UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOQUMICA GUIA N 7

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIN DE GLUCGENO
PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO
___________________________________________________________________________________
OBJETIVOS
1. Extraer del tejido heptico o muscular el carbohidrato de reserva ms importante en los mamferos y
otros organismos.
2. Aplicar la hidrlisis del glucgeno como tcnica in Vitro para obtener glucosa.
3. Cuantificar por el mtodo de Antrona el glucgeno extrado de diferentes muestras biolgicas y una
muestra problema.
4. Determinar el porcentaje de glucgeno presente en tejido heptico y muscular para diferentes
muestras biolgicas.
5. Establecer que defectos enzimticos producen valores aumentados o disminuidos de Glucgeno.
PREPARACIN PREVIA
1.
2.

Repase el proceso de la glucogenlisis y glucognesis.

Lea el fundamento y el procedimiento de la practica.

INTRODUCCIN
El glucgeno es un homopolisacrido y fue aislado del hgado por primera vez por Claude Bernard en 1856.
Se ha encontrado en bacterias, algas, levaduras y tambin existe en animales inferiores como las ostras y
mejillones dndoles a estos alimentos una mayor consistencia y valor gastronmico.
El glucgeno es la reserva esencial de glucosa en los animales superiores; se sintetiza en todos los tejidos
animales, pero en mayor proporcin en el citoplasma del hepatocito y miocito por la accin de dos enzimas la
glicgeno sintasa y la glucosil (46) transferasa sobre un precursor de glucgeno (conformado por 8
residuos de glucosa) que esta unido a una protena llamada glucogenina. La glicgeno sintasa permite la
unin secuencial de unidades de D-glucosa provenientes de la UDP glucosa mediante enlaces lineales
(1 4) y la glucosil (46) transferasa forma puntos de ramificacin por la transferencia de 7 residuos de
una rama interna hacia otra posicin en la misma cadena o hacia otra cadena de glucgeno generando la
unin de dos residuos de glucosa con enlace (1 6), esto hace que la estructura presente un aspecto
arborescente como la amilopectina. Las ramificaciones le dan al glucgeno un carcter compacto
permitindole ocupar una menor cantidad de espacio, como tambin permiten una alta solubilidad e
incremento de los extremos no reductores [1].
El peso molecular del glucgeno vara segn su origen; es del orden de 1 a 5 x106, el hgado resulta de la
condensacin de 30.000 unidades de glucosa. Su estructura molecular le confiere propiedades que se pueden
utilizar para aislarlo eficientemente, purificarlo y cuantificarlo mediante tcnicas especficas.

PRINCIPIO
Para el anlisis cuantitativo del glucgeno; el tejido es sometido a hidrlisis cida con HCl para liberar
molculas de glucgeno. El rompimiento del tejido tambin libera protenas y otras sustancias que son
precipitadas por el cido tricloroactico y el proceso de centrifugacin. Las unidades de glucgeno liberadas
1

por el proceso de hidrlisis son solubles en el sobrenadante y son precipitadas al incubar ste con etanol en
fro. El glucgeno recuperado es hidrolizado para producir unidades de glucosa que en presencia de cido
sulfrico se deshidratan para producir furfurales que reaccionan con la Antrona generando un aumento de la
absorbancia que se lee a 625 nm contra una curva de calibracin construida con estndares de glucgeno de
8 mg % -2 mg %.

MATERIAL DE PRUEBA

Hgado y msculo frescos (Estudiantes)

Ostras crudas. (Estudiantes)

PROCEDIMIENTO
PRIMERA PARTE EXTRACCIN DE GLUCGENO POR HIDRLISIS ACIDA:
1.

Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos falcon de 15 ml y pese dos de estos con ayuda de un beaker o
espuma segn sea el caso y gurdelos para el paso 10. Registre su peso en Tabla 1 anlisis
cuantitativo Anexo 7.
2. Con ayuda de guantes y un bistur corte un fragmento de la parte interna del tejido, asegurndose de
no tomar adipositos ni membranas.
3. Pese en balanza analtica entre 0.5- 1 g de tejido o una cuarta parte del tejido disponible y registre el
valor en la Tabla 1 anlisis cuantitativo Anexo 7.
4. Homogenice en un mortero cada tejido con 0.5 g de arena lavada autoclavada mas 1 ml de cido
clorhdrico 6 N hasta obtener una pasta de consistencia suave. Tenga cuidado de no esparcir el
tejido por todo el mortero, porque perder tejido y por lo tanto analito.
5. Agregue 1 ml de solucin salina fisiolgica 0.85 % p/v.
6. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y transfiera la mayor parte del tejido macerado a un tubo de
15 ml.
7. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y recupere la mayor parte del tejido remanente que queda en
el mortero y la mano.
8. Equilibre y centrifugue por 6 minutos a 4.000 r.p.m.
9. Tome el sobrenadante con ayuda de una micropipeta y pase a los tubos de 15 ml que pes y rotul
en el numeral 1.
10. Agregue 2 ml de etanol absoluto y deje en nevera 12 horas a 4 C, compruebe que queden bien
tapados cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colquelos en una gradilla, si no los va a
procesar al da siguiente gurdelos a -20 C hasta su uso.
PRIMERA PARTE EXTRACCIN DE GLUCGENO POR HIDRLISIS BASICA:
1.

2.

Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos de 1.5 ml (dos para msculo y dos para hgado), pese dos de
estos con ayuda de una espuma y gurdelos para el paso 5. Registre su peso en Tabla 2 anlisis
cuantitativo Anexo 7.
Corte un fragmento de la parte interna del tejido con ayuda de guantes y un bistur, asegurndose de
no tomar adipositos ni membranas para los diferentes tejidos y pese para cada uno entre 10- 60 mg en
la balanza analtica sobre un papel aluminio. Registre el valor que tom en la Tabla 2 del Anexo 7.
2

3.

4.
5.

Ponga cada uno de los tejidos en el tubo correspondiente que no peso, agregue 50 mg de arena
lavada autoclavada mas 60 l de KOH 6 N y homogenice el tejido con ayuda de una varilla de
vidrio de punta roma hasta obtener una pasta de consistencia suave.
Agregue 600 l de H2O fra, homogenice mediante agitacin por vortex y centrifugue a 10.000
r.p.m por 2 min.
Recupere cada sobrenadante a los tubos que peso en el numeral 1 y adicione 200 l de etanol al
80%. Asegrese que estn bien tapados, cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colquelos
en una gradilla, si no los va a procesar al da siguiente gurdelos a -20 C hasta su uso.

SEGUNDA PARTE CUANTIFICACIN DE GLUCGENO :

1.
2.

3.
4.

5.

Programe el bao de Mara hasta que alcance la temperatura de ebullicin.

Centrifugue los tubos de 15 ml y 1.5 ml a 4000 r.p.m por 5 min a 4 C, si hay lpidos elimine la
capa de grasa con ayuda de una micropipeta y vuelva a centrifugar. Asegrese de que el pellet este
fuertemente unido para no perderlo.
Descarte el sobrenadante por inversin rpida del tubo y coloque sobre el tubo invertido una tolla
secante para eliminar la mayor cantidad de etanol posible.
Deje que cada muestra se evapore totalmente a temperatura ambiente en cmara de flujo laminar
con corriente de aire y establezca el peso del pellet recuperado (glucgeno), determine el factor de
dilucin aproximado que debe aplicar para que las muestras entren en la curva de calibracin (0.02
mg/ml-0.08 mg/ml), exprese el peso en mg /mL.
Resuspenda el precipitado en agua destilada mediante agitacin por vortex y evite que queden
grumos sin disolver, si el peso obtenido es hmedo divida por 3 aplique la siguiente relacin
verificando que su calculo entra en la curva de calibracin, por ejemplo:
a. mg de Hgado /1-5 ml H2O
b.

6.
7.

8.

mg de Msculo / 0.5 -1 ml H2O

Tenga en cuenta la capacidad del bao de Mara antes de iniciar el procedimiento.

Encendida la cabina de extraccin y dentro de sta procese los estndares y las muestras de acuerdo
a los volumenes indicados en Tabla 1 (para los espectrofotmetros anlogo y digital). Trabaje la
mitad del volumen para los colormetros y el espectrofotmetro Perkin Elmer.
Realice el procedimiento en una secuencia rpida, tape la parte superior de cada tubo con papel
parafilm o vinilpel y brale un pequeo orificio con un lpiz a cada uno. Esto se realiza para puedan
salir los vapores del cido y de impedir que en el proceso de incubacin dentro del bao de Mara
entren gotas de agua caliente producto de la condensacin del vapor agua sobre el cido y as
evitar accidentes.

Tabla 1. Metodologa para cuantificacin de glucgeno.

Reactivo

Blanco

Agua
Patrn de
glucgeno 8
mg/ dL
Muestra H
Muestra M
Antrona

0,6 ml

Patrones Glucgeno
1
2
3
2 mg/dl
4 mg/dl
8 mg/dl
0.45 ml
0.3 ml
0.15 ml
0.3ml
0,6 ml

Msculo
1/5

Muestras
Msculo
1/25

Hgado
1/200

0,6 ml
2,4 ml

0,6 ml
2,4 ml

0,6 ml
2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml
3

9. Incube en un bao de Mara en ebullicin durante 10 minutos exactos.

10. Pare la reaccin sumergiendo la base de los tubos en agua fra y lea contra el blanco de reactivos a
625 nm.
11. Descarte los residuos en el colector correspondiente, teniendo precaucin de voltear la cara para
evitar accidentes en sus ojos y rostro.
CALCULOS
1.
2.

Calcule los mg de glucgeno recuperado por los dos mtodos de acuerdo a los datos que proceso en
su Tabla 1 Anexo 7.
Registre los valores de la curva de calibracin en la Tabla 2 Anexo 7 y estime los valores de
intercepto, pendiente, coeficiente de correlacin y la concentracin de glucgeno en las muestras
analizadas.

Tabla 2. Datos de la curva calibracin de glucgeno y valores de glucgeno en muestras problema por
el mtodo de la antrona.

Grupo
Blanco reactivos
Estndar
Estndar
Estndar
Hgado
Musculo
Hgado Eppendorf
Musculo Eppendorf
a
b
r

1
2
3
4
5
6
7

3.

Volumen
Glucgeno
Resuspendido
mg
ml

Fd

mg/dL

2.5
5
10

Abs

Concentracin
mg/dL

Exponga el resultado en porcentaje de glucgeno por peso de tejido hmedo o seco segn sea el caso.

INVESTIGACIN PARA SU ARTCULO

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Qu otras molculas precipitan con TCA al 10%?

De qu esta conformado el pellet que se descart?
Por qu el etanol precipita el glucgeno?
Cules mtodos colorimtricos se pueden utilizar para cuantificar el glucgeno?
Qu diferencia(s) hay en la sntesis de glucgeno para plantas (amiloplastos) y bacterias?
Cul es el mtodo mas avanzado para cuantificar glucgeno?
Cul es la composicin y el mecanismo de accin del lugol para producir colores caractersticos
con: el glucgeno, la amilosa, la amilopectina, la celulosa y el almidn? Elabore una tabla
comparativa.

RESULTADOS
1. Describa las diferencias y semejanzas entre el almidn y el glucgeno mediante estructuras.
2. Determine que reacciones que se llevaron a cabo en la prctica.
3. Procese la Tabla 1- 2 del Anexo 7 para msculo e hgado y calcule el porcentaje de glucgeno
heptico y muscular observado.
4. Anexe la curva de calibracin e interpole las muestras analizadas, adjunte la Tabla 2 del Anexo 7
con la correccin por mnimos cuadrados (valores de coeficiente de correlacin, pendiente e
intercepto), factores de dilucin que aplic a sus muestras y despeje la concentracin de estas de los
datos obtenidos por correccin de mnimos cuadrados.
5. Determine el porcentaje de error de glucgeno en las diferentes muestras del valor obtenido al
despejar su concentracin en mg/dL de los datos obtenidos por mnimos cuadrados teniendo en
cuenta que el porcentaje de glucgeno esperado en humanos para hgado es de 6% y para msculo
1-2%.
6. Discuta que ocurre a nivel metablico con la cantidad de glucgeno hallado en las diferentes
muestras biolgicas analizadas.
7. Determine con los anlisis cuantitativos si la muestra problema analizada es normal o hay un defecto
enzimtico, de ser as discuta a que problema(s) metablico(s) podra corresponder y soporte sus
hallazgos con un artculo.
8. Elabore una tabla que resuma las enfermedades que se originan por defectos en glucognesis y
glucogenlisis, esta debe describir la enzima deficiente; el tejido (hgado / msculo); caractersticas
de la enfermedad; estructura del glucgeno normal, similar a almidn, amilopectina, dextrina,
dextrina lmite etc; concentracin de glucgeno normal, aumentada, disminuida etc y tratamiento.

BIBLIOGRAFA
1. NELSON, D. L., & COX, M. M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry. New York: Worth
Publishers 736-739.
BIBLIOGRAFA PARA CONSULTA
1.
2.
3.
4.

ALEMANY, M. Y FONT, S. Prcticas de Bioqumica. Espaa: Alambra, 1983.

PLUMMER, R.D. Bioqumica Prctica. Mxico: Mc Graw-Hill Latinoamrica, 1981.
RENDINA, G. Tcnicas de Bioqumica Aplicada: Mxico Interamericana, 1974.
WILBRAHAM, A.C. Y MATTA, M. S. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biolgica. Mxico:
Addison-Wesley. Iberoamericana, 1989.
5. WHITE, A. Y HANDLER, R. Principios de Bioqumica. Bogot: Mc Graw-Hill, 1982.

Grupo

ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificacin de Glucgeno

Tabla 1 Glucgeno recuperado por hidrlisis cida, bsica y sin hidrlisis
Cuantitativo
Cuantitativo
Cuantitativo
Cuantitativo
Cuantitativo Cuantitativo
Cuantitativo
Cuantitativo
Hgado B
Hgado B
Hgado B
Hgado B
Hgado B
Musculo
Musculo
Musculo
Peso mg tubo Peso mg tubo 15 Peso mg glucgeno
mg glucgeno
% Error
Peso mg tubo 15 Peso mg tubo 15 ml
Peso mg
15 ml vacio
ml con
observado
esperados
ml vacio
con glucgeno
glucgeno
glucgeno
observados

Cuantitativo
Musculo
mg glucgeno
esperados

Cuantitativo
Musculo
% Error

Cuantitativo
Musculo
mg glucgeno
esperados

Cuantitativo
Musculo
% Error

1
2
3
4
5
6
7
8

Grupo

Cuantitativo
Hgado B
Peso mg tubo
1.5 ml vacio

Cuantitativo
Hgado B
Peso mg tubo
1.5 ml con
glucgeno

Cuantitativo
Hgado B
Peso mg glucgeno
observado

Cuantitativo
Hgado B
mg glucgeno
esperados

Cuantitativo
Hgado B
% Error

Cuantitativo
Cuantitativo
Cuantitativo
Musculo
Musculo
Musculo
Peso mg tubo 1.5 Peso mg tubo 1.5 ml
Peso mg
ml vacio
con glucgeno
glucgeno
observado

1
2
3
4
5
6
7
8

Grupo 1

1
2
3
4
5
6
7

Blanco reactivos
Estndar
Estndar
Estndar
Hgado
Musculo
Hgado Eppendorf
Musculo Eppendorf
a
b
r
Grupo 3

1
2
3
4
5
6
7

Blanco reactivos
Estndar
Estndar
Estndar
Hgado
Musculo
Hgado Eppendorf
Musculo Eppendorf
a
b
r
Grupo 5

1
2
3
4
5
6
7

Blanco reactivos
Estndar
Estndar
Estndar
Hgado
Musculo
Hgado Eppendorf
Musculo Eppendorf
a
b
r

ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificacin de Glucgeno

Tabla 2. Datos de la curva calibracin de glucgeno y valores de glucgeno en muestras problema por el mtodo de la antrona.
Volumen
Glucgeno
Concentracin
Glucgeno
Volumen
Resuspendido
Fd
mg/dL
Abs
Grupo 2
Fd
mg
mg/dL
mg
Resuspendido ml
ml
Blanco reactivos

2.5
1 Estndar

5
2 Estndar

10
3 Estndar

4 Hgado
5 Musculo
6 Hgado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
b
r
Volumen
Glucgeno
Concentracin
Glucgeno
Volumen
Resuspendido
Fd
mg/dL
Abs
Grupo 4
Fd
mg
mg/dL
mg
Resuspendido ml
ml
Blanco reactivos

2.5
1 Estndar

5
2 Estndar

10
3 Estndar

4 Hgado
5 Musculo
6 Hgado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
b
r
Volumen
Glucgeno
Concentracin
Glucgeno
Volumen
Resuspendido
Fd
mg/dL
Abs
Grupo 6
Fd
mg
mg/dL
mg
Resuspendido ml
ml
Blanco reactivos

2.5
1 Estndar

5
2 Estndar

10
3 Estndar

4 Hgado
5 Musculo
6 Hgado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
b
r

mg/dL

Abs

Concentracin
mg/dL

Abs

Concentracin
mg/dL

Abs

Concentracin
mg/dL

2.5
5
10

mg/dL

2.5
5
10

mg/dL

2.5
5
10

Peso tejido Hgado y Musculo Esqueltico

Grupo

Cuantitativo H
Hidrlisis cida

Cuantitativo M
Hidrlisis cida

Cuantitativo H
Hidrlisis Bsica

Cuantitativo M
Hidrlisis Bsica

Cualitativo H

Cualitativo M

1
2
3
4
5
6
7
8
9