mas trabalhosa na aplicao

do mtodo completo; contudo, fornece informao fivel do nmero total de clulas e ainda o
nmero de clulas viveis, (Mather 1998; Freshney 2006).

Clulas/ml

Mudana meio

Subcultura
e sedimentao

Prxima
Subcultura

Tempo
Duplicao

Clulas/cm-2

Clulas/ml

Densidade de
Saturao

Dias aps subcultura

Figura 1.3. Curvas de crescimento celular: (a) Aumento do nmero de clulas numa escala logartmica
em funo dos dias decorridas aps subcultura; (b) Parmetros cinticos que podem ser derivados da
curva (a) (adaptado de (Freshney 2006)).

(a)

(b)

Figura 1.4. Hemocitmetro e determinao do nmero de clulas ((a) adaptado de (Mather 1998;
Coimbra 2008) e (b) de (Mather 1998)).

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A eficcia da cultura um mtodo de teste no qual um reduzido nmero de clulas

(entre 20 e 200) colocado num vaso de cultura, medindo-se o nmero de colnias que se
formam. A percentagem de colnias que se formam constitui uma medida de sobrevivncia
celular, enquanto o tamanho das colnias representa a taxa de crescimento. Este mtodo de
teste similar ao aplicado na anlise da taxa de crescimento celular; contudo, mais sensvel a
pequenas variaes em condies de cultura celular, (Ryan 2008).
No mtodo de determinao da eficcia da cultura, dado que a razo volume do
meio/volume de clulas muito elevada, existe um impacto mnimo das clulas sobre o
ambiente; por isso, a possibilidade das clulas metabolizarem e converterem os aminocidos em
compostos txicos ou secretarem factores de crescimento autcrinos muito reduzida. Assim,
este parmetro considerado muito til na avaliao dos requisitos nutricionais das clulas, para
comparao dos lotes de soro e avaliao dos componentes txicos a testar. Existem ainda
muitos investigadores que preferem este mtodo ao mtodo de determinao da taxa de
crescimento na avaliao dos efeitos dos factores de crescimento. Apesar disto, as
concentraes ptimas de nutrientes e factores de crescimento obtidas por este teste, podem
no ser adequadas para suportar elevadas densidades celulares. A eficcia da cultura
determina pelo quociente entre as colnias formadas e as colnias cultivadas, (Mather 1998).
A ltima caracterstica a avaliar a expresso de funes especializadas. Esta
geralmente mais difcil de medir e de observar, pelo que, testes bioqumicos e imunolgicos
podem ser utilizados para a sua determinao. Apesar de algumas culturas de clulas poderem
crescer em condies subptimas, funes altamente especializadas requerem, frequentemente,
condies de cultura quase perfeitas.
A contaminao de culturas de clulas divide-se em dois grandes grupos: qumicas e
biolgicas. Os contaminantes qumicos so os mais difceis de detectar, dado que, so causados
por agentes como as toxinas, ies metlicos e vestgios de desinfectantes qumicos. Os
contaminantes biolgicos na forma de bactrias ou fungos apresentam, frequentemente, efeitos
visveis sobre a cultura de clulas (alteraes de pH, por exemplo), sendo por isso mais fceis
de detectar, principalmente quando os antibiticos so omitidos do meio de cultura. Contudo,
duas formas de contaminao biolgica, por micoplasmas e vrus, no so facilmente detectados
visualmente e requerem mtodos especiais de deteco.
As principais regras para evitar contaminao de cultura de clulas so: treino adequado
e tcnicas asspticas por parte do investigador e equipamento esterilizado e correctamente
monitorizado, (Ryan 2008).

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As contaminaes biolgicas detectveis a olho nu podem, por isso, ser controladas com
rigor atravs de uma observao diria da cultura de clulas ao microscpio; contudo, no caso
de infeco da cultura de clulas por micoplasmas ou vrus, as alteraes podem passar
despercebidas, mas podem por outro lado incluir: reduo da taxa de crescimento, alteraes
morfolgicas, aberraes dos cromossomas e alteraes do metabolismo dos aminocidos e
cidos nucleicos, (SIGMA 2008).
A investigao utilizando culturas de clulas ou os bancos de clulas deve apresentar as
mesmas livres de contaminaes e em estado saudvel. O uso continuado de antibiticos e
agentes anti-fungicos pode, por vezes, mascarar a presena destes organismos, conduzindo ao
desenvolvimento de estirpes mais resistentes e, portanto, mais difceis de eliminar. Por este
motivo, importante avaliar periodicamente a presena de contaminao da cultura de clulas.
O primeiro passo para detectar contaminao bacteriana ou fngica consiste na
observao macroscpica e microscpica. Uma vez detectada a contaminao, todos os
reagentes e soros utilizados na cultura de clulas, bem como, a prpria cultura tm que ser
destrudos com hipoclorito de sdio e, posteriormente, descartados.
Dado que se utiliza soro e tripsina natural como suplementos aos meios de cultura, bem
como, para a realizao de subculturas, o risco de contaminao por estes agentes deve ser
sempre considerada. Para alm disso, a contaminao por vrus pode surgir de outras fontes,
tais como, o tecido ou rgo do dador ou factores de crescimento contaminados por outras
culturas infectadas. A eliminao das contaminaes por vrus difcil e no existe um teste
universal para identificao deste tipo de contaminantes, pelo que, os vrus podem ser
identificados utilizando um vasto leque de testes moleculares e imunolgicos. Estes testes
incluem, usualmente, os patogenes potencialmente perigosos para os humanos, como por
exemplo, o HIV. A monitorizao de vrus deve ser realizada cada 3 a 4 meses.
O micoplasma um organismo sub-microscpico que atravessa os filtros de 0.22 m
utilizados para a filtrao estril dos reagentes e soros utilizados nas culturas celulares. Ao
contrrio das infeces por bactrias comuns, as provocadas pelo micoplasma no resultam em
alteraes visveis da cultura. Actualmente, tm surgido testes dedicados ao teste de
micoplasma em culturas de clulas, sendo que, estes devem ser realizados cada dois meses,
(Besta 2004).

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Princpios Gerais de Culturas de Clulas e Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da Radiao Ionizante

1.6 Sumrio
Pretendeu-se como presente captulo apresentar e descrever os conceitos fundamentais
de culturas de clulas, com particular importncia nos relacionados com diferentes tipos de
culturas de clulas, morfologia de diferentes clulas e principais processos de avaliao da
cultura de clulas.
Neste captulo verificou-se que o uso de linhas celulares face s culturas primrias
apresenta algumas vantagens; nomeadamente, a sua maior padronizao e facilidade de
manipulao e desenvolvimento em meio laboratorial. Verificou-se ainda que existem diferentes
morfologias de clulas, que podem ser, geralmente, classificadas em trs grupos, que so:
epiteliais, linfoblsticas e fibroblsticas. Adicionalmente, observou-se que o meio de cultura um
componente muito importante na cultura de clulas e que uma avaliao de contaminaes, bem
como a monitorizao da cultura devem ser realizadas periodicamente.

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Captulo II. Citometria de Fluxo e Avaliao dos Efeitos

da Radiao em Culturas de Clulas

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2.1 Introduo
Dois modelos distintos de morte celular, necrose e apoptose, distinguem-se com base
nas diferenas morfolgicas, bioqumicas e alteraes moleculares que ocorrem nas clulas
aquando do seu processo de morte, (Hanon E. 1996). A necessidade de obter informao dos
processos biolgicos, nomeadamente processos de morte celular, tem conduzido ao
aparecimento e utilizao de mltiplos equipamentos e tcnicas para o efeito, (Silva 2004). Uma
das tcnicas utilizadas para avaliar tais processos biolgicos a citometria de fluxo.
Sabe-se que, a radiao ionizante um agente potencialmente danificador do ADN, quer
seja por efeitos directos, quer seja por efeitos indirectos sobre as clulas irradiadas. A induo
de aberraes cromossmicas, bem como, de alteraes no ciclo celular, mitose aberrante ou
morte celular podem aumentar com o aumento da dose de irradiao, (Baatout 2004).
Frequentemente, para que se possam estudar os efeitos da radiao em termos de
biologia celular, particularmente, induo de apoptose, usa-se a citometria de fluxo. Esta uma
ferramenta muito til e de fcil utilizao, sendo capaz de fornecer informaes sobre clulas em
fases iniciais de apoptose, clulas em fase final de apoptose, clulas necrticas, entre outras
informaes.
A citometria de fluxo uma tcnica quantitativa de anlise celular, tendo-se desenvolvido
o primeiro citmetro de fluxo em 1970 e, a partir da, este tem-se tornado um instrumento
essencial nas cincias biolgicas. De entre as suas mltiplas aplicaes salientam-se aquelas
relacionadas com hematologia, enumerao reticulcita, anlise da funo celular, cintica do
ciclo celular, gentica, biologia molecular e microbiologia, (Riley 2005; Nolla 2008).
No presente captulo pretende-se expor alguns dos conceitos chave para a
compreenso da citometria de fluxo, designadamente, pela enumerao de algumas
caractersticas do citmetro de fluxo e pela comparao desta tcnica com a microscopia
tradicional. Para alm disso, pretende-se ainda expor a utilidade da citometria de fluxo na
avaliao dos efeitos da radiao em culturas de clulas. Assim, o captulo foi organizado por
temas, comeando pelo citmetro de fluxo, vantagens e desvantagens da citometria de fluxo e
sua utilidade na avaliao dos efeitos da radiao em clulas.

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2.2 Citmetro de Fluxo: Principais Caractersticas

Um citmetro de fluxo um sistema constitudo por 5 elementos: fonte de luz, (lmpada
de mercrio ou laser), uma cmara de fluxo, unidades de filtros pticos para seleco de um
intervalo de comprimento de onda especfico, a partir duma gama espectral mais vasta,
fotododos ou fotomultiplicadores para a deteco sensvel e processamento dos sinais com
interesse e uma unidade que processa os dados recolhidos, Figura 2.1.
A suspenso celular injectada e atravessa a cmara onde se d a passagem clula a
clula atravs do feixe de luz, perpendicular ao fluxo. A passagem individual das clulas obtida
atravs da focagem hidrodinmica do fluxo de amostra, sendo esta injectada no seio de uma
soluo salina (sheath fluid) que tambm atravessa a cmara, Figura 2.2. A diferena de
velocidades entre os dois fluidos faz com que o fluxo se processe em regime laminar. A
velocidade de escoamento da soluo de revestimento (sheath fluid) superior da amostra, e
ajustvel, o que permite reduzir e controlar a espessura da soluo da amostra para que possa
passar uma clula de cada vez. Desta forma, podem detectar-se at 10000 clulas (eventos) por
segundo. O feixe de luz de excitao ao interceptar a clula na cmara, sofre disperso quer na
direco frontal (forward scattering - FS), quer lateral (side scattering). A luz assim dispersa
detectada directamente por fotododos (disperso frontal) ou pode ser desviada a 90 por lentes,
espelhos dicricos e filtros pticos e focada em fotomultiplicadores.

Filtros Dicrticos
Fluxo Clulas
Tubos
Fotomultiplicadores

Figura 2.1. Esquema da constituio interna de um citmetro de fluxo; deve-se notar o sistema de lentes
(adaptado de (Caprioglio 2008)).

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Amostra clulas
Sheat Fluid

Cmara de Fluxo

Lente do Laser

Figura 2.2. Representao de uma cmara de fluxo; a passagem individual das clulas (eventos)
conseguida pela focagem hidrodinmica do fluxo de amostra no seio da soluo salina (sheat fluid)
(adaptado de (Nolla 2008)).

A combinao dos dois tipos de luz dispersa revela informaes importantes,

nomeadamente, a dimenso celular, a granularidade/complexidade e a morfologia.
Compostos intracelulares com fluorescncia intrnseca (ex: clorofilas, ficobiliprotenas,
NAD(P)H, etc.) ou passveis de se ligarem a corantes fluorescentes (fluorocromos), permitem a
diferenciao selectiva de subpopulaes com base na combinao de vrios fluorocromos. A
fluorescncia destes compostos tambm detectada por fotomultiplicadores, atravs de um
sistema de lentes, espelhos dicrticos e filtros pticos, Figura 2.1.
Os citmetros actuais mais sofisticados podem possuir at 16 detectores em simultneo
(luz dispersa e fluorescente), o que permite analisar mltiplas possibilidades de caractersticas
celulares e/ou componentes celulares de um elevado nmero de clulas de forma individual.
Esta versatilidade designa-se por anlise multiparamtrica, (Silva 2004).
Em resumo, a preparao de suspenses e clulas necessria para a realizao da
anlise por citometria de fluxo. Vrios corantes imunoflurescentes ou anticorpos so adicionados
aos antigenes ou s protenas de interesse. A suspenso de clulas aspirada para um fluxo
de clulas, o qual se encontra envolvido numa corrente de fludo, e vai passando ao longo de um
feixe laser. A luz pode ser absorvida ou desviada assim que embate na clula, sendo que,
aquela que absorvida, quando apresenta o comprimento de onda apropriado, reemitida como
fluorescncia, caso a clula apresente substncia fluorescente ou mais do que um anticorpo
marcado com fluorocromo na superfcie da clula ou no seu interior. Por sua vez, a disperso da

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luz depende da estrutura interna da clula, do seu tamanho e forma. As substncia fluorescentes
absorvem luz com um dado comprimento de onda e re-emitem diferentes comprimentos de
onda. Finalmente, a luz e/ou sinais desviados fluorescentes so detectados por uma srie de
fotododos, sendo posteriormente amplificados. Alguns filtros pticos presentes so essenciais
para bloquear luz indesejada, permitindo que apenas a luz com o comprimento de onda
desejado atinja o fotodetector, (Riley 2005).

2.3 Vantagens e Desvantagens da Citometria de Fluxo

A informao que se pode retirar dos ensaios de viabilidade clssicos, sobre os estados
fisiolgicos das clulas, limitada a dois nveis extremos de actividade metablica: o saudvel,
presente em clulas viveis com capacidade para se dividirem, e o correspondente morte
celular. Contudo, por vezes, as clulas encontram-se num estado fisiolgico intermdio entre o
metabolicamente activo e a morte celular, sendo que, o mtodo tradicional no contabiliza essas
clulas.
A vantagem da citometria de fluxo em analisar clulas individualmente consiste na
deteco de uma variedade de estados fisiolgicos celulares intermdios que realmente existem
numa determinada populao, descobrindo assim uma heterogeneidade populacional. Para alm
disso, os dados obtidos atravs das tcnicas clssicas so relativos cultura como um todo, ou
seja, uma amostra representativa da cultura apresenta um nico valor, referente mdia dos
valores de um determinado parmetro, de todas as clulas. Contudo, numa populao celular, as
clulas no se encontram todas no mesmo estado metablico e fisiolgico, pelo que se torna
necessrio detectar e descrever as vrias subpopulaes de forma diferenciada. Mais uma vez,
a citometria de fluxo permite a avaliao da heterogeneidade de culturas, escala da clula
individual. Desta forma, dados discretos representando subpopulaes diferentes podem
fornecer uma imagem mais detalhada e real da complexidade e heterogeneidade que ocorre
num determinado bioprocesso. Por estes motivos, a citometria de fluxo tem tido, cada vez mais,
impacto na comunidade cientfica.
A combinao de vrios fluorocromos em citometria de fluxo permite a diferenciao de
diferentes subpopulaes numa determinada populao, correspondentes a diferentes nveis de
funcionalidade das clulas. Esta diferenciao levou introduo do termo vivel, mas no
culturvel, aplicado a clulas que no estando metabolicamente activas, tambm no esto
mortas e, evidentemente, no so reveladas atravs dos ensaios de viabilidade celular. A

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utilizao de critrios do funcionamento celular tais como o potencial da membrana

citoplasmtica e a integridade da mesma, permitem caracterizar estes estados metablicos.
De forma geral, a utilizao da mistura de diversos corantes permite a diferenciao dos
seguintes estados metablicos funcionais: clulas saudveis (com capacidade para se
dividirem), vitais, intactas e permeabilizadas. Pensa-se que quando uma clula se encontra sob
stress, alguns dos sistemas de transporte activo so afectados (clulas vitais), seguindo-se a
despolarizao da membrana citoplasmtica (clulas intactas) e, mais tarde, a sua
permeabilizao (clulas mortas). Clulas sem a membrana citoplasmtica intacta no
conseguem manter ou gerar o gradiente de potencial electroqumico que origina o potencial de
membrana. Alm disso, a sua estrutura interna, no estando protegida por uma membrana
citoplasmtica intacta, encontra-se livremente exposta ao meio ambiente, pelo que estas clulas
acabaro por se decompor. Todas estas etapas conduzem morte celular.
Assim, possvel diferenciar o estado fisiolgico de uma clula individual, para alm do
clssico e estrito conceito de viabilidade, baseado no funcionamento de alguns sistemas de
transporte activo, ou na presena ou ausncia da membrana citoplasmtica intacta e polarizada.
A citometria de fluxo surge assim como uma tcnica consistente e fivel na deteco das
verdadeiras percentagens de clulas viveis e mortas, numa determinada populao de clulas.
Uma comparao entre a microscopia pelo mtodo clssico e a citometria de fluxo
permite distinguir estas duas tcnicas em seis pontos fundamentais. Em primeiro lugar, na
microscopia so utilizadas clulas imobilizadas, realizando-se uma contagem manual; por outro
lado, na citometria de fluxo, as clulas so analisadas em suspenso e vo passando em fila
nica pela frente do laser. A deteco, no mtodo clssico, visual, enquanto, na citometria de
fluxo realizada uma deteco electrnica. No mtodo clssico detectam-se centenas de
clulas, com uma taxa de anlise de 100 clulas por minuto, enquanto, na citometria de fluxo se
detectam milhares a milhes de clulas, com uma taxa de 2000 a 5000 clulas por segundo. A
sensibilidade do mtodo clssico reduzida, detectando-se apenas expresses proteicas
marcadas, o que contrasta com a sensibilidade do mtodo por citometria de fluxo, que apresenta
elevada sensibilidade, mesmo para expresses proteicas diminudas. Finalmente, no mtodo
clssico a avaliao quantitativa, mas descreve apenas duas possibilidades, clula viva ou
clula morta; o que apresenta desvantagens, como explicado anteriormente. A citometria de
fluxo, por sua vez, tambm um mtodo quantitativo, mas a fluorescncia de cada clula
classificada, (Silva 2004).

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2.4 Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da

Radiao em Culturas de Clulas
Para alm das mltiplas vantagens da citometria de fluxo previamente explicadas, esta
permite ainda, uma rpida anlise do ADN, da expresso fenotpica e da funo celular. A
avaliao quantitativa desta tcnica tem sido muito utilizada na avaliao do transporte de
frmacos, fluxo do clcio, proliferao e apoptose celular. Sabendo destas potencialidades da
citometria de fluxo, e de muitas outras, alguns investigadores passaram a utilizar a citometria de
fluxo para monitorizar os efeitos da radiao na distribuio de ADN pelo ciclo celular em clulas
de mamferos.
O contedo de ADN de cada clula pode ser medido, podendo ser utilizado para estimar
a distribuio celular no ciclo celular. O ciclo celular divide-se em vrias fases: fase G1/G0, fase S
(sntese ADN), fase G2 e fase M (mitose). O contedo de distribuio de ADN numa populao
celular tpica em crescimento celular caracteriza-se por dois picos em G1/G0 e G2/M e um vale na
fase S. As clulas na fase G2/M apresentam o dobro da quantidade de ADN que a fase G1/G0,
sendo que a fase S apresenta variaes da quantidade de ADN entre as fases G1 e G2, Figura
2.3. A monitorizao do ciclo celular, bem como a sua regulao, fundamental para
compreenso dos efeitos da radiao na clula.

N clulas

G1/G0

Fase S
G2/M
Contedo de ADN

Figura 2.3. Representao do ciclo celular medido por citometria de fluxo com uso de iodeto de propdio
(adaptado de (Baatout 2004)).

Nas clulas eucariticas, a radiao ionizante causa atrasos na diviso, nomeadamente

no perodo G2, sendo este atraso proporcional ao tipo de clula, posio da clula no ciclo
celular e dose absorvida. Este atraso serve frequentemente para que a clula repare os danos
ao ADN, Figura 2.4.

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Clulas Irradiadas com 2.5Gy

Nmero de Clulas

Clulas Controlo

Contedo de ADN
Figura 2.4. Representao grfica obtida com citometria de fluxo em clulas controlo e clulas irradiadas,
de notar o atraso na fase G2; resultados obtidos com uso de iodeto de propdio (adaptado de (Baatout
2004)).

A apoptose caracteriza-se, basicamente, por alteraes morfolgicas, que incluem

aumento da granularidade citoplasmtica, retraco celular, condensao da cromatina e
formao de corpos apoptticos. Esta morte celular programada pode surgir espontaneamente
ou por agresses de estmulos externos, nomeadamente, pela radiao ionizante. A citometria
de fluxo permite tambm detectar apoptose radioinduzida pelo uso de iodeto de propdio e
anexina V, Figuras 2.5 e 2.6, (Baatout 2004).
Clulas Controlo

Clulas Irradiadas

Pico G0/G1

Nmero de Clulas

Sub-pico
G0/G1

Clulas
apotticas

Contedo de ADN
Figura 2.5. Deteco de apoptose em linfcitos humanos irradiados, utilizando o iodeto de propdio
(adaptado de (Baatout 2004)).

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Clulas mortas

Clulas vivas

Clulas apoptticas

Figura 2.6. Avaliao da integridade da membrana de leuccitos com anexina V; verifica-se um aumento
do nmero de clulas apopttica com o aumento da dose (adaptado de (Baatout 2004)).

A anexina V utilizada para reconhecer fosfatidilserina translocada e, uma vez

associada ao iodeto de propdio, que funciona como corante de excluso de viabilidade celular,
permite detectar clulas apoptticas e discriminar entre apoptose (precoce e tardia) e necrose,
(Baatout 2004). A viabilidade celular pode ser avaliada com base em alteraes morfolgicas ou
alteraes na permeabilidade da membrana e/ou estado fisiolgico inferido a partir da excluso
de certos corantes ou a reteno de outros. As clulas vivas apresentam membranas intactas e
podem ser avaliadas pela sua capacidade de excluir corantes que rapidamente entram para
clulas mortas ou danificadas. O uso de iodeto de propdio tem sido utilizado na maioria das
culturas celulares para a avaliao de clulas no viveis. A sua vasta aplicao tem por base o
facto do seu procedimento de realizar ser simples, pois as clulas danificadas coram de
vermelho vivo, sendo por isso facilmente identificadas, (Coder 1997). Em suma, o idodeto de
propdio no atravessa a barreira da membrana celular em situaes normais; contudo, quando
penetra na clula significa que a membrana est danificada, o que implicar a presena de uma
clula danificada ou morta.
Um dos sinais mais precoces de apoptose a translocao de fosfolpidos da membrana
celular, a fosfatidilserina, da camada interna da membrana celular para a camada externa. Uma
vez exposta ao ambiente extracelular, os locais de ligao da fosfatidilserina translocada tornamse disponveis para a anexina V, a qual apresenta dependncia do io clcio (Ca2+), Figura 2.7.

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Anexina V

Apoptose
Externalizao da
fosfatidilserina

Membrana
Plasmtica
Citoplasma

Citoplasma

Figura 2.7. Representao esquemtica da ligao da anexina V membrana plasmtica em clulas

apoptticas ( direita) e a ausncia de ligao em clulas normais ( esquerda) (adaptado de (BD 2007)).

Uma vez que a translocao da fosfatidilserina tambm ocorre em situaes de necrose,

a anexina V no um marcador absoluto de apoptose, pelo que, deve ser utilizada em conjunto
com corantes essenciais, nomeadamente o iodeto de propdio, os quais penetram nas clulas
quando a integridade membrana plasmtica est afectada, o que ocorre apenas nos estdios
finais da apoptose ou em casos de necrose celular. Assim, clulas que sejam negativas
anexina V e, simultaneamente, ao iodeto de propdio, so clulas sem indcios de apoptose,
verificando-se ainda que no correu translocao da fosfatidilserina e a membrana plasmtica
ainda est intacta. Por outro lado, se as clulas forem positivas anexina V, mas negativas ao
iodeto de propdio, estas encontram-se em estdios inicias de apoptose, pois j ocorreu
translocao da fosfatidilserina, mas a membrana plasmtica ainda est intacta. Finalmente, se
as clulas forem positivas a ambos (anexina V e iodeto de propdio), ento assume-se que as
clulas esto em estdios tardios de apoptose ou em morte celular confirmada; nestes casos,
quer a translocao da fosfatidilserina, quer a perda de integridade da membrana plasmtica j
ocorreram, (BD 2007).

2.5 Sumrio
Do presente captulo pode-se concluir que a citometria de fluxo uma tcnica superior
microscopia clssica, particularmente no que respeita determinao de clulas apoptticas,
necrticas e viveis, pois apresenta como principais vantagens a possibilidade de analisar

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milhares a milhes de clulas, com uma taxa de 2000 a 5000 clulas por segundo, o que se
traduz numa elevada sensibilidade de deteco e ainda a possibilidade de avaliar
individualmente cada clula. Por outro lado, verifica-se que a citometria de fluxo uma tcnica
vlida para o estudo das alteraes celulares em culturas de clulas (por exemplo, apoptose,
necrose e viabilidade celular), nomeadamente aquelas relacionadas com os efeitos da radiao
ionizante.

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Captulo III. Concluso

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As linhas celulares face s culturas de clulas primrias apresentam algumas vantagens,

nomeadamente, maior padronizao, facilidade de manipulao e desenvolvimento laboratorial,
o que pode explicar o crescente uso deste tipo de clulas face s culturas primrias, tipicamente
mais morosas e sensveis. Outra concluso possvel de retirar do Captulo I relaciona-se com a
classificao das clulas em cultura em trs grandes grupos, conforme diferenas morfolgicas
entre clulas: epiteliais, linfoblsticas e fibroblsticas. Por outro lado, conclui-se ainda que o meio
de cultura um componente muito importante da cultura de clulas e que uma avaliao de
contaminaes, bem como a monitorizao da cultura devem ser realizadas periodicamente pelo
uso de testes padronizados.
A citometria de fluxo uma tcnica superior microscopia clssica, possibilitando o
estudo de clulas apoptticas, necrticas e viveis. A sua elevada sensibilidade e rapidez de
anlise (possibilidade de analisar milhares a milhes de clulas, com uma taxa de 2000 a 5000
clulas por segundo) so as suas principais vantagens face microscopia clssica. Dada a sua
sensibilidade, rapidez e, com recurso a corantes caractersticos, especificidade, esta apresentase como uma tcnica vlida para o estudo das alteraes celulares em culturas de clulas. Uma
dessas possibilidades o estudo dos efeitos da radiao ionizante em culturas de clulas. Pelo
uso de iodeto de propdeo e anexina V, por exemplo, pode-se avaliar uma cultura de clulas,
classificando as clulas em necrticas, apoptticas ou viveis/saudveis.

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Bibliografia

Princpios Gerais de Culturas de Clulas e Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da Radiao Ionizante

Baatout (2004). "Cytometric methods to analyze radiation effects." Journal of Biological

Regulators and Homeostatic Agents 18(2): 101-105.
BD, B. (2007). "Annexin V - Introduction." Annexin V

Retrieved 26 June 2008, from

http://www.bdbiosciences.com/features/products/display_product.php?keyID=48.
Besta, I. N. N. C. (2004). Detection of Contaminants in Human Cell Culture. L. P. f. H. C. Culture.
Marina Mora, EuroBio Bank.
Caprioglio, D. (2008). "Fluorescence in Biology."

Retrieved 26 June 2008, from

http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html.
Coder, D. (1997). Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry, John Wiley &
Sons.
Coimbra, U. (2008). "Noes bsicas de cultura de clulas."

Retrieved Maio 2008, from

https://woc.uc.pt/bioquimica/getFile.do?tipo=2&id=523.
Freshney, I. (2006). Basic Principles of Cell Culture. Culture of Cells for Tissue Engineering. G.
V.-N. e. I. Freshney, Jon Wiley and Sons.
Hanon E., V. A., Pastoret P. (1996). "The Use of Flow Cytometry for Concomitant Detection of
Apoptosis and Cell Cycle Analysis." Biochemica 2(Technical Tips): 25-27.
Hartung, T. (2002). "Good Cell Culture Practice." ATLA 30: 407-414.
Mather, J. (1998). Introduction to Cell and Tissue Culture. New York and London, Plenum Press.
Nolla, H. (2008). Basic Principles in Flow Cytometry. U. o. California. Berkeley.
Riley, R. (2005). "Principles and Applications of Flow Cytometry." Retrieved 26 June 2008, from
http://www.pathology.vcu.edu/education/lymph/documents/Flow.pdf.
Ryan, J. (2008). Introduction to Aninmal Cell Culture. Technical Bulletin.
SIGMA (2008). Fundamental Techniques in Cell Culture... A Laboratory Handbook, SIGMA
Laborartories.
Silva, T. R., Alberto; Hewitt, Christopher; Roseiro, Jose (2004). "Citometria de fluxo Funcionalidade celular on-line em bioprocessos." Boletim de Biotecnologia 77(Mtodos
em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II): 32-40.

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