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EFEITOS ANTIPROLIFERATIVOS E APOPTTICOS DA

FOSFOETANOLAMINA SINTTICA NO MELANOMA B16F10.

RENATO MENEGUELO

Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps


Graduao Interunidades em Bioengenharia Escola de
Engenharia de So Carlos / Faculdade de Medicina de
Ribeiro Preto / Instituto de Qumica de So Carlos da
Universidade de So Paulo como parte dos requisitos para a
obteno do ttulo de mestre em Bioengenharia.

rea de Concentrao: Bioengenharia


Orientador: Prof. Dr. Gilberto Orivaldo Chierice

So Carlos,
2007.

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE


TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha catalogrfica preparada pela Seo de Tratamento


da Informao do Servio de Biblioteca EESC/USP

M541e

Meneguelo, Renato
Efeitos antiproliferativos e apoptticos da
fosfoetanolamina sinttica no melanoma B16F10 / Renato
Meneguelo ; orientador Gilberto Orivaldo Chierice. - So
Carlos, 2007.

Dissertao (Mestrado-Programa de Ps-Graduao


Interunidades em Bioengenharia. rea de Concentrao:
Bioengenharia) - Escola de Engenharia de So Carlos,
Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de
Qumica de So Carlos da Universidade de So Paulo, 2007.

1. Frmacos. 2. Fosfoetanolamina sinttica.


3. Melanoma animal. 4. Metstase neoplsica. 5. Cncer.
I. Ttulo.

AGRADECIMENTOS:

"Quando todos pensam da mesma maneira, porque nenhum pensa grande coisa."
Walter Junior

Em primeiro lugar gostaria de agradecer do fundo do corao aquele que


acreditou em um sonho, por mais louco que parecesse por mais inatingvel que
fosse um visionrio, SR. NELSON CIANFLONE in memria, de onde estiver
nos vendo, sei que est muito feliz por nossa conquista.......
A meus pais Reinaldo e Ana Maria que me ensinaram que o estudo tudo.
Meu irmo Sandro, Ivone e o pequeno Oto.
A minha esposa luz da minha vida Vivianne Paternostro Santa Rosa, minha
filhinha querida Anna Clara, minha outra beb que chegou este ms para
iluminar ainda mais nossas vidas Geovanna, a nosso brao direito Lurilene,
haja pacincia.
Ao grande amigo, professor, mestre, que me acolheu em seu laboratrio sem
pedir nada em troca, acreditou em minhas maluquices, e acrescentou muitas
outras, foram quase trs anos de uma troca gratificante de experincias, onde
aprendi que devemos defender nossos pontos de vista para podermos ampliar
nosso horizonte acadmico. Sei que obrigado muito pouco Prof. DR.
Durvanei Augusto Maria. Agradeo a Deus o dia em que voc me deu um
voto de confiana, voc sabe que foi o nico. Muito Obrigado.
Amigo!! Agora Prof. Marcos Vinicius de Almeida, s nos sabemos como foi
difcil, quantas vezes passou por nossas cabeas o pensamento em desistir,
sem seu exemplo eu no teria conseguido.
Prof. Dr. Salvador Claro Neto obrigado pela pacincia em nossas longas
discusses, cheguei at vocs sem base alguma do que falava hoje
amadurecido, posso discutir de igual com muita gente.
Ao amigo Toninho, sem ele no teramos o material para estudo...
Dr. Sandra Vasconcellos Al-Asfour por toda a parte qumica que est
desenvolvendo.
Ao pessoal do Butant, um obrigado muito especial, Ricardo e Iara eu toro
muito por vocs, tambm ao Rogrio, Danilo, Fernanda, Kamila, Norma e
Tiago.

E principalmente aquele que foi os meus dois braos neste trabalho Adilson
Kleber Ferreira, ns somos uma grande equipe...
Minha sempre amiga Janete Ferreira Rodrigues, obrigado pela pacincia,
voc vai para o cu com certeza.
Aquele que me mostrou um formidvel mundo novo de possibilidades, que
acreditou em minha capacidade, que me escolheu, para mim foi muito mais
que um orientador, me conduziu como se cuida de um filho. Prof. Dr. Gilberto
Orivaldo Chierice. A mente mais brilhante que conheci em minha vida, sou
uma pessoa de muita sorte.

Certa vez uma senhora me procurou desesperada para saber se eu


poderia ajudar seu esposo que tem cncer cerebral, onde os mdicos
afirmaram que ele j estava em estado terminal e que a nica coisa a ser
feito era amor de famlia, eu lhe disse: Senhora no sei se posso ajudar
muito, pois o que fazemos pesquisa. Respondeu-me ela: Dr. qualquer
dvida que o senhor me colocar na cabea ser melhor do que a certeza
que tenho; que daqui trs meses no terei mais meu marido. Abraoume e chorou.
Essas pessoas que mostram o valor real do trabalho que realizamos na
busca da cura para esta doena que mutila tantas famlias. No podemos
parar....

No se preocupe com o futuro, cante, no se sinta culpado por no saber o que


fazer da vida...
As pessoas mais interessantes que conheo no sabiam aos vinte e dois o que
queriam fazer da vida, alguns dos quarentes mais interessantes que conheo
no sabem...
As suas escolhas tem sempre metade de chances de dar certo, assim pra
todo mundo...Desfrute de seu corpo, dedique-se a conhecer os seus pais
impossvel prever quando eles tero ido embora de vez, seja legal com seus
irmos eles sero a melhor fonte com o seu passado e, possivelmente quem
vai mesmo te apoiar no futuro...
Entenda que Amigos vo e vem, mas, nunca abra mo dos poucos e
bons...aceite certas verdades inescapveis, respeite os mais velhos, voc
tambm vai envelhecer....acredite....
Esforce-se de verdade para diminuir as distncias geogrficas e destinos de
vida, por que quanto mais velho voc ficar, mais vai precisar das pessoas que
conheceu quando jovem, aceite certas verdades inescapveis, respeite os mais
velhos, voc tambm vai envelhecer.

Lista de Abreviaes:

1 %: Porcentagem.
2 MTT: Mtodo Colorimtrico.
3 IC 50 %: Concentrao Inibitria 50%.
4 ug: micrograma.
5 ml: mililitro.
6 CDKs: Quinases Dependentes de Ciclinas.
7 G1: Fase do ciclo celular.
8 S: Fase do ciclo celular.
9 G2: Fase do ciclo celular.
10 M: Fase do ciclo celular.
11 CDKIs: Inibidores de Quinase Dependente de Ciclinas.
12 P15, P16, P21, P53,...: Protenas especfica de ativao.
13 ATP: Aenosina Trifosfato.
14 FO: Fosforilao Oxidativa.
15 DNA: cido Desoxirribonuclico.
16 GTP: Glutamina Trifosfato.
17 mvolts: milivolts.
18 Bcl2: mediador qumico.

19 Apaf-1: Protena de ativao.


20 Bcl-xl: Protena antiapopttica.
21 Iaps: Protena de inibio de apoptose.
22 PEA: Fosfoetanolamina.
23 EA: Etanolamina.
24 AMD: Adenosina Monofosfato.
25 ADP: Adenosina Difosfato.
26 Li: Ltio.
27 SNC: Sistema Nervoso Central.
28 mM: Milimol.
29 - cm: Centmetro quadrado.
30 DMSO: Dimetil Sulfxido.
31 NCI: National Institute of Cncer.
32 mg: Miligrama.
33 nm: Nanmetro.
34 ul: Microlitro.
35 um: Micromolar.
36 ul: Microlitro.
37 mm: milmetro.
38 g: grama.
39 g/l: gramas por litro.

40 Ht: Hematcrito.
41 EDTA: Anticoagulante.
42 PHT: Fitohemaglutinina.
43 SFB: Soro Fetal Bovino.
44 Ts: Durao da fase S.
45 Tpot: Tempo de Duplicao Potncial.
46 RPM: Rotaes por Minuto.
47 mg/ml: Miligramas por Mililitro.
48 mg/kg: Miligramas por Kilograma.
49 Hb: Hemoglobina.
50 OMS: Organizao Mundial de Sade.
51 Qt: Quimioterapia.
52 MDR: Resistncia a mltiplas drogas.
53 T/C:Tratado por Controle.
54 Gm CSF: Fator estimulador de colnias do tipo granulcito-moncito.

Lista de Figuras:

Figura 1 Determinao da atividade citotxica da fosfoetanolamina sinttica


em clulas de melanoma B16F10, avaliada pelo mtodo colorimtrico MTT, as
barras do histograma representam a porcentagem relativa em cada
concentrao das clulas viveis e mortas.

Figura 2 Curva de regresso linear e concentrao inibitria 50% (IC50%) da


atividade citotxica da fosfoetanolamina sinttica em clulas de melanoma
B16F10, avaliada pelo mtodo colorimtrico MTT.

Figura 3 Avaliao da resposta linfoproliferativa de linfcitos T normais, aps


96 horas de cultura com fosfoetanolamina sinttica e com o mitgeno
fitohemaglutinina (PHA). A porcentagem da capacidade proliferativa foi
calculada comparando-se a resposta basal (ausncia de mitgeno) e o controle
na presena de PHA e 10% e 1% de soro fetal bovino (SFB).

Figura 4 Determinao da distribuio das populaes de clulas tumorais


dos tumores dorsais melanoma dos animais do grupo controle (A) e tratados
com 6.6 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes fases do ciclo
celular obtidos por citometria de fluxo.

Figura 5 - Determinao da distribuio das populaes de clulas tumorais


dos tumores dorsais melanoma dos animais do grupo controle (A) e tratados

com 1.65 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes fases do ciclo


celular obtidos por citometria de fluxo.

Figura 6 - Anlise comparativa da distribuio das populaes celulares nas


fases do ciclo celular dos tumores tratados com 6.6 mg de fosfoetanolamina (A)
e tratados com o quimioterpico Taxol (B), obtidos por citometria de fluxo.

Figura 7 - Anlise comparativa da distribuio das populaes celulares nas


fases do ciclo celular dos tumores tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina
(A) e tratados com o quimioterpico Taxol (B), obtidos por citometria de fluxo.

Figura 8 - Aspectos macroscpicos dos tumores dorsais melanoma do grupo


tratado com 1.65mg de fosfoetanolamina sinttica, aps 20 dias. Observa-se
massa tumoral no pigmentada, com raras reas de irrigao (*) e formao de
cpsula fibrtica (&).

Figura 9 Aspectos macroscpicos dos tumores dorsais melanoma do grupo


controle que recebeu soluo salina, aps 20 dias. Observa-se extensa massa
tumoral nodular, com grandes reas de irrigao (#), necrose (*) e ulcerao
(&).

Figura 10 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais melanoma do grupo


tratado com 6.6 mg de fosfoetanolamina sinttica, aps 20 dias. Observa-se
pequena massa tumoral amorfa (&) ou pequenos pontos de aplicao no local

da implantao das clulas tumorais (#), com ausncia de irrigao vascular


(* @).

Figura 11 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais melanoma do grupo


tratado com o quimioterpico Taxol 3.7 uM, aps 20 dias. Observa-se
volumosa massa pigmentada dorsal (&) com extensa rea de irrigao,
neoangiognese (*) e metstases ganglionares satlites (# @).

Figura 12 Aspecto macroscpico das leses metastticas presentes nos


parnquimas heptico (&) e pulmonar (*) do grupo controle e dos animais com
o quimioterpico comercial Taxol 3.7 uM (#) aps 20 dias. Observa-se
acentuado grau de anemia nos animais do grupo controle em relao aos
animais tratados.

Figura 13 Avaliao da rea tumoral dorsal dos animais portadores de


melanoma B16F10 durante o tratamento com fosfoetanolamina sinttica nas
concentraes de 9.9, 6.6 e 1.65 mg, durante 20 dias de tratamento. Os
animais tratados com fosfoetanolamina sinttica apresentaram uma reduo
significativa na carga tumoral de 78%, 87% e 89%, nas respectivas doses 1.65,
6.6 e 9.9 mg.

Figura 14 Anlise do nmero de metstases internas obtidas aps a


necropsia dos grupos de animais tratados com 9.9, 6.6 e 1.65 mg de
fosfoetanolamina sinttica e grupo controle.

10

Figura 15 Avaliao do crescimento da massa tumoral dorsal do melanoma


B16F10 implantado em camundongos e tratados com os quimioterpicos
combinados Taxol (Paclitaxel) nas concentraes de 3.75 e 7mg/Kg

Etoposideo (Vipeside) nas concentraes de 2.5 e 5 mg/Kg.

Figura 16 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais B16F10 do grupo


controle. Observam-se clulas tumorais em diviso celular (A), pigmentos
melnicos (B), vasos sanguneos neoformados, irregulares (C), clulas e debris
celulares pincticos (D) e reas de hemorragia intra-tumoral (E).

Figura 17 Aspectos histopatolgicos das leses metastticas dos


parnquimas heptico e pulmonar. Observa-se ndulo metasttico heptico
(A), vasos neoformados (B) e reas hemorrgicas (C) de leses metastticas
do pulmo.

Figura 18 Aspectos histopatolgicos dos tumores melanoma dorsais tratados


com 1.65 mg/ml de fosfoetanolamina sinttica. Observa-se extensa rea de
necrose intra-tumoral (A), infiltrado inflamatrio intra-tumoral (B e C).

Figura 19 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados pelo mtodo


citoqumico Picrosirius, evidenciando-se raras reas com presena de fibras de
colgeno deflagradas em vermelho ao redor dos vasos sanguneos (A) e no
interior do estroma tumoral (B), do grupo controle, que receberam soluo
salina.

11

Figura 20 Aspectos histopatolgicos dos tumores melanoma dorsais tratados


com 6.6 mg/ml de fosfoetanolamina sinttica. Observa-se extensa rea de
necrose intra-tumoral (A), clulas apoptticas (B) e vasos neoformados (C).

Figura 21 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados pelo mtodo


citoqumico Picrosirius, evidenciando-se moderadas reas com presena de
fibras de colgeno em vermelho das leses primrias, tratadas com 1.65 mg/ml
de fosfoetanolamina sinttica.

Figura 22 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados pelo mtodo


citoqumico Picrosirius, evidenciando-se extensas reas com presena de
fibras de colgeno em vermelho das leses primrias, tratadas com 6.6mg/ml
de fosfoetanolamina sinttica.

Figura 23 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais do grupo controle


corados pelo mtodo histoqumico de Verloff. Observam-se, nas setas vasos
sanguneos neoformados irregulares e distribudos no interior da massa
tumoral.

Figura 24 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais do grupo de animais


tratados com fosfoetanolamina sinttica 1.65 mg/ml (A) e 6.6 mg/ml, corados
pelo mtodo histoqumico de Verloff. Observa-se nas setas pequena rede de
vasos sanguneos neoformados irregulares e distribudos no interior da massa
tumoral, os quais apresentaram pequeno dimetro.

12

Figura 25 Anlise do nmero de glbulos vermelhos dos animais portadores


de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina
sinttica.

Figura 26 Anlise do hematcrito (Ht) dos animais portadores de melanoma


B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina sinttica.

Figura 27 Anlise quantitativa da hemoglobina (Hb) dos animais portadores


de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina
sinttica.

Figura 29 Anlise quantitativa do nmero de leuccitos dos animais


portadores

de

melanoma

B16F10,

grupos

controle

tratados

com

fosfoetanolamina sinttica.

LISTA DE TABELAS:

Tabela 1. Anlises das fases do ciclo celular obtidas por citometria de fluxo das
clulas de melanoma B16F10 dos grupos: controle, tratados com 6.6 e 1.65
mg/ml de fosfoetanolamina sinttica e com o quimioterpico Taxol.

13

14

Resumo:
MENEGUELO, R.(2007). EFEITOS ANTIPROLIFERATIVOS E
APOPTTICOS DA FOSFOETANOLAMINA SINTTICA NO MELANOMA
B16F10. 106 f. Dissertao (Mestrado) Programa de Ps-graduao da
Interunidades em Bioengenharia (EESC/FMRP/IQSC), Universidade de So
Paulo, So Carlos, 2007.

A fosfoetanolamina sinttica uma molcula fosforilada artificialmente, com


sntese indita realizada pela primeira vez pelo nosso grupo, diferindo-se das
molculas atuais pelo seu nvel de absoro de aproximadamente 90%, com
diversas propriedades antiinflamatrias e apoptticas. O objetivo principal
desse estudo e avaliar os efeitos antitumorais in vitro e in vivo da
fosfoetanolamina sinttica em clulas de melanoma B16F10 implantados em
camundongos Balb-c. Foram utilizados grupos de 60 camundongos Balb-c,
fmeas com aproximadamente 20g, tratados com gua e rao ad libidum. A
atividade citotxica do composto foi testada em linhagens tumorais pelo
mtodo colorimtrico MTT, e determinada concentrao inibitria (IC50%),
sua toxicidade foi tambm testada em linfcitos T normais, em ensaios de
proliferao celular, estimulados por mitgeno. Os animais portadores de
tumores foram tratados aps o 14 dia do implante tumoral com soluo
aquosa (i.p) de fosfoetanolamina sinttica e o grupo controle recebeu soluo
salina, e foram avaliados os seguintes parmetros: volume tumoral, rea e
nmero de metstases em rgos internos. Foi tambm realizada a
comparao da fosofetanolamina sinttica em relao aos quimioterpicos
comerciais Taxol e Etoposideo separados nas diferentes fases do ciclo celular.

15

Os resultados do tratamento com a fosfoetanolamina sinttica in vitro


mostraram que o composto induz citotoxicidade seletiva para as clulas
tumorais com IC 50% de 1.69ug/ml sem afetar a capacidade proliferativa de
clulas normais. Os animais portadores de tumores dorsais de melanoma
B16F10 apresentaram significativa reduo carga tumoral, mostrando inibio
da capacidade de crescimento e a metastatizao. A avaliao hematolgica
no

demonstrou

alteraes

relevantes

aps

administrao

da

fosfoetanolamina sinttica pela via intraperitoneal nos animais portadores de


melanoma.

Conclui-se

que

fosfoetanolamina

sinttica

diminuiu

significativamente o tamanho de tumores de forma seletiva, sem alteraes em


clulas normais, com vantagem em relao aos quimioterpicos comerciais,
pois a mesma no apresentou os terrveis efeitos colaterias dos mesmos.
Neste trabalho ficou evidente a capacidade inibitria da fosfoetanolamina
sinttica na inibio da progresso e disseminao das clulas tumorais.

Palavras chaves: frmaco, fosfoetanolamina sinttica, melanoma, metstases,


fosfolipideos, cncer.

16

Summary:
MENEGUELO, R.(2007). EFECTS ANTIPROLIFERATION AND APOPTOTIC
OF THE SYNTHETIC PHOSPHOETHANOLAMINE IN MELANOMA B16F10.
106 f. Dissertao (Mestrado) Programa de Ps-graduao da Interunidades
em Bioengenharia (EESC/FMRP/IQSC), Universidade de So Paulo, So
Carlos, 2007.

The synthetic phosphoethanolamine is a phosphorilad artificially


molecule, with unknown synthesis carried through for the first time for our
group, differing itself from current molecules for its level of absorption of
approximately 90%, with diverse anti-inflammatory and apoptotic as properties.
The main objective of this study and to evaluate the anti tumor effect in vitro
and in vivo of the synthetic phosphoethanolamine in cells of melanoma
B16F10 implanted in mice Balb-c. Groups of 60 Balb-c mice had been used,
females with approximately 20g, treated with water and ration ad libidum. The
cytotoxic activity of the composition was tested in lives tumor or normal cells for
colorimetric method MTT, and determined to the inhibitory concentration
(IC50%) its toxicid also it was tested in normal linphocytes T, in assays of
cellular proliferation, stimulated for mitogen. The bearing animals of tumors had
been dealt with after 14 day the tumor inoculation with watery solution (i.p) of
synthetic phosphoethanolamine and the group control received solution saline,
and had been evaluated the following parameters: tumor volume, area and
number of metastases in internal agencies. Also the comparison of the synthetic
phosphoethanolamine in relation to the convencionaly treatment with
quimioterapics separate Taxol and Etoposideo in the different phases of the

17

cellular cycle was carried through. The results of the treatment with the
synthetic phosphoethanolamine in vitro had shows that the composition
induces selective citotoxicity for the tumor cells with IC 50% of 1.69ug/ml
without affecting the proliferative capacity of normal cells. The bearing animals
of dorsal tumors of melanoma B16F10 had presented significant reduction
tumor load, showing to inhibition of the capacity of growth and the
metastatization. The hematological evaluation did not show alterations the
administration of the synthetic phosphoethanolamine by the intraperitoneal way
in the bearing animals of melanoma. The synthetic phosphoethanolamine
significantly reduced the size of tumors of selective form, without alterations in
normal cells; with advantage in relation to the commercial quimioterapics
therefore the same one did not present the terrible collaterals effect of the same
ones. In this work it was evident the inhibitory capacity of the synthetic
phosphoethanolamine in the inhibition of the progression and dissemination of
the tumor cells.

Key words: drougs, synthetic phosphoethanolamine, melanoma, phospholipids,


cancer.

18

SUMRIO:

1 INTRODUO:

1.1 Pele.............................................................................................................1
1.2 Cncer.......................................................................................................3
1.3 Etiologia......................................................................................................3
1.4 Tumorignese e Melanoma........................................................................5
1.5 Epidemiologia do Melanoma Cutneo........................................................8
1.6 Aspectos Clnicos do Melanoma...............................................................10
1.7 Citotoxicidade: morte celular apoptose e necrose.................................11
1.8 Apoptose...................................................................................................13
1.9 Aletraes Ultraestruturais Mitocondriais.................................................14
1.10 Apoptose mediado pela via mitocndrial................................................16
1.11 Fosfoetanolamina...................................................................................17

2 OBJETIVOS:

3 MATERIAIS E MTODOS:

3.1 Linhagens celulares tumorais e clulas normais......................................24


3.2 Determinao da atividade citotxica pelo mtodo colorimtrico MTT.....24
3.3 Anlise das fases do ciclo celular por citometria de fluxo........................25

19

3.4 Determinao do contedo de DNA por citometria de fluxo....................25


3.5 Determinao das fases do ciclo celular por citometia de fluxo...............26
3.6 Implantao de clulas tumorais..............................................................27
3.7 Animais e delineamento experimental......................................................27
3.8 Diviso dos grupos experimentais............................................................28
3.9 Observao do crescimento tumoral........................................................28
3.10 Contagem e quantificao dos glbulos vermelhos, hemoglobina,
hematcrito, leuccitos e plaquetas...................................................................29
3.11 Anlises hematolgicas..........................................................................31
3.12 Anlises histopatolgicas........................................................................31
3.13 Preparo das amostras para anlises histoqumicas: Picrosirius red e
Van Gienson-Verlof............................................................................................32

4 RESULTADOS:

4.1 Avaliao da atividade citotxica in vitro da fosfoetanolamina sinttica


em linhagens celulares......................................................................................35
4.2 Anlise das fases do ciclo celular por citometria de fluxo.........................39
4.3 Anlise dos parmetros tumorais dos camundongos portadores de
melanoma B16F10 tratados com fosfoetanolamina sinttica............................48
4.4 Avaliao histopatolgica dos tumores dorsais e leses metastticas dos
grupos tratados com fosfoetanolamina sinttica e controle...............................60
4.5 Avaliao dos parmetros hematolgicos dos animais portadores de
melanoma B16F10 tratados e no tratados com fosfoetanolamina sinttica....75

20

5 DISCUSSO:........................................................................................82

6 CONCLUSES:....................................................................................93

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................96.

21

Introduo:
22

1- INTRODUO:

1.1 - Pele:
A pele constituda por dois principais componentes, a derme e a
epiderme. A derme basicamente constituda por tecido conectivo formando
por fibras de colgeno, elsticas e reticulares, ricamente irrigadas por vasos
sanguneos e linfticos, alm de conter estruturas originalmente derivadas da
epiderme, que so as glndulas sebceas e sudorparas, folculos pilosos e
pelos. A derme possui terminaes nervosas de medeiam s sensaes de
tato, calor, frio e dor, entre nervos do sistema nervoso autnomo simptico que
regulam a atividade das glndulas sudorparas e arterola1.
Em contraste, a epiderme uma fina camada (0,1 a 0,15 milmetros de
espessura) desprovida de vasos sanguneos e terminaes nervosas.
composta por duas populaes distintas de clulas, clulas epiteliais ou
queratincitos

(tambm

conhecidas

como

clulas

de

Malpighi,

que

compreendem cerca de 95% da epiderme) e pelas clulas pigmentares ou


melancitos. A epiderme encontra-se dividida em 4 camadas ou estratos:

Estrato

basal

(camada

basal

ou

estrato

germinativo):

constitudo por uma camada nica de clulas colunares que


delineia a superfcie da derme. Os melancitos constituem
cerca de 10% das clulas presentes nessa camada, e a
melanina freqentemente encontrada nos queratincitos
basais.

Estrato espinhoso: constitudo por varias camadas espessas de


clulas

polidricas

irregulares

cobertas

por

estruturas

23

semelhantes a pequenos espinhos ou projees, formando uma


espcie de ponte com as clulas adjacentes.

Estrato granuloso: consiste em inmeras camadas de clulas


irregulares e polidricas, cujo o citoplasma contem grnulos de
queratihialina (que aparentemente contribuem para a formao
da queratina); como esses grnulos crescem em tamanho e
numero, o ncleo da clula gradualmente se degenera
culminando na morte da mesma.

Estrato crneo: composto por um numero varivel de camadas


de

clulas

queratinizadas

mortas,

prximas

umas

das

outras2, 3,4.
Os melancitos so clulas altamente especializadas que produzem e
exportam melanina, um heteropolmero cuja estrutura precisa at hoje
desconhecida. Em mamferos, esto presentes na camada basal da epiderme,
nos folculos pilosos, na derme, na retina e ris. Na pele, os melanossomos
(organelas que contm melanina produzida nos melancitos so transferidas
para os queratincitos vizinhos por um mecanismo ainda no totalmente
esclarecido, mas que parece envolver a fagocitose da ponta dos processos
dendriticos dos melancitos pelos queratincitos)5, 6,7.
Por serem altamente diferenciados, os melancitos apresentam baixa
atividade mittica in vitro e in vivo estas clulas necessitam de uma
combinao de fatores de crescimento e agentes que elevem a atividade das
protenas quinase A e C, para manter uma taxa tima de proliferao8, 9,10.

24

1.2 - Cncer:
Cncer o nome dado a uma patologia com mais de 100 subdivises
que tm em comum o crescimento desordenado (maligno) de clulas que
invadem os tecidos e rgos, podendo espalhar-se (metstase) para outras
regies do corpo. A maioria dos cnceres origina-se de uma nica clula
alterada. O cncer o resultado de uma srie de alteraes que controlam
o crescimento e o comportamento celular. Dividindo-se rapidamente, estas
clulas tendem a ser muito agressivas e incontrolveis, determinando a
formao de tumores (acmulo de clulas cancerosas) ou neoplasias
malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma
massa localizada de clulas que se multiplicam vagarosamente e se
assemelham ao seu tecido original, raramente constituindo risco de vida. As
clulas

cancerosas

mostram

uma

variedade

de

caractersticas

propriedades notveis11.
As clulas malignas possuem traos morfolgicos que as distinguem,
incluindo um ncleo maior, mitocndrias pouco funcionais, alteraes ultra
estruturais

do

citoesqueleto,

variao

na

diferena

de

potencial

transmembrana, maior produo de energia anaerbia, entre outras12.

1.3 - Etiologia:
As causas de cncer so variadas, podendo ser externas ou internas ao
organismo,

estando

ambas

inter-relacionadas.

As

causas

externas

relacionam-se ao meio ambiente e aos hbitos ou costumes prprios de um


ambiente social e cultural. As causas internas so, na maioria das vezes,
geneticamente pr-determinadas, esto ligadas capacidade do organismo de

25

se defender das agresses externas. Esses fatores causais podem interagir de


vrias formas, aumentando a probabilidade de transformaes malignas nas
clulas normais.
De todos os casos, 80% a 90% dos cnceres esto associados a fatores
ambientais. Alguns desses fatores so bem conhecidos: o cigarro, exposio
excessiva ao sol, alguns vrus. O envelhecimento traz mudanas nas clulas
que aumentam a sua suscetibilidade transformao maligna, porem o
surgimento do cncer depende da intensidade e durao da exposio das
clulas aos agentes causadores do cncer13, 14.
As alteraes so principalmente observadas dentro dos cromossomos
das clulas cancerosas, bem como das clulas transformadas em
cancerosas. As clulas normais mantm seus cromossomos diplides
direcionados ao crescimento e diviso celular, tanto in vivo quanto in vitro.
Em contraste, as clulas cancerosas freqentemente tm aberraes
cromossmicas, uma condio patolgica conhecida por aneuploidia. Assim, os
cromossomos diplides de uma clula normal podem sofrer leses, porm,
antes que a clula sofra uma transformao em clula cancerosa, ocorre
ativao de protenas especficas da clula que causam a sua eliminao, num
processo conhecido por apoptose15.
Entretanto a clula cancerosa freqentemente falha na estimulao da
apoptose, e dessa forma seus cromossomos se desorganizam com mais
intensidade.
As mais notveis alteraes morfolgicas que ocorrem no citoplasma de
uma clula cancerosa envolvem o citoesqueleto. Enquanto uma clula normal
contm organizada rede de microtbulos, microfilamentos, e filamentos

26

intermedirios, o citoesqueleto da clula cancerosa desorganizado e com


reduo na quantidade dessas organelas. Muitas mudanas morfolgicas
tambm so observadas na superfcie da clula, incluindo o aparecimento (ou
desaparecimento) de componentes especficos, como protenas de superfcie.
Algumas clulas cancerosas possuem novas protenas de superfcies,
conhecidas por antgenos associados a tumores, que induzem a formao de
anticorpos especficos contra as clulas16,

17

. Sendo que, quando as aes

desses anticorpos se tornam insuficientes, as clulas cancerosas crescem


desordenadamente em nmero e diferenciando-se em clulas tumorais. Essas
mudanas nas superfcies das clulas cancerosas alteram a adesividade para
com outras clulas teciduais bem como com substratos no celulares
(protenas de adeso). Assim, a perda da adesividade permite que as clulas
cancerosas se destaquem da massa tumoral e migrem para outros tecidos e
rgos do corpo, cujo processo conhecido por metstase18.

1.4 - Tumorignese e Melanoma:


O cncer uma doena gentica no sentido de que o fentipo maligno
resulta de uma alterao gentica que transmitida da clula alterada para
suas clulas filhas. Todos os dias, milhes de clulas se dividem no organismo
adulto normal. A cada diviso celular, estamos expostos a sofrer o efeito dos
inmeros

carcingenos

ambientais.

No

entanto,

aparecimento

desenvolvimento de um clone de clulas tumorais um evento relativamente


raro. Isto ocorre porque a clula necessita romper uma srie de barreiras
fisiolgicas para se tornar cancergena. As barreiras mais primrias so os
prprios pontos de controle do ciclo celular. Esta seqncia de fases, com

27

seus respectivos pontos de controle permitem que a clula complete seu ciclo
normal, replicando-se sem dar origem a clulas anormais. A diviso celular
normal positivamente regulada ou estimulada atravs de vias sinalizadoras.
Estas vias respondem a fatores extracelulares, os quais agem atravs de uma
seqncia de protenas por exemplo: receptores protena G protenaquinase fatores de transcrio. A progresso pelo ciclo celular a seguir, em
parte, controlada, por uma srie de protenas chamadas quinases
dependentes de ciclinas (CDKs), particularmente nas transies de fases,
tanto de G1 para S quanto de G2 para M19. Os nveis de ciclinas oscilam
durante as fases do ciclo, determinando o momento apropriado de sua ligao
com CDKs. Este grupo de enzimas, por sua vez, fosforila a progresso de uma
fase a outra do ciclo celular. Por outro lado, um grupo de inibidores do ciclo
atua impedindo ou regulando negativamente as vias sinalizadoras de tal
progresso no ciclo de diviso celular. semelhana dos fatores estimuladores
que levam produo de ciclinas/CDKs, os reguladores negativos ativaro
inibidores dos CDKs: os CDKIs19.
Podemos distinguir duas famlias de CDKIs, de acordo com seu
mecanismo de ao, homologia e CDK alvo:
1) o grupo do p21, p27 e p57.
2) o grupo do p15, p16, p18 e p1919 .
Anormalidades tanto nos genes estimuladores de diviso celular
(chamados de oncogenes), como nos protetores ou bloqueadores do ciclo
celular (chamados de genes supressores tumorais), podem conferir a uma
clula vantagens de crescimento e desenvolvimento sobre as clulas normais.

28

Cada uma das protenas envolvidas no ciclo celular codificada por um gene.
Mutaes nestes genes podem levar desregulao do ciclo celular.
Os genes que atuam de forma positiva, induzindo ou estimulando a
progresso do ciclo, so chamados proto-oncogenes, pois ao sofrerem
mutaes se tornaro oncogenes, cuja ao permitir ganho de funo clula
mutante. Ao contrrio, as protenas envolvidas no controle negativo do ciclo
celular so codificadas pelos assim chamados genes supressores tumorais.
Mutaes neste grupo de genes se manifestaro pela sua falta de ao, mas o
efeito final ser similar: perda dos mecanismos controladores do ciclo celular
normal17. J se sabe h muito tempo que expresso imprpria de fatores de
crescimento ou de seus receptores contribui para o desenvolvimento de
neoplasias. Mais recentemente, demonstrou-se que hiper-expresso da
ciclina D1 induz progresso de hiperplasia a carcinomas em camundongos.
Amplificaes da ciclina D1 tambm foram encontradas em tumores primrios
e linhagens celulares tumorais19. No ser humano, medidas indiretas baseadas
na prevalncia de tumores em diferentes faixas etrias, permitem inferir que
so necessrias cerca de cinco a seis mutaes sucessivas para que uma
clula se torne maligna e agressiva18.
Os mecanismos pelos quais os melancitos tornam-se malignos in vivo
ainda pouco conhecido; no entanto, a ativao e inativao de oncogenes
dominantes e recessivos esto envolvidos no processo tumoral. Sabe-se que
as clulas neoplsicas apresentam profunda anormalidade quando interagem
com seu micro ambiente, as transformaes malignas so provavelmente
tambm alteraes gnicas que codificam fatores de crescimento e/ou seus

29

receptores, o que confere autonomia de sinais proliferativos positivos,


independente do meio extracelular.
Outra evidncia que suporta a idia do envolvimento de pr-disposio
gentica e o fato que 10% dos pacientes portadores de melanoma possuem
histrico familiar da doena (pelo menos um parente tambm desenvolveu o
tumor)20.

1.5 - Epidemiologia do Melanoma Cutneo:

Os melancitos so clulas dendrticas originrias da crista neural, que


migram durante o desenvolvimento embrionrio para a epiderme e cuja
principal funo a sntese e transferncia dos grnulos de melanina para os
queratincitos circunvizinhos28.

Em parte, o tipo de grnulo de melanina

sintetizado pelo melancito, o qual pode ser composto por eumelanina


(pigmento marrom ou preto), feomelanina (pigmento amarelo ou vermelho) ou
uma mistura de ambos, que ir determinar a colorao da pele. A quantidade
de melancitos presentes na epiderme varia segundo a regio anatmica,
sendo cabea e antebrao as regies com maior densidade dessas clulas26.
Estmulos externos tais como a radiao ultravioleta, podem induzir
proliferao dos melancitos. Em indivduos expostos radiao solar,
observa-se um aumento da sua quantidade em regies do corpo mais
expostas21.
As mudanas proliferativas no sistema melanoctico, da menos para a
mais agressiva, so classificadas como:
1 - nevo melanoctico benigno;

30

2 - nevo displsico;
3 - melanoma de crescimento radial;
4 - melanoma de crescimento vertical;
5 - melanoma metasttico.28
Tanto

nevo

melanoctico

benigno

quanto

displsico

so

considerados marcadores para o melanoma, e sua presena aumenta o risco


de desenvolv-lo57,

21, 24, 28

. Considera-se o nevo displsico como uma leso

precursora do melanoma15. De fato, em estudos clnicos de seguimento de


leses cutneas, observou-se a evoluo do nevo displsico para melanoma24.
O

melanoma

corresponde

ao

estgio

final

da

carcinognese

melanoctica, no qual a instabilidade gentica das clulas iniciadas leva a um


aumento da sua capacidade proliferativa e de invaso15. Seu processo de
progresso aumenta em agressividade, passando pelas fases de crescimento
radial, vertical e no final, a metasttica24.
O melanoma cutneo classificado em quatro grupos clnicohistolgicos:
1 - melanoma em lentigo maligno;
2 - melanoma disseminativo superficial;
3 - melanoma nodular;
4 - melanoma acral lentiginoso.
O primeiro subtipo corresponde a 5% dos melanomas em caucasianos,
e mais freqentemente diagnosticado em mulheres, indivduos com idade
superior a 60 anos e em reas anatmicas mais intensamente expostas ao sol.
O subtipo mais comum em indivduos de pele clara o disseminativo
superficial, correspondendo a 70% dos melanomas diagnosticados. A

31

localizao anatmica predominante varia em funo da idade, ocorrendo nos


indivduos mais jovens em reas menos expostas ao sol (costas, braos,
ombro, perna e coxa) e entre os mais velhos nas mais expostas (cabea e
pescoo)25. O subtipo nodular o segundo mais comum entre caucasianos, e
corresponde entre 10 - 12% dos melanomas diagnosticados28. Similarmente ao
disseminativo superficial, a sua distribuio anatmica varia com a idade25. O
subtipo mais raro o melanoma acral lentiginoso24. Esse mais comum entre
negros e as reas anatmicas predominantes so as palmas, solas e leito
ungueal23, 25.
O prognstico para melanoma melhor para os subtipos; lentigo
maligno e disseminativo superficial. O pior prognstico est associado idade
superior a 60 anos, gnero masculino, leses localizadas no tronco, tumores de
maior espessura, e padro scio econmico mais baixo8, 27, 28,31.

1.6 - Aspectos Clnicos do Melanoma:

O tumor apresenta, na maioria das vezes, duas fases distintas:


1 - fase inicial ou de crescimento radial, no qual a leso ainda plana,
pequena e possui comportamento mais benigno,
2 - fase de crescimento vertical, com pior prognstico, apresentando
clulas malignas profundamente localizadas na derme reticular ou mesmo
invadindo o subcutneo.
A impresso clnica de que aproximadamente metade dos melanomas
surgem em associao com nevos preexistentes.

32

Sinais precoces em um nevo que podem sugerir malignidade incluem


variaes de cor, prurido, aumento do tamanho, irregularidade das bordas e
desenvolvimento de satelitose ulcerao e sangramento que so sinais
tardios29, 30.
Uma recente proposta divide as leses de pele em trs classes:
A - Classe I representa o nevo precursor;
B - Classe II so leses intermediaras nas quais as clulas
melanocticas encontram-se confinadas a epiderme ou em micro invases na
derme e representada pelos melanomas in situ ou melanomas invasivos;
C - Classe III compreende os melanomas tumorignicos.
Assim como em qualquer sistema neoplsico, o melanoma pode
eventualmente escapar de etapas durante seu desenvolvimento, isto ,
aparecer mesmo na ausncia de leses intermediarias, alternativamente o
melanoma pode surgir da transformao maligna de clulas precursoras32.

1.7 - Citotoxidade: morte celular-apoptose e necrose:


Fatores como estresse oxidativo, anxia, isquemia e uma grande
variedade de substancias txica so capazes de causar danos severos,
culminando na morte celular o que pode ocorrer pelo processo conhecido por
apoptose ou por outro extremo denominado necrose. Estudos demonstram que
clulas cancergenas tm uma peculiaridade em comum em relao
produo de energia, onde a via preferencial de produo de coenzimas

33

reduzidas (ATPs), a gliclise anaerbica que contra pem a fosforilao


oxidativa33.
A fosforilao oxidativa mitocndrial o meio mais comum e eficaz de
produo de ATP pelas clulas, atravs da via do ciclo de Krebs, onde produz
a maior parte energia que ser disponibilizada para os vrios compartimentos
celulares, em quantidades diferentes para cada organela. Sabemos que a
fosforilao oxidativa (FO) produz 17 vezes mais ATPs em relao gliclise
anaerbia. O ponto em comum e focado por ns esta relacionado na teoria de
Cabtree. Que existe inibio da FO que ocorre quando se estimula a gliclise
anaerbia, este efeito e observado somente em clulas tumorais e leveduras. A
FO fornece energia para o citoplasma e a gliclise anaerbia para o ncleo
celular, em clulas cancergenas temos uma diminuio de ATPs no citosol
conseqentemente aumento da funo glicoltica que produzir energia para o
ncleo celular gerando conseqncias para o hospedeiro, como diviso celular
perptua33
As clulas cancergenas apresentam grande variedade de estgios de
diferenciao, indo de clulas altamente diferenciadas, semelhantes a clula
original com gliclise anaerbia prxima do normal e uma baixa taxa de
crescimento, at clulas altamente indiferenciadas com alta gliclise anaerbia
e rpida velocidade de crescimento. A perda de ATPs pelo ncleo das clulas
malignas fazem com que haja um impedimento de algumas funes celulares
primordiais, como, transcrio e replicao de DNA, diminuindo a proliferao
celular e iniciando os mecanismos de apoptose. Em alguns tipos celulares a
deciso de morrer por apoptose ou necrose determinada pela quantidade de

34

ATPs presente na clula, de modo que a necrose acontece quando a


quantidade de coenzimas limitante34, 35.

1.8 - Apoptose:
O termo apoptose e usado nos casos de morte celular quando, a clula
diminui seu volume, apresenta alteraes em sua superfcie como a
externalizao de fosfatidilserina (que se liga com alta afinidade a protena
anexina V), alteraes nucleares tpicas como condensao e marginalizao
da cromatina, alm da quebra do DNA em pequenos fragmentos36.
Com respeito aos mecanismos intracelulares que participam da
apoptose, estes processos podem ter incio com a ativao de um receptor
especfico ou por alteraes nas mitoncndrias, sendo que ambos levam ao
vazamento do citocromo c dessa organela e a ativao de caspases, famlia de
sistenas proteases que coordenam e atuam como efetores da apoptose,
promovendo a hidrlise de protenas e DNA, alteraes do citoesqueleto,
dentre outros processos apoptoticos37.
A resistncia a apoptose uma caracterstica das clulas cancergenas.
O conceito de que a apoptose pode influenciar o fentipo maligno de uma
clula foi primeiramente mencionado em 197236. Contudo, a importncia do
processo na patognese do cncer permaneceu sob investigao por quase
duas dcadas, at que evidencias de genes reguladores da apoptose no
processo de tumorignese

comeassem a sugir. Sabe-se, que em grande

parte as terapias existentes contra os diversos tipos de cncer eliminam as


clulas malignas atravs da induo de apoptose, de modo que, alteraes na

35

regulao deste tipo de morte celular podem tornar o tumor mais resistente ao
tratamento, assim especulasse que um desequilibrio das protenas reguladoras
do processo apopttico possa contribuir a resistncia do melanoma maligno ao
tratamento. As bases moleculares para a resistncia a apoptose em melanoma
ainda no so bem compreendidas, alteraes nas diversas etapas do
programa da morte celular, tem sido descritos, variando desde a ineficincia da
sinalizao extracelular, ativao de caspase 8 at o desbalano na expresso
de protenas pr e anti apopttica37.

1.9 - Alteraes Ultraestuturais Mitocondriais:

Mitocndria uma organela citoplasmtica que est envolvida nos


processos primordiais de respirao celular a qual pertence maquinaria
celular, sendo tambm uma das mais importantes organelas celulares. A
mitocndria abastecida pela clula que a hospeda por substncias orgnicas
como oxignio e glicose, as quais processam e convertem em energia na forma
de ATP, e fornece para a clula hospedeira. Tendo como funo a produo de
coenzimas reduzidas pela cadeia de fosforilao oxidativa, funo essa
essencial para as clulas de mamferos. So responsveis pela produo de
grande parte dos compostos fosfatados de alta energia (ATP, GTP, creatina
fosfato) e tambm participam da gerao de calor celular, controle das
concentraes de clcio citosolicos, regulao da morte celular, gerao e
detoxificao de radicais livres e espcies reativas de oxignio.
Existe uma intima relao entre o potencial trasmembrana mitocondrial
(Deltpsi-m), e proliferao celular onde a queda do potencial trasmembrana a

36

nveis inferiores a -15mvolts, desencadeia um mecanismo de sntese de DNA


nuclear dependente de glicolise e conseqente mitose, os valores normais dos
potencias trasmembranas devem permanecer em torno de -20mvolts
-90mvolts, dependendo do tipo celular, e sendo mantidos estes valores atravs
da FO38.
A alterao ultraestrutural da cadeia de transporte de eltrons como uma
das explicaes para diminuio do processo respiratrio, uma seqncia de
enzimas respiratria que se localizam na membrana interna mitocondrial esto
cobertas por lipdeos para isolar o transporte de eltrons da fase aquosa e
evitar um curto-circuito.
O sistema efetor-mecno-qumico responsvel pelo inchao e contrao
da mitocndria onde est intimamente ligado a cadeia respiratria, e sua
seqncia de acoplamento responsvel pela FO, este sistema pode sofrer
leso devido alteraes metablicas dos cidos graxos, fosfolipdios e
colesterol, componentes estes da membrana interna da mitocndria. Uma vez
que a perda da habilidade do inchao-contrao mitocondrial parece ser um
fator constante de todas as mitocndrias tumorais possvel que a maioria dos
tumores apresente leso da camada lipdica isolante.
Em relao as mitocndria podemos seguir os seguintes passos, um
carcinogeno lesa a membrana mitocondrial, provoca escape de eltrons que
alimenta a gerao de radicais livres que vo lesar o DNA, ocorrendo ento a
fase de iniciao do cncer38. A leso da mitocndria diminui a FO que faz
surgir o predomnio das gliclise anaerbia que gera a proliferao celular
maligna. O sistema mitocondrial defeituoso existente nas clulas cancerosas
pode ser melhorado e o fenmeno sendo reversvel do ponto de vista estrutural

37

e funcional com a mudana do metabolismo anaerbio para o aerbio (FO),


promovendo diferenciao de clula maligna em clula no tumoral33.
A regio lesada da membrana mitocondrial interna pode ser susceptvel
a reparo porque o impedimento respiratrio in vitro, substancialmente
diminudo ou abolido pela adio de lipdeos totais, obtidos de mitocndrias
normais38.

1.10 - Apoptose mediado pela via mitocondrial:

A via mitocondrial envolve membros pr-apoptticos da famlia Bcl-2,


mais precisamente, elementos da sub-famlia BH3 estas protenas, que incluem
a Bid, Bim, Harakiri, Noxa, entre outras, possuem apenas um dos domnio (o
BH 3) caractersticos da famlia Bcl-2. Em resposta a um estmulo, que
compromete outro conjunto de membros pr apoptticos, a sub-famlia da Bax,
que inclui a Bax, Bak e, provavelmente, a Bok, que normalmente se encontram
fracamente associados membrana externa da mitocndria, prevalecendo
majoritariamente no citosol. A interao entre protenas das subfamlias BH3 e
Bax leva oligomerizao dos elementos do ltimo grupo, seguido de insero
na membrana externa da mitocndria. Estas molculas passam, ento, a
constituir canais de sada de protenas intermembranares desde a mitocndria
at ao citoplasma, incluindo o citocromo c e o factor indutor da apoptose. O
citocromo c, uma vez liberado, ativa uma protena citoplasmtica designada de
Apaf-1, a qual recruta e ativa a pr-caspase-9, constituindo um complexo
proteico denominado de apoptossoma. A caspase-9, na sua funo de
caspase iniciadora, ir requerer e ativar a caspase-3, executora, a qual

38

degradar protenas importantes para a viabilidade celular, e tambm, outras


caspases. As protenas Bcl-2 e Bcl-XL, membros anti-apoptticos da famlia
Bcl-2, bloqueiam a morte celular por prevenirem a liberao das protenas
intermembranares da mitocndria. No entanto, uma vez ultrapassada a fase de
morte celular que envolve, as protenas anti-apoptticas, deixam de ter
qualquer efeito na inibio da apoptose. As protenas pr-apoptticas e as antiapoptticas pertencentes famlia Bcl-2, podem inter atuar entre si atravs dos
domnios de homologia BH, formando homo e heterodmeros e regular, assim,
reciprocamente, as suas funes. Por outro lado, a funo das caspases
executoras tambm pode ser modulada por outro tipo de protenas, as IAPs
(inhibitor of apoptosis proteins), que podem ligar caspase 9 e inibir sua
atividade de protease, bloqueando a este nvel o processo apopttico. Contudo,
tambm a atividade destas protenas podem ser reguladas por outra protena
de nome duplo Smac/DIABLO, a qual, juntamente com o citocromo c,
liberada do espao intermembranar da mitocndria durante a apoptose. A
Smac/DIABLO associa-se s IAPs e inibe sua ao, permitindo a ativao da
caspase 9 a partir do complexo Apaf-1, e consequentemente, favorecendo a
apoptose40, 41,42.

1.11 - Fosfoetanolamina:

A fosfoetanolamina (PEA) foi isolada em 1936 por OUTHOUSE, (um


monoster cujo grupo R corresponde a NH2-CH2-CH2-), de tumores malignos
bovinos, fornecendo a primeira comprovao da existncia deste composto no
estado livre na natureza43. Aps seus trabalhos, outros pesquisadores

39

encontraram a fosfoetanolamina em intestinos de ratos e em tecidos cerebrais


de bovinos 44,45.
Por estarem presentes em tecidos orgnicos, surgiu um especial
interesse cientfico nos compostos fosforilados, com o objetivo de se elucidar o
papel bioqumico destas substncias. Assim, vrios trabalhos enfocaram os
diferentes comportamentos qumicos dos fosfolipdios, fosfoprotenas e outras
classes de organofosforados 45.
Os aspectos da interao entre steres fosfricos, como a lecitina, a
cefalina e a serina, com ons metlicos como sdio e potssio. Sugeriram, na
poca, um papel bioqumico destas substncias, no controle do equilbrio entre
os eletrlitos nos organismos vivos. Desde ento, o interesse na interao
fosfolipdeos-metais

tem

aumentado

outros

trabalhos

abrangendo

complexaes com outros ctions metlicos foram publicados, como o exemplo


do estudo onde foram medidas as constantes de estabilidade dos complexos
formados entre adenosina mono, di e trifosfato (AMP, ADP e ATP) com clcio.
Tais complexaes so de grande importncia na formao das lipoprotenas,
transporte de ctions e outros processos bioqumicos46, 47, 48.
Verificou-se existir uma interao especfica e atpica entre a
fosfatidilserina e o ction Li(I), resultando na cristalizao de um complexo
cristalino. Como o ltio costuma ser usado na terapia de doenas manacodepressivas, esses autores sugeriram que esta interao representaria
provavelmente um papel na ao farmacolgica do ltio49. Com relao ao
equilbrio de dissociao da fosfoetanolamina, preocupados em manter um
rigor para clculo termodinmico, surpreendentemente ignoraram o desvio
ocorrido do pK da forma protonada e a forma livre da protonao. Esse estudo

40

do comportamento da FO gerou interesse de verificar se outros aminocidos


apresentariam tambm tal fenmeno de dimerizao, j que possuem a mesma
estrutura50.
A fosfoetanolamina orgnica e a etanolamina (EA) esto presentes no
crebro normal em grandes quantidades e sua concentrao tambm se
encontra aumentada em vrios tipos de tumores, onde este aumento pode ser
da ordem de at 10 vezes51. Essas aminas esto envolvidas no metabolismo
dos fosfolpides e so precursoras da fosfatidiletanolamina e da fosfatidilcolina,
dois dos quatro fosfolpides que compe a membrana celular52. Foi
demonstrado por vrios pesquisadores que a PEA e a EA so liberadas por
despolarizao em algumas circunstncias, embora no se saiba qual o
verdadeiro significado fisiolgico desta constatao, discute-se ainda quais as
reais interaes eletroqumicas envolvidas na dimerizao do composto
fosfoetanolamina no organismo52, 53.
As funes precisas da PEA e da EA ainda so desconhecidas. No
coelho a PEA liberada do hipocampus aps despolarizao com potssio,
glutamato ou metil-aspartato. A liberao de PEA est sempre associada com
o aumento da concentrao de taurina. A interao entre taurina e PEA foi
confirmada quando se mostrou que a taurina exgena e os bloqueadores da
recaptao de taurina aumentam os nveis de PEA. O metil-aspartato induz a
liberao de taurina e PEA dos locais dendrosomticos, mas no nos
sinaptosomticos54.
A EA se converte em PEA no sistema nervoso sob a ao da
etanolamina-kinase. No prximo passo, atravs da via de Kennedy, forma-se a
fosfatidiletanolamina, um dos quatro fosfolpides componentes da membrana

41

celular55. Uma segunda via envolve o clcio estimulando a incorporao de


serina, etanolamina e colina nos fosfolpides endgenos j existentes, em
reaes que no precisam de ATP

56

. A colina uma trimetil-etanolamina e se

transforma por acetilao em acetilcolina.


Estudos recentes indicam que muitas patologias de SNC e tumores
inespecficos, tm causa provvel na deficincia de fosfoetanolamina. Em
pacientes com doena de Alzheimer confirmadas neuropatologicamente, foram
dosados a fosfoetanolamina nas regies de predileo da doena. Os dados
foram comparados com crebros normais da mesma idade. Constataram que
com diferenas estatisticamente significantes, quando comparados com
crebros normais da mesma idade, os nveis de fosfoetanolamina se
encontravam 64% reduzidos no cortex temporal (rea 21 de Brodmann), 48%
no cortex frontal (rea 9 de Brodmann) e 40% no hipocampus57.

42

Objetivo:
43

2 - Objetivos:

O objetivo principal deste trabalho foi avaliar os efeitos anti-tumorais e


anti-proliferativos in vitro e in vivo da fosfoetanolamina sinttica em clulas
normais e linhagens de clulas tumorais de Melanoma Murino B16F10. Foram
avaliados os seguintes aspectos na inibio do crescimento e disseminao
das clulas tumorais em animais portadores de melanoma:

determinao

das

concentraes

inibitrias

(IC50%)

toxicidade nas linhagens tumorais e clulas normais por ensaios


colorimtricos (MTT);

Analisar as modificaes na distribuio das clulas tumorais nas


fases do ciclo celular por citometria de fluxo e as propores de
clulas mortas por necrose e ou apoptose;

Avaliar in vivo os efeitos anti-tumorais nos camundongos


portadores de melanoma B16F10 e as comparaes com os
quimioterpicos comerciais Taxol e Etoposideo;

Avaliar as alteraes histopatolgicas e histoqumicas da matriz


extracelular e dos vasos sanguneos dos tumores nos animais
tratados com diferentes concentraes da fosfoetanolamina
sinttica

Determinar as alteraes hematolgicas (leuccitos, eritrcitos e


plaquetas) nos animais portadores de melanoma submetidos ao
tratamento com fosfoetanolamina sinttica.

44

Materiais e Mtodos:
45

3 - Materiais e Mtodos:

3.1 - Linhagens celulares tumorais e clulas normais.

A linhagem tumoral de melanoma murino B16F10 foi gentilmente cedida


pelo Instituto de Pesquisa para o Cncer Ludwig, Genebra, Sua. As clulas
sero cultivadas em frascos de cultura de 75 cm em meio de cultura
(RPMI - 1640), suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de
L-glutamina e antibiticos. Antes das clulas atingirem confluncia, as clulas
sero subcultivadas para ampliao e congelamento (meio completo contendo
10% de dimetil-sulfxido), e mantidas em nitrognio lquido. As suspenses
celulares utilizadas para a implantao no flanco dorsal dos animais sero
obtidas aps o tratamento dos frascos de cultura com Tripsina 0,2% por 5
minutos e inativao com 10% de soro fetal bovino. As clulas desprendidas
sero centrifugadas duas vezes, ressuspensas em meio de cultura e a
concentrao celular ajustada por contagem em cmera de Mallassez.

3.2 - Determinao da atividade citotxica pelo mtodo colorimtrico MTT.

A viabilidade celular das linhagens celulares tumorais e normais foram


tratadas com as diferentes concentraes de fosfoetanolamina sinttica e
avaliadas pelo mtodo colorimtrico do MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5diphenil tetrazolium bromide)58. Este mtodo baseado na reduo do MTT a
Formazan pelas clulas vivas. A determinao da sensibilidade das diferentes
doses foi otimizada de acordo com as normas estabelecidas pelo Instituto

46

Nacional de Cncer, USA (NCI). Foi determinada a atividade citotxica das


suspenses das linhagens celulares e das clulas tumorais in vivo, retiradas
cirurgicamente e em condies estreis, incubadas em placas de 96 orifcios.
Foram adicionados 10 ml de MTT (5mg/ml) s clulas, incubadas por 3 horas
em estufa contendo 5% de C02 a 37C. Aps este perodo, o meio foi removido
e acrescentado 100 ml de dimetilsulfoxido (DMSO) para dissolver os cristais de
Formazan formados e precipitados. A quantificao da absorbncia foi feita em
leitor de ELISA em comprimento de onda de 540 nm (TiterTek Multiskan)59,71.

3.3 - Anlise das fases do ciclo celular por citometria de fluxo.

A citometria de fluxo aplicada no estudo do ciclo celular registra os


parmetros cinticos da populao celular, revelando o ndice de DNA,
aploidia, a frao de proliferao celular, e a porcentagem de clulas
encontradas nas fases G0/G1, S e G2/M, indicando parmetros uni ou
multivariveis, prognsticos e possveis rumos teraputicos. A anlise da
porcentagem de clulas fornece o percentual de clulas que esto sintetizando
DNA (labeling index), da durao da fase S (Ts) e do tempo de duplicao
potencial (Tpot).

3.4 - Determinao do contedo de DNA por Citometria de Fluxo.

Alquotas das suspenses das clulas normais e tumorais tratadas e no


tratadas, foram imediatamente congeladas em tampo citrato (2mM), sucrose

47

25 mM e 0,05% dimetil sulfxido (DMSO), e mantidas em nitrognio lquido at


o momento de sua utilizao.
Aps o descongelamento das amostras em banho de gelo, as clulas
foram digeridas com 375 ml de tripsina 0,03 g/l (Sigma) por 10 minutos
temperatura ambiente e neutralizada com o inibidor de tripsina 0,5 g/l (Sigma),
ribonuclease A 0,1 g/l (Sigma) e espermina 1,2 g/l (Sigma). As amostras foram
transferidas para tubos de citometria de fluxo e a quantidade de clulas nas
diferentes fases do ciclo, nveis de apoptose (Sub-G1) e contedo de DNA na
fase S, que sero obtidos pela anlise em Software Mod-fit.

3.5 - Determinao das fases do ciclo celular por Citometria de Fluxo:

As suspenses celulares (106/ml) normais dos tumores dorsais e ou


metstases foram centrifugadas duas vezes a 3000 rpm com soluo PBS e
ressuspensas em 200 ml soluo de iodeto de propidium (20 mg/ml), contendo
20 ml Triton X-100 e 4 mg RNAse-A, por trinta minutos, temperatura
ambiente, protegidas da luz. Aps este perodo as amostras foram transferidas
para tubos de citometria, e as imagens adquiridas sero capturadas em
citmetro de Fluxo (Scalibur-Becton e DicKson) e analizadas em Software CellQuest. As fases do ciclo celular pr e ps-mitticas (G0-G1, fase S e G2-M)
sero analisadas em software Modi-fit

48

3.6 - Implantao das clulas tumorais:

Os camundongos foram injetados subcutaneamente no dorso com


5x104 clulas tumorais de melanoma murino B16F10. Aps o dcimo quarto
dia do implante tumoral, os tumores dorsais foram medidos com o auxlio de
um paqumetro. Os tumores em mdia apresentaram dimetro mdio de 0,5
cm, foi iniciado o tratamento com a fosfoetanolamina sinttica nas diferentes
concentraes descritas anteriormente, injetados pela via intraperitoneal.
Como grupo controle os animais receberam soluo salina pelas
mesmas vias de tratamento. Aps o 20 dia do tratamento, os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical, e em seguida, realizados a necropsia,
os tumores dorsais analisados, leses internas macroscpicas identificadas,
medidas e fotodocumentadas. Amostras dos tumores dos diferentes grupos de
tratamento e grupo controle, no tratado, foram processadas para as das
anlises do contedo de DNA, ciclo celular e anatomopatolgico.

3.7 - Animais e Delineamento Experimental:

Utilizaremos 40 camundongos da linhagem Balb c, fmeas e machos,


com aproximadamente 25g, idade aproximada de 6 a 8 semanas, dieta e gua
ad libitum, dos quais sero divididos em 4 grupos distintos a seguir:

49

3.8 - Os grupos experimentais foram compostos por:

Grupo A 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas


tumorais pela via subcutnea, aps o 14 dia do implante os animais foram
tratados com fosfoetanolamina sinttica pela via intraperitoneal com a
concentrao de 0, 033g/ml em 100ul;
Grupo B 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas
tumorais pela via subcutnea, aps o 14 dia do implante os animais foram
tratados com fosfoetanolamina sinttica pela via intraperitoneal com a
concentrao de 0, 066g/ml em 200ul;
Grupo C 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas
tumorais pela via subcutnea, aps o 14 dia do implante os animais foram
tratados com fosfoetanolamina sinttica pela via intraperitoneal com a
concentrao de 0, 099g/ml em 300ul;
Grupo D 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas
tumorais pela via intraperitoneal, aps o 14 dia do implante os animais foram
tratados com soluo salina pela via intraperitoneal;

3.9 - Observao do crescimento tumoral:

Aps a injeo de clulas B16F10, o crescimento tumoral foi medido e


fotodocumentado, diariamente com o auxlio de um paqumetro para medies
longitudinais e transversais do tumor (duas medidas). Foram calculados a rea
e o volume mdio do tumor, atravs das seguintes frmulas:

50

A=R2 e V= 4/3R3 onde:


A=rea, R= raio, V= volume.

Os

animais

foram

sacrificados

cada

etapa

de

tratamento,

necropsiados e os ndulos tumorais macroscpicos presentes nos rgos


internos foram contados e medidos.

3.10 - Contagem e quantificao dos glbulos vermelhos, hemoglobina,


hematcrito, leuccitos e plaquetas:

Glbulos Vermelhos: alquotas de 10l do sangue de cada grupo


experimental e controle foram diludas 1:1000 em soluo salina 0,9% e 0,01%
paraformoldedo para a anlise do nmero total de glbulos vermelhos. A
contagem foi realizada em cmera de Malassez, e o nmero de clulas ser
expresso em 109 /ml.
Hematcrito: a determinao do hematcrito (Ht) foi realizada pela coleta
do sangue em microcapilar de 10ul heparinizado selado em uma das
extremidades com fogo no bico de Bunsen. O capilar foi colocado em
microcentrfuga com a extremidade fechada voltada para o crculo externo e
centrifugada a 11.000 rpm durante 5 minutos. Os resultados foram expressos
aps a anlise comparativa da relao do sedimento rico em glbulos
vermelhos e o plasma, em tabela de referncia padro.
Hemoglobina: a determinao do teor de hemoglobina foi coletada 200ul
de sangue do plexo venoso retro orbital em tubos microcapilares contendo
como

anticoagulante

EDTA.

Utilizando-se

mtodo

da

51

cianometa-hemoglobina, com leitura em espectrofotmetro 540nm, foram


analisadas as concentraes de hemoglobina.
Plaquetas: a contagem de plaquetas foi realizada em cmara de
Neubauer, utilizando como diluente a soluo de oxalato de amnio a 1%
(lquido de Brecker). Tambm foram realizados esfregaos sanguneos, dos
diferentes grupos de animais tratados e grupo controle para a avaliao da
morfologia e do dimetro plaquetrio mdio.

Foram tambm avaliados

aspectos citolgicos, como a presena de macro ou micro plaquetas, que so


mais funcionais que as plaquetas normais e indicam regenerao da medula
ssea e a presena de agregados plaquetrios indicativos de alteraes
txicas promovidas pelos compostos como tambm alguma alterao
morfolgica celular.
Leuccitos: uma alquota de 10l do sangue de cada grupo experimental
e controle foram diludos em 90l de soluo de Turk (azul de metileno 0,5%
em 30% de cido actico glacial) para a anlise do nmero total de glbulos
brancos. A contagem foi realizada em cmera de Malassez, e o nmero de
clulas foi expresso em 106/ml. O sangue total dos camundongos portadores
de melanoma B16F10 tratados com fosfoetanolamina sinttica durante 20 dias
e grupo controle que recebeu soluo salina, foram coletados pela puno do
plexo venoso retro-orbital com o auxlio de um microcapilar de 10ul
heparinizado. Parte desse material foi utilizado para a confeco do esfregao
sanguneo.

52

3.11 - Anlises Hematolgicas:

A anlise dos nmeros globais de glbulos vermelhos e leuccitos


constitui em um importante exame de auxlio diagnstico para doenas
hematolgicas,

sistmicas

aes

farmacolgicas

ou

teraputicas.

Rotineiramente indicado para avaliao de anemias, neoplasias sistmicas,


reaes

infecciosas

inflamatrias,

acompanhamento

de

terapias

medicamentosas e avaliao de distrbios plaquetrios. Fornecem dados para


classificao das anemias de acordo com alteraes na forma, tamanho, cor e
estrutura das hemcias e conseqente direcionamento diagnstico e
teraputico, orienta na diferenciao entre infeces virticas e bacterianas,
parasitoses,

inflamaes,

intoxicaes,

interaes

medicamentosas

neoplasias atravs das contagens globais e diferenciao de leuccitos e


avaliao morfolgica dos mesmos.
As lminas para as anlises diferenciais dos leuccitos foram fixadas em
metanol puro por cinco minutos, em seguida coradas em soluo de Giemsa
por quinze minutos, lavadas em gua corrente e secas temperatura
ambiente. Aps a secagem das lminas foi realizada a contagem diferencial de
glbulos brancos em microscopia ptica com aumento de 1000x em leo de
imerso.

3.12 - Anlises histopatolgicas:

Foram retirados pequenos fragmentos de aproximadamente 0.2cm2 dos


rgos (corao, pulmo, fgado, bao, pncreas e rins), dos animais tratados

53

e controles, pesados e fixados por 24 horas em tampo formalina, tamponado


com o ph = 7.4 para a realizao de anlises histopatolgicas, tambm como
de seus tumores e metstases, para serem corados de diversas maneiras
possibilitando uma melhor visualizao das manifestaes ocorridas no
microambiente celular, como diferenciao celular, neoformao vascular,
apoptose, necrose, regenerao tecidual, hemorragias entre outros.

3.13 - Preparo das amostras paras anlises histoqumicas PicrosiriusRed e Van Gienson-Verhoff:

Aps perodo de fixao de 24 horas, utilizando-se lmina histolgica


sobre tbua de macroscopia foram retiradas duas amostras retangulares.
Todas as amostras foram acondicionadas em cpsula histolgica e colocadas
no autotcnico (Leica modelo RM 2145) para processamento overnight,
sendo desidratadas em concentraes crescentes de lcool etlico a 70, 80 e
90%. Posteriormente, foram diafanizadas em xilol contendo misturas
seqencialmente concentradas de parafina durante 12 horas. Realizada
incluso em parafina quente (Leica modelo EG 1160), os blocos foram
microtomizados (Leica modelo RM 2145) em cortes de 5m e dispostos em
lmina de vidro de 75 x 25 mm, realizando-se dois nveis de corte para cada
rea de estudo e a seguir as lminas foram corados pelos mtodos
citoqumicos de Picrosirius Red, para fibras de colgeno e Van Gienson
Verhoff para as fibras elsticas e vasos.
Os cortes histolgicos (3m) dos tumores dos grupos tratados com
fosfoetanolamina sinttica e controles que receberam soluo salina foram

54

fixados em tampo contendo 3% paraformaldedo, 0,2% de glutaraldedo e


0,1% triton X-100 em tampo fosfato de sdio pH= 7.4.
O colgeno, por ser uma protena bsica, provavelmente interage com
os grupos sulfnicos do corante Vermelho Srio a 0,1%, e em pH baixo, com os
grupos amino da lisina e da hidroxilisina e os grupos guanidina da arginina. A
colorao pelo mtodo do Picrosirius faz com que grande quantidade de
molculas do Sirius Red, de carter cido e alongado, disponha-se
paralelamente s molculas do colgeno, o que provoca aumento considervel
da birrefringncia das fibras que contm colgeno quando observadas luz
polarizada. Assim, o mtodo da colorao com Picrosirius associado
microscopia de polarizao um mtodo histoqumico especfico para
deteco de estruturas compostas de molculas de colgeno orientadas60, 61, 62,
63,64

55

Resultados:
56

4.1 - Avaliao da atividade citotxica in vitro da fosfoetanolamina


sinttica em linhagens celulares:

Aps 24 horas de cultura, fase de crescimento exponencial das clulas


de melanoma B16F10 foram plaqueadas em microplacas de 96 orifcios e
adicionadas s diferentes concentraes do composto diludo em meio de
cultura. O tratamento com a fosfetanolamina sinttica, em culturas celulares de
melanoma murino B16F10, mostrou efeito adverso sobre a toxicidade deste
composto, tempo e dose dependentes (Figura -1). A viabilidade celular aps
24 horas de tratamento nas concentraes de 6 mg 0.005 mg da
fosfoetanolamina sinttica mostrou que este composto apresenta alta
citotoxicidade em clulas tumorais

somente nas altas concentraes

analisadas (6 a 1.5mg/ml), porm nas outras concentraes testadas no


foram observados efeitos deletrios significantes (menor 0.75mg/ml). Nessas
condies foi determinada a concentrao inibitria 50% a partir da curva de
regresso linear, nosso resultado para as clulas de melanoma foi de 2.3
mg/ml (Figura 2).
A

fosfoetanolamina

sinttica

no

inibe

resposta

proliferativa

inespecfica de linfcitos T normais mantidos em cultura por 96 horas e


ativados pelo mitgeno PHA (fitohemaglutinina) (Figura - 3).

57

Mortas
Vivas

120

(%) Celulas B16F10

100

80

60

40

20

0
6000

3000

1500

750

325

162

81

40

20

10

2.5

Concentrao (ug/ml) fosfoetanolamina

Figura

Determinao

da

atividade

citotxica

da

fosfoetanolamina sinttica em clulas de melanoma B16F10, avaliada pelo


mtodo colorimtrico MTT, as barras do histograma representam a
porcentagem relativa em cada concentrao de clulas viveis e mortas.

58

(%) Inibio

80

Clula Tumoral B16F10

70

IC50% = 2.3mg/ml

60
50
40
30
20
10
0
0

2000

4000

6000

8000

Concentrao da Fosfoetanolamina Sinttica (10-6/mL)

Figura 2 Curva de regresso linear e concentrao inibitria 50%


(IC50%) da atividade citotxica da fosfoetanolamina sinttica em clulas
de melanoma B16F10, avaliada pelo mtodo colorimtrico MTT.

59

(% ) A tivid a d e P ro life rativ a

150

100

50

0
Co 10%SFB25ug

125ug

6ug

3ug

1.5ug 0.75ug 0.37ug 0.15ug 0.075ug


Co 1% SFB

Concentracao Fitohemaglutinina (ug/ml)

Figura 3 Avaliao da resposta linfoproliferativa de linfcitos T


normais, aps 96 horas de cultura com fosfoetanolamina sinttica e com
o mitgeno fitohemaglutinina (PHA). A porcentagem da capacidade
proliferativa foi calculada comparando-se a resposta basal (ausncia de
mitgeno) e o controle na presena de PHA 10% e 1% de soro fetal
bovino (SFB).

60

4.2 - Anlise das fases do ciclo celular por citometria de fluxo:

Os animais portadores de melanoma B16F10 tratados durante 20


dias

consecutivos

com

fosfoetanolamina

sinttica,

apresentaram

aumento significativo na taxa de sobrevida nas concentraes variando


de 9.9 mg at 1.65 mg em comparao ao grupo controle.

Aps a

necrpsia destes grupos de animais portadores de tumor dorsal ou


metstases pulmonares e do grupo controle que recebeu soluo salina,
foram avaliadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo e
determinadas a porcentagem das clulas nas seguintes fases: sub G1
ou apoptticas que apresentam DNA fragmentado, G0/G1 clulas
quiescentes, Fase S em sntese de DNA e G2/M em mitose.
Nossos resultados mostraram que as clulas tumorais B16F10
obtidas do tumor dorsal do grupo controle apresentam 6.9% 3.4 em
apoptose (sub-G1), 25.6% 4.8 clulas quiescente (G0/G1) e em grande
proporo com capacidade proliferativa 51.3%3.0 na fase (G2/M). Os
animais tratados com 9.9 mg apresentaram significante aumento na taxa
de mortalidade e seus tumores significativas reas de necrose.
Os tumores dos animais tratados com a concentrao de 6.6 mg
apresentaram aumento extremamente significante na proporo de
clulas em apoptose, sub G1 (12.8% 4.4) em comparao ao grupo
controle

no

tratado.

Tambm

foram

observadas

diminuies

significantes (p<0.001) na porcentagem de clulas em GO/G1 (2.90 %


0.9), e clulas com capacidade de sntese de DNA, fase S
(1,49%0.28) induzidos pela fosfoetanolamina sinttica em comparao

61

ao grupo controle (23.1% 4.6). A proporo de clulas com capacidade


proliferativa (G2/M)

valor significativamente menor (P<0.001) nas

clulas tumorais tratadas com 6.6 mg de fosfoetanolamina sinttica


(2.1%0.89) em relao ao grupo controle (51.4%3.0). Os dados esto
apresentados na figura - 4.

62

55

50

(%) Populao Tumoral

45

40

35

30

25

20

15

10

Apo Co

G0/G1 Co

S - Co

G2/M - Co

Fases do Ciclo Celular


17.5

***
B

(%) Populao Tumoral

15.0

12.5

10.0

7.5

***

5.0

***
2.5

***

0.0
Apoptose

G0/G1

G2/M

Fases do Ciclo Celular

Figura - 4 Determinao da distribuio das populaes de clulas


tumorais dorsais de melanoma dos animais do grupo controle (A) e
tratados com 6.6 mg de

fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes

fases do ciclo celular obtidos por citometria de fluxo.


* Anlise estatstica One-Way Analise of Variance ANOVA (p significativo p<0.05)

63

Os tumores do grupo de animais tratados com a concentrao de 1.65


mg apresentaram aumento significante na proporo de clulas em apoptose
(17.5% 2.3) em comparao ao grupo controle no tratado (6.8% 3.4).
Quando comparadas s concentraes de 6.6 e 1.65 mg de fosfoetanolamina
sinttica os nveis de apoptose no tiveram diferenas significantes. As
propores de clulas quiescentes diminuram significantemente (p=0.0015) no
grupo de clulas tratadas com fosfoetanolamina sinttica (12.7 % 4.06) em
relao ao controle (25.6% 4.8). A capacidade de sntese (fase S) diminuiu
significativamente (P<0.001) no grupo tratado com fosfoetanolamina sinttica
(4.9% 1.2) enquanto que no grupo controle (23.01%4.6).
As

clulas

com

capacidade

proliferativa

(G2/M)

diminuram

significativamente (p<0.001) no grupo de tumores tratados com 1.65 mg de


fosfoetanolamina sinttica (11.9%2.2) em relao ao grupo controle
(51.4%3.0). Os dados esto apresentados na figura - 5.

64

55

50

(%) Populao Tumoral

45

40

35

30

25

20

15

10

Apo Co

G0/G1 Co

S - Co

G2/M - Co

Fases do Ciclo Celular


20

***

(%) Populao Tumoral

***

15

10

***
5

0
Apoptose

G0/G1

G2/M

Fases do Ciclo Celular

Figura - 5 Determinao da distribuio das populaes de clulas


tumorais dorsais de melanoma dos animais do grupo controle (A) e
tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes
fases do ciclo celular obtidos por citometria de fluxo.
* Anlise estatstica One-Way Analise of Variance ANOVA (p significativo p<0.05)

65

Anlises comparativas entre os tratamentos com a fosfoetanolamina


sinttica nas concentraes de 6.6 e 1.65 mg com o quimioterpico Taxol na
concentrao de 3.7uM, especfico de ltima gerao responsvel pela inibio
de protenas envolvidas na dimerizao de
celular,

microtbulos durante a diviso

nas fases G2/M; mostraram que em todas as fases do ciclo a

fosfoetanolamina

sinttica

na

concentrao

de

6.6

mg

diminui

significativamente a capacidade de proliferao celular e um indutor


importante de clulas em apoptose com a mesma eficcia teraputica, porm
sem apresentar catastrficos efeitos colaterais. Na concentrao de 1.65 mg
de fosfoetanolamina sinttica a eficcia de inibio das fases quiescentes, S e
proliferativa G2/M mostrou-se dependente da dose administrada no tratamento.
Os dados e as anlises estatsticas esto apresentados nas figuras 6 e 7.

66

17.5

(%) Populao Tumoral

15.0

12.5

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

Apoptose

G0/G1

G2/M

Fases do Ciclo Celular

(%) Tumor B16F10 + Taxol 3.7uM

20

15

10

Apoptose

G0/G1

G2/M

F a se s d o C i c l o C e l u l a r

Figura - 6 Anlise comparativa da distribuio das populaes


celulares nas fases do ciclo celular dos tumores tratados com 6.6 mg de
fosfoetanolamina sinttica (A) e tratados com o quimioterpico Taxol (B),
obtidos por citometria de fluxo.

67

20

(%) Populao Tumoral

A
15

10

Apoptose

G0/G1

G2/M

Fases do Ciclo Celular

(%) Tumor B16F10 + Taxol 3.7uM

20

15

B
10

Apoptose

G0/G1

G2/M

F a se s d o C i c l o C e l u l a r

Figura - 7 Anlise comparativa da distribuio das populaes


celulares nas fases do ciclo celular dos tumores tratados com 1.65 mg de
fosfoetanolamina sinttica (A) e tratados com o quimioterpico Taxol (B),
obtidos por citometria de fluxo.

68

Tabela - Anlises das fases do ciclo celular obtidas por citometria


de fluxo das clulas de melanoma B16F10 dos grupos: controle, tratados
com 6.6 e 1.65 mg/mL de fosfoetanolamina sinttica e com o
quimioterpico Taxol.

Linhagem B16F10

Sub-G1

G0/G1

G2/M

/ Tratamento

(%)

(%)

(%)

(%)

6.9 3.4

25.6 4.8

23.1 4.6

51.3 3.0

12.8 4.4

2.9 0.9

1.49 0.28

2.1 0.89

17.5 2.3

12.7 4.1

4.9 1.2

11.9 2.2

15.4 8.7

2.6 1.6

0.61 0.43

1.38 0.7

Controle

Fosfoetanolamina
6.6mg/mL
(0.0468uM)
(80 x)

Fosfoetanolamina
1.65mg/mL
(0.0117uM)
(320 x)

Taxol (3.75 uM)

Valores expressos em mdia (x) e desvio padro ( d.p.)

69

4.3 - Anlise dos parmetros tumorais dos camundongos portadores de


Melanoma B16F10 tratados com fosfoetanolamina sinttica:

Aps o 14 dia da implantao de 5x104 clulas tumorais na regio


dorsal, 100% dos animais apresentavam tumores dorsais prximos aos locais
de inoculao apresentando em mdia volume de 0.10 0.05cm3. Os animais
de todos os grupos de experimentao tratados e controle foram pesados e
realizados a medio (comprimento x largura), dos tumores diariamente com o
auxilio do paqumetro, e fotodocumentados.
Os animais foram observados diariamente e aps 20 dias de tratamento
com fosfoetalonamina sinttica administrada pela via intraperitoneal, com as
seguintes concentraes (9.9, 6.6 e 1.65 mg), e foram sacrificado por
deslocamento cervical, necropsiados e os tumores dorsais e as metstases
presentes nos rgos internos, (corao, pulmo, fgado, rins, bao), pesados
e fixados por 24 horas em tampo formalina, tamponado com o pH 7,4 para a
realizao de anlises histopatolgicas.
Macroscopicamente os tumores dos animais tratados com 1.65 mg de
fosfoetanolamina sinttica apresentavam-se como massas nodulares dorsais
no pigmentadas, no ulceradas e com raras reas de irrigao ou
neoangiognese, tambm foi observada a formao de tecido encapsulado
caracterstico de fibrose, a massa no se apresentava aderida superfcie
interna do animal, caractersticas de tumores benignos. Por outro lado, o grupo
controle apresentava tumores dorsais pigmentados e necrose, com extensas
reas de ulcerao, extremamente irrigada e ocupando um volume expressivo
em relao superfcie corprea total do animal (Figuras 8 e 9).

70

&

Grupo Fosfoetanolamina (1.65mg)

Figura 8 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais de


melanoma do grupo tratado com 1.65mg de fosfoetanolamina sinttica,
aps 20 dias. Observa-se massa tumoral no pigmentada, com raras
reas de irrigao (*) e formao de cpsula fibrtica (&).

71

&

Grupo Controle

Figura 9 Aspectos macroscpicos dos tumores dorsais de


melanoma do grupo controle que recebeu soluo salina, aps 20 dias.
Observa-se extensa massa tumoral nodular, com grandes reas de
irrigao (#), necrose (*) e ulcerao (&).

72

Os tumores melanoma B16F10 dos animais tratados com 6.6 mg de


fosfoetanolamina sinttica apresentaram pequenas massas tumorais amorfas
ou um pequeno ponto de aplicao na rea onde foi inoculado s clulas,
ausncia de metstases internas, ausncia de neoangiognese. No foi
observada perda de peso significativo ou alteraes comportamentais
importantes pela utilizao do composto (Figura - 10).

73

&

Figura 10 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais de


melanoma do grupo tratado com 6.6mg de fosfoetanolamina sinttica,
aps 20 dias. Observa-se pequena massa tumoral amorfa (&) ou
pequenos pontos de aplicao no local da implantao das clulas
tumorais (#), com ausncia de irrigao vascular (* @).

74

&

Figura 11 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais de


melanoma do grupo tratado com o quimioterpico Taxol 3.7uM, aps 20
dias. Observa-se volumosa massa pigmentada dorsal (&) com extensa
rea de irrigao, neoangiognese (*) e metstases ganglionares satlites
(# @).

75

Fgado
&

Rim

Fgado

Pulmo
*

Figura 12 Aspecto macroscpico das leses metastticas


presentes nos parnquimas heptico (&) e pulmonar (*) do grupo controle
e dos animais com o quimioterpico comercial Taxol 3.7 uM (#) aps 20
dias. Observa-se acentuado grau de anemia dos animais do grupo
controle em relao aos animais tratados.

76

A curva de crescimento tumoral foi avaliada pela medio dos seguintes


parmetros tumorais: incidncia, taxa de sobrevida, rea tumoral e nmero de
metstases internas. Os animais portadores de melanoma B16F10 e tratados
com a concentrao de 9.9mg apresentaram reduo significativa da massa
tumoral de 89% em comparao ao grupo controle no tratado. Este grupo de
animais apresentou pequenas massas tumorais, porm a taxa de mortalidade
no curso do tratamento foi grande, possivelmente pela interao do composto
com o microambiente tumoral, o que levaria possivelmente a liberao de
substncias ou produtos da degradao celular com potencial citotxico
(horror citotxico), figura 13.
Nas concentraes de 6.6 e 1.65mg de fosfoetanolamina sinttica
observa-se uma reduo significativa da massa tumoral (figura 13), sem a
ocorrncia de mortalidade, como tambm no foram observados efeitos
colaterias, como caquexia ou modificaes comportamentais.
Aps a dissecao cirrgica verificamos que o tumor implantado
localizava-se no tecido subcutneo, apresentando colorao enegrecida
decorrente da produo excessiva de liberao para o meio de melanina pelas
clulas tumorais, em diferentes propores e tambm nos diferentes grupos de
tratamento com a fosfoetanolamina sinttica. A necropsia revelou que os
animais tratados com fosfoetanolamina sinttica apresentaram reduo
altamente significativa (p<0.001) da formao de metstases internas. Os
animais que foram tratados com fosfoetanolamina sinttica na concentrao de
6.6mg apresentam tumores dorsais com leses ocupando rea e volume
extremamente reduzidos com caractersticas amorfas, sem sinais de
metstases macroscpicas em rgo alvo como os gnglios linfticos, pulmo

77

e fgado e ausncia significativa de neovascularizao, como tambm no


apresentaram sinais de anemia e caquexia. (Figura 14).
Em nenhum grupo experimental foi observada a formao em rgos
internos de modificaes estruturais dignas de nota, como reas hemorrgicas,
exsudato peritoneal, infeces no parnquima pulmonar, quadros de
hemorrgica pulmonar ou mesmo depresso imunolgica.
Por outro lado, o tratamento combinado com os quimioterpicos Taxol
(Paclitaxel) nas concentraes de 3.75 e 7.0 mg/Kg e o Etoposideo (Vipeside)
nas concentraes de 2.5 e 5.0 mg/Kg administrados no mesmo esquema
teraputico, mostraram uma reduo importante na carga tumoral de 66.7 e
91%, respectivamente, porm foi observada alta e significativa taxa de
mortalidade (>85%), alm dos extremos efeitos colaterais mielossupressores
causados por estes grupos de inibidores da proliferao celular em todas as
concentraes avaliadas ( Figura 15).

78

Controle
Fosfo 9.9 mg

Fosfo 6.6mg
Fosfo 1.65 mg

15.0

rea tumoral (cm2)

12.5

10.0

7.5

5.0

*78%
*87%

2.5

*89%
0.0
12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

Dias de Tratamento

Figura 13 Avaliao da rea tumoral dorsal dos animais


portadores

de

melanoma

B16F10

durante

tratamento

com

fosfoetanolamina sinttica nas concentraes de 9.9, 6.6 e 1.65 mg,


durante 20 dias de tratamento. Os animais tratados com fosfoetanolamina
sinttica apresentaram uma reduo significativa na carga tumoral de
78%, 87% e 89%, nas respectivas doses 1.65, 6.6 e 9.9 mg.

79

100
90

(%) Mettases Internas

80
70
60
50
40
30
20

***

10

***
***

0
Controle

9.9 mg

6.6mg

1.65mg

Grupos de Tratamento Fosfoetanolamina

Figura 14. Anlise do nmero de metstases internas obtidas


aps a necropsia dos grupos de animais tratados com 9.9, 6.6 e 1.65mg
de fosfoetanolamina sinttica e grupo controle.
*** Anlise estatstica comparativa entre os grupos tratados e controles
Anlise de Contingncia Teste Exato de Fishers.

80

10000

Volume do Tumor (mm)

9000
8000

Controle - Salina
Taxol 3.75mg/Kg+Etoposideo 2.5mg/Kg

7000
6000

Taxol 7 mg/KguM +Etoposideo 5mg/Kg

5000
4000
66.7%

3000
2000

91%

1000
0
11

12

14

16

18
20
22
Tempo (dias)

24

27

29

31

Figura 15 Avaliao do crescimento da massa tumoral dorsal do


melanoma B16F10 implantado em camundongos e tratados com os
quimioterpicos combinados Taxol (Paclitaxel) nas concentraes de 3.75
e 7mg/Kg e o Etoposideo (Vipeside) nas concentraes de 2.5 e 5 mg/Kg.

81

4.4 - Avaliao histopatolgica dos tumores dorsais e leses metastticas


dos grupos tratados com fosfoetanolamina sinttica e controle:

Aps 20 dias de tratamento dos animais portadores de melanoma


B16F10 com fosfoetanolamina sinttica nas diversas concentraes, os
camundongos foram necropsiados e seus tumores dorsais e leses
metastticas,

retirados

fotodocumentados

realizados

as

anlises

histopatolgicas.
Os animais do grupo controle possuem massas tumorais dorsais
volumosas, ocupando em torno de 40 60% de seu peso corpreo, seus
tumores
ulcerados

macroscopicamente
e

necrticos.

apresentavam-se

Histologicamente

nodulares,

observou-se,

pigmentados,

massa

celular,

pleomrfica (vrias formas e tamanhos celulares), pigmento melnico intra e


extracelular, clulas tumorais apresentando-se com figuras de diviso (mitose),
vasos sanguneos neoformados, reas hemorrgicas proximais, raras clulas
tumorais picnticas e raras reas de necrose intra-tumoral. No foram
observados infiltrados inflamatrios, intra ou peri-tumorais ( Figura 15 ).

82

A
Aumento 400X

Aumento 200X

Figura - 15 Aspectos histopatolgicos dos tumores dorsais B16F10


do grupo controle. Observam-se clulas tumorais em diviso celular (A),
pigmentos melnicos (B), vasos sanguneos neoformados irregulares (C),
clulas e debris celulares picnticos (D) e reas de hemorrgicas intratumorais (E).

83

Os

animais

do

grupo

controle

apresentaram

uma

quantidade

significante de leses metastticas em rgos internos, principalmente pulmo


e fgado. Essas leses apresentaram-se como massas nodulares irregulares,
com alta densidade e capacidade proliferativa, alta rede neovascular, com
presena de infiltrado intra ou peri-tumoral e/ou reas de hemorragia intersticial
( Figura 16 e 17).

Figura 16 Aspecto macroscpico das metstases pulmonares, grupo


controle. As setas mostram ndulos tumorais distribudos nos lbulos
pulmonares

84

Figura 16 - Aspecto macroscpico de metstases pulmonar

Aumento 200X

Aumento 400X

Figura 17 - Aspectos histopatolgicos das leses metastticas do


parnquima heptico e pulmonar. Observa-se ndulo metasttico
heptico (A), vasos neoformados (B) e reas hemorrgicas metastticas
do pulmo (C).

85

Os animais portadores de melanoma tratados com fosfoetanolamina


sinttica na concentrao de 1.65 mg apresentaram pequenas massas
tumorais nodulares, pouco pigmentadas e com extensas reas de necrose.
Histologicamente, os tumores dorsais indicam pequenas reas tumorais,
ausncia de figuras de diviso celular e extensas e significativas reas de
necrose que foram substitudas por elementos fibrilares do estroma. Essa
organizao da matriz extracelular foi avaliada pelo mtodo citoqumico de
Picrosirius.

Observa-se moderado infiltrado inflamatrio peri-tumoral, rico em

clulas mononucleares, e digno de nota, foram encontradas clulas em


degenerao, ncleos celulares fragmentados e apoptticos (Figura 18).

86

Aumento 200X

Aumento 200X

Aumento 400X

Figura 18 - Aspectos histopatolgicos dos tumores dorsais de


melanoma tratados com 1.65 mg/ml de fosfoetanolamina sinttica.
Observa-se

extensa

rea

de

necrose

intra-tumoral

(A),

infiltrado

inflamatrio intra-tumoral (B e C).

87

Aumento 400X

Aumento 400X

Figura 19 - Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados


pelo mtodo citoqumico Picrosirius, evidenciando-se raras reas com
presena de fibras de colgeno deflagradas em vermelho ao redor dos
vasos sanguneos (A) e no interior do estroma tumoral (B), do grupo
controle, que recebeu soluo salina.

88

Os animais portadores de melanoma tratados com fosfoetanolamina


sinttica na concentrao de 6.6 mg apresentaram pequenas e raras ou
ausncia

de

massas

tumorais

nodulares,

pouco

pigmentadas.

Histologicamente, os tumores dorsais apresentaram-se com pequenas reas


tumorais, ausncia de figuras de diviso celular e extensas e significativas
reas de necrose que foram substitudas por elementos fibrilares do estroma.
Observam-se numerosas clulas em degenerao celular, apoptticas e com
ncleos fragmentados. A vascularizao neste grupo de tumores tratados
apresentava-se escassa, com vasos irregulares e ausncia de reas
hemorrgicas (Figura 20).

89

Aumento 200X

Aumento 400X

Aumento 400X

Figura 20 - Aspectos histopatolgicos dos tumores dorsais de


melanoma tratados com 6.6mg/ml de fosfoetanolamina sinttica. Observase extensa rea de necrose intra-tumoral (A), clulas apoptticas (B) e
vasos neoformados (C).

90

Aumento 200X

Aumento 200X

Figura 21 - Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados


pelo mtodo citoqumico Picrosirius, evidenciando-se moderadas reas
com presena de fibras de colgeno (em vermelho) das leses primrias,
tratadas

com

1.65mg/ml

de

fosfoetanolamina

sinttica.

91

Aumento 200X

Aumento 200X

Figura 22 - Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados


pelo mtodo citoqumico Picrosirius, evidenciando-se extensas reas
com presena de fibras de colgeno em vermelho das leses primrias,
tratadas com 6.6mg/ml de fosfoetanolamina sinttica.

92

Os vasos sanguneos foram corados pelo mtodo citoqumico de Verloff,


para evidenciar as fibras musculares lisas das paredes dos vasos.
Os tumores do grupo controle apresentaram vasos sanguneos
neoformados distribudos em toda a massa tumoral. Estes se mostraram com
grandes dimetros ao redor da massa tumoral e com propriedades
proliferativas. (Figura 23)

93

Aumento 200X

Aumento 400X

Figura 23 - Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais do grupo


controle corados pelo mtodo histoqumico de Verloff. Observam-se nas
setas vasos sanguneos neoformados irregulares e distribudos no
interior da massa tumoral.

94

Nos grupos de animais portadores de melanoma B16F10 e tratados com


fosfoetanolamina sinttica nas concentraes de 1.65 e 6.6 mg observamos
uma reduo significativa na rede vascular neoformada, como tambm no
dimetro dos vasos existentes ( Figuras 24 ).

95

Aumento 200X

B
Aumento 200X

Figura 24 - Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais do grupo


de animais tratados com fosfoetanolamina sinttica 1.65mg/ml (A) e
6.6mg/ml, corados pelo mtodo histoqumico de Verloff. Observa-se nas
setas pequena rede de vasos sanguneos neoformados irregulares e
distribudos no interior da massa tumoral, os quais apresentam pequeno
dimetro.

96

4.5 - Avaliao dos parmetros hematolgicos dos animais portadores de


melanoma B16F10 tratados e no tratados com fosfoetanolamina
sinttica:

As amostras sanguneas de animais tratados com fosfoetanolamina


sinttica nas concentraes de 9.9 a 1.65mg e grupo controle na presena do
anticoagulante EDTA (10%), foram obtidas do plexo venoso retro-orbital dos
camundongos portadores de tumores dorsais B16F10. Os animais foram
mantidos durante a experimentao e colheita em condies normais e no
estressantes sem o uso de sedao ou anestesia.
As anlises hematolgicas do tratamento com fosfoetanolamina sinttica
mostraram

que

em

todas

as

concentraes

administradas

pela

via

intraperitoneal, nos animais portadores de tumores melanoma, submetidos ao


tratamento apresentaram um aumento significativo (p< 0.001) no nmero total
de glbulos vermelhos, sem modificaes em seus aspectos morfolgicos, no
sendo observados: anemia, hemorragia ou estmulo de eritropoiese extramedular e sem desvio a esquerda, quando foram comparados ao grupo
controle, que recebeu soluo salina. Esses resultados tambm foram
comprovados pela determinao do hematcrito e da quantidade de
hemoglobina, em todas as concentraes e observamos um aumento
extremamente significativo em torno de 37% no grupo de animais submetidos
ao tratamento com fosfoetanolamina sinttica (Figura 25).

97

***

80

***

Nmero de Eritrcitos x 10 9/ ml)

70

60

**
50

40

30

20

10

Co - Tumor

9.9

6.6

1.65

Controle

Fosfoetanolamina (mg/ml)

*** Diferenas estatsticas entre os grupos controle e tratados com fosfoetanolamina.


Teste estatstico de Varincia de ANOVA.

Figura 25 - Anlise do nmero de glbulos vermelhos dos animais


portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com
fosfoetanolamina sinttica.

98

55

50

45

H e m a t o c r it o ( H t % )

40

***

35

###

***
###

30

***

###

###

25

20

15

10

C0 - Tumor

9.9

6.6

1.65

Controle

Fosfoetanolamina mg/ml

*** Diferenas estatsticas entre os grupos controle portador de tumor e tratado com
fosfoetanolamina sinttica.
### Diferenas estatsticas entre os grupos controle e tratado com fosfoeatanolamina.
Teste Estatstico de Varincia de ANOVA.

Figura 26 - Anlise do hematcrito (Ht) dos animais portadores de


melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina
sinttica.
99

Hemoglobina g/dl

15

10

Co - Tumor

9.9

6.6

1.65

Controle

Fosfoetanolamina (mg/ml)

Figura 27 - Anlise quantitativa da hemoglobina (Hb) dos animais


portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com
fosfoetanolamina sinttica.

No foram observadas alteraes quantitativas no nmero total de


plaquetas aps o tratamento dos animais portadores de melanoma B16F10
com o composto fosfoetanolamina sinttica (Figura 28).

100

Nmero de Plaquetas 10 3/m m 3

1000

800

600

400

200

0
Co - Tumor

9.9

6.6

1.65

Controle

Fosfoetanolamina mg/ml

Figura 28 - Anlise quantitativa do nmero de plaquetas dos


animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com
fosfoetanolamina sinttica.
O tratamento com fosfoetanolamina sinttica nos animais portadores de
melanoma mostrou que o composto induz um aumento extremamente
significativo (p<0.001), no nmero de leuccitos total nas concentraes de 9.9
e 6.6 mg/ml , quando comparados aos grupos controles tratados com salina ou
animais normais (Figura 29).

101

Nmero de Leuccitos x 106 /ml

***
3

2
###

###

###

Co - Tumor

9.9

6.6

1.65

Controle

Fosfoetanolamina mg/ml

*** Diferenas estatsticas entre os grupos controle portador de tumor e tratado com
fosfoetanolamina sinttica.
### Diferenas estatsticas entre os grupos controle e tratado com fosfoeatanolamina.
Teste Estatstico de Varincia de ANOVA.

Figura 29 - Anlise quantitativa do nmero de leuccitos dos


animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com
fosfoetanolamina sinttica.

102

Discusso:

103

5 - Discusso

A cada ano, o cncer tem se consolidado como um problema de sade


pblica em todo o mundo. Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), o
cncer atinge pelo menos 9 milhes de pessoas e mata cerca de 5 milhes a
cada ano, sendo hoje a segunda causa de morte por doena nos pases
desenvolvidos, perdendo apenas para as doenas cardiovasculares 58, 59,60.
As clulas malignas, diferentemente das outras clulas, so caracterizadas por um
processo de crescimento no qual existe uma perda parcial ou mesmo total dos
mecanismos normais de controle. Como resultado deste crescimento descontrolado,
as clulas malignas se multiplicam mais rpido do que as clulas normais. Esta maior
taxa de crescimento, em parte responsvel por sua sensibilidade as formas de
tratamento, como a quimioterapia (QT). A taxa de crescimento ou multiplicao
celular no pode explicar isoladamente a maior sensibilidade das clulas tumorais
QT ou mesmo a sua resistncia ao prprio tratamento (genes ativos de resistncia a
mltiplas drogas - MDR) ou a prpria morte celular programada.
A desregulao da apoptose leva provavelmente, ao menor nmero de
clulas mortas encontradas em vrias patologias como cncer, AIDS, Mal de
Alzheimer e artrite reumatide. A morte de clulas por necrose oposta a
apoptose ocorre quando uma clula severamente injuriada, por desastre
fsico, qumico ou pela privao de oxignio, por exemplo61.
A apoptose pode comear pela ao de vrios gatilhos, inclusive pela
remoo dos sinais qumicos das clulas (fatores de crescimento ou de
sobrevivncia).

A morte celular pode tambm ser desencadeada pelos

receptores de mensagens internos e externos, que podem comear a ignorar


certas mensagens qumicas; ou pelos receptores celulares para sinais
conflitantes como aqueles que indicam se ela deve ou no sofrer diviso
celular, mecanismos de reparo ou pontos de checagem da integridade
estrutural e seqencial do DNA61.
104

As clulas tumorais podem ainda estar desprovidas de seus gatilhos


apoptticos que controlam diretamente a entrada e a sada das clulas no ciclo
celular. A tendncia das clulas normais em cometer suicdio, quando privadas
de seus fatores de crescimentos ou de contatos juncionais ou pela perda da
expresso de molculas de adeso com clulas adjacentes so provavelmente
uma das formas para a inibio da formao de metstases em tipos de
tumores66.
Em diversos tipos de neoplasias, especialmente certos linfomas, a morte
da clula impedida pela excessiva produo de protena inibidora a Bcl-2,
regulada pelas vias de sinalizao mitocondrial. Os melancitos expressam
grandes quantidades de quantidades de Bcl-2, como mecanismo reparador dos
efeitos deletrios da luz ultravioleta. As clulas geralmente morrem por
apoptose, freqentemente pela ativao da p53, por outro lado, a inibio ou
supresso de sua expresso produz altos nveis da protena inibidora Bcl-2, as
quais contribuem para a progresso e disseminao32.
O acmulo de clulas tumorais em alguns tipos de cncer pode estar
relacionado com o funcionamento anormal das vias proliferativas, que induzem
a multiplicao das clulas, podendo ocorrer simultaneamente ou no a
inibio do turnover celular - processo de renovao e substituio de clulas
que j no exercem suas atividades corretamente 58,59,60.
Considerando a necessidade de novas abordagens para o tratamento do
cncer, estudos bioqumicos dos mecanismos de transduo de sinal celular
possibilitaram um melhor entendimento da biologia da clula neoplsica. Dessa
forma,

novos

mecanismos

de

ao

esto

sendo

explorados

no

desenvolvimento de novos medicamentos para o seu controle. O surgimento

105

de frmacos antitumorais seletivos como alvo para cada capacidade adquirida


do comportamento do cncer, e seu uso em combinaes apropriadas;
associado com tecnologia sofisticada para detectar e identificar todos os
estgios da doena pode contribuir na preveno do desenvolvimento de
muitos tumores, ou at mesmo, na cura de tumores pr-existentes 61.
A fosfoetanolamina metabolizada em fosfatidiletanolamina, principal
fosfolpide da membrana mitocondrial um dos principais responsveis pela
manuteno do potencial transmembrana - Deltapsi-m - da mitocndria38. A
fosfoetanolamina convertida no fgado nos trs fosfolpides constituintes da
membrana interna mitocondrial: a fosfatidiletanolamina, a fosfatidilcolina e a
fosfatidilserina. Esses trs fosfolpides esto implicados diretamente na
permeabilidade da membrana interna da mitocndria. O evento mais precoce
produzido pela leso mitocondrial a alterao do potencial transmembrana
Deltapsi-m e somente a alterao deste potencial j diminui drasticamente a
produo de ATP, em um processo contnuo cuja seqncia provoca alterao
do Complexo I e demais componente da cadeia de eltrons da mitocndria38,39.
Neste trabalho, a fosfoetanolamina sinttica obtida a partir de um
processo de latenciao mostrou-se eficaz inicialmente in vitro na capacidade
de inibir o crescimento de clulas de melanoma B16F10, expostas as varias
concentraes deste composto. Apresentou uma concentrao inibitria 50%
de 2.3 ug/m avaliada pelo mtodo colorimtrico MTT, mtodo fundamentado na
capacidade de enzimas do tipo succcinato desidrogenases, presentes na
mitocndria, quando as clulas viveis degradam o substrato fornecido pelo
reagente MTT71,72.

Comparando sua atividade inibitria in vitro a outros

quimioterpicos, usualmente administrado em pacientes portadores de

106

cnceres, como o paclitaxel, inibidor especfico da fase G2/M ou o etoposideo,


inibidor de topoisomerases tipo II, a fosfoetanolamima sinttica se mostrou
cerca de 130 vezes mais eficaz em sua atividade inibitria que as drogas
comerciais, demonstrados neste mesmo estudo.
O conceito de ciclo celular introduzido em 1953 tem auxiliado no
delineamento de diversos eventos que governam a proliferao das clulas de
mamferos. Durante o ciclo celular podem ser distintas as seguintes fases: G1
("Gap 1"), intervalo aps a mitose durante o qual as clulas se preparam para
iniciar a sntese de DNA63. Este perodo caracterizado pela transcrio gnica
e traduo, levando sntese de protenas necessrias para a sntese de DNA;
S perodo no qual ocorre a duplicao do DNA celular e o G2/M ("Gap 2")
intervalo aps a sntese de DNA, durante o qual as clulas se preparam para a
diviso e a mitose propriamente dita.
Anlises genticas de cnceres humanos tm revelado que protenas
envolvidas no ponto de checagem G0/G1 - S esto inativas na maioria dos
casos, e que alteraes no ponto de checagem da ocorrncia de danos no
DNA parecem ser responsveis pela resistncia das clulas tumorais a agentes
quimioterpicos ou irradiao. Em contraste, alteraes no ponto de checagem
G2/M so encontradas mais raramente64. Algumas alteraes no complexo
mecanismo regulatrio da transio G0/G1- S, maior alvo de alteraes em
cncer, envolvem deleo ou superexpresso de genes ou mutaes pontuais
que impossibilitam a funo gnica, com resultado comum de alterao do
balano fosforilao/desfosforilao, determinando o estado proliferativo da
clula65.

107

O controle da proliferao celular ocorre, sobretudo, na fase G1, e a


parada do crescimento de clulas de mamferos pode ser concluda nesta fase,
pela depleo de fatores de crescimento ou soro ou em condies de cultura
sob alta densidade celular. O estado de parada de crescimento
alternativamente chamado de repouso, G0 ou fase quiescente do ciclo66. A
sada do ciclo celular para um estado de parada de crescimento reversvel (G0)
um processo ativo que envolve a expresso e atividade de produtos de genes
de parada de crescimento67. Sob estas condies, um programa intrseco de
expresso gnica induzido e genes envolvidos na parada de crescimento
comeam a ser altamente expressos. Este quadro de expresso gnica
reversvel, por exemplo, fibroblastos em parada de crescimento quando
estimulados apresentam regulao negativa dos genes de parada de
crescimento68.
O tratamento in vivo de animais portadores de melanoma dorsal
B16F10 com fosfoetanolamina sinttica, nas concentraes de 6.6 e 1.65mg/
ml durante 20 dias, induziu aumento expressivo das clulas apoptticas
(>54%), quando comparadas ao grupo controle. Quando analisados as
diferenas de apoptose induzida por quimioterpicos clssicos, como o
Paclitaxel (Taxol), a fosfoetanolamina sinttica um composto seletivo e com
alta especificidade por este tipo de morte celular.
As demais fases do ciclo celular obtidas por citometria de fluxo dos
tumores dorsais tratados com fosfoetanolamina sinttica revelaram que o efeito
citotxico equivalente aos apresentados por drogas quimioterpicas como o
Taxol. As fases quiescentes (G0/G1) foram diminudas significativamente,
quando comparadas ao grupo controle ou ao Taxol, possivelmente decorrentes

108

das diferenas de massas moleculares entre os compostos testados. As


diferenas das massas moleculares da fosfoetanolamina sinttica nas
concentraes de 6.6 mg/ml (~ 4.7nM) e 1.65 mg/ml (~ 1.2nM) em relao a
massa do

Taxol (~3.7uM) mostraram que o composto sinttico

respectivamente 230 e 100 vezes, mais potente nesta inibio que a droga
comercial.
Na fase S de sntese foi demonstrado que a fosfoetanolamina sinttica
na dose de 6.6 mg/ml >93% equivalente ao quimioterpico comercial Taxol
>97%, enquanto que na dose de 1.65mg/ml seu efeito foi significativo >78%, na
inibio, porm em menor proporo.
O Taxol um taxano inibidor da polimerizao dos microfilamentos
envolvidos na formao do fuso equatorial durante a diviso mittica, o
tratamento das clulas de melanoma B16F10 foi capaz de inibir em mdia 97%
das clulas na fase G2/M. O tratamento com a fosfoetanolamina sinttica nas
concentraes de 6.6 e 1.65mg/mL inibiram respectivamente, 96 e 77% das
clulas

em

diviso

celular.

Como

frmaco

comercial

Taxol,

fosfoetanolamina sinttica mostrou-se dose dependente na parada (arrest)


das clulas em G2/M.
O processo da carcinognese varia dependendo da intensidade e
agressividade

do

agente

promotor,

convertendo-se

em

um

processo

rapidamente progressivo, como ocorre em certos tumores de alta agressividade


biolgica.
O modelo de melanoma murino B16F10 um dos modelos utilizados
pelo Instituto Nacional do Cncer (NCI USA), para a avaliao da atividade
antitumoral de novos agentes antineoplsicos.

109

WITTES e GOLDIN em 1986 mostraram que a curva de dose resposta


para um determinado composto indica que medida que a dose aumentada,
o tempo de sobrevivncia dos animais portadores de tumor estendido at que
o mximo efeito teraputico seja alcanado. medida que a concentrao
aumentada a toxicidade do frmaco se manifesta e o tempo de sobrevivncia
dos animais diminui. Este tipo de sistema fornece uma medida quantitativa da
efetividade do frmaco e permite avaliao da eficcia antitumoral baseada no
aumento do tempo de sobrevida. Os resultados encontrados no tratamento dos
animais aps o 14 dia do implante das clulas tumorais no dorso aumentaram
a taxa de sobrevida nas concentraes de 1.65 e 6.6 mg/ml, administradas
durante 20 dias pela via intraperitoneal.
Nos experimentos de eficcia anti-tumoral, a partir do 14 dia, todos
animais apresentavam ndulos de pelo menos 0.5 mg, calculados a partir da
frmula utilizada pelo NCI para estes estudos. Neste momento foram iniciados
os tratamentos de cada grupo de animais com seus respectivos regimes
teraputicos. As curvas de crescimento do tumor indicaram haver diferenas
significativas entre os grupos de tratamento com fosfoetanolamina sinttica,
controle salina e com o quimioterpico paclitaxel. A taxa de reduo da carga
tumoral foi calculada a partir da mdia da massa tumoral dos grupos tratados
em relao mdia do grupo controle, descritos por Plowman69.
A eficcia antitumoral de todos os grupos de camundongos que
receberam fosfoetanolamina sinttica foi refletida nos altos ndices de reduo
da carga tumoral observados, ultrapassando 89% de reduo na carga tumoral
em relao ao controle e de 67% para os quimioterpicos Taxol e Etoposideo.

110

De acordo com os padres estabelecidos pelo NCI, valores de T/C < 42


% (tratado/controle) so indicativos de atividade antitumoral significativa.
Quando estes valores so < 10, indicam atividade antitumoral altamente
significativa69.
Nos camundongos tratados com fosfoetanolamina sinttica os valores
obtidos de T/C so aproximadamente < 8%, indicando sua significativa
efetividade como droga anti-tumoral.
Em camundongos do grupo , foi ntida a intensa disseminao e
agressividade do tumor. Todos os animais deste grupo apresentaram ndulos
metastticos, principalmente em pulmo, fgado e linfonodos satlites e
sistmicos e tambm em 66% foram encontrados ndulos em gnglios paraarticos.
O nmero de linfonodos comprometidos por metstases um aspecto
crtico do prognstico. No cncer de mama, por exemplo, a presena de quatro
ou mais gnglios axilares ipsilateral comprometidos sem evidncia de outras
metstases, interpretada como de pior prognstico do que a presena de at
trs gnglios comprometidos. Nos animais do grupo controle foram
encontradas presenas de ndulos pulmonares e hepticos, e acima de 30%
apresentavam metstases retro abdominais, no mesentrio e no peritnio,
caracterizando uma intensa disseminao do tumor neste grupo.
A necrpsia dos camundongos tratados com fosfoetanolamina sinttica,
macroscopicamente

mostrou

ausncia

de

neovascularizao,

anemia,

caquexia e as anlises histolgicas e histoqumicas revelaram tumores com


baixa densidade celular, aumento de clulas apoptticas, necrticas e em
degenerao. Foi observado intensa deposio de material fibrilar ao redor da

111

massa tumoral, rico em fibras de colgeno, expressivamente na concentrao


de 1.65 mg/ml de fosfoetanolamina sinttica.
As anlises hematolgicas dos nmeros de glbulos vermelhos e
leuccitos constituem um importante exame de auxlio diagnstico para
doenas hematolgicas, sistmicas e aes farmacolgicas ou teraputicas de
vrias drogas, principalmente aquelas decorrentes s doenas neoplsicas.
Rotineiramente indicado para avaliao de anemias, neoplasias sistmicas,
reaes

infecciosas

inflamatrias,

acompanhamento

de

terapias

medicamentosas e avaliao de distrbios plaquetrios. Fornecem dados para


classificao das anemias de acordo com alteraes na forma, tamanho, cor e
estrutura das hemcias e conseqente direcionamento diagnstico e
teraputico, orienta na diferenciao entre infeces virticas e bacterianas,
parasitoses,

inflamaes,

intoxicaes,

interaes

medicamentosas

neoplasias atravs das contagens globais, diferenciao de leuccitos e


avaliao morfolgica dos mesmos.
A fosfoetanolamina sinttica alterou significativamente a quantidade do
nmero de glbulos vermelhos e leuccitos, nos animais portadores de
melanoma. O composto previne os quadros anmicos decorrentes do
desenvolvimento e da disseminao das clulas tumorais.
A mielossupresso, decorrente de quimioterapias clssicas mono ou
politeraputicas, podem levar a granulocitopenia e conseqente quadros
infecciosos sistmicos graves. Quando so utilizados esquemas teraputicos
de mltiplas drogas, existe um somatrio de efeitos colaterais em funo da
associao. A princpio, nestes casos, a droga mielotxica. Fatores de
crescimento, por exemplo, a eritropoetina ou os fatores estimuladores de

112

colnias, fator estimulador de colnias do tipo granulcito-moncito (GM-CSF),


diminuem a morbidade e a mortalidade por estas complicaes70.
A imunossupresso que acomete os animais portadores de tumores foi
suprimida pela administrao da fosfoetanolamina sinttica, somente em altas
concentraes.

No

foram

evidenciadas

alteraes

quantitativas

ou

qualitativas das plaquetas, no se observou agregaes ou macroplaquetas.


Desde o surgimento do emprego da quimioterapia para o cncer na
dcada de 40, ps-guerra foram identificados muitos caminhos pelos quais as
clulas cancerosas escapam do agente qumico. Embora a terapia atual para
o cncer dependa principalmente do uso de cirurgia, irradiao e quimioterapia,
a evoluo na compreenso da biologia da transformao maligna e das
diferenas no controle da proliferao e morte da clula normal e cancerosa71
proporcionou a descoberta de novos alvos possveis para o tratamento do
cncer. provvel que novas terapias, como no caso da fosfoetanolamina
sinttica, desenvolvida pelo nosso grupo, venham a substituir ou combinar-se
as j existentes, aumentando a eficcia do tratamento e diminuindo a
incidncia de efeitos colaterais.

113

Concluses:
6 - Concluses:

A fosfoetanolamina sinttica apresentou concentrao inibitria


(IC 50%) de 2.3mg/ml em clulas de melanoma B16F10, sem
efeito sobre clulas normais;

Quando linfcitos T cultivados e ativados por mitgenos


especficos, a fosfoetanolamina sinttica no apresentou efeito
inibitrio sobre a resposta linfoproliferativa;

114

As fases do ciclo celular por citometria de fluxo dos tumores


tratados a fosfoetanolamina sinttica induziu a parada (arrest)
nas

fases

G0/G1,

no

proliferativas

aumentou

significativamente a populao celular morta, possivelmente por


apoptose;

Quando comparado o tratamento do melanoma B16F10 com


fosfoetanolamina sinttica e os quimioterpicos comerciais,
Taxol e Etoposideo, foi significativa a reduo da carga tumoral
e aumento da taxa de sobrevida dos animais dos animais
tratados sem efeitos colaterias importantes e caquexia;

Alteraes macro e microscpicas foram observadas no


tratamento do melanoma B16F10 com a fosfoetanolamina
sinttica, reduo do volume e densidade de clulas tumorais,
necrose, aumento importante de clulas apoptticas, e reduo
e ou ausncia de neovascularizao;

A fosfoetanolamina sinttica reduziu drasticamente a formao


de metstases;

As anlises da matriz fibrilares do colgeno mostraram que a


fosfoetanolamina sinttica, induziu significativamente a sntese
dessa protena, possivelmente pela substituio da densidade
das clulas tumorais, como tambm pelo aumento das reas de
fibrose encontradas nos grupos de tratamento;

Os dados hematolgicos avaliados neste estudo mostraram, que


o tratamento com a fosfoetanolamina sinttica nos animais
portadores de melanoma apresentou durante o crescimento

115

tumoral, o composto aumenta significativamente o nmero de


leuccitos totais, eritrcitos durante o tratamento no alteraro
elementos eritropoiticos.

Nos padres estabelecidos pelo NCI (National Cncer Institute)


com relao eficcia classificamos a fosfoetanolamina sinttica
como

um

agente

antitumoral

de

efetividade

altamente

significativa.

Sendo a fosfoetanolamina sinttica um composto seletivo e com


alta especificidade contra a proliferao e disseminao das
clulas tumorais.
Supostamente temos indicaes para trabalhos futuros, que o
composto tambm promissor para o tratamento de outras
patologias como: doenas neurodegenerativas, autoimunes,
neurolgicas, endcrinas e cardiolgicas, pois vemos no ciclo da
fosfoetanolamina atravs do mapa metablico a diversidade e o
poder de transformao deste composto em nosso organismo.

116

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127

Animal do grupo controle apresentando grande massa tumoral dorsal.

128

Diferena de tamanho entre tumores do animal controle e tratado com FOS.

129

Animal controle com tumor aderido ao corpo e grande neovascularizao.


Animal tratado apresenta pequena massa amorfa no aderida ao corpo sem
presena de neovascularizao.

130

Animal controle apresentando rea hemorrgica e grande massa tumoral


Animal tratado no apresenta rea hemorrgica ou sinais de caquexia,
podemos notar apenas um pequeno ponto no local de aplicao do tumor.
131

Animal controle, tumor muito agressivo, incapacitante.

132

133