Você está na página 1de 12

Ney hay una palabra que no supe que es, est en medio de dos asteriscos, otra cosita hice

todo lo
posible por traducirlo todo, pero hay unos trminos que son muy pero muy tcnicos entonces los dej
as, son pocos pero le digo para que no diga, jajaja. Otra cosita ponte pilas a leer eso porque uyy est
re complicado. Te quiero mucho amiguita.
PROPIEDADES PROBITICAS DEL LACTOBACILLUS, CEPAS AISLADAS DE GRANOS DE KFIR
TIBETANOS
Yongchen Zheng, Yingli Lu, Jinfeng Wang, Longfei Yang, Chenyu Pan, Ying Huang*
ABSTRACTO
El objetivo de este estudio fue evaluar las propiedades funcionales de las bacterias del cido lctico (LAB)
aislado de granos de kfir tibetano. Tres Lactobacillus aislados identificados como:
Lactobacillus acidophilus LA15.
Lactobacillus plantarum B23
Lactobacillus kefiri D17
Las cuales mostraron resistencia a las sales de cidos biliares y fueron seleccionados para su posterior
evaluacin de sus propiedades pro biticas. Las 3 cepas seleccionadas expresadas en alta adherencia in
vitro a clulas Caco-2.
Ellos fueron sensibles a la gentamicina, eritromicina y cloranfenicol y resistente a la vancomicina con valores
de MIC de 26 ug/ml. Todas las 3 cepas mostraron potencial actividad de Hidrolasas de sales biliares (BSH), la
asimilacin y capacidad de co-precipitacin del colesterol. Adems, el efecto potencial de estas cepas sobre
los niveles de colesterol en plasma se evalu en ratas Sprague-Dawley (SD) (rata albina de uso extensivo en
el campo de la biomedicina). Se alimentaron ratas en 4 grupos de tratamiento siguiendo dietas experimentales
durante 4 semanas:
una dieta alta en colesterol
Una dieta en alto contenido de colesterol ms LA15,
Una dieta alta en colesterol ms B23
Una dieta alta en contenido de colesterol ms D17
El colesterol total, triglicridos y los niveles de colesterol de lipoprotena de baja densidad en el suero fueron
significativas (P, 0,05), en las ratas de laboratorio tratadas disminuy en comparacin con las ratas
alimentadas con una dieta alta en colesterol sin suplementacin LAB. Los niveles de colesterol de lipoprotena
de alta densidad en grupos B23 y D17 fueron significativamente (P, 0,05) superiores a los de los grupos
control y LA15. Adems, los niveles de colesterol y de cidos biliares fecales aument significativamente (P,
0,05) despus de la administracin LAB. El nmero de lactobacilos fecales fueron significativamente (P,
0,05) mayor en los grupos de tratamiento con LAB que en los grupos de control. Adems, se detectaron las 3
cepas en el intestino delgado, colon y las heces de las ratas durante el ensayo de alimentacin. Los niveles de
bacterias se mantuvieron altos, incluso despus de la administracin de LAB se detect durante 2 semanas.
Estos resultados sugieren que estas cepas pueden ser utilizadas en el futuro como cultivos iniciadores
probiticas, es as como se inicia una nueva novela de fabricacin de alimentos fermentados.
INTRODUCCIN
Los granos de kfir tibetanos son el motor de arranque natural para la leche fermentada en
Tbet, China. La leche fermentada por granos de kfir tibetanos es un tipo de yogur auto-carbonatado llamada
kefir tibetano, que es una comida tradicional del pueblo tibetano. Los datos estadsticos muestran que las
personas que consumen el kfir en su dieta son longevas. Los datos sugieren que las bacterias probiticas
en el intestino de los consumidores de kfir se presentan en abundantes y diversas comunidades microbianas
en el intestino que estn estrechamente relacionada con la salud. AL Kefir se le ha asignado una variedad de
declaraciones de propiedades saludables, adems de su valor nutricional. Muchos estudios sobre las
actividades biolgicas de kfir han establecido que tiene actividad anti-inflamatoria, actividad inmune
moduladora, actividad antimicrobiana y actividad anti-proliferativa, tambin tiene el potencial de convertirse en
un tipo de alimento funcional. Los granos de kfir tibetanos contienen una comunidad microbiana compleja

compuesta de bacterias lcticas (BAL) (Lactobacillus, Lactococcus y Leuconostoc) y levaduras


(Saccharomyces, Kluyveromyces y Torula). Varios LAB que se han aislado a partir de granos de kfir tibetano
incluyendo Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum y Kefiranofaciens Lactobacillus.
La investigacin sobre nuevas cepas probiticas es importante para satisfacer el aumento de la demanda del
mercado y obtener probitico altamente activos para la mejora de los productos con caractersticas probiticas
que son superiores a los actualmente hay en el mercado.
El objetivo de este estudio fue identificar las propiedades de los probioticos de las cepas aisladas de
Lactobacillus en los granos de kfir tibetanos. Los aislamientos fueron preliminarmente seleccionados en base
a la tolerancia en cido y bilis, fueron examinados ms de diversas propiedades funcionales, tales como
capacidad de adhesin, antibitico la resistencia y la actividad de reduccin del colesterol. Tres cepas que
muestran propiedades deseables se seleccionaron para su posterior ensayo de su efecto reductor del
colesterol en ratas, y la supervivencia de las cepas tambin se examin despus de paso en una prueba de
alimentacin a travs de los intestinos de rata en 4-semana.
RESULTADOS
LA tolerancia al cido y bilis
En total, 10 aislamientos de bacterias Gram-positivos y catalasa-negativos, en forma de bastoncitos se
obtuvieron a partir de granos de kfir. La Tabla 1 muestra la supervivencia de los 10 aislamientos bajo pH bajo
y las condiciones de sal biliar. Todas las cepas excepto para las que tenan Co2 (Dioxido de carbono)
mostraron consistentemente la tolerancia a pH 3, y los recuentos residuales fueron superiores a 10 6 CFU / ml
despus de 3 h de incubacin. Slo 7 aislamientos sobrevivieron a pH 2, y el LA15, B23 y D17 aislados
mostraron niveles bastante altos de tolerancia al cido, con niveles mayores que el 85% despus de la
exposicin a pH 2. En la prueba de sales biliares, todos los aislados ensayados fueron capaces de crecer en
0,3% de bilis, pero slo LA15, B23 y D17 mostraron resistencia a una concentracin de 1% de bilis por hasta
12 h. Los aislamientos LA15 y B23 mostr mejor tolerancia y dio viable recuentos superiores a 10 7 CFU / ml
en 1% de bilis. Sobre la base de los resultados de la proyeccin para la tolerancia al pH y las sales biliares
bajos, 3 aislamientos, LA15, B23 y D17, fueron capaces de sobrevivir a niveles de 10 6 CFU / ml bajo pH 2 o
1% de sales biliares, condiciones que por lo tanto fueron seleccionados para su posterior anlisis de sus
propiedades probiticas.
Tabla 1. cido y tolerancia a bilis de cepas de BAL (log CFU / ml).
Nombre a Recuentos Resistencia al jugo Tolerancia a Bilis
Aislar
en medios gastrico
pH 2
pH 3
0.3%
0.5%
inicialesa

1%

A06

8.980.12

2.300.14

6.340.23

3.710.32

2.310.25

A18
9.030.16 b
6.280.15 3.250.12 LA03
8.970.11 6.520.23 4.670.31 3.720.22 LA15
9.100.17 8.230.24 8.720.21 7.760.24 7.640.26 7.580.23
B05
9.020.18 6.530.24 3.280.16 B07
8.970.15 3.120.19 6.490.16 3.450.13 2.170.13 B23
8.990.23 7.760.17 8.680.26 7.490.20 7.710.22 7.840.33
C02
9.010.19 3.630.26 C09
9.030.14 4.570.13 6.730.14 4.120.23 3.590.18 D17
8.970.21 7.740.15 8.590.18 6.370.23 6.640.18 6.820.21
a
Cada valor representa el valor 6 desviacin estndar media (DE) de los 3 ensayos.
b
No hay crecimiento.
LA IDENTIFICACIN DE LAS BACTERIAS DEL CIDO LCTICO
Los aislamientos LA15, B23 y D17 fueron identificados como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
plantarum y Lactobacillus kefiri, respectivamente, mediante la prueba API50CHL. El 16S rDNA de cada uno
de los 3 aislamientos se secuenci, y los organismos fueron identificados por alineamiento de estas
secuencias como LA15 Lactobacillus acidophilus 16S (GenBank no la adhesin. KC166236), Lactobacillus
plantarum B23 (GenBank no la adhesin. KC166237) y Lactobacillus kefiri D17 (GenBank no la adhesin.
KC155629).

PROPIEDADES DE ADHESIN
Las tasas de adhesin a clulas Caco-2 vara dependiendo de las cepas probadas y oscil desde 6,5 hasta
13,2% (Fig. 1). B23 mostr significativamente mejores tasas de unin que el LGG cepa de referencia. Las
tasas de adhesin de cepas LA15 y D17 fueron significativamente inferior (P 0,05) que los de la cepa
B23. Las capacidades de unin de LA15 y D17 fueron equivalentes a la capacidad de unin de LGG.

Figura 1. capacidad de adhesin de Lactobacillus, asla a Caco-2 clulas epiteliales en comparacin con la
cepa de referencia Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). Los valores presentados son las medias de por
triplicado determinacin, y las diferentes letras (a, b) Representar significativa diferencias (P 0,05).
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS
Se encontr que todas las cepas de 3 a ser susceptibles a la gentamicina, eritromicina y cloranfenicol pero
fueron resistentes a la vancomicina, con valores de MIC de 26 g / ml. LA15, que era tambin resistentes a la
tetraciclina, con un valor de MIC de 45 g / ml, que se prob por PCR para la presencia de genes de
resistencia a tet. Despus de la PCR amplificacin, se detect slo tet gen (M) en LA15 cepa (datos no se
muestran).

EFECTOS PARA REDUCIR EL COLESTEROL


Todas las cepas seleccionadas mostraron capacidad de des conjugacin a sal biliar usando la prueba de BSH
en placas de agar (Tabla 2). La diferencia entre las capacidades de las 4 cepas de asimilar el colesterol fue
significativo (P 0,05). Las cantidades de colesterol asimilados oscilaron entre 62,63 a 56,19 g / ml. Las
cepas B23 y D17 mostraron significativamente cantidades ms altas (P 0.05) de la asimilacin del
colesterol en comparacin con LA15 y LGG. El colesterol se co-precipit simultneamente con glicocolato
sdico desconjugado a diferentes niveles (P 0,05), que van desde 2,36 hasta 3,89 g / ml en las 4
culturas. Desconjugacin de glicocolato de sodio por B23 y D17 result en una cantidad significativamente
mayor (P 0,05) de colesterol co-precipitacin en comparacin con LA15.
Tabla 2. Ensayo in vitro de las actividades relacionadas con el colesterol de LAB aislados de granos de kfir
tibetanos.
Cepas
Actividad hidrolasa Asimilacin
Colesterol
code sales biliares
Colesterol (g / ml)
precipitacin (mg /
l)
LA15
+
56.190.53b
2.360.11b
a
B23
+
62.630.41
3.890.13a
D17
+
61.580.62a
3.520.24a
b
LGG
+
55.320.46
3.740.18a

a,b

Los valores medios dentro de la misma columna con diferentes letras de superndice difieren
significativamente (P 0,05).
LA INGESTA DE ALIMENTOS, EL AUMENTO DE PESO Y LA EFICIENCIA ALIMENTICIA
Todas las ratas fueron generalmente saludables durante todo el periodo del ensayo de alimentacin. Los 4
grupos de ratas no mostraron significativo (P 0.05) periodo de diferencias en la ganancia de peso corporal,
la ingesta de alimentos o la eficiencia alimentaria. Esto indica que los animales suplementados con cepas de
LAB creci en patrones similares en comparacin con el control (Tabla 3).
Tabla 3. Aumento de peso corporal, la ingesta total de alimentos y la alimentacin eficiente de ratas
alimentadas con una dieta alta en colesterol (control) o complementado con diferente cepa de bacterias de
cido lctico (LA15, Dietas B23 y D17) despus de 4 semanas.
Los grupos de tratamiento
Item
Control
LA15
B23
D17
Ganancia
de 171.78.9a
173.66.9a
174.49.5a
169.37.2a
peso corporal
(g)
Ingesta total de 468.611.5a
470.98.7a
472.88.7a
469.96.8a
los
alimentos
(g)
Eficiencia
de 36.62.1a
36.92.3a
36.92.6a
36.01.8a
los Alimentos *
(%)
a
Los valores medios dentro de una fila con letras diferentes superndices difieren significativamente
(P 0,05).
Los datos se muestran como la desviacin estndar media, n = 10.
* Eficiencia alimentaria (%) = (ganancia de peso corporal / ingesta de alimentos) x100.

Anlisis de lpidos en sangre


El suero TC, TG, HDL-C y LDL-C en los niveles de los 4 grupos se muestra en la Figura 2. Las ratas
alimentadas con LA15, B23 y dietas D17 tevieron significativamente (P 0.05) los niveles de CT inferiores
comparados con el grupo control. Los grupos B23 y D17 tuvieron significativamente (P

0,05) TC niveles

que LA15 grupo. Grupos B23, D17 y LA15 mostraron una significativa (P 0,05) reduccin de los niveles
de TG en comparacin con el grupo de control. Grupo B23 tenan los niveles ms bajos de TG.El grupo D17
expresa los niveles de LDL-C ms baja, seguido por el grupo B23 y la LA15 y grupos de control. Las
diferencias en los niveles de LDL-C entre los 4 grupos fueron significativas (P 0,05). El HDL-C los niveles
en los grupos B23 y D17 fueron significativamente (P

0,05) ms alto que en los grupos control y LA15.

Figura 2. El colesterol total (TC), triglicridos (TG), colesterol de alta densidad en las lipoprotenas
(HDL-C) y el colesterol lipoprotenico de baja densidad (LDL-C) los niveles en el suero de ratas
alimentadas con una dieta solo en colesterol alto (control) o suplementado con diferente bacterias del
cido lctico las cepas (LA15, B23 o D17) durante 4 semanas.
Los resultados se expresan como la desviacin estndar, n = 10. Medios dentro de la misma serie de
lpidos con diferentes letras minsculas (a-d) son significativamente diferente (P 0,05).
Hgado y Colesterol Fecal
La Tabla 4 muestra los niveles y el hgado y colesterol fecal pesos de los hgados. El peso medio del hgado
no fue significativamente diferente entre los grupos (P>0.05). Grupos LA15, B23 y D17 tena un contenido de
colesterol heptico reducido significativamente en comparacin con el grupo control (P 0,05). las
diferencias entre los grupos tratados con BAC y no fueron significativas (P>0.05). La concentracin de
colesterol fecal de ratas alimentadas con las cepas de BAL aumentado significativamente en comparacin con
el grupo control (P 0,05). Grupos B23 y D17 mostraron significativamente ms altos de colesterol fecal
concentraciones que LA15 grupo.
Tabla 4. Los niveles de peso del hgado y el colesterol total en el hgado
y las heces de las ratas alimentadas con una dieta alta en lpidos solo (control) o
complementado con diferentes cepas de bacterias del cido lctico (LA15,
B23 o D17) durante 4 semanas.
Los grupos de tratamiento
ITEM
CONTROL
LA15
B23
D17
Peso Higado(g) 9.050.06a
9.030.09a
9.060.08a
9.040.11a
colesterol
del 16.880.18a
11.250.09b
10.950.12b
12.050.08b
hgado
(g / g)
Colesterol
10.680.15b
15.930.19a
16.130.21a
15.880.25a
Fecal (g/g)
ac Medios dentro de la misma fila seguidos por diferentes letras de superndice son significativamente
diferentes (P 0.05).
Los datos se muestran como la media desviacin estndar
Fecales totales de cidos biliares excreciones
La Figura 3 muestra las excreciones de cidos biliares fecales totales en ratas. La excrecin fecal de cidos
biliares totales fue significativamente (P 0,05) mayor en las ratas alimentadas con las dietas B23 y D17
que en los otros grupos. La extraccin fecal total de cidos biliares fue similar entre el control y LA15 grupos.

Figura 3. Concentraciones de cido clico fecales en ratas alimentadas con una dieta basada en
colesterol alto y una dieta sola (control) o suplementado con diferente bacterias del cido lctico las
cepas (LA15, B23 o D17) durante 4 semanas. Los resultados se expresan como la media desviacin
estndar. Los valores medios con letras diferentes (a, b, c) difieren significativamente (P 0,05).
La colonizacin por cepas LAB (LA15, B23 o D17) en la rata
Tracto Intestinal
Como se muestra en la Tabla 5, no se detectaron LA15, B23 o D17 en el duodeno, yeyuno, leon, colon y
heces de ratas en el da 0. Sin embargo, se detectaron respectivamente en el yeyuno, leon, colon y heces
despus de 28 das de alimentacin forzada, salvo en el duodeno. Cargos de las 3 cepas fueron
significativamente (P 0,05) ms alta en el leon, colon y heces que aquellos en el yeyuno. En el da 42,
despus de detener la administracin bacterias durante 2 semanas, las 3 cepas eran todava detectadas en el
intestino delgado, colon y heces. Los nmeros de
las bacterias haban disminuido ligeramente.
Tabla 5. Condes de diferentes cepas de bacterias del cido lctico (LA15, B23 o D17) en el duodemun,
yeyuno, leon, colon y heces de ratas.
Los
grupos de
tratamient
o
LA15

B23

D17

Das

Duodeno

Yeyuno

leon

Colon

Heces

0
28

0
0

42

0
28

0
0

42

0
28

0
0

0
2.430.02
c
2.360.02
c
0
2.780.03
c
2.530.02
c
0
2.670.02
c

0
3.630.03
b
3.380.02
b
0
3.890.02
b
3.390.03
b
0
3.590.02
b

0
5.190.04
a
5.070.03
a
0
5.530.03
a
5.140.02
a
0
5.130.03
a

0
5.120.04
a
4.980.02
a
0
5.230.02
a
5.080.03
a
0
5.070.04
a

42

2.470.03 3.210.03 4.570.02 4.810.03


c
b
a
a
a, b, c Los valores medios dentro de una columna con diferentes letras de superndice son significativamente
diferentes (P 0,05).
Los datos se muestran como la media desviacin estndar.
Anlisis microbiano
La Tabla 6 resume la composicin de la poblacin microbiana de las muestras de heces de los grupos
tratados y de control, determinados por recuentos de colonias en medios selectivos. Los recuentos totales
anaerobios fueron significativamente mayores en cada grupo LAB-tratado que en el grupo de control. Se
observ un aumento significativo en el nmero de lactobacilos fecal en las ratas tratadas en comparacin con
que con las ratas de control para cada aislado probado. Por el contrario, para cada LAB treated grupo, los
condes de organismos coliformes en las heces de ratas disminuy significativamente en el da 28. Despus de
28 das de administracin, los condes de organismos coliformes se mantuvieron estables hasta la final de 42
das.
Tabla 6. Efectos de la alimentacin con probiticos sobre bacterias fecales poblacin
Los grupos de Das
Total
Lactobacilos
Coliformes
tratamientos
anaerobios
Control
0
9.240.02b
8.9960.04b
6.850.02a
28
28 9.210.03b 9.0460.03b
6.890.03a
42
9.250.03b
9.0560.04b
6.930.02a
LA15
0
9.230.05b
9.0260.03b
6.880.03a
28
10.380.04a
9.5660.03a
4.590.02b
42
9.900.03a
9.3660.02a
4.620.02b
B23
0
9.190.03b
9.040.03b
6.860.04a
28
10.280.04a
9.660.04a
4.590.02b
42
42 9.840.03a 9.470.03a
4.910.03b
D17
0
9.210.02b
8.970.03b
6.910.03a
28
10.780.04a
9.660.04a
4.920.04b
42
9.940.03a
9.590.03a
5.150.03b
a,b Los valores medios dentro de una columna con diferentes letras de superndice eran significativamente
diferente (P 0,05)
Los datos se muestran como la media desviacin estndar
DISCUSIN
Una de las propiedades de los probiticos es la capacidad de sobrevivir en el tracto gastrointestinal (GI)
superior. Antes de llegar a la parte distal del tracto intestinal y ejerciendo su efecto probitico, estas bacterias
tienen que sobrevivir durante el trnsito a travs del estmago y la parte superior del tracto intestinal. En este
estudio, 3 cepas (LA15, B23 y D17) fueron resistentes a pH 2, incluso despus de 3 h de la exposicin, pero la
mayora de los aislamientos mostraron una reduccin de viabilidad despus de la exposicin a condiciones de
pH 2. El Lactobacillus plantarum B23 creci mejor que el Lactobacillus plantarum LP27 aislado de granos de
kfir tibetano en nuestro estudio anterior a un pH bajo y en la presencia de concentraciones de sales biliares
altas (datos no mostrados). La bilis desempea un papel fundamental en los mecanismos de defensa
especficos y no especficos del intestino; la magnitud de sus efectos inhibitorios es determinada
principalmente por la concentracin de sales biliares. Las concentraciones fisiolgicas relevantes de gama de
la bilis humana 0,3% a 0,5%. Hubo una considerable variabilidad en resistencia a las sales biliares entre las
diferentes especies de Lactobacillus, el apoyo a la importancia de evaluar la tolerancia de la bilis de los
aislados en la seleccin de probiticos potenciales. En este estudio, las cepas LA15, B23 y D17 fueron
resistentes a altas concentraciones biliares de buey, lo ms probable debido a la expresin de protenas
relacionadas con la bilis de resistencia en bacterias de las clulas.
La adhesin y colonizacin de bacterias probiticas en el tracto GI se cree que es el anfitrin, lo cual es una
caracterstica esencial requerida para la entrega de sus beneficios para la salud. De hecho, la adhesin es un

requisito previo para la colonizacin, la estimulacin de la respuesta del sistema inmune y la actividad
antagnica contra enteropatgenos. En nuestro estudio, las habilidades de adhesin de B23 a las clulas
Caco-2 fueron significativamente ms fuerte que el de la LGG cepa de referencia. A15 y D17 mostr una
capacidad de unin similar a LGG. Aunque las conclusiones extradas de los resultados de los estudios in vitro
no pueden ser directamente aplicado a las situaciones en vivo, una asociacin entre capacidad de adhesin y
colonizacin temporal de la humana tracto intestinal se ha demostrado previamente. Por lo tanto, las cepas
LA15, B23 y D17 fueron seleccionadas para los ensayos de alimentacin animal debido a sus capacidades
adhesivas.
La importancia de evaluar el perfil de resistencia a los antibiticos patrn de nuevos aislamientos es restringir
el uso de cultivos probiticos albergar genes de resistencia a antibiticos transferibles. En nuestro estudio, las
3 cepas seleccionadas se ensayaron para determinar la susceptibilidad a antibiticos 5 pertenecientes a las
clases de mayor relevancia clnica de antibiticos. Las pruebas de sensibilidad a los antibiticos indicaron que
eran resistentes a vancomicina. Se esperaba estos resultados, ya que se sabe los lactobacilos son
naturalmente resistente a la vancomicina; esta resistencia es generalmente intrnseca, cromosmicamente
codificada y no transmisibles. LA15 tambin era resistente a la tetraciclina y se encontr que contiene el gen
tet(M). Segn la EFSA, cuando una cepa de una especie susceptible tpicamente es resistente a un
antimicrobiano dando medicamentos, se considera que tienen una resistencia adquirida. Adquirida resistencia
puede ser debida a la presencia de genes adicionales (genes adquiridos por las bacterias a travs de
ganancia de ADN exgeno) o de la mutacin de genes indgenas. Para determinar el origen de la resistencia,
la PCR se aplic a buscar LA15 la presencia de genes tet (L), tet (M) y tet (S), que se transfiere
horizontalmente a genes asociados con la resistencia a la tetraciclina. Slo el gen tet (M) se detect en la
cepa LA15 (datos no mostrados).
Una alta concentracin de colesterol en los flujos de sangre de los seres humanos ha sido reconocida como
un factor de riesgo de la enfermedad de cardiopata coronaria. El consumo de productos lcteos fermentados
que contienen lactobacilos o bifidobacterias se ha comprobado que sirve para disminuir la concentracin de
colesterol en el torrente sanguneo los seres humanos. Algunos informes han indicado que las cepas de
lactobacilos que fueron capaces de asimilar el colesterol in vitro fueron tambin capaz de reducir el colesterol
in vivo. En este estudio, se seleccionaron 3 cepas que tenan niveles similares de resistencia in vitro de sales
biliares con baja tolerancia a pH, pero con la variante propiedades de colesterol-asimilando para determinar
cmo su metabolismo del colesterol afectara ratas alimentadas con una dieta alta en colesterol. Las 3 cepas
mostraron reducida la actividad de colesterol en experimentos in vitro. Por lo tanto, hemos intentado
caracterizar sus efectos reductores del colesterol en ratas alimentadas con una dieta alta en colesterol para
determinar su potencial como agentes de mejorar los perfiles de suero. Los resultados mostraron que las 3
Cepas de Lactobacillus eran eficaces en la reduccin de suero TC, TG, LDL-C y el hgado TC en comparacin
con el grupo control. Grupos B23 y D17 demostraron significativamente (P 0,05) a reducir el colesterol
niveles que LA15 grupo. Esto est de acuerdo con el Los resultados in vitro en el que las cepas B23 y D17
exhibieron mayor cantidades de colesterol que la asimilacin LA15. La presencia en estudios a animales
mostr un incremento significativo en el nivel de HDL-C en los grupos alimentados con B23 y D17 en
comparacin con el control y Grupos LA15. Los resultados coinciden con otros resultados de animales
alimentados con una dieta rica en colesterol en la cual tuvo una reduccin total en los niveles de colesterol y
un aumento en la fraccin de HDL cuando se suministr con una ingesta diaria de LAB.
LAB podra influir en el colesterol srico por la promocin de la excrecin de cidos biliares fecales.
Encontramos ms cidos biliares en las heces de las ratas de laboratorio tratados, especialmente en aquellas
ratas en el B23 y los grupos D17. Por lo tanto, un posible mecanismo de cmo las 3 cepas bajaron el nivel de
colesterol puede ser que ms de la bilis cidos en la circulacin entero heptica se *deconjugated*,
precipitaron y se excreta en las heces, lo que resulta en el suero reducida las concentraciones de colesterol.
Esto puede explicar en parte por eso en los grupos de ratas B23 y D17 tenan niveles ms bajos de colesterol
en suero que las ratas en el grupo LA15. Adicionalmente, el colesterol ms fecal se detect en el grupo B23 y
D17 ratas. LAB puede asimilar colesterol de la dieta por incorporarlo en sus membranas celulares o paredes
de las clulas antes de la excrecin fecal de las bacterias.
Por lo tanto, las cepas de LAB con propiedades hipocolesterolmicos pueden disminuir colesterol srico en
mltiples formas.
Con el fin de evaluar la colonizacin de las 3 cepas seleccionadas a mucosa gastrointestinal, el anlisis del
intestino delgado, colon y muestras de heces se llev a cabo despus de la administracin LAB. Viable LA15,
se recuperaron las clulas B23 o D17 en las heces, el intestino delgado y el colon despus de 28 das de

suplementacin y se mantiene a una nivel considerable despus de dejar de Lactobacillus cepas


administracin durante 2 semanas. Estos datos indicaron que la seleccin de las 3 cepas colonizaron con
xito el intestino de ratas y persisti eficientemente en la mucosa del intestino delgado y el colon.
Sobrevivir al paso por el tracto GI se considera importante para los probiticos poder funcionar eficazmente en
el intestino. En el presente estudio se analizaron especficamente los efectos de dietas experimentales que
contienen LA15, B23 y las cepas D17 en la poblacin bacteriana fecal. Un anlisis microbiano fecal revelado
demostr mayores recuentos de lactobacilos fecales en los grupos de tratamiento de probitico en
comparacin con la del grupo de control. Este podra atribuirse a su capacidad para sobrevivir a pH bajo y alta
concentracin de la bilis, tal como se describe para los experimentos in vitro. Sin embargo, los niveles de
coliformes fecales se redujeron significativamente. Nuestros resultados estn de acuerdo con los de Liong,
quien inform que disminuy recuento de coliformes fecales son debido a la alimentacin probitica en ratas.
Tales bacterias potencialmente probiticas que colonizan la mucosa intestinal proporcionando un efecto de
barrera contra los agentes patgenos mediante el uso de una variedad de mecanismos, ocupacin de nichos,
la competencia por los nutrientes y la produccin de antibiticos.
En conclusin, se identificaron con xito 3 cepas de Lactobacillus a partir de granos de kfir tibetanos que
muestran propiedades satisfactorias para aplicacin probitica. El presente estudio indica que las Cepas de
Lactobacillus analizadas aqu pueden ser tiles en la produccin de productos lcteos para los posibles
beneficios para la salud humana. Otros estudios estn obligados a centrarse en la mejora de las
caractersticas tecnolgicas de cepas probiticas y diversas propiedades de las leches fermentadas mediante
la optimizacin de las variables fisicoqumicas utilizados comnmente en el nivel industrial.
Materiales y mtodos
Granos tibetanos de kfir
Los grnulos de kefir recogidos del Tbet, China, fueron evaluados. Los granos de kfir se activaron mediante
la adicin de 20 g de granos, 500 ml de leche esterilizada y la incubacin a 25C durante 24 h. Los granos
eran recuperados por tamizado y fueron luego re-inoculadas en leche fresca y se incubaron a 25C durante 24
h. A continuacin, se consideraron los granos activo y utilizado en todo este estudio.
Aislamiento de LAB
A 10 g alcuota de granos de kfir se suspendi en 90 g de tampn de solucin salina esteril (0,85%) y se
homogeniz con un Stomacher (Mezclador de laboratorio Stomacher 400, Seward, Reino Unido) durante 20
min. Diluciones decimales seriados se realizaron utilizando las homogeneizadas suspensiones de granos de
kfir. Cada solucin diluida se spreadplated a De Man, Rogosa y Sharpe (MRS) agar (Difco, Sparks, MD,
EE.UU.). Las placas se incubaron en una anaerbico pecho con una AnaeroPack (Mitsubishi Gas Chemical
Co., Inc., Tokio, Japn) a 30C durante 48 h. Las colonias bacterianas que desarrollado en las placas fueron
recogidos de forma individual y sembr en frescas placas de agar MRS por vetas de dilucin para obtener
solo colonias; estas colonias se mantuvieron en agar MRS para uso inmediato y se almacenan en 20% de
glicerol a 280C. los aislamientos fueron examinados por primera vez para la actividad de la catalasa y la
tincin de Gram, y slo aquellos que eran catalasa-negativas y Gram-positivas fueron seleccionada para
estudios posteriores.
TOLERANCIA AL CIDO
Se prepar cada suspensin celular de los cultivos LAB seleccionados por granulacin cultivos crecidos
durante la noche (37C) y luego se lavaron y re suspendieron en solucin salina de peptona a una
concentracin de 109 unidades formadoras de colonias (CFU) / ml. MRS medio ajustado previamente para pH
2,0 y 3,0 se inocul con aproximadamente 10 8 CFU / ml del seleccionado culturas LAB y se incubaron a 37C
durante 3 h. viabilidad se determin utilizando el mtodo de recuento en placa. Una mililitros muestras se
extrajeron de cada tubo a 0, 1, 2 y 3 h y se sedimentaron y se lavan, y diez veces diluciones seriadas se
hicieron utilizando peptona diluyente de solucin salina. Las diluciones se sembraron en agar MRS e
incubadas anaerbicamente a 37C durante 24-48 h.
Tolerancia a la sal de bilis
Las soluciones de sales biliares se prepararon utilizando hiel de buey (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en polvo
a concentraciones finales de 0,3%, 0,5% y 1%. Agua estril doblemente destilada sin hiel de buey se utiliz
como un control. Todas las soluciones se trataron en autoclave, y 10 ml de cada solucin se transfiri a tubos

de ensayo estriles. Las suspensiones celulares que contiene aproximadamente 10 9 CFU / ml se aadieron a
cada solucin (es decir, 0,3%, 0,5%, 1% y control) y se incubaron a 37C en el pecho anaerbico. Despus de
un 12 h de incubacin, 1 ml de cada cultivo se diluy en un recipiente estril alcuota de 9 ml de una solucin
salina 0,85% en blanco. Se incubaron las placas en el pecho anaerbica a 37C para 24-48 h.
Identificacin y caracterizacin bioqumica de la
Los aislamientos
Los aislamientos fueron identificados con la disponible en el mercado 50CHL API del sistema (Biomerieux SA,
La Balme les Grottes, Francia) y un anlisis de 16S rRNA secuencias de genes. el nucleico cidos de cada
aislado se extrajeron usando un kit de purificacin de ADN (Promega, EE.UU.) segn las instrucciones del
fabricante. Dos cebadores universales, 27f y 1492r, se utilizaron para la amplificacin del gen 16S rRNA.
Amplicones fueron ms tarde secuenciado (BioAsia Co. Shanghai, China) y en comparacin con las que se
encuentran en el Centro Nacional de Informacin sobre Biotecnologa (NCBI) de base de datos. Las
secuencias 16S fueron sometidos luego a NCBI.
In vitro Ensayos de Adhesin
La adhesin de los aislamientos fue ensayada de acuerdo con el mtodo descrito por Jacobsen y compaeros
de trabajo. Inicialmente, 105 clulas Caco-2 se sembraron en cada pocillo de un cultivo de tejido de 6 pocillos.
Medio esencial de Dulbecco modificado de Eagle mnimo (DMEM) suplementado con 10% (v / v) inactivado
por calor (30 min en 56C) de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml estreptomicina fue
utilizado para el cultivo. El medio fue reemplazado con medio fresco cada dos das. El ensayo de adhesin fue
realizado despus de 20 das de post-confluencia. Las clulas se lavaron entonces dos veces con 3 ml de
solucin salina tamponada con fosfato (pH 7,4), y Se aadieron 2 ml de DMEM sin suero y antibiticos a cada
bien y se incub a 37uC durante 30 min. Aproximadamente 109 CFU / ml de un cultivo bacteriano se
suspendi en 1 ml de DMEM medio (sin suero y antibiticos) y se aadi a la diferente pozos. La placa se
incub a 37C durante 2 h en un 5% de CO2 / 95% atmsfera de aire. La monocapa se lav con PBS estril, y
se las clulas se separaron mediante tripsinizacin. Una alcuota de 1 ml de 0,25% solucin de tripsina-EDTA
(Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se aadi a continuacin, cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y la placa se
incub durante 15 min a temperatura ambiente. Las diluciones en serie de clulas suspensiones se sembraron
en agar MRS para determinar el nmero de clulas bacterianas adherentes. Las placas se incubaron durante
24-48 h en 37C, y las colonias fueron contadas. El nmero de bacterias clulas inicialmente a cada pocillo de
las placas de 6 pocillos tambin fue contado por dilucin en serie y placas en agar MRS. Los resultados del
ensayo de adhesin se expresa como el porcentaje de adhesin, es decir, la relacin entre las bacterias
adherentes y bacterias aadidas por pocillo. Caco-2 clulas del mismo pasaje se utilizaron en 3 independiente
experimentos (n = 3) con 2 repeticiones en cada experimento.
Prueba de Susceptibilidad a los antibiticos
Las concentraciones inhibitorias mnimas (CIM) de gentamicina, tetraciclina, eritromicina, vancomicina y
cloranfenicol (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se determinaron para cada cepa usando el procedimiento como
se describe anteriormente. De acuerdo a FEEDAP, los valores de punto de interrupcin MIC para la
gentamicina, tetraciclina, eritromicina, vancomicina y cloranfenicol fueron 8 mg / ml, 8 mg / ml, 4 mg / ml, 4
mg / ml y 4 mg / ml, respectivamente. La deteccin basada en PCR de los genes responsables de resistencia
a cloranfenicol [catpIP501], tetraciclina [tet (L), tet (M), tet (S)], eritromicina [erm (B), erm (C)], la vancomicina
(vanA y vanB) y gentamicina [aac (69) -aph (29) -Ia] se aplic a cepas sospechosos para transportar genes de
resistencia a antibiticos. Los cebadores y protocolos fueron los descritos por Maietti et al.
Actividades relacionadas con el colesterol
Los cultivos fueron examinados para hidrolasa de sales biliares actividad (BSH) mediante la deteccin de 10
ml de un cultivo cultivaron en caldo MRS en BSH medio de deteccin que consiste en placas de agar MRS
suplementado con 0,5% (w / v) sal de sodio de TDCA (cido taurodesoxiclico, Calbiochem, Estados Unidos y
Canad) y 0,37 g de CaCl2 / l. Las placas se incubaron en condiciones anaerobias en el recipiente de
anaerobios (Difco, EE.UU.) a 37C, y el BSH actividad se determin semicuantitativamente midiendo el
dimetro de la precipitacin zonas. El ensayo se realiz por duplicado. Colesterol asimilacin in vitro se
determin mediante el cultivo de clulas en 37C en Caldo MRS suplementado con 0,5% w / v TDCA y 0,1 g
de soluble en agua colesterol / l. Despus de la incubacin, las clulas bacterianas se recogieron por
centrifugacin (2,0006g durante 5 min), y el sobrenadante y caldo MRS control de un-inoculados se ensay
por su contenido de colesterol de acuerdo con el mtodo de Mathara et al. Co-precipitacin de colesterol con
clico cido se determin basndose en la diferencia entre el los niveles de colesterol en el control (caldo

MRS inoculadas sin bilis) antes y despus de la inoculacin de caldo MRS suplementado con glicocolato de
sodio.
Declaracin de tica
Este estudio se llev a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Gua para el Cuidado y
Uso de Animales de laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No. 85-23,
revisado 1996). Los protocolos experimentales fueron aprobados por la Universidad de Jilin Comit de
Revisin tica de la Investigacin (Nmero de permiso: 2010-069). Toda la ciruga se realiz bajo
pentobarbital de sodio anestesia, y todos los esfuerzos se hicieron para minimizar el sufrimiento. No Se
requieren permisos especficos para estos experimentos y la estudios de campo no implican especies en
peligro o protegidas.
Grupos de Animales y Dietas
Cuarenta Sprague-Dawley (SD) ratas macho de entre 4 semanas y pesaje 128.662.9 g se adquirieron de la
Animal Nacional Cra y Centro de Investigacin, Beijing, China. Las ratas se alimentaron una dieta comercial
(Kangqiao, Inc., Beijing, China) que contena 32% de protenas, 5% de grasa, fibra 2%, 1,8% de Ca, 1.2% de
P y 59% N-libre extraer durante 1 semana. Despus de este periodo de adaptacin, las ratas se
seleccionados al azar y se asignan a 4 grupos de 10 ratas cada uno. La los pesos corporales promedio
iniciales fueron similares entre los 4 grupos. La 4 grupos se asignaron dietas de acuerdo con el siguiente
rgimen: (1) grupo control, dieta alta en colesterol; (2) Grupo LA15, highcholesterol dieta + L. acidophilus
LA15; (3) Grupo B23, rica en colesterol dieta + L. plantarum B23; (4) Grupo de D17, alto colesterol dieta + L.
D17 kefiri. La dieta alta en colesterol contena 1% (w / w) colesterol, 10% de manteca de cerdo, 10% de
sacarosa, 0,3% de colato de sodio, 0,2% propiltiouracilo y una mezcla de dieta comercial (Aoboxing Biotech
Co., Ltd, Beijing, China). Todas las ratas se alojaron individualmente en jaulas de metal a una temperatura
ambiente controlada (2362uC) y humedad (5,565%) y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. la
ratas tuvieron libre acceso al agua y su dieta especfico de grupo. cada
da durante el perodo de estudio de 4 semanas, el grupo LA15, grupo B23 y el grupo D17 recibi 2 ml (109
ucf / ml) de L. acidophilus LA15, L. plantarum B23 o L. kefiri D17, respectivamente, por va intragstrica. La
grupo de control recibi una cantidad equivalente de solucin salina normal.
Los pesos corporales se registraron semanalmente, y el consumo de alimentos fue monitoreado diariamente.
Despus de 28 das de alimentacin forzada, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 12 h y la eutanasia.
Se midi el peso de los hgados.
Ensayo para la medicin de lpidos en suero
Las ratas en ayunas durante la noche se extrajo sangre de la vena de la cola bajo pentobarbital anestesia de
sodio a los 28 das del estudio perodo. Aproximadamente 1 ml de sangre fue tomada de cada rata,
transferidos a tubos de recogida de vaco no heparinizado y se mantiene en hielo durante 30 min. Los tubos
se centrifugaron a 2,0006g para 20 min a 4C. El colesterol srico total (TC), de alta densidad colesterol de las
lipoprotenas (HDL-C), colesterol de las lipoprotenas de baja densidad Se midieron (LDL-C) y triglicridos
(TG) con kits comerciales (Biosino Biotecnologa y Ciencia, Beijing, China).
Los ensayos para el hgado y colesterol Fecal
Despus de la eutanasia, se retiraron los hgados de rata, se aclar con una solucin salina fisiolgica,
borrado seca y se pesa. despus de hgado y las muestras fecales se extrajeron con una cloroformo-metanol
(2: 1) solvente, las concentraciones de colesterol en el hgado y fecales fueron
determinar utilizando los mismos kits utilizados para determinar el suero los niveles de colesterol. Se
midieron los niveles de cido clico fecales utilizando mtodos publicados.
anlisis microbiano
Se recogieron muestras fecales en los das 0, 28 y 42 (2 semanas despus detener la administracin de
Lactobacillus). En cada muestreo microbiano anlisis y reaislamiento de las cepas se realizaron como sigue:
muestras fecales fueron suspendidos (1:10 w / v) en solucin fisiolgica y diez veces diluido en serie, y 100 ml
de la dilucin apropiada se extendi sobre agar Rogosa (Oxoid) con o sin 26 mg / ml vancomicina (SigmaAldrich, Missouri, EE.UU.). el vancomycinresistant lactobacilos fueron enumerados en Rogosa-tetraciclina
agar. Las placas se incubaron anaerbicamente durante 3 d en 37C. De diez a veinte por ciento de las
colonias totales, seleccionados al azar desde Rogosa placas de agar tetraciclina contables, fueron aislados y
examinadas por su pureza. Identificacin fenotpica del LAB fue logrado utilizando el kit API 50CHL

(BioMe'rieux), basado 16S rRNA similitud y por homologa de ADN, segn lo determinado fluoromtricamente
por el mtodo de Ezaki et al. Recuentos totales anaerobios fueron obtenido utilizando agar sangre anaerobio
CDC, y las placas se incubaron en condiciones anaerobias durante 3 da 37uC. Para recuentos de coliformes,
una nica alcuota (1 ml) de cada dilucin se extendi sobre PetrifilmTM E. Las placas Count coli / Coliformes
(3M Corporation, St. Paul, Minnesota). Las placas se incubaron a 37C durante 2 d. colonias se identificaron y
contaron de acuerdo con el fabricante de instrucciones.
En diferentes momentos despus de alimentacin forzada con las cepas de Lactobacillus (das 0, 28 y 42), las
ratas se sacrificaron por ketamina-HCl anestesia. El intestino delgado y el colon se eliminaron aspticamente
y 1 gramo de cada muestra se transfiri a un tubo con 9 ml de 0,9% de solucin de NaCl y se homogeneiza
por agitacin durante 10 minutos antes de la dilucin y el cultivo en agar Rogosa (Oxoid). Aislamiento y la
identificacin de las colonias se realizaron segn mtodos microbiolgicos estndar, como se describi
anteriormente.
Anlisis estadstico
El anlisis de datos se realiz con SPSS, Inc. software (versin 10.0). Utiliz un modelo lineal se utiliz para
estudiar cualquier significativo diferencia entre las medias con un nivel de significacin de P 0,05. Se
utilizaron valores de diferencia crticos para realizar comparaciones mltiples entre medios. Todos los datos se
expresan como la media 6 desviacin estndar.