CROMATOGRAFA

SEGN IUPAC:

La Cromatografa es un mtodo usado permanentemente para la separacin de los

componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve.
La fase estacionaria puede ser un slido, un lquido retenido sobre un slido o un gel.
La fase estacionaria puede estar extendida como una capa o distribuida como una
pelcula, etc. La fase mvil puede ser

lquida, gaseosa o un fluido supercrtico.

La cromatografa es una tcnica de separacin ( fraccionamiento o purificacin) cuyo

propsito es separar y cuantificar
complejas).

analitos en mezclas (por lo general en matrices

El botnico russo Mikhail Semenovich Tswett. A inicios del s XX

separ los pigmentos de hojas en una columna de vidrio,
empleando carbonato de calcio (fase estacionaria) y ter de

petrleo (fase mvil).

Tswett le llam a esta tcnica Cromatografa, del griego escritura

del color

CMO ES QUE OCURRE LA SEPARACIN EN

CROMATOGRAFA?

Por migracin de los analitos en mezcla, a diferentes velocidades.

La velocidad de migracin est gobernada por diferentes interacciones entre un

soluto (conducido por una fase mvil en

movimiento) y un slido o lquido (fase

estacionaria).

La separacin ocurre como resultado de la diferencia de interaccin entre los

analitos y la fase estacionaria, el componente ms afn a la fase estacionaria se
retiene ms y tarda en eluir.

La fase estacionaria por lo general es un slido poroso, con un tamao de

partcula muy pequeo, de superficie inerte. Este slido est recubierto por una
pequea capa o pelcula de un lquido.

La fase mvil es un solvente de alto grado de pureza o una mezcla de ellos.

FUERZAS INTERMOLECULARES INVOLUCRADAS EN LOS

PROCESOS CROMATOGRFICOS
Fuerza intermolecular

Grupos tpicos en la molcula

Fuerza relativa de los

enlaces

Interacciones de

Cadenas de hidrocarburos

Dbil

Enlaces dobles C = C , halgenos

Dbil

van der Waals

Dipolares y atracciones
Inducidas por dipolos

Enlaces hidrgeno

Atracciones inicas

nitrgeno
Grupos OH

y NH2

Grupos ionizables o con carga

Fuerza moderada

Fuerte

PROCESOS FSICO QUMICOS QUE OCURREN EN LA

CROMATOGRAFA
ADSORCIN
Es un fenmeno fsico de superficie , las molculas de una sustancia (adsorbato) se adhieren
en la superficie de un slido finamente dividido (adsorbente).
El desplazamiento de la sustancia depende del equilibrio adsorcin desorcin de la
sustancia contenida en un disolvente mvil sobre un slido estacionario y ocurre en la
superficie de contacto durante la adsorcin.

ADSORCIN
La proporcin de la distribucin entre las dos fases luego del
equilibrio se llama coeficiente de adsorcin, el cual disminuye
cuando aumenta la temperatura, menos sustancia es adsorbida
cuando la temperatura se incrementa.
El tiempo de retencin (tR ) disminuir y los valores de Rf aumentarn. La
desorcin es la separacin de las molculas adsorbidas por el adsorbente.

DISTRIBUCIN O REPARTO
Ocurre un reparto mltiple de la muestra entre dos lquidos o fluidos no miscibles por la diferencia de
solubilidad de los componentes en esas fases. (Ley de distribucin de Nernst)
La fase estacionaria es siempre un lquido inmovilizado de algn modo y la fase mvil puede ser un
lquido o un gas, que la atraviesa con un gran rea de interfase.

C1

C2 : Conc. en fase 2

= k
C2

Ce
=k

C1 : Conc. en fase 1

Cm

Ce: Conc. en fase estacionaria

k : coeficiente de reparto
Cm: Concentracin en fase mvil

ELUCIN DE LOS COMPONENTES DE UNA

MEZCLA

INTERCAMBIO INICO
La FE es una matriz porosa, llamada resina, es un polmero con grupos portadores de
carga elctrica positiva o negativa a la cual estn enlazados los ligandos y a travs de la

cual pasa la fase mvil, la FE retiene el soluto inico pero de signo opuesto, se
intercambia por un proceso irreversible con iones de la FM.
Se denomina intercambio aninico si el analito tiene carga negativa y catinica si tiene

carga positiva.

R+X-

A-

R+A-

X-

C+ R-C+

X+

Resina intercambiadora
aninica

R-X+
Resina intercambiadora
catinica

FILTRACIN EN GEL
Es llamada tambin Cromatografa de permeacin en gel y se basa en la diferencia de tamao
molecular, se usa para compuestos de PM > 2000.
La FE consiste de un fluido contenido dentro de una matriz polimrica tridimensional y porosa
(gel) , cuyos poros no son mayores que un determinado tamao.
Los poros resultan de la formacin de enlaces cruzados formados por una reaccin

qumica entre la cadena del polmero y un reactivo puente, el tamao de los poros puede
disminuirse , incrementando el nmero de enlaces cruzados.

La FM es el fludo que est fuera de la matriz del gel. Las molculas ms grandes de las

sustancias son incapaces de ingresar a los poros y son eluidas primero y las ms
pequeas son retenidas dentro de los poros del gel, requiriendo ms tiempo y solvente
para ser eluidas .

El lmite de exclusin es el tamao mximo de una molcula ( peso molecular), que puede ser
retenida en los poros del gel .

FILTRACIN EN GEL

Caractersticas de las resinas de

Exclusin Molecular clsicas
Nombre

BioGel

Sephadex

Cdigo

P-60
P-100
P-200
P-300
G-50
G-100
G-150
G-200

Rango de Fraccionamiento
(kDa)

3-60
5-100
30-200
60-300
2-30
4-150
5-300
5-600

Flujo mximo
(cm/hr)

5
5
4
3
5
5
3
2

AFINIDAD

AFINIDAD O BIOAFINIDAD

MODALIDADES DE CROMATOGRAFA
CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL
La fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar o hidroflica: slice, almina y la fase mvil es apolar ( hexano,
cloroformo, etc )
Las muestras polares quedan retenidas ms tiempo que las menos polares; es un mtodo apropiado para solutos de
alta y mediana polaridad o para separar ismeros de posicin.
En el mecanismo de separacin pueden ocurrir : Interaccin dipolo dipolo, interacciones de puente hidrgeno,
transferencia de carga.

CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA

La FE es de naturaleza apolar (hidrocarburos C8, C18), mientras la FM es un lquido polar, agua, MeOH, AcN, THF, el
agua acta como carrier. La FM es un solvente polar y un modificador orgnico y se puede agregar aditivos, sales o
buffers. La selectividad del sistema depende del modificador en funcin y su capacidad de aceptar y donar protones.

FASE LIGADA
La fase ligada est formada por un material de base: slicagel, almina, agarosa
copolmero de estireno, que se une qumicamente a un compuesto con un grupo funcional
determinado.
La unin ms frecuente es un enlace covalente tipo siloxano (Si - O - R). Hay tambin

uniones tipo amino (SiNR2), tipo carbono (Si CR3)

Qumicamente la slicagel es un xido de silicio hidratado (SiO2.H2O), sus tomos internos
estn ligados por oxgeno y los superficiales por OH, es fuertemente higroscpica, el
agua es responsable de su inactividad, es insoluble en solventes no polares y muy soluble

en solventes alcalinos.
Su mecanismo de retencin ocurre por la interaccin entre el soluto y la fase ligada, que
puede ser:
Particin: del soluto con FM y FE lquidas
Adsorcin: interaccin con la FE slida
Mixto: particin y adsorcin.

TCNICAS CROMATOGRFICAS
Cromatografa Planar
Se presenta cuando la fase estacionaria est colocada en una superficie plana tridimensional,
aunque una de sus dimensiones es muy reducida, se considera que es bidimensional.
Puede ser:
Cromatografa de Capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC)

Cromatografa de Alta Performance en Capa Fina ( High Performance Thin Layer Chromatography,
HPTLC)
Cromatografa en Papel, CP

El flujo de la fase mvil puede ser por capilaridad ( C. horizontal y ascendente) o por capilaridad y
Gravedad (C. descendente).

Cromatografa en Papel y Capa Fina (TLC)

Sembrado:

Puntiforme

Banda

Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

Cualitativa
x

Identificacin

Pureza

x x

Ausencia

Preparativa

Cuantitativa

x x

TLC o CCD

TLC (Rf)

Adicin de reactivos cromognicos

TLC

HPTLC

CROMATOGRAFA EN PAPEL

EMPAQUETADO
COLUMNA

CROMATOGRAFA EN COLUMNA

APLICACIN
MUESTRA

ELUCIN Y RECOGIDA DE FRACCIONES

RESERVORIO
f. mvil

LECHO
CROMATOGRFICO
f. estacionaria

COLUMNA

MUESTRA
EMPAQUETADO
COLUMNA
FLUJO
gravedad

DIFUSIN
llave

SEPARACIN

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
PERFIL DE ELUCIN
FRACCIONES

ANLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES

Espectrofotomtrico
Abs 280nm Protenas
Otras Abs - Colorantes

respuesta del detector

Molc. distribuida
en f.mvil

fraccin

ETAPAS DE LA CROMATOGRAFA
EN COLUMNA

TERMINOLOGA Y PARMETROS CROMATOGRFICOS

Eluyente : As se denomina a la fase mvil portadora de la muestra
Eluato: es el trmino con el que se define la salida del eluyente
ELUYENTE
(entra)

columna

ELUATO
(sale)

(proceso de ELUCIN
Flujo: mide la velocidad de la fase mvil, se expresa como gasto
en volumen ( ml disolvente/minuto de recorrido de la columna)
o gasto lineal (cm de recorrido/minuto)
CROMATOGRAMA: Grfica que expresa la respuesta del detector
en funcin del tiempo de elucin

Limitaciones de la cromatografa en
Columna abierta

Imposibilidad fsica de aumentar el flujo

Resinas compresibles

Corridas de muchas horas

Grandes volmenes

Descubrimientos que
facilitaron la HPLC
Sntesis

de resinas incompresibles
Nuevas tcnicas en el empaque de
las columnas
Microparticulacin de las resinas
Adelantos en la tecnologa
espectrofotometrica

INSTRUMENTACIN

DIFERENCIAS MS SIGNIFICATIVAS ENTRE

CL A PRESIN Y CL POR GRAVEDAD
Tcnica

Tamao
partculas (m)

MP

P (Bar)

Tiempo
(min)

Cromatografa
en Columna

63 - 200

64

CC Flash

40 63

40 mg 2,5 g

0,75

09

CLBP

50 - 120

10 mg 1 g

1 - 10

15 - 20

12

12

cromatografa liquida a baja presin

CLMP

25 - 40

100 mg - g

cromatografa liquida a media presin

HPLC prep

12 15

500 mg g

150

HPLC
semiprep

10

1 50 mg

400

HPLC anal

g a 1 mg

20

10

HPLC ultra alta

presin

1,5 - 3

1000