Salinas Berná, Paloma

Anlisis de interacciones reguladoras en transduccin...
Paloma Salinas Bern
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad d'Alacant. 2003
Anlisis de interacciones reguladoras en transduccin... Paloma Salinas Bern
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Anlisis de interacciones reguladoras en transduccin

de seales de nitrgeno mediante el sistema del doble
hbrido de levaduras
Trabajo realizado en la Divisin de Gentica del Departamento

de Fisiologa, Gentica y Microbiologa de la Universidad de
Alicante, para optar al grado de Doctor en Biologa por la
Licenciada Paloma Salinas Berna
Alicante, 2003
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NV-:'.Fj.
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ASUNCIN CONTRERAS DE VERA, Profesora Titular de

Gentica de la Universidad de Alicante
HAGO CONSTAR:
Que el presente trabajo h a sido realizado bajo mi direccin y

recoge fielmente la labor desarrollada por la Licenciada Paloma
Salinas Berna para optar al Grado de Doctor en Biologa.
Alicante, Noviembre de 2003
Agradec
mientos
A Asuncin Contreras, por confiar en m capacidad para llevar a cabo este

trabajo. Por su dedicacin y entusiasmo por este proyecto desde el primer al
ltimo momento.
A Rafael Maldonado, Jos Martn Nieto e Ignacio Luque, por permitirme
aprender de su amplia experiencia. Por su ayuda durante los aos de
laboratorio y por soportar pacientemente mis largas discusiones y "comeduras
de coco".
A Isabel Martnez y Mara Luisa Cayuela, por su constante apoyo dentro del
laboratorio y por todos los momentos compartidos fuera de el. Gracias a
vosotras, las horas de laboratorio se hicieron ms amenas. Me habis ayudado
a aprender muchas cosas, tanto a nivel profesional y cientfico como a nivel
personal.
A Inma Fuentes por su inestimable ayuda tcnica y por su entusiasmo
constante por el trabajo (incluso el rutinario y aburrido!). Sin las largas
charlas que hemos compartido y las sesiones de "despeje" (a costa de nuestros
pobres bolsillos) los ltimos aos no habran estado tan llenos de buenos
recuerdos. No cambies nunca!
A ms compaeros y vecinos del laboratorio de al lado. Por compartir penas,
quejas, malos ratos, experimentos fallidos, algn que otro reactivo y,
sobretodo, buenos cafs y buena msica. A Fernando y Arantxa, porque sois
nicos. S que vais a llegar lejos!!!
A Elena, por compartir los ltimos cinco aos de trabajo, charlas, y buenos
recuerdos. Empezamos siendo slo dos en el laboratorio y mira cuanta gente
hay ahora! Por haber estado siempre ah para escuchar mis largos rollos
delante de u n caf. Se que conseguirs todo lo que te propongas.
Al Dr. Martin Drummond y a su grupo en el John Innes Centre (Norwich), por
acogerme durante una brevsima estancia en su laboratorio. Por su paciencia,
entusiasmo y apoyo en el trabajo que realic all. Fue u n a experiencia

enriquecedora a nivel cientfico y personal.
A mis amigos de siempre. J u n t o a vosotros empec mi andadura universitaria.
Porque se que a pesar de que nuestros caminos hayan tomado rumbos
diferentes siempre estis al otro lado del telfono o del correo electrnico, sea
la hora que sea y pase lo que pase. Entonces ya erais, y segus sindolo, como
el viento que ayuda a sostener mis alas.
A mi familia, por su apoyo incondicional y su cario.
A mis hermanos, porque se que siempre estn ah, (aunque a veces no lo
parezca o yo no sepa verlo). Espero que sigis poco a poco encontrando
vuestro sitio en este mundo (creo que empezis a ir por buen camino!).
A mis padres, porque me han enseado casi todo lo que se. Por haberme
inculcado el afn por conseguir todo con mi propio esfuerzo. Y por haberme
dado, con su educacin y ejemplo, los dos mejores regalos que puede tener
u n a persona: unas slidas races sobre las que basarme y unas fuertes alas
para poder volar.
A Jos. Llegaste en el momento ms complicado, cuando todo era u n remolino
en mi cabeza que no saba deshacer. Me diste la paz y la serenidad necesarias
para saber encajar todas las piezas en su sitio y llevar este barco a buen
puerto. No se que me depara el camino que ahora se abre ante mi. Pero se
que, me lleve a donde me lleve, quiero andarlo contigo.
-Hijo mo -dijo el padre-. Para volar, hay que

crear el espacio de aire libre necesario para
que las alas se desplieguen. Es como tirarse en
paracadas: necesitas cierta altura antes de
saltar.
Para
volar
hay
que
empezar
asumiendo
riesgos. Si no quieres, lo mejor quizs sea

resignarse y seguir caminando para siempre.
Jorge Bucay
Djame que te cuente...
ndice
Introduccin
1. Transduccin de seales y sistemas de dos componentes.
1.1. Los sistemas de dos componentes en la era genmica
1.2. Regulacin.
1.3. Organizacin y mecanismo.
1.4. Relacin estructura-funcin en histidina quinasas.
1.5. Relacin estructura-funcin en reguladores de respuesta.
2. Regulacin de la asimilacin del nitrgeno.
2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.
2.2. Relacin estructura-funcin en el sistema de dos componentes
NtrB/NtrC.
2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en Klebiella
pneumoniae y Azotobacter
vinelandit
3. El sistema del doble hbrido de levaduras y transduccin de seales en

bacterias.
3.1. El problema biolgico: Interacciones entre protenas.
3.2. El sistema del doble hbrido de levaduras. Variantes y
secuelas
3.3. Contribucin de las herramientas doble-hbrido al estudio de
la transduccin de seales en bacterias
3.4. Ensayos doble hbrido: Consideraciones generales.
Objetivos
Materiales
Mtodos
1. Estirpes y plsmidos.
2. Medios y condiciones de cultivo.
2.1.Cultivo de bacterias.
2.2. Cultivo de levaduras.
3. Procedimientos de obtencin, manipulacin, clonacin y seleccin de
molculas de DNA recornbinante.
3.1. Aislamiento de DNA de microorganismos.
3.1.1. Obtencin de DNA genmico de Azotobacter
vineland.
ndice
3.1.2. Obtencin de minipreparaciones de DNA de S. cerevisiae.

3.2. Fragmentacin de DNA genmico medante sonicacin.
3.3. Tratamiento enzimtico de DNA.
3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificacin del DNA.
3.3.2. Reparacin de extremos de DNA.
3.3.3. Comprobacin por PCR de fragmentos clonados.
3.4. Construccin de fusiones a dominios de GAL4 de AnfA y VnfA de A.
vinelandii.
3.5. Construccin de u n plsmido para la sobreexpresin de AspA91-312
4. Obtencin y conservacin de genotecas doble hbrido en S. cerevisiae
PJ696.
Resultados
Discusin
1. Interacciones moleculares mediadas por NtrB, NtrC y sus dominios.

1.1. Diseo de protenas de fusin y anlisis doble hbrido.
1.2. Interacciones NtrC-NtrC.
1.3. Interacciones NtrB-NtrB.
1.4. Interacciones NtrB-NtrC.
1.5. Interacciones NtrB-GlnB.
Anexo I
Anexo II
2. Interacciones entre los activadores parlogos NfA, AnfA y VnfA de A.
vinelandii.
3. Identificacin de protenas implicadas en transduccin de seales de
nitrgeno.
3.1. Fragmentacin del genoma de A. vinelandii por sonicacin.
3.2. Construccin genotecas >Sau3AI de E. coli.
3.3. Escrutinios de genotecas Sau3AI de E. coli con NtrB como cebo.
3.3.1. Interacciones NtrB-GlnK.
3.3.2. Interacciones NtrB-AspA.
3.4. Escrutinios de genotecas Sau3AI E. coli con GlnB como cebo.
3.5. Construccin de genotecas Tsp5091 de E. coli
3.6. Construccin de genotecas Sau3AI y Tsp509I de K. pneumoniae.
3.7. Escrutinios doble hbrido por conjugacin.
ndice
Anexo III
Conclusiones
Bibliografa
Introduccin
13
introduccin
1, Transduccin de seales y sistemas de dos

componentes.
1.1. Los sistemas
de dos componentes
en la
era
genmica.
Con la aparicin de los programas de anlisis de secuencias, se puso de
manifiesto
una
sorprendente
relacin
entre
protenas
bacterianas
aparentemente no relacionadas (Drummond et al, 19S6; Kofoid & Parkinson,

1988; Nixon et al, 1986). Estas protenas estaban implicadas en el control de
procesos como el metabolismo del nitrgeno en enterobacterias, la quimiotaxis
en E. coli y la esporulacin en B, subtilis. Se clasificaron en dos grandes
familias: sensores y reguladores, entre las que la transmisin de la seal se
realiza a travs de u n mecanismo conservado de transferencia de grupos
fosfato. A diferencia de los entonces mucho mejor conocidos sistemas
eucariticos, la fosforilacin implicaba residuos His y Asp, en lugar de Ser/Thr
o Tyr. El trmino "sistema de dos componentes" se acu entonces para
referirse a este nuevo tipo de sistemas de regulacin, en los que cada pareja de
sensor y regulador {ms tarde denominado regulador de respuesta) constituye
la unidad bsica del sistema de regulacin (Gross et al, 1989; Stock et al,
1989; Stock et al., 1990). La secuenciacin de genomas completos y su
posterior anlisis han aportado u n a gran cantidad de informacin en cuanto a
diversidad y distribucin biolgica de estos sistemas de transduccin de
seales, que, aunque presentes en los tres dominios, son mucho ms
abundantes en Eubacteria que en Arehaea y Eukarya.
En bacterias, donde ms importancia relativa adquieren estos sistemas,
su nmero puede variar considerablemente y refleja en buena medida la
necesidad de responder a ambientes cambiantes, y por tanto su capacidad de
adaptacin. As, en Escherichia
coli se h a n identificado
62
protenas
pertenecientes a estos sistemas (Mizuno, 1997), 27 en Streptococcus (Throup

et al, 2000) 70 en B. subtilis (Fabret et al, 1999), 80 en Synechocystis
et al,
1996} y ninguna en organismos como Micoplasma
(Mizuno
genitalium
Methanoccoccus jannaschii (Mizuno, 1998). Recientemente, se ha creado u n a

base de datos, que incluye todas las protenas pertenecientes a sistemas de
dos componentes identificadas en los distintos organismos (Maltsev et al,
2002). Los procesos celulares que regulan estos sistemas incluyen adaptacin
metablica a cambios en las fuentes de carbono (Island et al, 1992), nitrgeno
15
Introduccin
{Keener & Kustu, 1988), aceptares de electrones (Lin & Iuchi, 1991) o fosfato
{Wanner & Wilmes-Riesenberg, 1992); respuestas a cambios en la osmolaridad
{Mizuno,
1991), temperatura
o pH; quimiotaxis
(Stock
et al,
2002);
diferenciacin (Shapiro & Losick, 1997; Ward & Zusman, 1997) y esporulacin
(Hoch, 1993; Perego, 1998). Tambin actan regulando procesos de especial
inters sanitario o medioambiental como los relacionados con patognesis
(Groisman & Heffron, 1995), resistencia a antibiticos (Matsushita & Janda,
2002) o establecimiento de simbiosis {Gottfert et al, 1990).
En eucariotas, donde la presencia de estos sistemas de dos componentes
se restringe a levaduras, hongos, protozoos y plantas, los sistemas de dos
componentes identificados estn implicados en osmorregulacin, estrs y
procesos de desarrollo mediados por hormonas (Thomason & Kay, 2000).
Merece la pena destacar la ausencia de este tipo de sistemas en animales, no
habindose encontrado los correspondientes genes en ninguno de los genomas
completos analizados hasta la fecha (1998; Adams et al, 2000; Lander et al,
2001).
1.2. Regulacin.
Con frecuencia
el componente regulador
de u n
sistema de dos
componentes est sometido a autorregulacin, actuando la forma fosforilada

del regulador como activador o represor de su propio opern (Birkey et al.,
1994; Soncini et al, 1995; Ueno-Nishio et al, 1984; Wanner & Chang, 1987).
Por otra parte, dependiendo del tipo de ruta o proceso que controlan, algunos
sistemas de dos componentes producen u n a respuesta del tipo todo o nada,
como el sistema Spo que controla la esporulacin en B. subtilis (Hoch, 1995),
mientras que otros median respuestas ms graduales (Pratt & Silhavy, 1995).
En cualquier caso, las respuestas producidas son dependientes del nivel de
acumulacin del componente regulador fosforilado, que a su vez puede
depender de diversas seales y componentes, que permiten optimizar la
respuesta en funcin de las necesidades de cada sistema concreto. Esta
multiplicidad de mecanismos de regulacin permite la integracin de distintas
seales metabcas, proporcionando u n a importante flexibilidad.
16
Introduccin
1.3. Organizacin y mecanismo.

El nico mecanismo demostrado de comunicacin entre protenas de los
sistemas de dos componentes (Bourret e al., 1991) implica reacciones de
fosforilacin y desfosforilacin entre mdulos altamente conservados. En el
sistema
prototipo,
cada
componente
esta
formado
por
dos
mdulos
funcionales, aunque estos mdulos pueden hallarse en solitario, es decir

constituir el nico dominio de la protena, o en combinacin con otros
mdulos de transferencia de fosfatos, dando lugar a las denominadas histidina
quinasas hbridas (Grebe & Stock, 1999; Wolanin e al, 2002). Esto ltimo
ocurre
en
la
mayora
de
los
sistemas
eucariticos
analizados.
Independientemente de su asociacin con otros, los mdulos conservados se

denominan transmisor y receptor, y se localizan, respectivamente, en la regin
C-terminal de las histidina quinasas y N-termnal de los reguladores de
respuesta "clsicos". Dentro de cada componente, estos dominios conservados
se asocian a otros dominios no relacionados que funcionan como elementos de
entrada (dominio sensor o input} o de salida (dominio efector, regulador u
outpuf,
respectivamente.
El
dominio
input
del
componente
sensor,
generalmente asociado a membrana, acta detectando la seal especfica del

sistema y regulando la actividad del mdulo transmisor conservado, que a su
vez controla la fosforilacin del dominio receptor del regulador de respuesta.
Esta fosforilacin repercute drsticamente en la conformacin de la protena,
alterando la actividad del correspondiente mdulo efector.
El mdulo transmisor del componente sensor posee actividad autoquinasa, lo que le permite catalizar la incorporacin de grupos fosfato desde el
ATP a residuos conservados de histidina presentes en este mismo mdulo. Por
este motivo, los componentes sensores de los sistemas de dos componentes
reciben tambin el nombre de histidina quinasas. El residuo de fosfohistidina
es el sustrato para la transferencia del fosfato al dominio receptor del
regulador en u n a reaccin que parece catalizada por el propio dominio
receptor, al igual que la desfosforilacin (Hess e al, 1988; Lukat e al,, 1992).
En otros casos, la histidina quinasa promueve la rpida desfosforilacin del
dominio receptor en respuesta a seales ambientales (Aiba e al, 1989; Keener
8s Kustu, 1988; Lois e al., 1993). Esta actividad recibe el nombre de actividad
fosfatasa regulada, aunque no est claro si implica u n a actividad cataltica
propia del mdulo transmisor o u n a activacin alostrica de la actividad
autofosfatasa del dominio receptor (Parkinson, 1993). Anlisis genticos y
17
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Introduccin
bioqumicos en diversos sistemas indican que esta actividad juega u n papel

central en la regulacin de la actividad del componente regulador (Stock et al.,
2000). En otros sistemas, la desfosforilacin del componente receptor est
mediada por protenas no relacionadas con las histidina quinasas (Blat &
Eisenbach, 1994; Blat & Eisenbach, 1996; Ohlsen et al, 1994; Perego et al,
1994).
As, pues, las actividades quinasa y fosfatasa
de los sensores y
reguladores de respuesta constituyen la base bioqumica de la transduccin

de la seal en los sistemas de dos componentes. A pesar de la gran cantidad
de anlisis que se han llevado a cabo en algunas de estas protenas, los
mecanismos moleculares operativos en la comunicacin entre los distintos
mdulos, y entre stos y las seales de entrada y salida del sistema continan
siendo en muchos casos desconocidos.
1.4. Relacin estructura-funcin en histidina quinasas.

El mdulo transmisor, de unos 250 aminocidos, presenta u n a serie de
motivos altamente conservados en la superfamilia de las histidina quinasas. El
sitio de fosforilacin, incluido en la regin H, se localiza en posicin N-terminal
respecto del resto de las secuencias conservadas que constituyen las regiones
N, G l , F y G2, denominadas asi por el residuo conservado que define al
corespondente bloque de secuencias (Alex & Simn, 1994; Parkinson &
Kofod, 1992). En todos los casos estudiados, la autofosforilacin tiene lugar
mediante u n
mecanismo de transfosforilacin
entre las unidades
que
constituyen el dmero (Ninfa et al, 1993; Pan et al, 1993; Surette et al, 1996;
Swanson et al., 1993; Wolfe & Stewart, 1993). Los alineamientos de u n a gran
cantidad secuencias han permitido la clasificacin de las histidina quinasas
en 11 subfamilias diferentes (Grebe & Stock, 1999).
Las estructuras tridimensionales de las histidina quinasas EnvZ y CheA,
indican la presencia de dos dominios diferenciados en el mdulo transmisor
(Bilwes et al, 1999; Park et al, 1998). En EnvZ, el dominio fosfotranferasa,
central o de dimerizacin comprende las regiones H y N
y forma u n a
estructura de cuatro hlices {four-helix bundle), a la que cada monmero

contribuye con dos hlices (Tomomori et al, 1999). Por el contrario en CheA,
una
histidina quinasa atpica, la misma
estructura
de 4 hlices
es
monomrica, y cada dmero CheA contiene dos de estas estructuras con sus
correspondientes histidinas fosforilables (Zhou et al, 1995).
19
Introduccin
El segundo dominio del mdulo transmisor es el dominio quinasa o

cataltico, localizado en posicin C-terminal. Las estructuras determinadas
para este dominio en EnvZ y CheA muestran u n a elevada homologa con la
familia GHKL de ATPasas, a la que pertenecen las protenas DNA girasa B,
Hsp90 y MutL (Bilwes et al, 1999; Tanaka et al, 1998). Esta similitud haba
sido previamente observada a nivel de secuencia, fundamentalmente en los
motivos N, G l , F y G2, que conforman el sitio de unin a ATP (Mushegan et
al, 1997).
La organizacin de ambos dominios, fosfotranferasa y cataltico, dentro
de la protena y del dmero implican movimientos de estos dominios uno sobre
el otro para llevar a cabo la autofosforilacin. Algunas evidencias sugieren que
las regiones entre dominios pueden ser importantes para permitir esta
flexibilidad de movimientos.
Las histidna quinasas pueden llevar asociados diferentes tipos de
dominios
sensores,
que
pueden
ser
extracelulares
citoplasmticos,
diseados para interacciones especficas con sus ligandos o estmulos (Dutta

et al, 1999; Galperin et al, 2001; Stock et al, 2000). Esta enorme variedad se
refleja en una muy baja similitud de secuencia y tamao existente entre los
sensores
pertenecientes
distintas
histidna
quinasas.
Los
sensores
extracelulares se encuentran conectados al citoplasma y al mdulo transmisor

a travs de u n a o ms regiones transmembrana. Entre los dominios sensores
citoplasmticos, se han identificado en muchos casos la presencia de dominios
tipo PAS o GAF. Estos dominios actan como mdulos de deteccin de
diferentes tipos de seales {luz, potencial redox, etc..) y su funcin suele estar
asociada a la unin de u n cofactor o a interacciones protena-protena (Taylor
&Zrrulin, 1999).
La mayora de las histidna quinasas contienen u n a regin de unos 50
amino cidos con dos segmentos en hlice separados por u n a corta regin ms
compacta, denominada "linker" (o HAMP), que precede a la regin H y que
parece jugar u n papel importante en la transduccin de seales (Appleman et
al, 2003; Aravind & Ponting, 1999; Hsing et al,
1998). Diversos anlisis
mutacionales sugieren su implicacin en u n correcto alineamiento de los

monmeros (Appleman & Stewart, 2003; Hsng et al, 1998; Raivio & Silhavy,
1997). En base a la naturaleza dinmica de estas estructuras, se ha propuesto
u n posible papel en la deteccin de cambios conformacionales producidos en
el dominio sensor y su transmisin al mdulo transmisor (Park & Inouye,
20
Introduccin
1997). La localizacin de la histidina fosforilable cerca del extremo de una

estructura de este tipo sugiere que u n cambio en la conformacin de dicha
estructura podra controlar la accesibilidad de esta histidina al dominio
quinasa, permitiendo la fosforilacin (Hsing e al, 1998).
1.5.
Relacin
estructura-funcin
en
reguladores
de
respuesta.
El dominio que caracteriza a u n regulador de respuesta es el dominio
receptor, que suele tener unos 125 residuos y presenta homologa con las
GTPasas eucariticas (Artymiuk e al, 1990; Chen e al, 1990; Stock e al,
1991). La mayora de los reguladores de respuesta contienen dos dominios: el
dominio receptor conservado en su extremo N-terminal, y u n dominio efector
en su extremo C-terminal. Estos ltimos estn generalmente implicados en
regulacin transcripcional, aunque tambin se conocen algunos ejemplos de
dominios efectores con actividad enzmtica, como es el caso de CheB (Simms
e al, 1985).
Los
reguladores
de
respuesta
que
actan
como
reguladores
transcripcionales pueden clasificarse en tres subfamilias en funcin de la

homologa que presentan en su dominio efector C-terminal. Estas subfamilias
reciben el nombre del regulador representativo de la subfamilia: OmpR, NarL y
NtrC (Gross e al, 1989). Aunque todos ellos contienen motivos de unin a
DNA del tipo hlice-vuelta-hlice, la estructura del dominio que lo contiene es
diferente. Las interacciones que cada regulador de respuesta presenta con la
maquinaria de transcripcin y el mecanismo de activacin de la transcripcin
varan entre componentes de u n a misma subfamilia.
La primera estructura tridimensional obtenida para u n dominio receptor
fue la de la protena CheY, implicada en el control de la quimiotaxis en E. coli,
y que no contiene dominios efectores asociados (Stock e al,
1990; Volz,
1993). Todos los dominios receptores cuya estructura ha sido resuelta desde
entonces, y que incluyen a NtrC (Volkman e al, 1995), PhoB (Sola e al,
1999) CheB (Djordjevic e al, 1998), tienen u n a estructura similar a la
determinada para CheY.
Los dominios receptores catalizan la transferencia del grupo fosfato
desde la correspondiente histidina quinasa a su propio residuo de Asp. Esta
autofosforilacin
del dominio receptor tambin
21
puede llevarse a
cabo
introduccin
utilizando como sustrato pequeas molculas donadoras como el acetilfosfato

(Lukat et al, 1992) o, a menos in vitro, a los residuos de fosfohistidina de
histidina quinasas pertenecientes a otros sistemas. Las tasas de fosforilacin
en ambos casos son mucho menores que las obtenidas utilizando como
sustrato su correspondiente histidina quinasa (Fisher et al, 1996; McCleary,
1996).
En la mayora de los casos, los dominios receptores catalizan su propia
desfosforilacin
con
eficiencias
que
difieren
considerablemente
de
un
regulador a otro, con oscilaciones en el tiempo de vida medio de la forma

fosforilada de entre segundos y horas. Estas diferencias reflejaran
las
necesidades propias de cada sistema.

Los estudios genticos, bioqumicos y biofisicos llevados a cabo con
diferentes reguladores ha permitido elaborar hiptesis para explicar la
transduccin de las seales intramoleculares. Los reguladores de respuesta se
encontraran en equilibrio entre dos estados conformacionales alternativos:
inactivo y activo. La fosforilacin del dominio receptor provocara u n cambio
conformacional que desplaza este equilibrio hacia la forma activa (Birck et al.,
1999; Halkides et al, 2000; Kern et al, 1999; Lewis et al, 1999; Nohaile et al,
1997; Zhu et al, 1997). Las regiones alteradas tras la fosforilacin coinciden
con
las
superficies
previamente
identificadas
por
su
implicacin
en
interacciones protena-protena y difieren de u n regulador a otro. Las

consecuencias de estas interacciones intramoleculares tambin pueden ser
muy diferentes. En algunos casos se modifican regiones implicadas en la
interaccin con sus correspondientes histidina quinasas u otras protenas
auxiliares que controlan la actividad de los reguladores de respuesta. En otros
casos, la fosforilacin promueve la dimerizacin u oligomerizacin de la
protena,
requerida para alguna
de sus
actividades, la liberacin
de
interacciones inhibitorias o la regulacin de la actividad enzimtica.
2. Regulacin de la asimilacin de nitrgeno.

2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.
En enterobacterias, la actividad de la glutamina sintetasa {GS) y de otros
enzimas importantes en la asimilacin de nitrgeno est regulada de acuerdo
con la disponibilidad de fuentes de nitrgeno, entre las cuales el amonio es la
que permite la mayor velocidad de crecimiento. La GS y en general las
22
introduccin
protenas implicadas en el transporte y catabolismo de fuentes alternativas de

nitrgeno se sintetizan a bajos niveles cuando dicho nutriente es abundante, y
a altos niveles en ausencia o escasez de amonio (Kustu et al, 1979; Merrick &
Edwards, 1995; Neidhardt & Magasanik, 1957; Pahel, Rothstein & Magasanik,
1982; Prival & Magasanik, 1971).
Los genes implicados en la asimilacin de fuentes alternativas de
nitrgeno se agrupan en varios operones ntr (de nitrogen regulation), que en
conjunto se conocen como el reguin Ntr. Este reguin incluye sistemas de
movilizacin y transporte de aminocidos como glutamina (glnHPQ), arginina
(argT) o histidina (hisJQMP), genes implicados en la asimilacin de nitrato y
nitrito (nasFEDCBA) y, en K. pneumoniae,
los genes reguladores de la fijacin
de nitrgeno atmosfrico (nifLA) (Ninfa et al,
2000; Reitzer, 2003). La
expresin de estos operones est regulada por el sistema de dos componentes

NtrB/NtrC. La histidina quinasa NtrB (tambin llamada NRII) est codificada
por el gen ntrB (glnL) y el regulador de respuesta NtrC (NRI) por el gen ntrC
(glnQ.
En condiciones limitantes de amonio, NtrB fosforla
al
regulador
transcripcional NtrC, mientras que en condiciones de exceso de nitrgeno

promueve su desfosforilacin. La protena activa (NtrC-P) regula positivamente
al conjunto de promotores ntr, que tienen en comn la presencia de
secuencias
UAS (de
Upstream
intensificadoras o enhancers,
Activator
sequence),
tambin
llamadas
localizadas a cierta distancia del inicio de la
transcripcin. Estos promotores dependen para su actividad de NtrC-P, que

reconoce u n a secuencia consenso centrada a 100-150 pb aguas arriba del
inicio de la transcripcin, y de la RNA polimerasa cargada con el factor sigma
alternativo a 54 (Ea54) (Hirschman et al, 1985; Ninfa, Reitzer & Magasanik,
1987; Reitzer & Magasanik, 1986; Reitzer, Movsas & Magasanik, 1989). Los
promotores dependientes de Ea 54 presentan secuencias consenso centradas a
-12 y -24 con respecto al inicio de la transcripcin en +1, mientras que la
inmensa mayora de los promotores de enterobacterias estn definidos por
secuencias consenso a -10 y -35 (Merrick, 1993).
Los genes ntrB y ntrC comparten opern con glnA, el gen estructural de
la glutamina sintetasa, y enzima clave en la asimilacin de nitrgeno. Estos
tres genes se transcriben en el orden glnA, ntrB, ntrC (Esphi et al, 1982) a
partir de tres promotores distintos: glnApl, glnAp2 y ntrB (Pahel et al, 1982).
Las dos primeros estn situados aguas arriba del gen glnA y el tercero se
23
Introduccin
encuentra entre los genes glnA y ntrB. En condiciones de exceso de amonio,

tiene lugar u n a expresin basal del opern a partir de los promotores glnApl y
ntrB. Estos son promotores tpicos, dependientes del factor de iniciacin
transcripcional 0 70 (Retzer & Magasanik,
1985) y estn
negativamente
regulados por NtrC (Ueno-Nishio et al, 1984). En condiciones de carencia de

amonio, la transcripcin se realiza a partir del promotor glnAp2, dependiente
de cr54 y NtrC, lo que permitte la amplificacin de la seal correspondiente
(Hunt & Magasanik, 1985; Reitzer & Magasanik, 1985).
A diferencia de otros sistemas de dos componentes, la histidina quinasa
NtrB no detecta directamente la seal, sino que le es comunicada por las
protenas trimricas PII, codificadas por los genes parlogos glnBy glnK. Tanto
GlnB como GlnK son modificados por la enzima UTasa/UR, producto del gen
glnD, en
funcin
de la
concentracin
intracelular
de glutamina.
En
condiciones de escasez de nitrgeno (baja concentracin de glutamina), la

UTasa uridilila a GlnB y GlnK, mientras que en condiciones de exceso de
nitrgeno cataliza la reaccin contraria (Arcondeguy et al, 2001). Las formas
no uridililadas
de las protenas
PII inhiben
ligeramente
la
actividad
autoquinasa e inducen la actividad fosfatasa de NtrB (Atkinson & Ninfa, 1999;

Jiang & Ninfa, 1999; Jiang et al, 2000). Este efecto resulta en la rpida
desfosforilacin de NtrC-P {Kamberov et al, 1995). En ausencia de protenas
PII, o en presencia de sus formas modificadas (GlnB-UMP y/o GlnK-UMP),
prevalece la actividad quinasa de NtrB (Jiang e al, 2000). A pesar de sus
funciones comunes, el papel fisiolgico de las protenas GlnB y glnK difiere
debido a sus diferentes patrones de expresin (Atkinson et al, 2002). Por otra
parte,
las
protenas
PII forman
heterotrmeros
estables,
aunque
propiedades distintas de los homotrmeros, que han sido puestas
con
de
manifiesto tanto in vitro como in vivo {Forchhammer et al, 1999; van Heeswijk
et al, 2000 y datos sin publicar). La formacin de heterotrmeros aade por
tanto nuevas sutilezas a la regulacin dependiente de nitrgeno (van Heeswijk
et al, 2000).
Adems de en el control transcripcional del reguin Ntr, las protenas PII
juegan u n papel clave en el control de la actividad glutamina sintetasa (GS).
Esta
regulacin
la
ejercen
travs
de
la
ATasa
adeniltransferasa/adenilremovasa, codificada por glnE. Las actividades de la

ATasa son reguladas en funcin del grado de uridililacin de las protenas PII
24
Introduccin
(Jaggi et al, 1997). La adenilacin de la GS resulta en una rpida inactivacin

del enzima (Rhee et al, 1985; Rhee et al, 1989).
Las interacciones
clave
en
las
que
participan
los
componentes
reguladores de la asimilacin de nitrgeno en enterobacterias se resumen

esquemticamente en la Figura 2
ATasa
glutamina
UTasa\\
GlnB
PII
GlnK
i!
/
1 NtrB(P)l NtrC(P)
oxoglutarato
S^
*/
Qenes
aen
ntr
nifA
Figura 2. Regulacin de la asimilacin de nitrgeno en K.

pneumoniae.
Los detalles se describen en el texto.
2.2. Relacin estructura funcin en el sistema de dos

componentes NtrB/NtrC.
NtrB es una protena de 369 aminocidos, cuya organizacin modular se
representa esquemticamente en la Figura 3. La regin N-terminal de NtrB,
bastante diferente a las de la mayora de las histidina quinasas, es esencial en
la regulacin de las actividades quinasa y fosfatasa de NtrB. En esta regin, y
en particular en el linker que precede al sitio de fosforilacin, se localizan la
mayora de las mutaciones reguladoras (Ninfa et al, 1995; Pioszak & Ninfa,
2003a). En el extremo N-terminal se localiza u n a regin con homologa a los
recientemente identificados dominios PAS, implicados en la unin de ligandos
reguladores y en interacciones protena-protena.
El mdulo transmisor conservado presenta una organizacin tpica,
estando compuesto por dos dominios estructurales y funcionales. El dominio
central o fosfotransferasa contiene el sitio de autofosforilacin His-139 y el
dominio C-terminal, quinasa o cataltico contiene el resto de los motivos de
secuencia conservados (Kramer 85 Weiss, 1999; Jiang et al, 2000; Kramer &
25

iniroclucx-io::
Vv'eiss. i999). La autofosforilacin

s u b u n i d a d e s (Ninfa et ai.
de NtrB implica transfosforilacin
entre
1993). En condiciones de deficiencia de nitrgeno.
NtrB promueve la transferencia del grupo fosfato desde su residuo de h i s t i c m a

al residuo Asp54 del domino receptor de NtrC. m i e n t r a s que en suficiencia de
nitrgeno promueve la desfosforilacin
de NtrC a travs de su
actividad
fosfatasa. Ensayos con derivados t r u n c a d o s indican que esta actividad reside

en
el
dominio
central
sugieren
que
es
necesaria
una
determinada
conformacin ce dicho dominio p a r a inducirla. La actividad fosfatasa ce NtrB.

que r x es u n a reversin de la reaccin de transferencia, de fosfato es el blanco
principal cic las protenas PII (Jiang et ai.
2000: Pioszak & Ninfa. 2003a:
Pioszak & Ninfa. 2003b).

El reguiador de r e s p u e s t a NtrC pertenece a la subfamilia de activadores
trar.scripcicnales dependientes de a 5 : (Kustu et ai.
proteir.a cimrica en la que se distinguen
funcionales
1989:. Se t r a t a ele u n a
tres dominios estructurales v
Figura. 3: ;Drummond et ai. 1986). El dominio N-termmal de 123
aminocidos es el mdulo receptor conservado, fosforilado por NtrB en Asp-5-1El dominio centra.! interacciona con el complejo
transcripeior.al
E~ :
contiene un motivo de unin a ATP (Morctt & Segovia. 1993: O s u n a . Soberon

& Morett. 1997.. El dominio C-tcrminal contiene u n motive H-'i'-i: -ce E'exv
T:.n:-Iielix o hlice-giro-hlice necesario p a r a la unin a ENA Ccntrerax &
Drummonci. 19SS y es tambin necesario p a r a la dimenzacin de NtrC Portcr
et ai. 1993: Shiau. Chcn & Reitzer. 1993).
La fosforilacin
enhancer
de NtrC a u m e n t a la coopcratividac en su tmir. al
en el DNA ;Chen & Reitzer. 1995: Portcr et ai.
1993' Wciss ?:, ai.
1991'. estimula la actividad ATPasa e induce la formacin de oiigmercs sobre

los sitios de unin a 1DNA (Hwang et ai.
ai.
1999: VVeiss et ai.. 1992: IVyman et
1997'. Mientras que la capacidad de represin reside en el dominio ele
unin a ENE iContreras & Drummonci. 1988: Erummonci et ai.
199C:. la
funcin activacora requiere los tres dominios de la protena Erummonxl el ai.

1990, y es notablemente m s compleja. nicamente la forma fosfonlaxla de
NtrC es capaz de activar la transcripcin (Ninfa & Magasanik. 1986:.
26

Introduccin
x x -
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c =
c o o
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-3 5;
C -o
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27

r.iroiurci::
2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en

Klebsiella pneumoniae y Azotobacter
La capacidad
de fijar
nitrgeno
atmosfrico
uinelandii.
supone
un
alio
coste
energtico, que unido a la sensibilidad de la enzima nitrogenasa al oxigene,

obliga a u n estricto control de los genes correspondientes (genes nifl. La
regulacin
organismos
ele estos procesos h a sido ampliamente

modelo,
entre
ellos
K. pneumoniae,
estudiada
en
enterobacteria
vares
que
fija
nitrgeno en anaerobiosis. y A. uinelandii, u n aerobio estricto.

Tanto en K. pneumoniae
como en A. uinelandii,
la expresin de los genes
.".;/" es dependiente del regulador transcripcional NifA. codificado por nifA. que
comparte operon con el gen nifL. En condiciones de exceso de nitrgeno y
presencia de oxgeno. NifL forma un complejo proteico con NifA inhibiendo su
actividad. La formacin de este complejo NifLA e s t m o d u l a d a por cambios
redox e interaccin con ligandos y otras protenas reguladoras (Schmitz el al..
2002:.
Las protenas NifL p r e s e n t a n uno o dos dominios PAS en su regin Xtcrmina'. en K. pneumoniae
o .4. uinelandii.
respectivamente.. irr.pLca.doiS en
la deteccin del estado redox m e d i a n t e la unin a u n cofactor LAD HL1 ez al.

1996:
Schrnnz.
1997).
Los
dominios
C-terminal
de
las
protenas
Nifl..
comparten homologa con histidina q u i n a s a s , a u n q u e no estn implicados en

transferencia de fosfato (Blanco et al, 1993; D r u m m o n d & Wootton. 1987) El
dominio C-terminal de NifL de A. uinelandii
(Soderback et al.
es capaz de unir
nucletidos
1998). m i e n t r a s que no se h a demostrado ic mismo en el
caso de NifL ele K. pneumoniae
(Klopprogge et al, 2002).
Las protenas NifA comparten homologa en s u s dominios centra, y Cternninal con reguladores transcripcionales dependientes ce factor stgma 5 ceme XtrC Lvoreit & Buck. 1988; Morett et al.
1988: Studholme & Dixon.
20031. En su regin N-terminal p r e s e n t a n u n dominio GAF. que h a sido

relacionado con la regulacin de NifA en r e s p u e s t a a oxgeno.
La regulacin de la activacin de NifA en funcin de ia disponibiicia de
nitrgeno se realiza a travs de la protena GlnK ; a u n q u e el mecanismo difiere
en Celda organismo. En K. pneumoniae.
een condiciones ce ausencia
de
nitrgeno. NtrC-? activa la expresin de GlnK. La interaccin de Glr.X con el

complejo XifLA promueve su disociacin, permitiendo la activacin de XifA 1-1 c
28
Introduccin
et ai, 1998; Jack et al, 1999). En el caso de A. vinelandii, donde la expresin

de GlnK es constitutiva (Colnaghi et ai, 2001; Meletzus et al, 1998), la forma
no modificada de GlnK promueve la formacin de u n complejo ternario
inhibitorio de la actividad de NifA. En condiciones de falta de nitrgeno, la
modificacin de GlnK promueve la liberacin del complejo y la activacin de
NifA.
En A. vinelandii, existen tres nitrogenasas alternativas que contienen
diferentes cofactores. La expresin de los genes correspondientes requiere
activadores especficos. Asi, NifA activa la expresin de la nitrogenasa de
hierro y molibdeno, mientras que sus parlogos VnfA y AnfA activan la sntesis
de las nitrogenasas de hierro y vanadio y hierro solo, respectivamente (Joerger
et ai, 1989}. Algunos genes nif pueden ser activados transcripcionalmente por
cualquiera de los tres reguladores. La presencia en dichos promotores de sitios
de unin solapados para los tres reguladores puede implicar la existencia de
interacciones moleculares entre ellos, que jugaran u n papel en el control de
estos genes en las distintas situaciones fisiolgicas (Drummond et ai, 1996).
3. El sistema del doble hbrido de levaduras y

transduccin de seales en bacterias.
3.1. El problema biolgico: Interacciones entre protenas.
Las interacciones pro tena-pro tena y su especificidad son fundamentales
en los ms variados procesos
estructuras
celulares,
complejos
biolgicos, incluyendo
enzimticos y otras
la formacin
asociaciones
de
ms
transitorias y no exentas de complejidad, como las que pueden tener lugar

entre protenas implicadas en transduccin
de seales. Puesto que la
supervivencia de las bacterias depende en buena medida de la capacidad de

detectar e integrar estmulos ambientales para producir u n a respuesta celular
apropiada, el estudio de las interacciones que tienen lugar entre componentes
de las rutas de transduccin de seales es fundamental para entender las
estrategias de adaptacin de los microorganismos.
La complejidad de los procesos de transduccin de seales se sustenta,
en gran parte, en la multifuncionalidad de las protenas implicadas en estos
procesos. Esta multifuncionalidad puede ser un reflejo de las actividades de
los diferentes dominios de la protena, pero tambin de la interaccin u n
29
Introduccin
mismo dominio con diferentes componentes celulares. Esto explicara el efecto

pleiotrpico de muchas mutaciones en este tipo de genes. La existencia de
redundancia
de
funciones,
su
vez,
complicara
la
correspondiente
adscripcin fenotpica de los mutantes (Schaechter, 2001). La visin "lineal",

en la que la amplificacin de u n a seal a travs de actividades catalticas
sucesivas conduce a u n a respuesta celular, ha dado paso a u n a visin ms
interactiva en la que las protenas reguladoras de u n a ruta modulan su
actividad en funcin de interacciones con otros reguladores y componentes
celulares. Diferentes seales pueden as converger en elementos comunes o
ser anuladas o amplificadas, en funcin de la actividad de los distintos
componentes celulares, permitiendo u n a regulacin coordinada y flexible en
funcin de las condiciones ambientales. Por todo ello, ms que de rutas habra
que hablar de redes de transduccin de seales.
3.2, El sistema del doble hbrido de levaduras. Variantes

y secuelas.
En la dcada de los ochenta se describi la organizacin modular de los
reguladores
transcripcionales
eucariticos, constituidos por dominios
de
activacin (AD, de Activation Domain) y dominios de unin a DNA (BD, de

Binding Domain)(Keegan,
GUI & Ptashne, 1986; Ma & Ptashne, 1987a; Ma &
Ptashne, 1987b). Esta separacin de funciones fue elegantemente demostrada

en experimentos de intercambio entre el dominio de activacin de la protena
GAL4 de S. cerevisiae y el represor de LexA de E. coli, compuesto por un solo
dominio de unin a DNA (Brent & Ptashne, 1985) y posteriormente confirmada
con ejemplos en los que los mdulos AD y BD son proporcionados por
protenas diferentes (Ptashne, 1988; Triezenberg, Kingsbury & McKnight,
1988a; Triezenberg, LaMarco & McKnight, 1988b). Estos experimentos fueron
la base para el desarrollo de u n a nueva metodologa en el estudio de las
interacciones protena-protena in vivo: el sistema del doble hbrido de
levaduras (Fields & Song, 1989). En este sistema, los mdulos AD y BD son
acercados mediante la interaccin entre las protenas a las que h a n sido
fusionados (Figura 4). Esta interaccin da lugar a la activacin de genes
testigos, en los que promotores dependientes del dominio BD utilizado han
sido fusionados a genes cuya actividad es fcilmente detectable. Segn el tipo
de genes testigo presentes en las cepas de levaduras empleadas (tpicamente
30
Introduccin
a)
UASf
b)
*** r
Gar//
c)
d)
" . . .
- l
Figura 4. Deteccin de interacciones moleculares mediante el sistema
del doble hibrido. a) La activacin del promotor gall por la protena modular
Gal4 requiere la unin a DNA del dominio BD y la interaccin con la RNA
Polimerasa II medate el dominio AD. b) La fusin del dominio BD a la
protena de inters X no activa la transcripcin, c) La fusin entre el dominio
AD y la protena Y tampoco activa la transcripcin, d) La expresin
simultanea de ambas protenas de fusin reconstituye la actividad
transcripcional si las protenas X e Y interaccionan entre s.
31

[ni roducciii
u n m a r c a d o r nutricional como HIS3 o el gen lacZ de E. coh). la interaccin

puede
visualizarse
directamente
en
medios
especficos
cuamiearse
mediante determinacin de actividades enzimticas.

Ademas del ya clsico sistema del doble hbrido basado en GAL4, se h a n
desarrollado otros, como los b a s a d o s en LexA y la protcina VP16 del virus del
herpes Vojtek et al.. 1997) o en LexA y B42 de E. coli (Goicmis & Bren;.. 1997i.
En los a o s siguientes a la descripcin de la tcnica, la simplicidad del ensayo
hizo crecer"
rpidamente
s u s aplicaciones. Las variantes de uno o tres hbridos
permiten, respectivamente, el estudio de interacciones DXA-pro:ena
Li &
Fieles. 1993. Wang & Stillman, 1993) o RNA-protena (Putz. Skehe". & Kuhl.
1996 . Las v a n a n t e s '"reversas" permiten la identificacin y el estudio de
mutaciones y molculas que destruyen interacciones protena-protena o DXAprotetia Lcanna & l a n n i n k . 1996; Vidal et al. 1996. Una de las aplicaciones
ms
potentes
es.
sin
duda,
la identificacin
de
protenas
capaces
de
interaccionar con otra de inters, mediante el escrutinio de genotecas ce

expresin.
Ms recientemente, se han desarrollado u n a serie ce sistemas doble
hbrido bacterianos. Algunos de estos s i s t e m a s estn b a s a d o s , de m a n e r a
homologa a ios sistemas de levaduras, en la obtencin
de
reguladores
t r a n s c n p c i o n a l e s hbridos, tanto represores (Hu et al. 1990: Kornacker el a'..

1998: Oer:el-Buchheit et al..
1993) como activadores
Jappelli & Brer.r.er. 1998: Kolmar et al.
Dove et al.
1997:
1995). El sistema m s conocido, sin
embargo, se b a s a en la reconstitucin, en u n a estirpe cya
deficiente en
adenilatc ciclasa, de E. coh de la actividad de la enzima aderulato ciclasa ce

Borceteila pertussis (Karimova et al.
1998). A pesar de que estos sistemas
h a n sido aplicados con xito en diversos estudios, su uso no h a sido todava

generalizado y no
procedentes
de
se h a n
escrutinios
publicado,
de
hasta
genotecas.
donde
con
lo
sabemos,
que.
resultados
para.
algunas
aplicaciones, los sisteman bacterianos son todava estrategias "de nesgo" Hu

et al. 2000: Ladant & Karimova. 2000).
3.3. Contribucin de las herramientas doble-hbrido al

estudio de la transduecin de seales en bacterias.
La concentracin
de recursos
en
la investigacin
de s i s t e m a s
de
transduecin de seales relacionada con procesos de desarrollo y cncer, h a
.2
Introduccin
influido en el xito espectacular de las estrategias doble hbrido. Esta

circunstancia, ha hecho que sepamos hoy en da ms sobre las interacciones
protena-protena
en
las complejas
rutas
de transduccin
de
seales
eucarticas que en las mediadas por sistemas de dos componentes en

bacterias.
En investigacin cientfica es comn la utilizacin de sistemas simples
para el estudio de sistemas ms complejos. As, durante dcadas, u n a buena
parte de los conocimientos sobre el funcionamiento de los seres vivos a nivel
molecular han sido obtenidos en E. coli. Esta bacteria y en menor medida la
levadura Saccharomyces
laboratorios
cerevisiae,
son utilizadas de forma rutinaria, en
de todo el mundo, como herramientas
en
el anlisis
manipulacin de genes y genomas de organismos pluricelulares. En el marco

de la Gentica clsica ambos microorganismos han compartido protagonismo
con otros sistemas modelo como Drosopha melanogaster, sometidos a anlisis
genticos cada vez ms sofisticados. Quizs esta lgica, que implica en
muchos casos trabajar con organismos simples para intentar extrapolar a
otros ms complejos, explique el retraso en la aplicacin del sistema del doble
hbrido al estudio de interacciones proteicas en procariotas. Es hecho es que,
tras u n a cierta resistencia a la utilizacin de herramientas
genticas
eucarticas para estudiar procesos biolgicos bacterianos, este tipo de

aproximacin se ha consolidado en la literatura cientfica {Bartel et al., 1996;
Lei et al., 1999; Rain et al., 2001). Es este contexto, la menor complejidad de
los genomas bacterianos y su distancia evolutiva a levaduras implican, al
menos en teora, que el ruido de fondo debido a interacciones
con
componentes endgenos sea menor que con protenas eucariotas. Basndose

en esta premisa, algunos autores sugieren que el uso del sistema de levaduras
sera preferible en el estudio de protenas procariotas, mientras que el sistema
bacteriano sera el ambiente apropiado para el estudio de protena de origen
eucaritico (Hu et al., 2000).
La secuencia genmica de B. coli revela que u n a importante fraccin de
sus hipotticos productos gnicos son todava de funcin desconocida. Los
sistemas doble hbrido permiten obtener informacin sobre estas protenas, a
partir de la identificacin y anlisis de las interacciones en las que participan.
Proporcionan por tanto, herramientas fundamentales en "genmica funcional",
que complementan las aproximaciones genticas y bioqumicas clsicas. En el
contexto
concreto
de
la
transduccin
de
33
seales
de
nitrgeno
en
Introduccin.
enterobacferias, intensamente estudiada, el sistema del doble hbrido de

levaduras, al estar basado en u n a
premisa distinta
(la deteccin
de
interacciones protena-protena), nos permite abordar aspectos como la

identificacin nuevos elementos, de funcin conocida o no, en las redes de
transduccin de seales, as como obtener informacin relevante sobre los
dominios y motivos proteicos implicados en las interacciones detectadas.
3.4. Ensayos doble hbrido: Consideraciones generales.

Actualmente existe u n a gran variedad de vectores y estirpes que
permiten "personalizar" el sistema del doble hbrido para adecuarlo a objetivos
experimentales concretos (Bartel & Fields, 1997; Zhu & Hannon, 2000),
aunque el sistema ms utilizado sigue siendo el basado en el regulador GAL4.
A los componentes bsicos de todos los vectores pueden aadirse elementos
adicionales, que facilitan la deteccin y posteriores estudios de las protenas
de fusin. Estas secuencias, sin embargo, pueden aumentar la probabilidad
de recombinaciones entre los plsmidos en el interior de la levadura, lo que
puede dificultar la deteccin de algunos clones interesantes (falsos negativos),
o generar fusiones capaces de activacin independiente del cebo (falsos
positivos) (Fromont-Racine et al, 1997).
Los distintos tipos de vector permiten diferencias en el nivel de expresin
de las protenas de fusin, en las dianas de restriccin del MCS (sitio de
clonacin mltiple) y en el marcador de seleccin para levaduras. As por
ejemplo, u n elevado nivel de expresin de las protenas de fusin puede
favorecer la deteccin de interacciones dbiles, pero aumenta la probabilidad
de que la protena de fusin expresada resulte txica para la clula. Este
fenmeno, particularmente si afecta a la fusin a utilizar como cebo en los
correspondientes escrutinios, repercute negativamente en el nmero de clones
detectado. La utilizacin los vectores AD y BD con el mismo MCS facilita la
construccin de los dos tipos de fusiones necesarias para la realizacin de
ensayos recprocos, en los que se intercambian los mdulos de GAL4
fusionados a u n a pareja concreta de protenas. La disponibilidad de variantes
que difieran en la pauta de lectura del MCS, a su vez, resulta particularmente
importante en la construccin de genotecas por fragmentacin enzimtica. Por
ltimo, los marcadores de seleccin de levaduras presentes de los vectores
suelen ser de tipo nutricional, y la nica caracterstica a tener en cuenta es
34
Volver al ndice/Tornar a l'ndex
Introduccin
que sean compatibles con la estirpe de levadura seleccionada para realizar los
ensayos.
Los genes testigo ms utilizados en anlisis doble hbrido son aquellos
que permiten u n a seleccin nutricional (ADB2 HIS3), debido a su facilidad de
ensayo. El marcador lacZ es tambin ampliamente utilizado, tanto en ensayos
lquidos (actividad (5-galactosidasa), que producen resultados cuantitativos,
como en placa (X-gal). Las caractersticas del promotor {tipo y repeticiones de
las secuencias UAS) al que se encuentra fusionado el gen testigo permiten
detectar y / o discriminar interacciones ms o menos dbiles.
La presencia en una misma estirpe de varios marcadores de seleccin
bajo el control de diferentes promotores facilita la discriminacin de seales
no derivadas de la interaccin entre las fusiones ensayadas {falsos positivos).
Aunque las causas de la aparicin de este tipo de clones son diveras y no
siempre pueden establecerse (Bai & Elledge, 1997), suelen asociarse a
mutaciones genmicas o a la capacidad de algunas fusiones GAL4AD de
unirse de manera especfica a promotores concretos.
35
Objetivos
37
Objetivos
El objetivo fundamental de este proyecto de investigacin es contribuir

a la comprensin de los mecanismos moleculares implicados en transduccin
de seales de nitrgeno en bacterias mediante la utilizacin del sistema del
doble hbrido de levaduras. El reto estaba en demostrar que u n a herramienta
gentica eucaritica poda utilizarse para aportar informacin en sistemas de
transduccin de seales procariticos y, en particular, en el paradigmtico
sistema de dos componentes NtrBC.
Los objetivos concretos de este trabajo son los siguientes:
1.
Investigar la utilidad del sistema del doble hbrido de levaduras en el

estudio
de
interacciones
moleculares
mediadas
por
protenas
pertenecientes a los sistemas de dos componentes.

2.
Explorar el potencial del sistema del doble hbrido para abordar el

problema de la especificidad y posible comunicacin cruzada entre
histidina quinasas y reguladores de respuesta.
3.
Analizar interacciones intra e intermoleculares en el sistema de dos

componentes NtrB/NtrC.
4.
Analizar interacciones entre NtrB y las protenas que actan aguas arriba
en la ruta de transduccin de seales de nitrgeno (protenas PH).
5.
Construir
y analizar
genotecas
doble
hbrido
encaminadas
la
identificacin de nuevos componentes de las rutas de transduccin de

seales de nitrgeno.
6.
Contribuir a la construccin de u n "nteractoma del nitrgeno" en

enterobacterias.
7.
Caracterizar las posibles nuevas interacciones identificadas.
39
40
Una gran parte de ios resultados obtenidos en esta Tesis Doctora.! han sido
publicados en los tres artculos que se incluyen como anexos. Con el fin de
evitar duplicaciones innecesarias, en la Tesis se hace referencia a las figuras y
tablas de las publicaciones f a la vez que se presenta u n resumen de los
resultados y discusin correspondientes. Por el contrario, se detalla en mayor
profundidad lo relativo a los resultados que, por diversas razones, no han sido
publicados.
Anexo I: Two-hybrid analysis of domain interactions
involving NtrB and
NtrC two-component regulators. Martnez-Argudo, L, Martin-Nieto, J., Salinas,

P., Maldonado, R., Drummond, M. y Contreras, A. Molecular Microbiology
40(1):169-178. 2001.
Anexo II: Domain interactions
on the ntr signal transduction pathway:
two-hybrid analysis of mutant and truncated derivatives of histidine kinase

NtrB. Martnez-Argudo, I., Salinas, P., Maldonado, R., y Contreras, A. Journal
of Bacteriology 184(1): 200-206. 2002.
Anexo III: Identification and analysis of Bscherchia coli proteins that
interact with the histidine kinase NtrB in a yeast two-hybrid system. Salinas,
P. y Contreras, A. Molecular Genetics and Genomics 269:574-581. 2003.
41
Materiales y Mtodos
43
Materiales y Mtodos
La mayora de los procedimientos utilizados en la presente Tesis Doctoral

se hayan descritos con detalle en las publicaciones incluidas como anexos. En
esta seccin se detallan tan slo aquellos procedimientos, estirpes y plsmidos
que no se mencionan en dichos anexos.
1. Estirpes y plsmidos
Estirpe
Referencia/ procedencia
Genotipo
Derivado RiP de UW (ATCC
A. vinelandii
UW136
K.(pneumoniae)
E. coli ET8000
oxytoca M 5 a l
J o h n Innes Centre
Silvestre
rbs lacZy.lSl
gyrA
hut&K
(MacNeil e al, 1982)
(silvestre)
rbs lacZ::lSl
E. coli FT8000
(Bishop & Brill, 1977)
13705)
gyrA hutCPK
(Reyes-Ramirez e al, 2001)
AglnBl G m ' AglnKl
Tabla 1. Estirpes.
Plsmido
Caractersticas
Referencia/procedencia
pTM13
vn#lenpT7.7
John Innes Centre
pTM 14
anfA en pT7.7
John Innes Centre
pTRC99a
Vector expresin inducible por IPTG (Amann e al, 1988)
Tabla 2. Plsmidos.
2. Medios y condiciones de cultivo

2.1. Cultivo de bacterias.
El cultivo de K. pneumoniae
se realiz en medio Luria-Bertani (LB,
(Miller, 1972) a 37 C y con agitacin orbital {220 r.p.m.) en el caso de cultivo

lquido.
45
Materiales y Mtodos
Para analizar el efecto de a sobreexpresin de AspA 91312 en estirpes de E.

coli se utiliz el medio WN. Las soluciones A y B se prepararon y autoclavaron
por separado. La solucin A contiene (por litro) 120 g Tris, 75 mi de HCl
concentrado, 20 g KC1, 6,54 g Na2HPC>4 anhidro y 3,5 g Na2S0 4 . La solucin B
se prepar disolviendo 5 g de MgCb'LbO en 100 mi de agua destilada. Para
preparar 100 mi de placas de medio slido, se mezclaron 90 mi de agua
destilada, 9 mi de solucin A y 1 mi de solucin B, se suplemento con 1,5 g de
agar bacteriolgico y se esteriliz mediante autoclavado. Tras enfriar a 50 C,
se aadi glucosa (20 mg/ml), sulfato amnico {1 mg/ml), glutamina (25
ug/ml), prolina (2 mM), tiamina (0,05 mM), 30 uM IPTG y los antibiticos
correspondientes, en su caso.
El cultivo de A. vinelctnd se realiz en medio BS (Guerrero et al, 1973).
2.2. Cultivo de levaduras.

El cultivo de S. cerevisiae se realiz a 30 C, con agitacin orbital (220
r.p.m.) en el caso de los cultivos lquidos, en medio rico YPD o en medio
mnimo YNB con los suplementos necesarios segn el caso (20 mg/1 de
adenina, 20 mg/1 de histidina, 20 mg/1 de triptfano y / o 100 mg/1 leucina).
En la estirpe PJ696, los ensayos de interaccin entre protenas se realizaron
en medio YNB -Ade e YNB -His con lmM y 5mM de 3-AT.
3. Procedimientos de obtencin,
clonacin
seleccin
de
manipulacin,
molculas
de
DNA
recombinante.
3 . 1 . Aislamiento de DNA de microorganismos.
3.1.1. Obtencin de DNA genmico de Azotobacter
vinelandii.
Las clulas contenidas en 20 mi de u n cultivo de A. vinelandii (DOs40nm

entre 0,6-1) fueron recogidas por centrifugacin a 4.000 r.p.m. durante 4 min.
El precipitado se lav con u n volumen equivalente de NaCl 3%, se volvi a
centrifugar y se resuspendi en 10 mi de tampn TES (2 mM Tris, 90 mM
EDTA pH 8,0, 150 mM NaCl). Las clulas se Usaron mediante adicin de 1,6
mi de SDS 10% e incubacin a 37 C durante 15 min. El DNA presente en el
lisado fue precipitado mediante la adicin de u n a mezcla de 10 mi de etanol
46
Materiales y Mtodos
absoluto y 1,2 mi de acetato de sodio 3 M. Las hebras de DNA que se formaron

fueron extradas de la solucin utilizando u n a pipeta Pasteur de vidrio sellada
a la llama. El DNA recogido en la pipeta se dej secar al aire y se resuspendi
en 3 mi de 0,1 x SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato sdico). Posteriormente, se
aadieron 10 ug/ml de RNAsa y se incub durante 30 min a 37 C. Tras la
adicin de 500 ug/ml de proteasa K se incub a 37 C durante 12-16 horas.
La solucin de DNA fue entonces extrada dos veces con u n volumen
equivalente de fenol:cloroformo, y el DNA precipitado mediante al adicin de
150 ul de acetato de sodio 3 M y 2 mi de etanol absoluto fro. Tras recoger el
precipitado del modo descrito anteriormente, se dej secar y se resuspendi en
100-500 ul de 0,1 x TESL.
3.1.2.
Obtencin
de
minipreparaciones
de
DNA de
S.
cerevisiae.
Tras centrifugar u n volumen de cultivo de S. cerevisiae equivalente a 2 U
de DOeoonm, las clulas se resuspendieron en 200 ul de buffer YLS (300 mM
NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0 y 0,1 % SDS) y transferidas a u n tubo
de 1,7 mi con tapn de rosca (Sorenson). Tras la adicin de 200 ul de bolas de
vidrio
de
0,5
mm
de
dimetro
(Sigma)
200
ul
de
fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1), la suspensin celular fue sometida a

homogenizacin durante 30 seg en u n Mini-BeadBeater (Biospec). Tras
centrifugacin a 5.000 r.p.m. durante 10 min, la fase acuosa fue transferida a
u n tubo eppendorf. El DNA presente en esta solucin fue precipitado mediante
la adicin de 500 ul de etanol absoluto y centrifugacin a 13.000 r.p.m.
durante 20 min a temperatura ambiente. Tras lavar con etanol 70% y dejar
secar al aire, el DNA fue resuspendido en 30 ul de agua ultrapura.
3.2.
Fragmentacin
de
DNA
genmico
mediante
sonicacin.
El DNA genmico de A. vinelandii se fragment utilizando u n sonicador
Soniprep 150 (Sanyo). Muestras de 20 ug de DNA se llevaron a u n volumen de
2 mi mediante al adicin de HoO ultrapura estril, y se sometieron a uno o
varios pulsos de diferente duracin a u n a amplitud de onda de 10 um. Tras
cada pulso, la muestra se introdujo en u n bao de agua-hielo para evitar el
sobrecalentamiento. Tras la aplicacin de los pulsos, u n a alcuota de 100 ul se
47
Materiales y Mtodos
precipit con etanol absoluto y acetato potsico, se dej secar, y se

resuspendi en 10 pil de agua ultrapura estril. Esta alcuota se analiz por
electroforesis
para determinar el rango de tamao de los
fragmentos
producidos y, tras comprobar que el rango de tamao de los fragmentos era el

deseado, el resto de la muestra fue precipitada con etanol absoluto y acetato
potsico. El DNA precipitado se dej secar, se resuspendi en 200 ul de agua
ultrapura estril, y se carg en u n gel de agarosa para su fraccionamiento por
tamaos.
3.3. Tratamiento enzimtico de DNA.

3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificacin del
DNA.
El tratamiento del DNA con enzimas de restriccin y modificacin
(fosfatasa alcalina, quinasa, ligasa, etc..) se realiz siempre siguiendo las
condiciones y tiempos de incubacin indicados por el fabricante, o siguiendo
protocolos estndares (Ausubel et al, 1999; Sambrook e al., 1989)
3 . 3 . 2 . R e p a r a c i n d e e x t r e m o s d e DNA.
En la reparacin de extremos de los fragmentos de DNA obtenidos tras la
sonicacin se utilizaron tres protocolos diferentes que variaban en los tiempos
y condiciones de incubacin, as como en el tipo y cantidad de enzimas
utilizadas.
Protocolo 1; 2 pg de producto de sonicacin se incubaron durante 3
horas a 15 C en u n volumen final de 35 ul que contena 2 ul de dNTPs 0,25
mM, 3 ul de tampn TM {100 mM Tris pH 8,0 y 100 mM MgCl2) y 20 U de DNA
polimerasa de T4 (Invitrogen).
Protocolo 2: 3 ug de producto de sonicacin se incubaron durante 30
60 min a 37 C en u n volumen final de 40 ul que contena 50 mM de acetato
potsico, 20 mM de Tris acetato, 10 mM de ditiotreitol, 1 mM ZnSCU y 120 U
de nucleasa Mung Bean (Amersham Pharmacia Biotech).
Protocolo 3: 3 ug de producto de sonicacin se incubaron durante 30 min
a 37 C en u n volumen final de 40 ul que contena tampn de polimerasa de
T4 (Invitrogen), 2,5 mM dNTPs, 10 U de polimerasa de T4 (Invitrogen) y 10 U
de polimerasa Klenow (Invitrogen).
48
Materiales y Mtodos
Tras c u a l q u i e r a de estos t r a t a m i e n t o s , el DNA fue extrado dos veces con

fenol :cloroformo,
precipitado
con
etanol y
acetato
de
sodio,
secado
r e s u s p e n d i d o en a g u a u l t r a p u r a estril.
3.3.3. Comprobacin por PCR de fragmentos clonados.

La amplificacin de fragmentos clonados en los vectores pGAD424 y
derivados a partir de biomasa de colonias de E. col se realiz en u n a mezcla
de PCR q u e contena 200 uM de c a d a dNTP, 0,4 uM de los cebadores ACT-A
(Anexo I) y ACT-B (5'-CAGTATCTACGATTAATAG-3') y 1 U de la enzima Taq
Polimerasa NEED, en el t a m p n de reaccin s u m i n i s t r a d o p o r el fabricante y
en u n volumen final de 50 ul. Se u s a r o n p u n t a s de plstico estril p a r a
transferir b i o m a s a de los distintos clones (colonias) a analizar a la mezcla de
PCR descrita. Las m u e s t r a s se introdujeron en u n termociclador p r o g r a m a d o
p a r a realizar 30 ciclos con las siguientes fases: desnaturalizacin, i n c u b a c i n
1 min a 95 C; alineamiento, incubacin 1 m i n a 50 C, y polimerizacin,
incubacin 2 min a 72 C. Estos ciclos i b a n precedidos de u n a incubacin
inicial de 4 min a 95 C, y finalizaban con u n a incubacin adicional de 5 m i n
a 72 C, p a s a n d o luego a p e r m a n e c e r a 4 o C por tiempo indefinido. Los
p r o d u c t o s de PCR obtenidos fueron analizados m e d i a n t e electroforesis e n geles
de agarosa.
3.4. Construccin de fusiones a dominios de GAL4 de

AnfA y VnfA de A.
vinelandii
Los fragmentos Ndel-BamH
de los p l s m i d o s pTM13 y pTM14 (Tabla 2),
se clonaron e n los vectores pGAD424-NdeI y pGBT9-NdeI (Anexo II), d a n d o

lugar a los vectores pSBOl (GAL4AD:AnfA), pSB02 (GAL4BD:AnfA),
pSBll
(GAL4AD:VnfA) y pSB12 (GAL4BD:VnfA). Estos p l s m i d o s fueron verificados

por anlisis de restriccin con varias e n z i m a s .
3.5. Construccin de u n plsmido p a r a la sobreexpresin

de AspA91-312
El fragmento SmaifSa
del p U A G S l l (Anexo II} se clon en el vector
pTRC99a digerido con los m i s m o s enzimas. El plsmido p U A G S H E obtenido,

que permite la expresin del polipptido AspA 91-312 bajo el control de u n
49
Materiales y Mtodos
promotor inducble por IPTG, se verific mediante anlisis de restriccin con

varias enzimas.
4. Obtencin y conservacin de genotecas doble

hbrido en S, cerevisiae PJ696.
50 ug de DNA plasmdico de l a / s genoteca/s correspondiente/s se utiliz
para
transformar
S.
cerevisiae
PJ696
mediante
un
protocolo
de
transformacin a gran escala, tal como se describe detalladamente en el

"MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Librarles User Manual" de
Clontech. Varias diluciones de la mezcla de transformacin obtenida se
sembraron en placas de YNB -Leu y se incubaron a 30 C durante 3 das. Las
colonias
resultantes
se utilizaron
para
calcular
el nmero
total
de
transformantes totales.
Para amplificar la genoteca obtenida en levaduras, el resto de la mezcla
de transformacin se sembr en placas de medio YNB -Leu y se incub a 30
C durante 3 das, tras los cuales se aadieron 3 mi de TE estril a cada placa,
se resuspendieron las colonias con ayuda de u n asa de vidrio estril y la
suspensin celular se traspas a u n matraz estril. Este procedimiento se
repiti con cada u n a de las placas sembradas y por duplicado, hasta recoger
toda la biomasa obtenida en la amplificacin de la genoteca. Tras centrifugar a
5000 r.p.m. durante 10 min, las clulas fueron lavadas en TE estril. Tras
centrifugar
de nuevo, las clulas
se resuspendieron
en u n
volumen
equivalente de u n a solucin de glicerol al 65% y 25 mM Tris pH 7,5, se

distribuyeron en alcuotas de 500 ul y los crioviales se almacenaron a -80 C.
Para titular las genotecas congeladas, se descongel u n a alcuota y se
prepararon diluciones seriadas en agua destilada estril. 100 ul de las
diluciones 10-5, 10"6 y 1 0 7 se sembraron en medio YNB -Leu y se incubaron
durante 3 das a 30 C. Las colonias resultantes se contaron para determinar
el nmero de unidades formadoras de colonias por unidad de volumen de
clulas congeladas (ufe/100 ul).
50
Resultados y Discusin
51
xcsU -tcjs . .):srs:6n
1. Interacciones moleculares mediadas por \trB,

NtrC y sus dominios.
1.1. Diseo de protenas de fusin \ anlisis doble
hbrido.
Con el objetivo de investigar las posibilidades del sistema del doble
hbrido de levaduras en el estudio de las interacciones moleculares m e d i a d a s
por proteinas de los s i s t e m a s de dos componentes,
generamos
diversas
fusiones proteicas entre los dominios de GAL4 y las proteinas NtrB y NtrC :y
diversas variantes truncadas) de K. pneumoniae.
En el contexto ele esta tesis
se generaron u n a b u e n a p a n e de los p l s m i c o s que codifican fusiones
polipeptidos derivados de NtrB. que se indican e s q u e m t i c a m e n t e , j u n t o con

los derivados de NtrC utilizados en este trabajo, en la Figura
1. E s t a s
variantes t r u n c a d a s se disearon de acuerdo con la informacin disponible en

su momento sobre la e s t r u c t u r a y funcin de ios c o r r e s p o n d e n t e s mdulos y
dominios Kramer & Weiss. 1999: Porter et al.
muestran,
sobre la
oligonucletidos
secuencia
utilizados
de
ntrB,
como
1993'. En la Figura 2 se
las posiciones
cebadores
para
las
de los
distintos
construcciones
correspondientes. Para el estudio de las interacciones entre NtrB y GinB. se

utilizaron fusiones a dominios de GAL4 de GlnB de K. pneumoniae.
Para
analizar la especificidad de las interacciones, se utilizaron como controles

fusiones a dominios de GAL4 de otras protenas come CheA _. F:r.Z-"::'-: de E.
CG.
\ PhoP de Samonella
typhirnurium.
La secuencia de ios otigoncleudos y
la construccin de ios plsmidos correspondientes se d e s e n o e c>~al"adamentc

en ios anexos 1 y 11.
Para
determinar
la capacidad
de dos
polipeptidos
cualesquiera
de
interaccionar, se ensay, en todos los casos, la expresin de los genes testigo

GAL AlacZ y GAL1:H!S3 en estirpes de S. cereuisiae Y190 mediante ensayos 8gaactosidasa y crecimiento en medio sin histidina, respectivamente. El grado
de crecimiento en medio selectivo se clasific en cuatro categoras Figura 2Al,. Cada pareja de fusiones proteicas a estudio se n o m b r siempre en el
orden GAE-ALYX GAE-3D:Y. abreviado X/V. donde X e Y son
cualquier
poiipptido fusionado a GAL4AD GAL4BD, respectivamente. Ninguna de las

construcciones derivadas ce NtrB o NtrC activ a ios genes testigo por s
misma,
por
le
que
se
excluy
la
posibilidad
construcciones "autoactivara".
53
de
eye
alguna
de
las
Plsmidos
Protena de fusin a
Dominios
Aas.
pUAGll
pUAG12
NtrC
1-469
pUAG31
pUAG32
NtrC R
1-130
pUAGl
pUAG62
NtrC 0
127-381
pUAG21
pUAG22
NtrC D
380-469
NtrB
1-349
pUAG211 pUAG212
pUAG261 pUAG262
pUAG281 pUAG282
pUAG251 pUAG252
pUAG221 PUAG222
>
>
XL
D
1 lili
pUAG291 pUAG292
pUAG301 pUAG302
SHN
1-269
NtrB SH
1-221
NtrB s
1-115
NtrB
4L 1
lili
pUAG331 pUAG332
pUAG311 pUAG312
NtrBHNG
110-349
NtrBH
110-221
NtrB HN
110-269
NtrBNG
221-349
NtrBG
269-349
Figura 1. Representacin esquemtica de las protenas de fusin a NtrB y

NtrC codificadas por los plsmidos utilizados en este estudio. Siguiendo el
cdigo de colores previamente utilizado, los dominios de NtrB se representan en
verde y los de NtrC en rojo. S: dominio "sensor"; H, N y G: motivos del mdulo
transmisor; R: dominio receptor; C: dominio central; D: dominio de unin a
DNA. Los plsmidos impares codifican fusiones a GAL4AD, los pares codifican
fusiones a GAL4BD. Los nmeros de la ltima columna hacen referencia a los
aminocidos de NtrB y NtrC presentes en las protenas de fusin.
54
NTRB-2R
alnA
NTRB--1R
NTRB-5R
ntrB
NTRB-1F
NTKU-1R
ntrC
NTRB-2F
NTRB-8I-'
NTKB-5F
Figura 2. Subclonacin de fragmentos de ntrB. Se esquematiza el gen ntrB y

las secuencias genmicas adyacentes de K. pneumoniae. Los cebadores utilizados
se representan como flechas horizontales orientadas en direccin 5' a 3'.
1.2. Interacciones NtrC-NtrC.

Con el objetivo de investigar si las interacciones conocidas entre
monmeros de NtrC podran detectarse en el sistema del doble hbrido,
analizamos en todas las combinaciones posibles las fusiones a NtrC y sus
variantes truncadas. Los resultados obtenidos con las distintas variantes de
NtrC (Figura 3-AI) indican que las protenas de fusin que contienen el
dominio C-terminal (NtrC y NtrCD), responsable de la dimerizacin de NtrC
(Klose et al, 1994), son estables y retienen la capacidad de reconocerse en
levaduras. Otras interacciones, como las que deben tener lugar entre los
dominios N-terminal (NtrCR) y central (NtrCc) o entre los dominios centrales no
se detectaron. Puesto que las interacciones entre dominios centrales tienen
lugar durante la oligomerizacin de los dmeros, que requiere fosforilacin y
unin a secuencias especficas, es comprensible que estas interacciones no
tengan lugar en nuestras condiciones experimentales. Por otra parte, las
interacciones protena-protena entre los dominios N-terminal y central, que
dependen del estado de (des)fosforilacin, y son fundamentales para la
transmisin de seales intramolecular, podran tambin depender de la
conexin fsica entre ambos dominios. Dado que otros autores han descrito
recientemente interacciones muy dbiles entre los dominios N-terminal y
central de NtrC (Harrod et al, 2003), utilizando construcciones similares a las
usadas aqu aunque con vectores doble-hbrido distintos, el tipo concreto de
protena de fusin y su grado de expresin parecen ser determinantes para la
deteccin de interacciones dbiles.
55
^esui:;K:os v iiscusin
Tomados en conjunto, n u e s t r o s resultados indicaron que el sistema el

doble hbrido utilizado reproduca las interacciones protena-protena
ms
estables entre dominios de NtrC y, por extrapolacin, probablemente tambin

de otras protenas relacionadas.
1.3. Interacciones NtrB-NtrB.

Aunque la e s t r u c t u r a dimrica de NtrB es conocida de hace tiempo (Ninfa
et al.
1993:. ios d e t e r m i n a n t e s de las interacciones entre m o n m e r o s no
haban recibido atencin al comienzo del presente estudio. Por este motive, y
con el fin e obtener informacin sobre los d e t e r m i n a n t e s de dimerizacin en
NtrB, se realizaron a d e m s de las construcciones derivadas de NtrB (Figura 1).
construcciones
de la regin
citoplsmica
de la histidina
quinasa
EnvZ
(EnvZ-;N'G, p a r a utilizarlas como control en los correspondientes ensayos doble

hbrido. Paralelamente se hicieron experimentos in uitro [cross-linkingt
a fin ce
confirma.!" los resultados mediante u n a aproximacin experimental distinta

Para ello se construyeron
s
purificacin de NtrB y NtrB
plsmidos p a r a la posterior sobreexpresin y

r;NG
. y se utilizaron otros previamente c o n s f u i c o s
p a r a la sobreexpresin y purificacin de NtrB y EnvZ HVG (Tabla 1-AI .

Tocias las construcciones de derivados de NtrB que contenan el module
N-terminal. y slo estas, producan seales en el doble hbrido cuando se
ensavaron entre s (Figura 4-AI y Figura 3-AII). Los experimentos de
linking
tambin confirmaron
cross
estos resultados (Figura 6-Ah. sugiricr.de
en
conjunto que los d e t e r m i n a n t e s de la dimerizacin residen en el dominio

'"sensor" ci NtrB. Estos datos c o n c u e r d a n p l e n a m e n t e con los resultados in
uitro obtenidos paralelamente por otros a u t o r e s (Jiang et al, 2000).
La a u s e n c i a de seal entre protenas que contenan sle el modulo
t r a n s m i s o r Ntr3" ; ; G ; o las protenas NtrB H NtrB ; : x contradeca, sin embargo,
ios ciatos que comenzaban a a c u m u l a r s e d u r a n t e el curso de este traba;o con
la histidina q u i n a s a EnvZ (Hidaka et al, 1997; Park et al, 1998; T o m o m o n el
al., 1999!. Estos estudios indicaban que el dominio central (HN. tambin
conocido como dominio de dimerizacin) de EnvZ. v probablemente cic la
mayora
re las
histidina
quinasas.
era. dimerico.
Por
el
contrario,
el
comportamiento de las protenas EnvZ1XG y NtrB HNG fue idntico tanto en ios
ensayos doble hbrido como en los de cross-linking
es decir, las dos protenas
interaccionaban consigo m i s m a s in vitro, pero no en el sistema de levaduras

Figura 5-Al y Figura 3-AII. respectivamente). Por lo tanto, en conjunto los
56
resultados sugieren que el dominio central de NtrB tambin podra ser u n

homodmero, y que el sistema del doble hbrido no es capaz de detectar estas
interacciones. La posibles causas de este fenmeno fueron
exploradas
experimentalmente y discutidas con cierto grado de detalle (Anexo II).
1.4. Interacciones NtrB-NtrC.

Las protenas NtrB y NtrC deben reconocerse para que se produzca la
transferencia
de fosfato necesaria para la transduccin de seales
de
nitrgeno mediada por este sistema de dos componentes. La pregunta que

pretendamos responder es si esta interaccin entre histidina quinasa y
regulador de respuesta era lo suficientemente estable para ser detectada en el
sistema del doble hbrido de levaduras. Y, en el caso de respuesta positiva, si
esta interaccin era especfica. Esta ltima pregunta tena inters en el debate
de la posible comunicacin cruzada entre componentes de distintos sistemas
de transduccin de seales (Hellingwerf e al, 1995; Hellingwerf et al, 1998;
Ninfa et al, 1988). A fin de explorar estas cuestiones, se incorporaron tambin
a los ensayos las protenas CheA (histidina quinasa citoplsmica), EnvZ1*, y
el regulador de respuesta PhoP.
Las protenas
NtrB y NtrC dieron u n a
fuerte
seal
en
ambas
orientaciones (Figura 5-AI), lo que implica que el reconocimiento tambin tiene

lugar entre las protenas de fusin en levaduras. Por el contraro, no se
obtuvieron seales entre NtrB y PhoP, entre NtrC y CheA o EnvZHNG, o entre
PhoP y CheA o EnvZHNG (Figura 2-AI y Figura 4-AII).
Para investigar la posible contribucin de los diferentes dominios de NtrB
y NtrC a la interaccin detectada entre ellas, se ensayaron las diferentes
construcciones de NtrB frente a las variantes de NtrC. Los resultados fueron
concluyentes: los determinantes de las interacciones detectadas entre ambas
protenas se localizan en los mdulos conservados (transmisor y receptor,
Figura 5-AI) y ms concretamente en los dominios directamente implicados en
la transferencia de fosfato, puesto que el dominio central de NtrB es suficiente
para la interaccin con el dominio receptor de NtrC (Figura 4-AII). La
interaccin entre los mdulos transmisor y receptor tambin se detect en
experimentos de cross-linking,
para lo que previamente se sobreexpres y
purific NtrC* (Tabla 1-AI).

Es de sealar que estos resultados suponen la primera demostracin de
que la interaccin fsica entre protenas de sistemas de transduccin se
57
seales procariticos poda detectarse mediante aproximaciones in vivo como

el sistema del doble hbrido de levaduras (Martnez-Argudo et al., 2001).
Aunque estos resultados puedan parecer triviales, torpedearon la visin
imperante hasta entonces de que las interacciones entre los miembros de los
sistemas de dos componentes eran demasiado sutiles y transitorias para
detectarse en el sistema del doble hbrido. La utilidad de este sistema gentico
en el estudio de los sistemas de dos componentes es cada vez ms obvia,
siendo buena prueba de ello la aparicin posterior de trabajos, procedentes de
diversos grupos de investigacin, en los que se aborda tanto el anlisis de
determinantes de interacciones histidina quinasa-regulador de respuesta
{Martnez-Argudo et al, 2002; Ohta & Newton, 2003) como la bsqueda de
nuevos componentes de rutas de transduccin de seales procaritica
(Pawlowski et al, 2003; Rain et al, 2001; Salinas & Contreras, 2003; Zhang &
Inouye, 2002).
1.5. Interacciones NtrB-GlnB.

Las protenas PI de enterobacteras (GlnB y GlnK), regulan las
actividades quinasa y fosfatasa de NtrB (Atkinson & Ninfa, 1998; Atkinson &
Ninfa, 1999; Jiang & Ninfa, 1999; Jiang et al, 2000). NtrB es u n a histidina
quinasa atpica, que representa a u n a de las 11 subfamilias en las que se han
clasificado recientemente estas protenas (Grebe & Stock, 1999). Su mdulo Nterminal no guarda homologa con otros dominios conocidos y, al contrario de
la mayora de las histidina quinasas, no est anclado a membrana. Puesto que
en las histidina quinasas tpicas, el dominio N-terminal detecta la seal
correspondiente, sta era la funcin que se atribua al correspondiente mdulo
de NtrB, que tambin reciba la denominacin de "sensor". Era por tanto
predecible que el dominio N-terminal de NtrB interaccionara directamente con
las protenas PI.
El anlisis mediante el doble hbrido de la interaccin entre GlnB, las
diversas variantes de NtrB y las protenas control NtrC, CheA y EnvZHNG,
indicaron claramente que los determinantes de la interaccin con GlnB se
localizan en el mdulo transmisor de NtrB, siendo estas
altamente
especficas
(Figura
4-AII).
Estos
resultados,
interacciones
en
principio
sorprendentes, fueron ampliamente confirmados por otros autores (Pioszak et

al,
2000), que localizaron ms precisamente los determinantes de la
interaccin con GlnB en el dominio quinasa de NtrB. As pues, el sistema del
58
doble hbrido permita tambin analizar otras interacciones funcionales en el

sistema de transduccin de seales de nitrgeno.
El descubrimiento de que el dominio "sensor" no interaccionaba con
GlnB planteaba nuevos interrogantes en relacin con su funcin.
Su
homologa con dominios PAS, implicados en interacciones con otras protenas

o ligandos (Taylor & Zhulin, 1999) hacer pensar en la posibilidad de que
estuviera implicado en interacciones con otras protenas reguladoras. Esta
posibilidad puede ser abordada mediante la construccin de genotecas doble
hbrido y su posterior escrutinio con NtrB o NtrB s como cebos.
59
Anexo I
61
Molecular Microbioogy (2001) 40(1), 169-178
Two-hybrid analysis of domain interactions invoiving

NtrB and NtrC two-component regulators
Isabel Martnez-Argudo,1 Jos Martn-Nieto,1 Paloma
Salinas,1 Rafael Maldonado,1 Martn Drummond2 and
Asuncin Contreras1*
1
Divisin de Gentica, Facultad de Ciencias, Universidad
de Alicante, Apartado 99, E-03080 Alicante, Spain,
2
Department of Molecular Microbiology,
John tnrtes Centre, Norwich NR4 7UH, UK.
Summary
Signal transduction by two-component regulatory
systems involves phosphorylation of the receiver
domain of a response regulator by the transmitter
domain of the cognate histidine kinase. In the NtrBC
system, phosphorylation of NtrC by NtrB results
in transcriptional actvation of nitrogen-regulated
genes. We have used the yeast two-hybrid system
to prob interactions between domains of the NtrB
and NtrC proteins from Klebsiella pneumoniae. We
construcied fusions from each of a series of proteins
or protein domains to the activation and the DNAbnding domains of GAL4 and analysed expressiort
of GAL1:lacZ and GAL1:HIS3 reporters in yeast.
The DNA-bnding domain o NtrC and the so-called
sensor domain of NtrB appeared to provide the major
determinants for dimerization of the fusin proteins.
A strong and specific interaction was also shown
between NtrB and NtrC, locaKzed to the HN regin of
the NtrB transmitter module and to the NtrC receiver
domain, whereas other domains of these proteins do
not appear to contribute to the recognition specificity. The results presented here indcate that communication between two-component partners also
involves protein-protein interactions that can be
detected in vivo, suggesting that the yeast two-hybrid
system is a powerful genetic tool for identifying
functional partners of prokaryotic signal transduction
pathways.
In the simplest such systems, the transmitter module of a

sensor protein autophospriorylates at a conserved histidine
residue, then transfers tfie phosphoryl group to a conserved
aspartate in the receiver domain of a response regulator,
which is often a transcriptional regulator. The priman/
structures of the receiver domains are relatively well
conserved, and they fold as single units whose terfery
structure has been determined in a number of cases (Stock
etal., 1989; Volkman era/., 1995). Less well conserved, the
transmitter module has characteristic sequence motifs
called the H, N, G1, F and G2 boxes. Tertiary structures
have been determined for histidine kinases EnvZ {Tanaka
et a!., 1998) and CheA (Bilwes et a!., 1999), revealing
the presence of separated phosphotransfer and kinase
domains.
The NtrB/NtrC system regulates o-54-dependent iranscription of nitrogen-regulated genes in enteric bacteria
(Ninfa et ai., 1995). NtrB possesses a C-terminal
transmitter module that has both kinase and phosphatase
activtties and caalyses the phosphorylation and dephosphorylation of the N-terminal receiver domain of NtrC,
the activator of the Ntr regulon. The ntrogen status of
the cell is relayed to this couple by the Pll protein,
which determines the balance of the phosphorylation and
dephosphorylation reactions in response to the intracellular abundance of small molculas such as 2ketoglutarate and glutamine {Jiang and Ninfa, 1999;
Pioszak et al., 2000). The poorly characterzed Nterminus of NtrB, known as the sensor domain, has
homology to PAS domains (Taylor and Zhulin, 1999) and
is joned to the transmitter module by a Q-linker (Wootton
and Drummond, 1989). The central domain of NtrC, which
drives open complex formation by RNA polymerase
containing <r54, is also joined to the receiver domain by
a Q-linker (Drummond ef ai., 1986). NtrB is a dimer (Ninfa
etal., 1993). In soluion, NtrC also exists primarily as a
dimer, but builds higher order oligomers when bound to
DNA through tts Oterminal domain. This oligomerization
is promoted by phosphorylation of the receiver domain
(Porter et al., 1993; Fiedler and Weiss, 1995; Wyman
etal., 1997).
Introduction
Histtdine-aspartate signalling phosphotransfer was first
described in bacteria! two-component systems {for reviews,
see Parkinson and Kofoid, 1992; Hoch and Silhavy, 1995).
Accepted 22 January, 2001, Tor correspondence. E-mai oontrera
ga.es; Tel, (+34) 96 590 3957; Fax (+34) 96 590 9569.
Bacteria contain numerous two-component systems.

The Escherichia coii genome encodes 62 proteins
homologous to one or other of the components (Mizuno,
1997). Although cross-talk between some of these
regulators may be physiologically relevant, specific
recognition between pairs of these elements must also
2001 Biaokwel! Science d
63
170
/. Martnez-Argudo
et al.
be required for accurate signa! channelling, and specific

contacts between domains other than receiver and
transmitter may have evolved to avoid cross-talk between
seprate signalling pathways.
We have used an in vivo approach, the yeast twohybrid system (Fieids and Song, 1989), to analyse domain
interactions within and between NtrB a n d NtrC proteins
from Klebsiella pneumoniae. T h e resuits indcate that the
DNA-binding domain provides the dimerizaton interface
for NtrC, in accordance with earlier work {Porter e ai,
1995), and that the sensor domain of NtrB also provides
a major dimerizaton interface. T h e interaction between
NtrB a n d NtrC generates a strong signal that maps to
the receiver domain of NtrC and the H N regin of the
transmitter module of NtrB, ndcating that recogniton
specificity in ths two-component system does not invove
interactions between surfaces outside the transmitter and
receiver domains.
Resuits
The activator and DNA-binding domains of GAL4
(GAL4AD and GAL4BD) were fused to the N-termini of
NtrC and NtrB using vectors pGAD424 and pGBT9
respectively. Fusions were also made to truncated
versions of NtrB and NtrC proteins and to individual
domains, domain boundaries being chosen on the basis
of earlier work {Porter e al., 1995; Kramer and Weiss,
1999). NtrC and NtrB domains are designated by letters
according to established conventions and are used here
as superscripts to refer to particular constructs succnctly
(Fig. 1). The transmitter module s denoted as H N G ,
where G comprises G 1 , F and G 2 boxes. N is always
included in constructs containing the H domain, as the N
box seems to contribute to stabization (Kramer and
Weiss, 1999; data not shown).
To determine the ability of two given polypeptides to
interact, expression of both GAL1:lacZ and GAL1:HIS3
reporters was determined in strains of
Saccharomyces
cerevisiae Y190 by p-galactosidase assay and growth on
histidine-deficient mdium respectively. Growth raies
were categorized roughly into four groups (for examples,
see Fig. 2). The fusin proteins carried by a given strain
are always named in the order GAL4AD;X/GAL4BD:Y,
abbrevtated X/Y, where X and Y are any polypeptide
fused to GAL4AD and GAL4BD respectively. None
of the constructs bearing NtrC or NtrB derivatives
activated reporters by themselves, thus excluding direct
transcriptiona! activation by individual fusin proteins.
Interactions
between NtrC
subunits
Interaction between full-length NtrC proteins (NtrC/NtrC,

Figs 2 and 3) indicates that both fusin proteins are stable
pUAG 11 pUAG 12
} B ,>f~
p(JAG31 pUAG32
>, H >
PAG61
pUAG62
PUAG21
pUAG22
| D>
NtrC
NtrC
_l
NtiC a
Nt/C15
pUAG211 pUAG2l2
H H
NtrB
lis
pUAG251 pUAG2S2
Isttre^
PUAG221 pUAG222
^H
H"
o>
MtiSi^s
1
E
PUAG261 {JUAG262
iMtrBsit
Fig. 1. Sctiematic representation of the different NtrC and NtrB

domains encoded by two-hybrid plasmids. Numbers indcate the
amino acid boundaries of the NtrC and NtrB polypeptides. Odd and
even pUAG plasmids encode GAL4AD and GAL4BD fusions,
respectively, to the N-terminal residue indicated, NtrCR, receiver
domain; NtrCc, catalytic domain; NtrCD, DNA-binding domain;
NtrBs, sensor domain; and NtrBHNG, transmitter module,
and capable of associaion in S. cerevisiae. T o determine
the contribution of individual domains to NtrC/NtrC
interaction, w e measured GAU.IacZ
and
GAL1:HS3
expression with all combinations of the four NtrC
derivatives constructed here. The resuits are shown in
Fig. 3 (see also Fig. 2). T h e C-terminal DNA-binding
domain gave significant interaction with itself (NtrC 0 /
NtrC D ) and with NtrC (NtrC/NtrC and NtrC/NtrC 0 ), For
both receiver (NtrC R ) and catalytic (NtrC c ) domains, no
interaction was found with any of the NtrC derivatives.
Therefore, the only interactions observed between NtrC
domains were those taking place between NtrC D domains.
Interactions between NtrB subunits

Although NtrB is known to be a tight dimer, the
contribution of individual domains to dimerizaton did not
receiveattention until very recently (Jiang era/., 2000). To
approach this problem, we designed truncated proteins in
the ght of previous structural and functional studies.
NtrB HNG proteins have constitutive kinase activity, both in
v'ttro and in vivo (Kamberov et ai, 1994; Kramer and
Weiss, 1999), whereas NtrB SHN proteins are constitutive
phosphatases unable to autophosphorylate (Atkinson
and Ninfa, 1993; Kramer and Weiss, 1999). The sensor
domain (NtrB s ) has no known enzymatic activity, but is
predicted to old independently.
When paired with themselves, full-length NtrB and
truncated proteins containing the sensor domain ali gave
positive signis (Figs 2 and 4) that we attribute to
dimerizaton. Signis were much weaker for NtrB s and
2001 Blackwell Science Ltd, Molecular Microbiology, 40, 169-178
64
Two-hybrid analysis o NtrB and NtrC interactions

50mM3AT
NtrC/NtrB
++
NtrB/NtrB
++
NtrC/NtrC
NtrB s /NtrB s
NtrC/NtrC D
NtrB H N G /NtrC
2 5 m M 3AT
His
CheA/NtrC
CheA/PhoP
NtrB/PhoP
PhoP/NtrB
Fig. 2. Growth conferred by fusin proteins on histidine-deficient

media. Pairs of fusin proteins are indicated in the order
GAL4AD:X/GAL4BD:Y. where X and Y are the proteins indicated in
each case. Dashes refer to absence of proteins fused to GAL4
domains. Signs indcate levis of growth, decreasing from 4 t- to - ,
under the experimental conditions shown. Cell patches correspond
to three independent transformants. Photographs were taken
4 days after streaking, except for patches grown on 25 mM 3AT
(8 days after streaking).
NtrB SHN than for NtrB, suggesting that the transmitter

module also contributes to dimer stability. Although all
pairs in which both members nclude the sensor domain
always gave signis, we detected no interactlon between
NtrB HNG and any other NtrB derivative. This lack of
interactlon cannot be attributed to lack of expression, as
NtrBHNG
g a v e
s i g n a
|s
wth
N t r C j
a n d
b o t h
G A L 4
fuson
proteins were detected by Western blottlng (see below).

To provide an independent assay for these results, we
constructed His-tagged derivatives of sensor and transmitter domains from NtrB and performed chemicai crosslinking assays. We also extended the analysis to the
transmitter domain of EnvZ, for which homodimerization
through the H box has been reported (Hidaka et al., 1997;
Tomomori et al., 1999). The results obtained confirmed
the ability of sensor domains to interact with each other
and revealed interactions between NtrB transmitter
modules, as was the case for EnvZ (Fig. 6).
Interactions between NtrB and NtrC

NtrB and NtrC must recognize each other to transduce
171
changes in nitrogen status, but the question arse

whether the interaction between sensor and response
regulator, which are related stoichiometrically as enzyme
and substrate, would be too transient to be detected in the
yeast two-hybrid system. In fact, they give a remarkably
strong signal (Figs 2 and 5), showing that recognition
between NtrB and NtrC also takes place with fusin
proteins in yeast.
Obviously, the histidine phosphotransfer and receiver
domains must come into contact for phosphotransfer to
occur and, in other systems, this interface provides much
of the binding energy. However, this does not necessarily
mean that t provides specificity, and we wished to
investgate the possible involvement of other domains in
recognition. As shown in Fig. 5, when individual NtrC
domains were paired with full-length NtrB, only NtrCR
gave a signal. Pairing of truncated NtrB derivatives with
full-length NtrC gave a signal only when they included the
histidine phosphotransfer domain, in agreement with the
results from EnvZ (Tomomori et al., 1999). The same
pattern was observed for NtrB derivatives paired with
NtrCR. NtrC c and NtrCD gave no interaction with any of
the NtrB truncated proteins (data not shown). As interactions were only detected between NtrCR and the HN
regin of the NtrB transmitter module, the receiver domain
of NtrC and the HN regin of NtrB appear to provide
major surfaces for recognition between NtrB and NtrC. In
agreement with these data, chemicai cross-lnking was
observed between H6-NtrCR and both H6-NtrB and H6NtrB HNG (Fig. 6). but not between H6-NtrBs and H6-NtrC
or H6-NtrCR (data not shown).
Specificity of signal channelling

Sensor and receiver modules from different two-component
systems share a high degree of sequence conservation.
Although signal channelling must be effective for twocomponent systems to be useful, cross-talk between
them has been documented both in vivo and in vitro. One
of the earliest reports describes NtrC phosphorylation
by CheA (Ninfa et al., 1988). We used GAL4 fusions
to CheA (a histidine kinase involved in chemotaxis) and
PhoP (a response regulator involved in pathogenesis) to test
for possible interactions between histidine kinases and
response regulators in non-cognate pairs. No signal was
found for CheA/NtrC, CheA/PhoP, NtrB/PhoP or PhoP/NtrB
pairs with GAL1:HIS3 (Fig. 2) or GAU.IacZ (data not
shown). Because GAL4BD:CheA activated both reporters
by itself (data not shown). the NtrC/CheA and PhoP/CheA
pairs could not be tested for two-hybrid interactions. With the
exception of NtrCc, expression of all fusin proteins that
failed to give signis with the two-hybrid pairs analysed was
confirmed by Western blotting (Fig. 7).
2001 BlackweII Science Ltd, Molecular Microbiology, 40, 169-178
65
172
/. Martinez-Argudo et al.
Fig. 3. Expression of GAL1 :lacZ and
GAL1:HIS3 in strain Y190 carrying different
pairs of full-length and/or truncated NtrC
fusin proteins.
A. Each bar represents the mean pgalactosidase activity from al leas! four
independent transformants, each measured in
triplicate. Filled bars refer to pairing of the
same NtrC derivatives and open bars to
pairing of different ones.
B. Growth on histidine-deficient media
according to levis illustrated in Fig. 2.
A
60-
50J
40-
o
ro
o
<n 30es
TI
"5
O
O
20-
JS
'* ? 1
Cfl
10-
^ v Q Si ^ S;
z z z z z z
n-
'JE}0
ZJ LJ J
z z z z
O <
z z
z z
_]n_JKJr- J_> J
o o>
1 z
'= *>
0 / 3 0 /
B
by the variation in the strength of the signal obtained when
a gven pair of interacting proteins is exchanged between
GAL4AD and GAL4BD. Such variation can reach one
order of magnitude in p-galactosidase assays and
may result from any of a number of factors, including
differential susceptibility to proteolysis of the link between
the two elements of the hybrid, occlusion of mportant
surfaces of one element by unfavourable positionme,
of the other or the instability of particular hybrids in
yeast cells. However, certain pattems are discemible.
For example, GAL4AD:NtrC gives a stronger signal for
a given interaction than GAL4BD:NtrC. The reverse is
true for NtrCR paired with NtrB derivatives, and here
an explanation may be found in terms of quatemary
Discussion
For more than a decade, the yeast two-hybrid system has
been fruitfully applied to eukaryotic systems, often in
library screening. Reports of its successful application to
bacterial proteins are remarkably sparse and recent, and
the present work illustrates its potential in this rea,
particularly on two-component signal transduction pathways. The strength of some of the signis reported here
(Figs 2-5) is clearly sufficient for the analysis of the
interfaces involved using two-hybrid strategies.
The magnitude of the signis obtained with two-hybrid
approaches is affected by factors other than the binding
affinity of the protein pairs in question. This is shown here
Fig. 4. Expression of G/4..7acZand

GAL1-.HIS3 in strain Y190 carrying difieren!
pairs of full-length and/or truncated NtrB
fusin proteins. See legend to Fig. 3 for
details.
( ^
iz
120-
z
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2001 BlackweII Science Ltd, Molecular Microbiology, 40, 169-178
66
Two-hybrid analysis of NtrB and NtrC interactions
Fig. 5. Expression of GALV.IacZand

G-4L 7.H/S3 in strain Y190 carrying different
pairs of full-length and/or truncated NtrB and
NtrC fusin proteins. Filled bars refer to
GAL4AD:NtrC/GAL4BD:NtrB pairs and their
truncated derivatives. Open bars refer to
GAL4AD:NtrB/GAL4BD:NtrC pairs and their
truncated derivatives. See legend to Fig. 3 for
details.
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la
z
MU
"^
? z 52
'% I Z i? % f
z?
z z zz z z
z_z
B
structure. The affinity of NtrCR for NtrB may well be
enhanced through co-operativity resulting from its normally
being part of a dimer, and GAL4BD, itself a dimer. may be
able to replace this function to some extent, whereas
GAL4AD cannot.
Transcriptional activation by NtrC requires the formation of higher order oligomers. In addition to NtrCD
association leading to dimerization, interactions between
NtrC c domains and between NtrCR and NtrC c domains
have been postulated to contribute to oligomerization
(Flashner ef al., 1995; Rippe et al., 1998). In this
work, oniy one such domain interaction was detected,
representing the dimerization interiace provided by NtrCD
(Klose et al., 1994). Interactions between NtrC c or NtrCR
domains or interactions nvolving these two domains were
not detected (Figs 2 and 3). When NtrC c is involved, lack
of signis can be attributed to instability of the hybrids
involved (mRNA and/or proteins), as we could not detect
these proteins in Western blots with anti-GAL4AD or antiGAL4BD (Fig. 7). Furthermore, oligomerization of NtrC
dimers, requiring both phosphorylation and enhancer
binding, is unlikely to oceur in our experimental conditions.
and truncated NtrB proteins were paired with themselves.

Signis were only found when both members of a pair
contained the sensor domain (Fig. 4), thus suggesting the
presence of major dimerization determinants in NtrB s .
Our chemical cross-linking assays and very recent work
with E. coli NtrB derivatives, using gel filtration chromatography and non-denaturing PAGE (Jiang et al., 2000),
confirms this conclusin. Taking into account ali these
data, it seems that amino acids 111-115 are critical for
NtrB sensor dimerization.
To localize NtrB dimerization determinants, full-length
Why should two dimerization surfaces be required?
NtrB
NtrB s
NtrCR
NtrB +
NtrCR
NtrBHNO
NtrB HS
EnvZ';
- NttCR
70605040-,
Finding dimerization determinants in NtrB s was surprising, as in other histidine kinases of this class such as
EnvZ, the dimerization interiace is provided by the
histidine phosphotransfer domain, which comprises a
four-helix bundle bearing the phosphorylated histidines
and is formed by two pairs of hlices contributed by each
of the two subunits (Tomomori et al., 1999). All H domains
of known structure include such a bundle and, although
we could not detect contaets between H domains in the
two-hybrid system, these were apparent in our crosslinking studies (Fig. 6). Thus, we have evidence for
dimerization interfaces in two seprate domains.
^ M W
<
6050-
4030-
30-
2010-
2010-
2001 Blackwell Science Ltd. Molecular Microbiology. 40. 169-178
67
Fig. 6. Cross-linking assays using H6-NtrB,

H6-NtrC and H6-EnvZ derivatives. For each
protein, 10 p.g was assayed, except for NtrC R
+ NtrB laes, in which protein concentrations
were adjusted to 2.5 ixM each. Reactions
carried out in the absence (-) or presence
(-y) of DSS are shown. Cross-linked
complexes were analysed by SDS-PAGE on
5 - 2 0 % (left) or 1 0 - 2 0 % (right) polyacrylamide
gradient gels. Open and closed arrowheads
point to homodimeric and heterodimeric
complexes respectively. Numbers to the left
indcate the molecular masses (kDa) of
protein size standards.
174
/. Martnez-Argudo et al.
&
$> J? $ <$* $
90
SO ^
Fig. 7. Western blotting of GAL4 fusin proteins. In each case,

extracts were derived from Y190 carrying reciprocal pairs of twohybrid plasmids, except for CheA and PhoP, where the second
plasmid encoded NtrC and NtrB respectively. Each lae
corresponds to one out of two to four ndependent transformants
analysed with identical results. Arrowheads point to the protein
indicated above each lae. Numbers to the left indcate the
molecular masses (kDa) of protein size standards.
A. Anti-GAL4AD.
B. Anti-GAL4BD.
One possibility is thatthe association between H domains

of NtrB is not very strong, and the helix bundle forms and
dissociates during the phosphorylation cycle, with the Nterminal dimerization domain functioning as a clamp.
According to its conformation, this clamp could facilitate
the dissociation by providing a steric constraint or
reinforce contacts between the two pairs of hlices,
thereby providing the basis for intramolecular signal
transduction. Such a mechanism might be peculiar to
histidine kinases in which the sensor domain is cytoplasmic, as opposed to the more abundant type of histidine
kinases, such as EnvZ, in which sensor and transmitter
domains lie on opposite sites of the inner membrane.
Evidence is provided here for recognition between
NtrB and NtrC (Figs 2 and 5). This is the first report
in which the yeast two-hybrid system has been used to
show protein contacts between two-component regulators. Protein-protein interactions detected here appear to
take place only between partners in two-component
systems, with the histidine kinase CheA and the response
regulator PhoP not being able to give signis with NtrC
and NtrB, respectively, or with each other (Fig. 2; data not
shown). The lack of signal between CheA and NtrC is

worth noting given that in vitro cross-talk between these
proteins has been reported. CheA phosphorylates NtrC
with low efficiency compared with phosphorylation of the
cognate response regulator CheY (Ninfa era/., 1988). The
data presented here probably reflect the relatively poor
mutual affinity of the CheA-NtrC pair. Our failure to detect
binding of any non-cognate pair of signalling proteins
(Fig. 2; data not shown) strongly suggests that the
signis we do observe are physiologically relevant. If
this holds true, two-hybrid approaches could provide a
generic means of finding, for a given component, the
cognate partner(s) acting in the same signal transduction
pathway.
The results shown in Fig. 5 indcate that most, if not all,
of the binding energy between NtrC and NtrB is provided
by the interface between the receiver domain and
the HN regin of the transmitter module, and suggest
that dimerization of NtrCR is important for recognition
These data indcate similarities to previously characterized two-component systems, including EnvZ, in which
the H domain is involved in recognition of the OmpB
receiver domain (Park et al., 1998). Further investigation
including additional two-hybrid analysis, is needed te
assess whether recognition in other two-component
systems is also limited to receiver and phosphotransfer
domains.
Experimental procedures
Strains and plasmids used in this work are listed in Table 1. A
schematic representaron of the NtrB and NtrC polypeptides
encoded by two-hybrid plasmids is shown in Fig. 1. Oligo
nucleotides used to construct plasmids are listed in Table 2.
All construets made in this work were verified by automated
dideoxy DNA sequencing. Cloning procedures were carried
out in E. coli DH5a.
Construction of two-hybrid plasmids

All ntrC sequences were derived from plasmid pDW82. To
construct plasmids pUAG11 and pUAG12, an Nde\-Hind\\\
fragment encompassing the complete ntrC coding sequence
from pDW82 was Klenow treated and cloned into the Sma\
site of pGAD424 and pGBT9 respectively. From pUAG11,
a SsrYI fragment was cloned into pGAD424( + 2)rev and
pGBT9(+2)rev, giving plasmids pUAG21 and pUAG22
respectively. To genrate pUAG31 and pUAG32, a DNA
fragment was polymerase chain reaction (PCR) amplified
from pUAG11 with primers ACT-A and NTRC-2R, cut with
EcoRI and fiamHI and cloned into pGAD424 and pGBT9
respectively. To genrate pUAG61 and pUAG62, a DNA
fragment was PCR amplified from pUAG11 with primers
NTRC-5F and NTRC-5R, cut with EcoRI and BamW. and
cloned into pGAD424( + 1) and pGBT9( i 1) respectively.
All ntrB sequences were derived from pMD182. To
2001 Blackwell Science Ltd, Molecular Microbiology, 40, 169-178
68
Two-hybrd analysis of NtrB and NtrC interactions
175
Table 1. Strains and plasmids.

Strain or plasmid
Genotype or relevant characteristics
Source or referente
E. coli DH5
F" S0dlacZ\m5A(lacZYA-argF)AS9 endA1 recA1 hsdR17[rK~ m*1-)

deoR fw'- supE44 gyrA96 relA k~
F" ompT[ion] hsdSB (rB~ mB~) MDE3
Hanahan (1985)
S. cerevisiae Y190
MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 trpl-90 leu2-3112 ga!4A gaiSOA

URA3::GAL1 UAS-<3AL1TATA-lacZ LYS2::GAL1 U A S -HIS3 T ATA-HIS3 cyhr2
Harperetal. (1993}
pGAD424
pGAD424( + 1)
pGAD424(+2)
pGAD424rev
pGAD424(+2)re\j
pGBT9
pGBT9( + 1)
pGBT9{+2)
pGBT9rev
pGBT9(+2rev)
pDW82
pMD182
pKJP9
pEG5433
pUAG11
PUAG12
PUAG21
pUAG22
pUAG31
pUAG32
pUAG61
pUAG62
PUAG101
PUAG102
pUAG111
PUAG112
pUAG211
PUAG212
pUAG221
pUAG222
PUAG251
pUAG252
pUAG261
pUAG262
pET23a(+)
pDW78
Ampr, LEU2, GAL4(768-881) AD

As pGAD424 with a different frame (+1)
As pGAD424 with a different frame (+2)
As pGAD424 with inverted mltiple cloning site
As pGAD424rev wfth a drfererrt frame (+2)
Ampr, TRP1, GAL4(1-147) BD
As pGBT9 with a different frame (+1)
As pGBT9 with a different frame (+2)
As pGBT9 with inverted mltiple cloning site
As pGBT9rev with a different frame (+2}
K. pneutnoriae nfrCdoned into pT7-7 as an Afc/e!-H;7?dlll fragment
K. pneumoniae gnA ntrBC
E. coli cheA
S. typUimuum phoP
GAL4AD:NtrC
GAL4BD:NtrC
GAUAD:NtrCD
GAL4BD:NtrCD
GAL4AD:NtrCn
GAL4BD:NtrCR
GAL4AD:NtrCc
GAL4BD:NtrCc
GAL4AD:CtieA
GAL4BD:CheA
GAL4AD:PhoP
GAL4BD:PhoP
GAL4AD:NtrB
GAL4BD:NtrB
GAL4AD:NtrBHfJ0
GAL4BD:NtrBHN'3
GAL4AD:NtrBs
GAL4BD:NtrBs
GAL4AD:NtrBSHN
GAL4BD:NtrBSHN
Expressiort vecor for His-tagged fusin proteins
K. pneumoniae nfrCcIoned into pET28a(+) as an Nde\-Hn\\\ fragment.
Encodes H6-NtrC
K. pneumoniae ntrB doned into pET28a(+) as an /vtel-BamHf fragment.
Encodes H6-NtrB
H6-NtrCR
H6-NtrBHNG
H6-NtrBs
He-EnvZ*3
Bartel etal. (1993)

Roder ef ai (1996)
Roder ef a/, (1996)
Roder efaA (1996)
Roder et al. (1996)
Chien etal. (1991)
Roder et al. (1996)
Roder et al. (1996)
Roder ef al. (1996)
Roder etal. (1996)
D, Widdick (John Innes Centre)
Wootton and Drummond (1989)
Lux etal. (1995)
Groisman etal. (1989)
This work
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Novagen
D. Widdick (John Innes Centre)
E coli BL21(DE3)
pMR1
PUAG-H31
PUAG-H222
PUAG-H251
pPH006
construct pUAG211 and pUAG212 plasmids, a pMD182

ragment encompassing the complete ntrB coding sequence
was PCR amplified with primerg NTRB-1F and NTRB-1R, cut
with eamHI and doned into pGAD424(+2) and pGBT9{+2)
respectively. A pMD182 fragment was PCR amplified with
NTRB-2F and NTRB-1R, cut with BamHI and doned into
pGAD424(+2) and pGBT9(+2), giving plasmids pUAG221
and p(JAG222 respectively. A pMD182 fragment was PCR
amplified with NTRB-1 F and NTRB-5R, cut with BamHI and
doned into pGAD424(+2} and pGBT9(+2), giving plasmids
pUAG261 and pUAG262 respectively. A pMD182 fragment
was PCR amplified with primers NTRB-1 F and NTRB-2R, cut
with BamHI and doned into pGAD424(+2) and pGBT9{+2),
giving plasmids pUAG251 and pUAG252 respedively.
Studier ef al. (1990)
M. Reuter (John Innes Centre)

This work
This work
This work
Parkand inouye (1997)
phoP sequences were PCR amplified from pEG5433 with

primers PHOP-1F and PHOP-1R, digested with Sal\ and
FcoRI and doned into pGAD424 and pGBT9, giving
plasmids pUAG111 and pUAG112 respectivefy.
cheA sequences were taken from pKJP9. A Pst\-BamU\
fragment from pKJP9 was doned into pGAD424rev and
pGBT9rev, giving piasmids pUAGIOI and pUAG102
respectively.
Consiruction
proteins
of plasmids
for the expression
of
His-tagged
To construct pUAG-H222, a pUAG221 fragment was PCR
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69
176
Table 2. Oligonucleotides,
ACT-A
NTRB-1F
NTRB-1R
NTRB-2F
NTRB-2R
NTRB-5R
NTRC-2R
NTRC-5F
NTRC-5R
PHOP-1F
PHOP-1R
T7 universal
S'-AGGGATGTTTAATACCACTAC-3'
S'-CGGGATCCATGGCAACAGGCACA^
5'-CGGGATCCTACTTCCGAATAGGCAG-3'
5'-CGGGATCCATGGATAATCAGCGT-3'
5'-CGGGATCCTAACGCTGATTATCCAT-3'
5'-CGGGATCCTACTGGAAGGCCGTC-3'
5'-CGCGGATCCTCAATTACGCGGCTG-3'
5'-CGAATTCAGCCGCGTAATGCGCCG-3'
5'-CGGATCCTTTAAAGATCCTGCGTCAG-3'
5'-GCCGAATTCATGATGCGCGTACTGGTTGTA-3'
5'-GCCGTCGACTTAGCGCAATTCAAAAAGATA-3'
5' TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'
amplified wth NTRB-2F and NTRB-1 R primers, cut with

BamHl, Klenow treated and cloned into the Nd&\- and
BamHI-cut, Klenow-reated pET28a(+). pUAG-H251 was
generated by PCR amplificaron from pMR1 with T7 universal
and NTRB-2R primers, followed by Ndel and fiamHI
digestin and cloning into pET28a(+). pUAG-H31 was
generated by PCR ampcation from pDW7B with T7
universal and NTRC-2R primers, followed by Ndel and
SamHI digestin and cloning into pET28a(+).
Yeast methods
S. cerevisiae Y190 was co-transformed with different pars of
two-hybrid plasmids (1 n-g each), and at least four independent
clones were selected for further analysis. Yeast culture and
transformation procedures were essentially as described
previously (Ausubel et al., 1999). p-Gal actos idase activity
was assayed as described previously (Schneider era/., 1996).
Growth on histidine-deficient mdium was analysed on sod
YNB mdium lacking His, Leu and Trp in the presence of
different concentrations of 3AT (3-amno-1,2,4-triazole).
Protein purficaton
DerivativesofNtrB,NtrCandEnvZbearinga6 x HisN-terminal
tag were expressed and purrfied from E coli BL21{DE3),
cultured and induced with 1 mM IPTG as described previously
(Rippe ef al., 1997). Cells expressing H6-NtrB derivatives or H6EnvZHNG w e r e r e s u s p e r i c ed n 5 o m M HEPES, pH 7.5,10 mM
MgCla, 50 mM KCI, 20% glycerol {HMKG buffer), and the
soluble protein fraction was obtained essentially as described
previously (Martn-Nieto and Villalobo, 1998) upon lysozyme
treatment, iysis in jquid N2 and DNase 1 treatment, followed by
centrifugaron. The proteins were purified by Ni-affinify chromatography using 1 mi HiTrap chelatng columns (Pharmacia)
equilibrated in HMKG buffer, and eluion was carried out with
300 mM (H6-NtrB derivatives) or 200 mM (H6-EnvZHNG)
imidazole, pH 7.5, For purification of H6-NtrCR, the above
buffer was replaced by 50 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 M NaCI,
10 mM B-mercaptoethanol, and eiution was achieved with
200 mM imidazole.
Cross-linking assays
Aliquots of 10 fj,g (2.5-7 M) of each substrate protein were
incubated in 100 JULI of HMKG buffer containing 300 ^.M

imidazole for 30 min on ice, and then 2.5 mM disuccinimidyl
suberae (DSS) was added. After 2 h of incubation at room
temperature, the reactons were stopped by the addition of
0.25 M glycine and trichloroacetic acid (TCA) precipitation
(Martn-Nieto and Villalobo, 1998). The proteins were run on
SDS-potyacrylamirJe linear gradient gels and visuaiized by
Coomassie Blue staining.
Western biotting
Protein extracts from Y190 carrying different pairs of fulliength and/or truncated fusin proteins were obtained
essentially as described previously (Jazwinski, 1990). Cells
from 5-20 mi cultures were resuspended n 5% TCA buffer
and broken with glass beads in a Mnibeadbeater. After
centrifugation, the pellet was resuspended in Laemmti
loadng buffer. Equivalent amounts of protein extracts were
separated by efectrophoresis on 10% poIyacrylamide-SDS
gels and electrotransferred onto polyvinylidene difluoride
(PVDF). Membranes were probed wfth monoclonal antibodies against GAL4AD (sc-1663) and GAL4BD (sc-510) from
Santa Cruz Biotechnology. Primary antibodies were detected
with alkaiine phosphatase-conjugated goat anti-mouse
secondary antibodies (Sigma). Detection was carried out
by staining the membrane with 5-bromo-4-chloro-3-indoly
phosphate and nitroblue tetrazoiium.
Acknowledgements
This work was initiated with an EMBO short-term feilowship
(ASTF-8849) to A.C. We thank the Generalitat Valenciana
(grant AE98-14) and the Ministerio de Educacin y Cultura
(grants PB97-0115 and HB1997-0216) for current support.
We thank C. Schweichheimer, M. Schweizer, D. Widdick, M.
Reuter, R. Dixon, A. Garzn and D. Cano for plasmids and
strains, and R. Dixon and C. Kennedy for comments on the
manuscript.
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72
Anexo II
73
VoL 184, No. I
JOURNAL OF BACTEKIOI-OGY, Jan. 20027 p. 200-206
0021-9193/02/$04.00+0 DO: 10.1128/JB. 184.1.200-206.2002

Copyright 2002, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Domain Interactions on the ntr Signal Transduction Pathway:

Two-Hybrid Analysis of Mutant and Truncated
Derivatives of Histidine Kinase NtrB
Isabel Martnez-Argudo. Paloma Salinas, Rafael Maldonado, and Asuncin Contreras*
Divisin de Gentica, Universidad de Alicante, Apartado 99, E-03080 Alicante, Spain
Received 27 July 2001/Accepted 9 October 2001
We have used the yeast two-hybrid system to analyze protein-protein interactions mediated by domains of
regnlatory proteins o the ntr signal transduction system, including interactions among NtrB derivatives and
their interactions with NtrC and PII from KkbsieUa pneutnoniae. Interactions took place only between proteins
or protein domains belonging to the ntr signal transduction system and not between proteins or domains from
noncognate regulators. NtrB and its transmitter domain, but not NtrC, CheA, or the cytoplasmic C terminus
of EnvZ, interacted with P l l . In addition, interaction of NtrB with NtrC, but not with PII, depended on the
histidine phosphotransfer domain. Point mutation A129T, diminishing the NtrC phosphatase activity of NtrB,
affected thestrength oftfae signis between NtrC and the transmitter module of NtrB buthad n o i m p a c t o n P I I
signis, suggesting that A29T prevens the conformational change needed by NtrB to function as a phosphatase for NtrC, rather than disturbing binding to PII.
The NtrBC signal transduction system reglales rr34-dependent tianscription of nitrogen-regutated genes in enteric bacteria (reviewed in reference 19). The nitrogen status of the cell
is sensed by the urdyiyltranferase/uridylyi-removing enzyme
encoded by glnD (16). The uridylyltranferase/uridylyl-removing enzyme uridylylates the product o glnB, the PII protein,
under nitrogen limitation eonditions and deuridyly lates it under nitrogen excess eonditions (1). Nontrdylylaed PII interacts with NtrB to determine the balance of the pbosphorytation and dephosphorylation reactions of NtrB (12, 23), which
n turas catalyzes the phosphorylation and dephosphorylation
of NtrC, the ranscriptional regulator of the ntr regulon. NtrB
and NtrC are the sensor and the response regulator, respectively, of a two-component signa! transduction system based on
histidine-aspartate phosphotransfer (reviewed in reference
31). In the simplest such systems, the transmitter module of a
sensor protein autophosphorylates at a conserved histidine
residue and then transfers the phosphory! group to a conserved
aspartate in the receiver domain of a response regulator, which
s often a transcriptional Tegulator. Tertiary structures have
been determined for conserved domains, including the NtrC
receiver domain (13, 30), and both histidine phosphotransfer
and kinase domains from the re presen tat i ve members of the
histidine kinase families EnvZ and CheA (5,18, 27,29). On the
basis of domain organization, two classes of histidine kinases
have been proposed. The most abundant, ciass I, is represented by EnvZ and irtcludes- NtrB, and class II is r&pre-sented
by CheA. The histidine phosphotransfer domain is dimeric in
class I but monomeric in class II (5),
The Escherichia coli genome encodes 62 proteins homologous

to one or the other of the components (17). Specific recognition between pairs of these elements is required for accurate
signal channeling, although cross talk between some of these
regulators may also be physiologically relevant, In spite of
structural conservacin in two-component systems and their
possible implications for cross talk, the histidine phosphotransfer and receiver domains appear to be responsible for binding
and specificity of interactions between histidine kinases and
their cognate response reguators (15, 21, 22, 33). The kinase
domain has also been reported to be a target for regulation in
histidine kinases (8), and PII interaets in vitro with NtrB fragments eontaining the kinase domain (11, 23), Although NtrB
homologues are absent from mltiple organisms eontaining
one or more PII-Ike proteins, PII is one of the most ubiquitous
signa transduction proteins and genetic complementaron is
found with glnB from distantly related bacteria (1, 7). Conservation of kinase domains within histidine kinases and other
ATP-bnding proteins may faciltate recognition by common
regulatory proteins, raising the possibility of cross talk between
different signal transduction systems.
Most histidine kinases contain N-terminal transmembrane
domains invorved in sensory functions. Although there is no
evidence of such functions in the case of the N terminus of
NtrB, this regin of the protein has also been referred to as the
sensor domain, The N terminus of NtrB is rather unique and
possesses homology to PAS domains (28). Recently, it has
been shown that it contains determinants for dmerization (11,
15). The regin connecting the N terminus of NtrB to the
conserved boxes on the tiansmiuet module, known as the
linker (32), seems to be critical for regulation and is predicted
to form a coiled-coil motif in NtrB and other histidine kinases
(26). Consisten! with this regulatory role, in E. cal, amino
acds 115 to 138 of NtrB contain most of the constitutive point
mutations selected as suppressors of the N t r - phenotype of a
glnD Strain (2).
Recognition between components of signaling pathways is a

problem in organisms having mltiple homologous systems.
* Correspondlng auttior. Mailiivg addtess: Divisin de Gentica,

Facultad de Ciencias, Universidad de Alicante, Apartado 99, E-03080
Alicante, Spain, Phone: 34 96 591) 3957. Fax: 34 96 590 9569. E-mail:
contrera@ua.es.
200
75
VOL. 184, 2002
TWO-HYBRID ANALYSIS OF INTERACTIONS BY NtrB DERIVATIVES
201
TABLE 1. Strans and plasmids used in this study

Stran or plasmid
Genotype or relevan E characteristics
Sourcc or rcfcrcitcc
E. coll OH5a
K. pneumonas M5al
S. cerevisiae Y190
F" i{.itQ<}la;ZAM]5&(lacZYA-argF)UI69!!idAl recAl hsdRI7(cK- m K ") eoR thi-t supE44 gyrA96 relAl k"
Wild type
MATa ura3-52 his3-200 ade2-0l cip-90 leu2-3,l 12 gaMA galSOA URA3::GALIl;AS-QAU,..,. t-lacZ
LYS2::GAUUA!i.HiS3r/t-HlS3
cyhr2
9
M. Drummond
10
pGAD424
pGAD424( + 2)
pGBT1)
pGBT9( + 2)
pMDI82
pPHO
pUAGl I
pUAG12
pUAGlOl
pUAGl 1 ]
pUAO!12
pUAG211
pUAG212
pUAG221
pUAG222
pUAG25I
pUAG252
PAG261
pUAG262
pUAG17l
pUAG172
pUAG213
pUAG214
pUAG281
pUAG282
pUAG291
pUAG292
PUAG301
pUAG302
pUAG311
pUAG312
pUAG341
pUAG342
pUAG35J
pUAG352
pUAG501
pUAG502
Amp r LEV2 GAL4(768-S81) AD

Same as pGAD424 with a different trame ( + 2)
Ampr TRPI GAL4(1-I47) BD
Same as pGBT9 with a different frame ( + 2)
K. pneumoniae gl'iA iitrRC
H-EnvZ"^
GAL4AD-NtrC
GAL4BD-NtrC
GAUAD-CheA
GAL4AD-PhoP
GAUBD-PhoP
GAL4AD-NtrB
GAL4BD-NtrB
GAL4AD-NtrB Mfm
GAL4BD-NtrBI,NC'
GAL4AD-NrB s
GAL4BD-NlrBs
GAUAD-NtrB SUN
GAL4BD-NrB sl,N
GAL4AD-P11
GAL4BD-PII
GAL4AD-NtrB A ' 2 "
GAL4BD-NrB Al:!lrr
GAL4AD-NtrB s[|
GAL4BD-NtrB sl1
GAL4AD-NtrB11
GAL4BD-NtrB"
GAL4AD-NtrB" N
GAL4BD-NtrB"^
GAL4AD-NtrB
GAL4BD-NtrB
GAL4AD-NtrB ,lriOAn - !,r
GAL4BD-NtrB llNciAI:! ' JT
GAL4AD-NlrBSErhgAl2',T
GAL4BD-NtrB s,lfJA,2!,T
GAlAAD-EtwZ' Iroti
GAL4BD-EnvZllrJGi
4
24
6
24
32
20
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
This work
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In a previous work, we used the yeast two-hybrid system to

prob interactions between domains of the NtrB and NtrC
proteins, showing specific contacts between the transmtter
module of NtrB and the receiver doman of NtrC from Klebsiella pneumoniae (15). In this study, we used the same in vivo
strategy to further analyze interactions between NtrB domains
and their interactions with upstream (PII) and downstream
(NtrC) components of the nitrogen signal pathway. Resuls
obtained here confirm that interactions between NtrB and
NtrC and between NtrB and PI can be mapped, respectively,
to ftie histidine phosphotransfer and knase domains, validating the yeast two-hybrid approach. In addition, our results
suggest that the mutation AI29T perturbs interactions with
NtrC while not affecting the ability of NtrB to bind PIL
MATERIALS AND METHODS
The strans and plasmids jsed in this work are Usted in Table 1. The oligonucleotides used LO construct plasmids are listed in Table 2. All of the conslrucls
made n this work were verified by automated dideoxy DNA sequencing. Cloning
procedures were carried out with E. coii DH5a.
CoHsruction of two-hybrid plasmids. All ntrB nequsnces were derved from
plasmid pMDISZ. To consrruct pUAG281 and pUAG282, a pMD182 fragment
eneompassing he complete ntrB ccding sequence was PCR amplified with prim-
ers NTRB-1F and NTRB-4R, cut with BamHl, and cloned nto pGAD424(+2)
and pGBT9{+2), respectively. A pMD182 fragment was PCR amplified witli
NTRB-2F and NTRB^JR, cut with BamHl, and cloned into pGAD424{+2) and
pGBT9(+2), giving plasmids pUAG291 and pUAG292, respectively. A pMD182
fragment was PCR amplified with NTR6-2F and NTRB-5R, cut with BamHl,
and cloned nto pGAD424(+2) and pGBT9(+2), giving plasmids p(JAG301 and
pUAG32, respectively. A pMD182 fragment was PCR amplified with primera
NTRB-5F and NTRB-IR, cut with BamHl, and cloned tilo pGAD424(H-2) and
pGBT9{+2), giving plasmids pUAGjl I atidpUAG3I2, respectively. A two-step
TA8UE 2. Oligonucleotdes used in this study

Ollgonudeotide
Sequence
GLNB-FOR
GLNB-REV
MD138
MD139
NTRB-1F
NTRB-IR
NTRB-2F
NTRB-3F
NTRB-3R
NTRB-4R
NTRB-5F
NTRB-5R
5'-CGGAATTCATGAAAAAGATTGATGCG-3'
5'-CGGGATCCTTAAATTGCCGCGTCGTC-3'
5'-AATTTACATATGGG-3'
5'-AATTCCCATATGTA-3'
5'-CGGGATCCATGGCAACAGGCACA-3'
5'-CGGGATCCTACTTCCGAATAGGCAG-3'
5'-CGGGATCCATGGATAATCAGCGT-3'
5'-AGCAGATTACCGCTCGAGACTTAGT-3'
;'-ACTAAGTCTCGAGCGGTAATCTGCT-3'
5'-CGGGATCCTACACCAGCTrGACG-3'
5'-CGGGATCCCAG7TAACCCrrGCAC-3'
S'-CGGGATCCTACTGGAAGGCCGTC-y
76
202
MARTNEZ-ARGUDO ET AL
<
J. BACTERIO!...
TT~
111
221
29
34
"sensor"115
-
ransmlter
>
F[G. 1. Schcmatc re presen tat ton of the NtrB poiypeptides used in

this study. Capital (etters desgnate domains or regions in accordance
with established conventions. Numbers indcate the animo acid boundaries used to genrate different NtrB poiypeptides. The arrowhead
indcales the positrn of the point mutation used.
PCR was used to genrate the NtrBA,-,>T point mutacin. The irst PCR step was
carried out with primers NTRB-1F and NTRB-3R; the second step was done
with NTRB-3F and NTRB-1R. Products were used as tmplales for a third PCR
with primers NTRB-IF and NTRB-1R, and the resulliig fragment was cut
with BamHl and ciotied into pGAD424(--2) and pGBT9( + 2), giving plasmids
p(JAG213 and pUAG2i4, respectively. A fragment from pUAG2t3 was PCR
amplified with primers NTRB-2F and NTRMR, cut with BamHl, and cloned
into pGAD424(+2) and pGBT9(4-2), giving plasmds pUAG341 and pUAG342,
respectively. A pMD!S2 fragment was PCR amplied with primers NTRB-IF
and NTRB-5R, cut with BamH, and cloned into pGAD4(+2) and pGBT9
(+2), giving plasmids pUAGjSl and pUAG352, respectively.
eni'Z sequences were derived from pPHOOfi. To inser an Ndel site, oligonuceotides MD138 (sense) and MDI3* (antisense) were ntroduced into he
EcoRl sites of pGAD424{+2) and pOBT9(+2), generating pGAD424(+-2)-/Vde[
and pGBT9(+2)-Atel, respectively. To construct pUAG501, an Ndel-EcoRl
fragment from pPHOft was coned into pGAD424(-i-2}-MfcI. An Ndel-BamUl
fragment from p(JAC501 was cloned into pGBT9( + 2)-Vrfef, giving plasmd
pUAGSOZ.
glnB sequences were amplified from K. pneumaniae M5al chromosomal DNA
with primers GLNB-FOR and GLNB-REV, and the cortesponding product was
cut with SimHI and Ecok and cloned into pGAD424 and pGBT9, giving
plasmids pUAG171 and p(JAGI72, respectivey,
Yeast methods. Saccharomyces cerevisiae Y190 was cotransformed with different pairs of two-hybrid plasmids (1 jLg of each), and at least four independent
clones were selected for further analysis. The yeast culture and transformation
procedures used were previously described (3). (}-Galaetosidase activity was
assayed as previously described (25). Growth on histidine-deficient mdium was
analyzed on solid YNB mdium lackitig His, Leu, and Trp in the presence of
dlfte.ie.nt contentiations of 3-arno-l,2,4-triazole as previously described (15).
Western blotting. To obtain protein extrais from Y190carrying different pairs
of fusin proteins, cells from 2- to 3-ml cultures (optical density at 60u ntn, 2)
were resuspended in sodium dodecyl sulfate-gel loading buffer, boiled, and
broken with glass beads in a Minibeadbeater. To increase the protein yield of
GAL4AD construets, 10- to 15-ml cultures (optical density at 600 nm, 10) were
resuspended in 5% trichloroacetic acid buffer and broken with glass beads n a
Minibeadbeater. Aftcr cetitrifugation, the pellet was resuspended in Laemmli
loading buffer. Equivalent amounts of protein extracta were separated by electrophoresis on sodium dodecyl sulfate-I 2% polyacrylamide gels and electrotransferred onto polyvinylidene difluoride. Membranes were probed with monoclona! antibodies against GAL4AD (se-1663) and GAL4BD (se-510) from Santa
Cruz Biotechnoiogy. Primary antibodies were detected with alkaline phosphatase-conjugated goat ant-mouse secondary antibodies (Sigma). Detectiori was
carried out by stainng the membrane with 5-bromo4-chloro-3-ndolylphosphate
and nitrobiue tettazoiium.
(15). Fusin proteins consisted of the activator or DNA-bindng domain of GAL4 (GAL4AD or GAL4BD, respectively)
fused to the N termini of the corresponding poiypeptides. The
fusin proteins carried by a gtven srain are ahvays named
in the order GAL4AD-X/GAL48D-Y, abbreviated X/Y,
where X and Y are any polypeptide fused to GAL4AD and
GAL4BD, respectively. Domatn boundaries and nomencature
for NtrB poiypeptides and domains have been previously described (14, 15). Locations of boundaries and the point mutation used here are shown in Fig. L Expression of the different
NtrB fusin proteins was analyzed by Western blotting. Al
GAL4BD fusin proteins were detected, although with differences in expression (Fig. 2A). On the other hand, GAL4AD
fusions to NtrB G , NtrB H N , NtrB H , NtrB S H , and NtrB S H N were
not detected in Western blot assays (Fig. 2B), in spite of
the fact that we obtained in vivo evidence of expression
for GAL4AD-NtrB H N , GAL4AD-NtrB S H , and GAL4ADNtrB S H N (see below).
Roles of individual NtrB domains in interactions between
NtrB suburiits. To investgate the roles of individual domains
from the transmitter module in interactions within and between subunits of NtrB, we perormed two-hybrid analyses
with fuil-ength NtrB and truncated NtrB derivatives in different combinations. The results are summarized in Fig. 3.
In the histidine kinases EnvZ and NtrB, the dimerization
interface is provided by the histidine phosphofransfer domain
(11, 29). However, NtrB" 1 * 0 does not interact with itself in the
two-hybrid system (15) and we wished to investgate whether
we couid obtan signis from H domains by using different
5!
5,
2:
2=
3=
;z:
z:
97.4 _
66
45
*""*
31
21.5
97.4 __
66
45
3:
v,
E E E
z:
;Z
3>:
;K
Si
Z:
tsf^
31
RESULTS
To determine the ability of two givett poiypeptides to iuteiact n the two-hybrid system, expression of both GALlvJtacZ
and GALl:mJHIS3 reporters was analyzed in strains of S. cerevisiae Y190 by f3-ga actos idase assay and growth on histidinedeficient mdium, respectively. Growth rates were caegorized
into four classes ( + + , + , , and - } as previously described
21.5
FIG. 2. Western blotting of GAL4 fusin proteins. n each case,
extraets were derived from Y190 carrying reciprocal pairs of twohybrid plasmids. An arrowheads points lo the protein indicated above
each lae. T h e vales to the left of each panel indcate the molecular masses (kilodaltons) of protein size standards. Panels: A, antiGAL4BD; B, anti-GAL4AD.
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203
100
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2
X X
m m m m CQ m
Z Z Z 7 Z(5 2O
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5 i
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Sm &
O
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z z z z z z z
++
TTtf
s x m
m m co co i :
+ -
FIG, 3, Expression of GALl:\kicZ and CAL:\HIS3 in strain Y190 carrying differeni paire of truncated NtrB fusin proteins. Dashes indcate
tli absence of proteins fused to GAL4 domains. The numbered lines betvveen panels A and B encompass blocks of data depending on the type
of comparison. Blocks: 1, self-pairing proteins; 2, poiypeptides paired with GAL4AD-NtrB; 3, poiypeptides paired with GAL48D-NtrB; 4,
poiypeptides paired with GAL4AD-NtrB; 5, poiypeptides paired with GAL4BD-NtrB. (A) Each bar represents the mean p-galactosidase
activity from at least four independent transforma nts, each measured in triplcate. (B) Levis of growth on histidne-deficient mdium.
NtrB fragments. To this end, we tested the abilities of truncated NtrB derivatives to nteract with themselves and with
full-lengh NtrB. In contrast to the resuits obtained with constructs bearing the sensor domain, no signis were found when
NtrB H N or N t r B " was paired with itself or with NtrB (Fig. 3,
blocks 1 to 3), indicating that faure to obtain signis from
transmitter modules is not due to the presence of the G regin
in the fusin proteins. To investgate whether lack of interaction between transmitter domains reflects differences between
NtrB and other hstidine kinases, we tested the ability of the
corresponding module of EnvZ to interact with itself. Paralleling resuits obtained with NtrB H N G , no signal was found for
E n v Z H N O (Fig. 3, block 1), suggesting that lack of interaction
in the yeast system is common to transmitter modules.
It has been shown in vivo that the G domain is sufficient to
restore positive regulation by the HN fragment (14), suggesting that it folds ndependently into an active domain and phosphorylates the hstidine residue of the H domain in trans. To
test whether recognition between the H and G domains could
be detected in our assays, NtrB was paired with each of the
NtrB derivatives. Only NtrB S H N /NtrB gave signis (Fig. 3,
blocks 4 and 5), whiie other proteins containing the H domain
did not. Whiie failure of GAL4AD-NtrB to promote signis
is not surprising and can be attributed to lack of expression, the
negative resuits obtained with most of the pairs providing H
and G in different GAL4 fusions suggest very poor recognition
between the H and G domains.
Role of the hstidine phosphotransfer domain in interactions with NtrC. To study the contributions of individual domains to interactions between the NtrB transmitter module
and NtrC, we paired different combinations of the truncated
NtrB derivatives with NtrC and control proteins and performed two-hybrid analyses. The resuits are summarized in
Fig. 4 (blocks 1 and 2). NtrB interacted specifically with NtrC

in the two-hybrid system, whiie heteroiogous pairs of histidine
kinases and response regulators such NtrB and PhoP or CheA
and NtrC gave no signis (15). To rule out the possibiliy of
interactions between heterologous pairs in the absence of the
N-erminal regulatory domains of histidine kinases, we paired
transmitter modules NtrB HNC * and EnvZ H N G (from the histidine kinase EnvZ) with response regulators NtrC and PhoP.
No signis were found, except between N t r B H N O and NtrC,
supporting the specificity of interactions provided by N t r B H N .
To study the contributions of individual domains from the
transmitter module, NtrB H N G , NtrB SM , NtrB H , NtrB H N , and
NtrB were paired with NtrC. Except for the NtrB H /NtrC pair
(Fig. 2B; see Discussion), significant signis were obtained with
NtrB derivatives containing the histidine phosphotransfer domain whiie NtrB gave no signal, indicating that recognition
between NtrB and NtrC is provided by the H domain.
Interactions between PII and NtrB: determina nts of specificity. PII interacts with NtrB to reglate its kinase and phosphatase activities, and NtrB and PII can be cross-linked in vitro
to each other (23). However, the question arse whether the
interaction between NtrB and PII could also be detected in the
two-hybrid system. As shown in Fig. 4 (blocks 3 and 4), NtrB
gave signis with PII, showing that recognition between NtrB
and PII also takes place with fusin proteins in yeast. In addtion, NtrB H N O , but not NtrB s , NtrB S H N , or NtrB, gave signis
with PII, in agreement with recent in vitro data showing contacts between PII and a truncated protein containing most of
the transmitter module of NtrB (23). To explore the specificity
of the signis obtained with PII, additional fusin proteins
were incorporated into the analyses. No signis were found
when PII was assayed with EnZ M N O , CheA, or NtrC, hus
78
24
MARTINEZ-ARGUDO ET AL
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0.
.[. ,
+ + + +
FIG. 4. Expression of GALlvlacZ and GAL1.-.HIS3 in strain Y19E1 carrying different pairs of fusin proteins. Blocks: l, NtrB derivatives (or
EnvZH*G) paired with GAL4AD-NtrC or GAL4AD-PhoP; 2, NtrB derivatives (or EnvZHNG) pared with GAL4BD-NtrC or GAL4BD-PhoP; 3,
polypeptides paired with GAL4AD-PII; A, polypeptides paired with GAL4BD-PIE. Because GALBD-CheA activated both reporters by itself (data
not shown), the Pd/CheA pair was not included. See the legend to Fig. 3 for details.
supporting the specificity of the contaets between PII and both

NtrB and NtrB H N C i (Fig. 4, blocks 3 and 4).
Effect of mutation A129T on interactions mediated by NtrB
derivatives. The regin preceding the conserved histidine in
NtrB appears to be critica! for signal transduction. Poirst mutation A129T in NtrB, which confers a constitutive kinase phenotype, refleets the importance of tfiis regin in the regtrlation
of NtrB activities. We wondered whether the effect of this
mutation on NtrB conformation was large enough to be detected in our assays and, f so, whether mutation AL29T could
give information on signa! transduction by NtrB. Mutant and
wild-type versions of NtrB, NtrB S H N , and N t r B H N G derivatives
were compared for the ability to interact with themseves,
other NtrB derivatives, NtrC, and PII. Sgnificant dfferences in
signis between the wild type and mutant derivatives were only
obtained with NtrB S H N /NtrB and with interactions between
N t r B HNG a n d N t r C ( T a b [ e 3 ^ SU gge S ting that the A129T mu-
tation aflects the conformation of the H domain and that this

impairs contaets with NtrC.
DISCUSSON
To prob interactions medated by the histidine kinase and
phosphotransfer domains of NtrB, we have analyzed, by using
the yeast two-hybrid system, a vartety of truncated and mutant
NtrB derivatives (Fig. 1) for interactions with nitrogen signal
transduction proteins NtrC and PI and also for interactions
among NtrB derivatives. Every polypeptide was fused to
GAL4AD and GAL4BD in order to get, for each pair of
proteins tested. two independent signis for the CALJ::lacZ
and GALJ::HIS3 reporters. Interactions between NtrB derivatives and PII were remarkably similar for each pair of interacting proteins (Fig. 4, blocks 3 and 4). On the other hand,
GAL4AD-NtrC aiways gave a stronger signal for interaction
TABLE 3. Effect of mutation A129T on interactions with NtrB, NtrBG, NtrC, and PII fusin proteins" as shown
by its effect on GALlvlacZ1' and GAL1::HIS3C expression
Protein
Wild-type NtrB
NtrB A l f s , T
NtrB S H N
sJtrgSHNA129T
N[rBHNG
NtrB H N C A 1 2 ! , T
Mean p-galactosidase activily ( J )

Self-pairing
NtrB/
/NtrB
NtrBG/
97.3
83.7
97.3
115
97.3
138.4
Nry
18.6
2.1
88
42.8
0.45
0.55
2.97
1.97
0.42
0.2
0.29
0.64
0.52
0.63
0.53
1
0.44
/NtrBG
0.55
ND
13.97
0.45 {-)
0.96
0.38
NtrC/
/NtrC
pi/
/PJ]
35.2
36.9
145.9
101.9
46.9
36.9
20.63
13.7
14
11.5
158.4
117.4
0.47
0.34
0.16
0.69
7.8
6.3
3.38
2.17
17.1
2.09 ( )
1.38
0.87 ( - )
" Mutant NtrB derivatives and wild-type NtrB (lefteolumn) were tested with NtrB, N t r 8 G , NtrC, and PII in the appropriate GA1_4AD/GAL4BD paire indicated in
headings,
h
Mean numbers of [S-galactosidase unts are shown for comparison between wild-type NtrB (Fig. 3A and 4A) and mutant NtrB derivatives.
r
Growth rates obtained with construets bearing AI29T are indicated in parentheses only when they difer from those obtained with the equivalent wild-type
construets (Fig. 3B and 4B).
'' ND. not delermined.
79
VOL. 184, 2002
wih any given NtrB derivativo tlian did GAL4BD-NtrC (Fig. 4,

blocks 1 and 2), foilowing a previously noted pattern (15). This
effect, observed with the four pairs of proteins giving signis
with NtrC, was most dramatic with NtrBH, a result that we
attribute to instability of the H domain (14). GAL4BD-NtrBH,
but not GAL4AD-NtrBH, could be detected in Western blots
(Fig. 2), indieating that fusin to dimeric GAL4BD, but not to
GAL4AD, stabiiizes the H fragment. Regarding interactions
between individual domains of NtrB, only one pair of proteins
(NtrBSHN and NtrB; see below) gave signis in just one orientation, and here the same considerations apply to the effects
of GAL4AD and GAL4BD on the stability of the G fragment
(Fig. 2).
The phosphotransfer domain provides the dimerization interface in histidine kinase EnvZ (29). All H domains whose
structures are known comprise a four-helix bundle bearing the
phosphorylated histidines and formed by two pairs of hlices
contributed by each of the two subunits. Although there is in
vitro evidence of dimerization by the H domains of NtrB (11,
15), NtrB HNO fusin proteins did rsot nteract with each other
iti the two-rrybrid system (15; Fig. 3). The smaller polypeptides
NtrB!iN and NtrB" also failed to give signis when paired with
themselves or with full-length NtrB, indieating that failure of
transmitter modules to interact in the two-hybrid system is not
due to a negative effect of the G domain on putative signis
provided by interacting H domains. The fact that the NtrB HNG ,
NtrB HN , and NtrB" fusin proteins specifically gave signis
with NtrC (Fig. 4, blocks 1 and 2) suggests appropriate folding
of the H domains. It is worth noting that, in our experiments,
the transmitter modules of both the NtrB and EnvZ proteins
were identical in behavior, that is, n vitro cross-linking of the
corresponding His-tagged polypeptides (15) and failure of selfpaired NtrB HNG or EnvZ HNG to interact in the two-hybrid
system (Fig. 3, block 1). Our interpretation of these results is
either that the fusin to GAL4 domains prevens dimerization
of the H domains in both proteins or that, in vivo, the association between H domains of class I histidine kinases is not very
strong. If this is the case, the halix bwidie could be formmg and
dissociating during the phosphorylatin eyele and the role of
the N-terminal domain would be to faciltate the association
and dissociation between the two pairs of hlices, thereby providing the basis of intramolecular signa! transduction.
When difieren! NtrB derivatives were paired with each other
to detect possible interactions between different domains, no
signis were found, except for NtrB SHN and NtrBG in a given
orientation (Fig. 3, blocks 4 and 5). Although caution should
be used in interpreting the NtrBSHN/NtrBG signal, it is tempting to speculate that it may be due to the ability of the G
domains to weakly recogm'ze either an S or an H domain in the
particular conformation adopted by the truncated protein.
Lack of signis from the reciproca! NtrB<r7NtrBSHN pair can be
explained by the poorer stability of GAL4AD-NtrB versus
GAL4BD-NtrBG (Fig. 2).
Mutation A129T in NtrB was identified by screening for
glnD suppressors, and its phenotypic characterization suggested that the mutant protein was altered in PI binding or in
the ability to bring about a conformationai change responsible
for the conversin nto a phosphatase (2). Our results indicate
that mutation A129T produced, in truncated proteins and in
particular pairs, a conformationai change arge enough to be
25
detected in our assays since it impaired signis SHN

between
and
NtrB HNc; a n d N t r C a n d D e t w e e n GAL4AD-NtrB
G
GAL4BD-NtrB but not the remaming signis (Tabie 3). The
lack of impact of the mutation on interactions with PII suggests
that A129T affeets not the ability of NtrB to bind to PII but
rather ts ability to interact with NtrC as a phosphatase.
Protein-protein interactions detected here with NtrB derivatives took place only between components of the nitrogen
signal pathway, and evidence is provided for specific recogm'tion between domains of the NtrB transmitter module and
both Pl and NtrC (Fig. 4). Analysis of the different NtrB
derivatives confirms that the H domain is responsible for the
signis obtained with NtrC and indicates that, in the NtrBC
system, the histidine phosphotransfer domain is sufficient for
receiver recognition (Fig. 4, blocks 1 and 2). In agreement with
results obtained with full-iength NtrB (15), NtrB HNG did not
give signis with the heterologous response regulator PhoP. In
addtion, EnvZ HNG did not interact with NtrC or PhoP. Specificity is also observed for interactions between the NtrB transmitter module and PII. NtrB HNG , but not EnvZ HNO or histidine kinase CheA, gave a signal when paired with PII (Fig. 4,
blocks 3 and 4). Similar results have been obtained with purified components (A. Ninfa, unpublished data). Our failure to
detect binding of any noncognate pair of signaling proteins
strongly suggests that the signis we did observe are physiologicaily relevant, providing a rationaie for the use of yeast
two-hybrid approaches to investgate cross talk among signal
transduction proteins and to set up screens to flnd, for a given
component, the cognate partner(s) acting in the same signal
transduction pathway.
Regarding determinants for interactions with PII, our data
indicate that only construets retaining the NG regin gave
signis, while the S domain did not seem to contribute (Fig. 4,
blocks 3 and 4). in accordance with recen results showing in
vitro cross-linking between PII and a C-terminal fragment of
NtrB (amino acids 190 to 349) and suggesting that PII controls
NtrB by interaction with the kinase domain of the transmitter
module (11, 23). Although the G domain has in vivo activiy
(14), it is clearly not sufficient to promote signis with PII in
the two-hybrid system. A larger regin, including the N domain
and perhaps part of the H domain, seems to be required for
contaets with PII. For EnvZ, it has recently been proposed that
physical linkage between the phosphotransfer and kinase domains is critical for regulador) and enables the two domains to
maintain their correct spatial arrangements in a dimer configuraron (34). It is worth noting that the same experimental
approaches (cross-linking and two-hybrid system) showing interactions between PII and polypeptides containing the kinase
domain failed to show contaets between NtrBs and PII. This
highlights the present lack of knowledge of the role of the
unique sensor domain of NtrB. Its homology to PAS domains,
often involved in protein-protein interaction or ligand binding,
is most intriguing. The possibility of additional regulators acting on this domain is currently being explored by two-hybrid
screening o genomic libraries.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grant PB97-0115 from the Ministerio de
Educacin y Cultura.
We thank L Fuentes for excelient technical assistance, M. Drum-
80
206
MARTNEZ-ARGUDO
E T AL.
m o n d a n d M. I n o u y e for strains and plasmids, R. Dixon and . L u q u e

for crilical r e a d i n g of t h e manuscript, a n d A. Ninfa For unpublished
nformation and helpful c o r n m e m s .
J.
18.
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81
2. Interacciones entre los activadores parlogos

NifA, AnfA y VnfA, de A.
vinelandii
Los genes estructurales para el componente dinitrogenasa de cada u n a

de las tres nitrogenasas de A. vinelandii se organizan en tres operones
independientes: nifDK, anfDGK y vnfDGK. Cada uno de estos operones tiene
asociado u n activador especfico: NifA, AnfA y VnfA, respectivamente (Joerger
et al, 1989). Sin embargo, algunos promotores de genes nif auxiliares (como el
del gen nifB\ tienen sitios de unin solapantes para los tres reguladores y
pueden ser activados por cualquiera de ellos (Drummond et al., 1996). Se
desconoce si la unin de los activadores a estos promotores es competitiva o
cooperativa, lo que mpicara algn tipo de interaccin fsica, o incluso
heterodimerizacin, entre estos activadores transcripcionales.
Con el fin de explorar si existe afinidad entre estas protenas de A.
vinelandii y si resultaran adecuadas para usarlas como cebo para la
identificacin
de
protenas
adicionales
con
las
que
interaccionen,
se
construyeron fusiones a los dominios de GAL4 de los reguladores AnfA y VnfA

y se hicieron ensayos doble hbrido independientes en las estirpes de S.
cerevisiae Y190 y PJ696. Esta ltima permite u n a mayor discriminacin en el
rango de interacciones dbiles, ya que su fusin GAL1:HIS3 presenta u n
menor nivel basal de activacin que la de Y190. Los resultados obtenidos
utilizando medios deficientes en histidina, se resumen en las Tablas 1 y 2, y
son muy similares en las dos estirpes utilizadas.
Contrariamente a lo esperado, no se observ interaccin de AnfA consigo
misma, resultado que contrasta con los obtenidos in vitro con variantes
truncadas de esta protena (Austin & Lambert, 1994) y con los obtenidos por
nosotros con NtrC, de similar estructura. Puesto que la combinacin
GAL4AD:VnfA/GAL4BD:AnfA interacciona positivamente, al menos u n a de las
dos fusiones AnfA se expresa correctamente en levaduras y podra utilizarse
como cebo en escrutinios de genotecas. Estos resultados sugieren adems la
existencia de interacciones protena-protena entre los reguladores parlogos
AnfA y VnfA. Por otra parte, la fusin GAL4BD:VnfA activa los genes testigo
por si sola, lo que impide sacar conclusiones relativas a las parejas en las que
participe esta construccin, ni utilizarla en escrutinios de genotecas. As pues,
a pesar de la gran homologa (61% de identidad a nivel de secuencia de
83
aminocidos) existente e n t r e e s t a s d o s p r o t e n a s , s u distinto c o m p o r t a m i e n t o

en
los
ensayos
doble
hbrido
refleja
importantes
diferencias
de
las
correspondientes fusiones, p r o b a b l e m e n t e a nivel de estabilidad o e s t r u c t u r a .
GAL4AD:AnfA
GAL4AD:VnfA
GAL4BD:AnfA
+/-
GAL4BD:VnfA
+/-
+/-
+/-
GAL4BD
GAL4AD
Tabla 1: Interacciones entre AnfA y VnfA en Y190. Los

smbolos indican crecimiento en medio sin histidina de acuerdo
con las categoras previamente definidas (Martnez-Argudo et al,
2001).
GAL4AD:AnfA
GAL4AD:VnfA
GAL4BD:AnfA
GAL4BD:VnfA
GAL4AD
+/-
GAL4BD
Tabla 2: Interacciones entre AnfA y VnfA en PJ696. Los

smbolos indican crecimiento relativo tras tres das de incubacin
a 30C en medio sin histidina y en presencia de 3-AT 1 y 5 mM.
+: crecimiento en ambas concentraciones de 3-AT; +/-:
crecimiento slo en 1 mM 3-AT; -: no crecimiento en presencia de
3-AT.
84
3.
Identificacin
de
protenas
implicadas
en
transduccin de seales de nitrgeno.

La utilizacin de aproximaciones genticas y bioqumicas clsicas ha
permitido la acumulacin de datos sobre la regulacin del metabolismo del
nitrgeno en bacterias. No obstante, quedan preguntas por responder que
sugieren la existencia de u n a mayor complejidad, con elementos adicionales
cuya relacin con el metabolismo del nitrgeno a n no ha sido establecida. En
este sentido, el sistema del doble hbrido, al estar basado en u n a premisa
distinta, las interacciones protena-protena, puede complementar los estudios
previos y aportar nuevos elementos a la red de transduccin de seales de
nitrgeno.
La construccin y posterior escrutinio de genotecas con protenas-cebo
relacionadas
funcionalmente
contribuye
distinguir
las
interacciones
fisiolgicamente significativas de aquellas mediadas por protenas "pegajosas",

mientras que la utilizacin como cebos de presas obtenidas en escrutinios
previos permite ampliar y completar la red de interacciones (Fromont-Racine
ef al, 1997; Fromont-Racine et al, 2000). Este tipo de estrategias permite la
construccin de "interactomas" o redes de interaccin protena-protena.
Puesto que hemos establecido previamente que el sistema del doble
hbrido de levaduras refleja la mayor parte de las interacciones funcionales
que tienen lugar entre los reguladores del nitrgeno NtrB, NtrC y GlnB de
enterobacterias,
parece
razonable
aprovechar
este
potencial
para
la
identificacin de nuevos componentes implicados en transduccin de seales

de nitrgeno y contribuir a la construccin de nteractomas del nitrgeno en
organismos modelo. Adems de en B. coli y K. pneumoniae,
objetivo
fundamental de esta tesis, se ha realizado u n trabajo exploratorio en A.

vinelandit
En este apartado se describe la construccin y escrutinio de
diversas genotecas de expresin de los mencionados organismos.
3.1. Fragmentacin del genoma de A. vineland mediante

sonicacin.
La utilizacin de estrategias de fragmentacin "al azar" permiten,
tericamente,
que
cualquier
fragmento
genmico
est
igualmente
representado, con lo que se podran obtener, para u n mismo gen, diferentes

fusiones a GAL4AD, dominio recomendado para la clonacin de los insertos
85
(Ma & Ptashne, 1987; Ruden et al, 1991). Con el fin de obtener u n a genoteca
compleja y representativa, el DNA genmico de A. wneland fue fragmentado
por sonicacin en condiciones apropiadas para la obtencin fragmentos entre
0,5 y 2 kb de tamao, que fueron separados en geles de agarosa. Se
obtuvieron tres fracciones, de tamaos aproximados entre 0,5-1 kb (fraccin
AZ-A), 1-1,5 kb (fraccin AZ-B) y 1,5-2 kb (fraccin AZ-C). Para la reparacin
de los extremos se utilizaron distintas enzimas y condiciones de incubacin
(ver Materiales y Mtodos). Las diversas preparaciones de DNA genmico se
utilizaron en reacciones de ligacin a pequea escala con los vectores
pGAD424, pGAD424 (+1) y pGAD424 (+2) digeridos con Smal y tratados con
fosfatasa alcalina de gamba. El producto de estas ligaciones fue utilizado para
transformar E. coli DH5a. Las colonias transformantes aparecieron en u n
nmero muy pequeo, y en ninguna de ellas se detect, por PCR, a presencia
de inserto. El anlisis electrofortico de las reacciones de ligacin evidenci la
baja eficiencia de este proceso con fragmentos genmicos, probablemente
debida a u n a baja eficiencia del proceso de reparacin de los extremos
generados.
As pues, la sonicacin, u n a estrategia que en principio permite obtener
genotecas muy complejas, al producir fragmentos con diversos tipos de
extremos que deben ser reparados, implica manipulaciones adicionales, de
cierta dificultad, que suelen repercutir muy negativamente en el n de clones
de las genotecas. Tras sopesar las dificultades prcticas, decidimos descartar
esta estrategia de fragmentacin en favor del uso de digestiones parciales con
enzimas de restriccin.
3.2. Construccin de genotecas Sau3Al de E. coli.

Puesto que las enzimas de restriccin permiten fragmentar los genomas
en segmentos definidos, su utilizacin con genomas como el de E. coli, de los
que se tiene la secuencia y u n a gran cantidad de informacin funcional, nos
ayuda a evaluar el impacto de distintos factores en la calidad de las genotecas
generadas. Por otra parte, la utilizacin de enzimas de restriccin que
producen extremos cohesivos compatibles con sitios de clonacin en el vector,
simplifica el proceso de generacin y ligacin de extremos, con el consiguiente
aumento en la eficiencia de clonacin. As pues, decidimos, en u n a primera
fase, fragmentar el genoma de E. coli mediante digestiones parciales con la
enzima de restriccin Sau3Al. La Figura 3 resume el esquema utilizado en la
86
construccin de estas genotecas, de las que se obtuvieron u n total de 6 y

cuyas caractersticas se detallan en el Anexo III.
DNA geno mico

Digestin parcial Sau3M
Fraccin ara ien to
en sel
Digestin BamH
Fosfatasa alcalina
Fraccin iFYaccin 2
Ligacin
^/Sl
\N>-^
Electroporacin
Ge no teca en
E. coli DH5a
Amplificacin
genoteca
Recogida de clulas
Extraccin DNA plasmdico

DNA Genoteca
Figura 3 . C o n s t r u c c i n y amplificacin de g e n o t e c a s primarias por

fragmentacin e n z i m t i c a (Sau3AI). El proceso esquematizado se repiti p a r a
c a d a fraccin de DNA genmico purificada y c a d a preparacin plasmdica.
87
3.3. Escrutinios de las genotecas Sau3AI de E. coli con

NtrB como cebo.
Con el doble objetivo de aprovechar la abundante informacin existente
sobre NtrB y de identificar protenas adicionales con las que interaccione,
decidimos comenzar los escrutinios de las genotecas Sau3Al utilizando NtrB
como cebo. Esta eleccin nos permita predecir algunos resultados de los
escrutinios en funcin tanto de las interacciones doble hbrido de NtrB como
de la distribucin de sitios Sau3Al en el genoma de E. coli.
Para realizar los escrutinios de estas genotecas utilizando la fusin
GAL4BD:NtrB como cebo, se utiliz u n a
estrategia de
transformacin
secuencia! en la estirpe PJ696. El medio de seleccin se ajust empricamente

para poder detectar interacciones dbiles, minimizando al mismo tiempo la
aparicin de falsos positivos. Se realizaron cuatro escrutinios de estas
genotecas, siguiendo el protocolo esquematizado en la Figura 4, obtenindose
u n total de 96 clones candidatos (Tabla 2-AIII).
Durante el proceso de recomprobacin de los clones obtenidos en los
escrutinios aparecieron plsmidos "contaminantes" que correspondan a
algunas de las fusiones a GAL4AD generadas en la primera parte del trabajo y
que interaccionan con GAL4BD:NtrB. Con el fin de detectar la presencia de
este tipo de clones, se dise u n protocolo de recomprobacin de clones
candidatos que consista en clasificar los clones candidatos en funcin de su
patrn de interaccin con las protenas NtrB, NtrC y GlnB (Figura 5). Los
resultados de estos anlisis nos permitieron en u n
solo
experimento
recomprobar las interacciones detectadas en los escrutinios y discriminar

entre protenas conocidas (codificadas o no por plsmidos "contaminantes") y
desconocidas. Los clones candidatos se clasificaron de este modo en cuatro
grupos, cada uno de ellos representativo de u n fenotipo de interaccin (Figura
1-AHI). Los diferentes clones fueron entonces analizados mediante PCR y
digestiones para comprobar si contenan el mismo tipo de inserto. Al menos
u n plsmido representativo de cada tipo de inserto fue secuenciado para
identificar el fragmento clonado en el mismo.
88
DNA Gcncteca
Transformacin
P J 6 9 6 GAL4BD:NtrB
Genoteca en PJ696
GAL4BD:NtrB
Seleccin
-Leu -Tro -His -Ade 5rr.;
11
:>
)morooa.aon ienonoo
.-vcie
Figura 4. Escrutinio de genotecas Sau3AI mediante transformacin

secuencial y obtencin de clones candidatos. La utilizacin de ces genes
et-sugo permiti la clasificacin fenotpica preliminar de los clones obtenidos en
"falsos positivos" (en azul), candidatos de interaccin dbil (marrn), candidatos
de interaccin media (en verde) y candidatos de interaccin fuerte en rosaj.
Plsmidos cebo
enY187
Clon
candidato
Extraccin DNA
DNA plasmdico
Transformacin PJ696
Plsmido
candidato en
PJ696
Rplica YNB -leu
Rplica en YPD
Rplica medios selectivos
-Ade
+Ade +His
-His
Anlisis marcadores GALl:HIS3y
GAL2:ADE2
Figura 5: Recomprobacin y clasificacin fenotpica de clones candidatos.
90
El resultado neto del escrutinio de las genotecas Sau3Al de E. coli utilizando

NtrB como cebo fue La identificacin, entre 64 clones positivos, de cuatro
polipptidos
diferentes,
correspondientes
tres
protenas,
dos
cuya
interaccin funcional con NtrB era conocida (GlnB y GlnK) y otra ms cuya
interaccin con NtrB no haba sido previamente descrita (AspA o aspartasa)
(Tabla 3-A1II y Figura 2-AIII).
A pesar de que tanto NtrB como NtrC generan u n a fuerte seal en el
doble hbrido cuando se emparejan con NtrB (Martnez-Argudo et al, 2001;
Martnez-Argudo et al, 2002), no se detectaron clones genmicos para estas
protenas (Figura 2-AIII). Puesto que en ambos casos es la regin N-terminal la
requerida para la interaccin de las protenas con NtrB (Martnez-Argudo et
al, 2001), el resultado no es sorprendente. La distribucin discreta de los
sitios de corte Sau3Al explicara la ausencia de, al menos, NtrC como presa.
En el caso de NtrB, si bien no podemos descartar que los 11 aminocidos Nterminales (que inevitablemente se pierden en todas las fusiones a NtrB
generadas en las genotecas Sau3Al) sean requeridos para la interaccin NtrBNtrB, los falsos negativos podran deberse tambin a u n a baja eficiencia de
digestin de la diana Sau3Al relevante.
Es de sealar que, a pesar de que la transferencia de grupos fosfato entre
componentes de distintos sistemas ha sido documentada tanto in vitro (Fisher
et al, 1995; Ninfa et al, 1988; Yaku et al, 1997) como in vivo (Kim et al,
1996; Ninfa et al,
1988; Verhamme et al,
2002), no han
aparecido
reguladores de respuesta entre las presas de NtrB. Puesto que en estas

protenas los dominios receptores se encuentran en posicin N-terminal, las
consideraciones anteriores tambin podran aplicarse aqu, con lo que no
podemos
descartar "falsos
negativos". No obstante, como tampoco
se
detectaron interacciones en el doble hbrido entre CheA y NtrC (MartnezArgudo et al, 2001), entre las que se demostr fosforilacin in vitro (Ninfa et
al, 1988), es posible que la comunicacin cruzada implique interacciones muy
dbiles, no detectables en nuestros ensayos doble hbrido. Alternativamente,
la comunicacin cruzada entre elementos de distintos sistemas no es u n
fenmeno extendido en E. coli y probablemente las interacciones entre
protenas de fusin en levaduras son ms fisiolgicas que los ensayos in vitro.
Resultados recientes, obtenidos con genotecas de Caulobacter
crescentus
utilizando como cebo el regulador de respuesta DivK (Ohta & Newton, 2003)
apoyan la existencia de u n a gran especificidad para las interacciones entre
91
reguladores de respuesta y protenas quinasa pertenecientes a la misma red

de transduccin de seales.
3.3.1. Interacciones NtrB-GlnK.

Con el fin de aportar datos sobre la especificidad y determinantes de las
interacciones entre GlnK y NtrB, se realizaron anlisis doble hbrido entre
GlnK, las diversas variantes de NtrB y las protenas control NtrC, CheA y
EnvZHNG (Figura 3-AIII). Los resultados
indicaron
claramente
que
los
determinantes de la interaccin con GlnK se localizan en el mdulo transmisor

de NtrB, siendo estas interacciones altamente especficas. Estos resultados,
prcticamente indistinguibles de los obtenidos previamente con GlnB, no son
sorprendentes dada la elevada homologa entre los T-loops de ambas
protenas.
El grado de redundancia de las protenas PII de enterobacterias es u n a
cuestin muy debatida (Arcondeguy et al, 2001; Reitzer, 2003). Diversas
observaciones sugieren diferentes funciones para GlnB y GlnK en E. coli,
aunque recientemente se han aportado evidencias genticas de que las
diferencias funcionales entre estas protenas, al menos en lo que concierne a
la regulacin a travs de NtrB, son fundamentalmente
debidas a sus
diferentes patrones de expresin (Atkinson et al, 2002). De acuerdo con estos

autores, la concentracin
relativa de GlnB y GlnK en las
diferentes
condiciones fisiolgicas es lo que permite u n control diferencial de los genes

regulados por nitrgeno. Nuestros resultados son consistentes con esta idea,
sin excluir que existan diferencias en las interacciones entre las protenas PII y
otros receptores.
3.3.2. Interacciones NtrB-AspA.

La identificacin de u n fragmento de AspA (AspA9I-3i2) en los escrutinios
con NtrB como cebo supone la primera evidencia de u n a interaccin fsica
entre esta enzima y u n regulador del metabolismo del nitrgeno. Con el fin de
aportar datos sobre la especificidad y determinantes de la interaccin entre
AspA y
NtrB, se analizaron en el doble hbrido las
construcciones
GAL4AD:AspA5i-3iaf GAL4BD:AspA^-3i2 l a s diversas variantes de NtrB y las

protenas control NtrC, CheA y EnvZHNG. Los resultados indican que la
interaccin entre AspA y NtrB es especfica y que sus determinantes se
localizan en el dominio central de NtrB, coincidiendo, por tanto, con los
92
determinantes de la interaccin con NtrC {Figura 3-AII1, Martnez-Argudo et

al, 2002).
Aunque se requiere cierta precaucin hasta que se demuestre la
relevancia fisiolgica de la interaccin entre NtrB y AspA, es interesante el
hecho de que, como ya ocurriera con las protenas PII, la interaccin no resida
en el mdulo "sensor" sino en el transmisor. Sin descartar que escrutinios
adicionales
con
otras
genotecas
identifiquen
protenas
capaces
de
nteraccionar con el mdulo N-terminal de NtrB, los datos existentes indican

que las actividades fosfatasa (protenas PII) y probablemente quinasa (AspA?)
constituyen el blanco de los reguladores de la actividad de NtrB. Situaciones
reminiscentes se h a n descrito en otras histidina quinasas, en las que la
interaccin con protenas inhibidoras a travs de la regin H(N) regulan la
autofosforilacn (Wang et al, 1997) o la transferencia de fosfato al regulador
de respuesta correspondiente (Berges et al, 2001; Garnerone et al, 1999). En
este contexto, hemos realizado u n a bsqueda exploratoria en las bases de
datos de homologas entre AspA91-312 y estas otras protenas inhibidoras, sin
resultados claros.
La enzima aspartato amono-liasa, o aspartasa, cataliza la conversin
reversible de L-aspartato en fumarato y amonio. En E. coli, esta actividad est
implicada en la utilizacin de glutamato y otros aminocidos como fuente de
carbono y / o nitrgeno y en la produccin de fumarato como aceptor de
electrones durante la fermentacin de la glucosa (Cronan & LaPorte, 1996;
McFall & Newman, 1996; Reitzer, 1996). Teniendo en cuenta la interaccin
protena-protena detectada entre AspA y NtrB y los datos existentes sobre la
expresin de AspA, podra especularse con u n papel inhibidor, en condiciones
de anaerobioss, de la asimilacin de fuentes pobres de nitrgeno. Ello
supondra u n ahorro de metabolitos y energa, constituyendo por tanto u n a
conexin, con sentido fisiolgico, entre la disponibilidad de oxgeno y los
requerimientos de nitrgeno. De acuerdo con esta hiptesis, en condiciones de
anaerobioss, cuando AspA esta inducida (Golby et al, 1998), la interaccin
directa de AspA con el dominio central de NtrB provocara u n a inhibicin de la
fosforilacin de NtrC. De confirmarse dicha conexin, se establecera que la
regulacin de la actividad de NtrB, y por tanto de la activacin del opern Ntr,
se realiza de manera coordinada en funcin de la disponibilidad de carbononitrgeno (a travs de la regulacin por las protenas PII) y oxgeno (a travs de
AspA).
93
Con el fin de explorar la relevancia fisiolgica de la interaccin detectada,

decidimos investigar si las protenas AspA y NtrB t a m b i n interaccionan en E.
coli, m s c o n c r e t a m e n t e n o s p r e g u n t a m o s si la sobre-expresin de AspA
interferira con la actividad q u i n a s a de NtrB. P u e s t o q u e la sobre-expresin de
AspA es txica en E, coli (Chao et al,
2000) y d a t o s no mostrados), n o s
c e n t r a m o s de nuevo e n el fragmento AspA 91 " 312 , q u e se clon en el vector

pTRC99a.
El plsmido
91 312
expresin de AspA -
resultante,
pUAGSllE
nos
permite
controlar
la
en funcin de la conentracin de IPTG en los cultivos.
Los m u t a n t e s glnB glnK de E. coli son defectivos en la actividad fosfatasa

de NtrB y a c u m u l a n NtrC-P, q u e a s u vez d e t e r m i n a la a c u m u l a c i n del
regulador
transcripcional
Nac, q u e
acta
como r e p r e s o r
del gen
serA,
implicado en la biosntesis de p u r i n a s . La deficiencia en SerA es en g r a n p a r t e

r e s p o n s a b l e de la incapacidad de los m u t a n t e s c a r e n t e s de protenas PII d e
crecer en medio mnimo (Blauwkamp Sis Ninfa, 2002). La inhibicin de la
actividad q u i n a s a de NtrB, podra por t a n t o r e s t a u r a r el crecimiento, al
c o n t r a r r e s t a r la produccin de NtrC-P. Con el fin de explorar si la actividad
q u i n a s a de NtrB p u e d e ser inhibida por la sobreexpresin de AspA in vivo,
c o m p a r a m o s el impacto de la sobreexpresin de AspA 9 1 3 1 2 sobre el crecimiento
en medio mnimo de las estirpe silvestre (ET8000) y doble m u t a n t e glnB glnK
(FT8000). Los r e s u l t a d o s preliminares no indicaron diferencias significativas
de crecimiento al sobreexpresar AspA 9 1 3 1 2 . No o b s t a n t e , la inhibicin del
crecimiento en las condiciones utilizadas en n u e s t r o s e n s a y o s o b s e r v a d a en
los derivados de FTS000 que contienen
el vector control,
en
principio
i n e s p e r a d a , dificulta la interpretacin de r e s u l t a d o s (Figura 6). Se requieren

por t a n t o e n s a y o s adicionales y otras aproximaciones experimentales p a r a
investigar el significado fisiolgico de la interaccin e n t r e AspA y NtrB.
Figura 6: Efecto de la sobre-expresin de

AspA91"312. Crecimiento de derivados de ET8000
(silvestre) y FT8000 (rautante glnB glnK) en
condiciones de exceso de nitrgeno. 1: ET8000
2: ET8000 + pTRC99a 3: ET8000 + pUAGSllE
4: FT8000 + pUAG511E 5: FTS000 + pTRC99a 6:
FT8000.
94
3.4. Escrutinio de genotecas Sau3Al de E. coli con GlnB

como cebo.
Las protenas PII {GlnB y GlnK), reguladores clave del metabolismo del
nitrgeno estn altamente conservadas en bacterias, archaeas y plantas,
aunque no lo estn las protenas con las que interaccionan {blancos o
receptores de PII) en los diferentes organismos (Arcondeguy et al, 2001; Ninfa
& Atkinson, 2000). En E. coli se conocen tres receptores de GlnB (tambin
receptores de GlnK): NtrB, GlnD y GInE, cuyas interacciones funcionales han
sido objeto de numerosos estudios (Ninfa et al, 2000).
Con el objetivo de identificar nuevos receptores de GlnB, utilizamos esta
protena como cebo en nuevos escrutinios por transformacin secuencia! en
PJ696, utilizando mezclas equivalentes de las genotecas SO-1-2 y L0-1-2. La
clasificacin fenotpica de los clones candidatos se realiz en base al patrn de
interaccin con las protenas NtrB, GlnB, GlnD y GlnE. La Tabla 3 recoge los
datos correspondientes a estos escrutinios, en los que se identificaron nueve
tipos distintos de clones, correspondientes a cuatro polipptidos distintos
(Tabla 4 y Figura 7).
El resultado neto de los escrutinios con GlnB como cebo fue la
identificacin de tres protenas cuya interaccin con GlnB en el doble hbrido
era conocida o predecible
(NtrB, GlnB y GlnK), y otra ms
(YadF),
impredecible. Tres tipos de clones contenan secuencias del gen
glnK
correspondientes a los fragmentos Sav3hl de 1173 y 752 bp ya rescatados con

NtrB como cebo. A su vez el fragmento de 752 bp constitua todo el inserto en
unos clones o contena a continuacin u n segundo fragmento genmico
Sau3AI no relacionado. Dos tipos de clones correspondan al gen glnB, uno
contena el fragmento Sau3Al de 476 bp, rescatado con NtrB, y el otro u n
fragmento de unas 1300 bp. Un solo tipo de clon, de 1008 bp contena
secuencias del gen ntrB. Este fragmento codifica para el mdulo transmisor de
NtrB, dando u n a protena de fusin similar a la producida a partir del
plsmido pUAG221 (NtrBHNG, ver Figura 2), que interacciona con GlnB en el
doble hbrido (Martnez-Argudo et al, 2002). Por ltimo, tres tipos de clones
correspondan a secuencias del gen yadFf cynT2/can,
que codifica para u n a
anhidrasa carbnica clase p\ Los tres tipos de clones comparten u n fragmento

genmico de 835 bp que permite obtener fusiones a GAL4 de los aminocidos
22-220 de esta enzima. Dos de estos tipos de clones, contienen, fusionados a
95
Genoteca
,
JN clones
. coa
50
620.000
51
150.000
52
620.000
LO
100.000
Ll
300.000
L2
100.000
transformantes
,
colonias
obtenidas en
. .
levaduras
escrutinio
760.000
42
41
130.000
64
63
CJlones
candidatos
Tabla 3. Escrutinio de genotecas Sau3AI E. coli utilizando GlnB como cebo.
Genoteca
Inserto a
N de clones
yadFS35
/adFS35-A
yadF835-B
glnK752
glnK7 52-Y
glnm76
glnB1300
ntrBl 008
glnKl 173
glnK752
SO-1-2
LO-1-2
Tabla 4: Clones identificados en los escrutinios de genotecas

Sau3Al E. coli utilizando GlnB como cebo. a A, B e Y representan
fragmentos Sctu3AI no relacionados adyacentes a los fragmentos
indicados.
96
glnK
amtB
glnB
g/ttK752
hmpA
glnK] \73
nrf
g/476
g/1300
rcfrC
H
n/rfl]008
vadF
rf
yacMIS
glnE
I
T"
glnD
TTT
Tr*
Figura 7. Mapas fsicos de las regiones genomicas que codifcan para

protenas que interaccionan con GlnB. Las lneas verticales sealan sitios
Sau3AI (rojo) y Tsp509I (azul). Los fragmentos genmicos identificados en los
escrutinios de genotecas Sau3Al con GlnB como cebo se muestran como lneas
negras bajo cada gen. Los nmeros indican tamao en bp.
97

Resultados v Discusin
continuacin.
fragmentos
genmicos
Sau3Al
no
relacionados.
Las
correspondientes protenas de fusin contendran intactos el ncleo centra'.,

implicado en la unin a Zinc y el subdominio C-terminal. Solo estara a u s e n t e
u n a de las e e s hlices del brazo N-terminal de YadF. que
proporciona
importantes contactos entre los monmeros del dmero Y a c ? >Cronk el al..

2001,.
La falta ele p r e s a s correspondientes a los genes glnD y glnE. a pesau~ de
que las protenas de fusin correspondientes interaccionan con GlnB en el
doble hbrido catos sin publicar), sugiere que det.ermina.ntes importantes de
tales interacciones se e n c u e n t r a n en regiones N-terminales de las protenas,
m s difciles de identificar.
Las a n h i d r a s a s carbnicas catalizan la interconversin de CO2 en HCO3 .
Este anin es necesario p a r a la biosntcsis de varios amino cidos, b a s e s
nitrogenadas, cidos grasos y en el metabolismo central. El g e n o m a de E. col:
codifica p a r a dos a n h i d r a s a s carbnicas tipo (3: CynT y YadF y otras tres
hipotticas de tipo y. CaiE. PaaY y YrdA (Smith & Ferry. 2000: Tripp el al..
2001;. Entre ellas. YadF es la nica esencial p a r a la proliferacin clula:- en E.
col: en condiciones "normales" de crecimiento, a u n q u e no cuando la presin
parcial de CO- es alta o en anaerobiosis a pH bajo (Hashimcto & Xatc. 2003:
Merlin el al. 2003). S o r p r e n d e n t e m e n t e , la transcripcin de yaF.
analizada
con fusiones lacZ, no depende de la concentracin de CO2. a u n q u e si se afecta

por factores como la t e m p e r a t u r a o la densidad celular. La posibilidad ce
regulacin post-transcripcional dependiente de COo no fue analizada er .os
trabajos mencionados.
A la vista de todos estos datos, habra que considerar la posibilidad de
que GlnB t r a n s m i t i e r a a YadF informacin sobre la relacin C/N
celular
Nuestra: hiptesis de partida es que en condiciones de exceso de nitrgeno

GlnB mteraccionara con YadF a fin de estimular su actividad
cataltica,
incrementando por tanto la fijacin de CO2. Es de sealar que estas sen las
condiciones 1 medio rico LBi en las que se h a observado que YadF es esencial
para, el crecimiento en E. coli.
3,5, Construccin de genotecas Tsp509l
de E. coa
El u s e de varias enzimas de restriccin en la construccin de genotecas

permite el anlisis de u n gran n m e r o de clones sin r e n u n c i a r a las ventajas
98
:M .a. ;rag:::ertac;on etrzimtica James el al.. 1996: Kaoar: t: al.. .A.OC . A fin.
do
complementar
las
genotecas
Sau'SAl.
se abord
"a c e n s . "accin
g u t e t e c a s ~stp391 de X. roli. Para ello, los plasmados pGAA-'d A
JA.AI-2-
ce
1;
v pGAD-124 '-2) se mezclaron en u n a proporcin 1:1:1 a n t e s de s u digeridos

'."m. Acaba y ces.bsforbados con fosfatasa alcalina de gamba y el AAM genmico
de A. co// se digiri parcialmente con 71sp509I a n t e s de ser separado en cuatro
Xareior.es. aenombracias MGT5. MGT6. MGT7 y MG73. Se :r-abzar at u:: ;o:ai
de- cuatro reacciones de ligacin entre el "vector" y cada fraccin de inserios.
'cransformani.es. u n o s 5 x 1 0 clones de cada fraccin se mezclaron para d a r

lugar a a n a nica genoteca ele fragmentos
l",sy509i de .11. :a:l c r r c m i n a c l a
MGT. Una vez mezclada, esta genoteca fue amplificada y procesada, del modo
A serbo oa.ra ias genorecas Sa;<3AI. ba Tabla 5 recoge los caaos ce a g e n c e c a
MGT.
3.6. Construccin de genotecas SauSAl
"SDD091
de
pneumomae
Cor: el fin
de detectar
presas
adicionales
'falsos
eseruecinios ele A. cali y lo presas especficas de K. pneumona.':

genotecas SaaAAl y Tyy509I a partir del genoma de K. pnen
.c traeres
par su capacidad ce fijar niirgeno. El DMA genmico de K. >
lae Moa 1
bar
raccrenes
parcialmente
digerido
con
Saull.AL
y se
purificaror
a-ao:uinarlas KS (fragmentos de 0,5 1 kb) y Kb ;fragm.cn.

Astas fracciones se utilizaron para obtener seis genorecas
caraorerisbeas relevantes se reflejan en la Tabla 6.
bas digestiones parciales del DMA genmico de K. pneu
toa i cer-
IseACAl generaron las fracciones KPT. KPT7, K?T8 y KAMb
as que se
arocedi ele forma idntica a la descrita p a r a la genoteca A

:.M -ci lugar a la genoteca KPT (Tabla 7j.
MG
,-, .
yabgenoteoas
I amano
.
insertos
.\ clones
..
L. con
MGT5
0,5 I ,3 kb
500.00
MGT6
0,8 13 kb
500.000
MGT7
1,3-1,5 kb
500.000
MGT8
1,5 2 kb
500.000
V' clone
i.o;E.es
Tabla 5. Genoteca Tsp509l Escherichia coli MGISo
Tamao inserios
Vector utilizado
0.5-1 kb
pGAD424
0.5 i kb
pGAL)424 ' - I :
0.5-i kb
pGAD424 ;-2.
1.5 kb
pGAD424
.5 kb
pGAl)424 : - l .
.-1.5 kb
OGAD424 ;-2;
T " "
rabia 5. Genotecas Sau3Al Klebsiella pneumoniae Ivlsal
Gen o:eca
Subge:".o tecas
Tamao
insertos
N" clones
I-i. ecli
KFT18
0,4 0,7 kb
500.000
KPT6
0,8 13 kb
500.000
XPT7
1,3-1,5 kb
500.000
Klyi8
1,5 2 kb
500.000
K?T
v clones
totales
2 ><
Tabla 7. Genoteca Tsp509l Klebsiella pneumoniae MSal
100

r?esui..Kcos -; Discusin
3.7. Escrutinios doble hbrido por conjugacin.

Diversos factores, entre ellos el hecho de que a l g u n a s protenas de fusir.
resuitan
txicas,
dificulta
la
obtencin
de
transformantes
durante
los
escrutinios de genotecas por transformacin. As por ejemplo, la utilizacin de

G-ir.K o XtrC como cebo, siguiendo el procedimiento esquematizado en la
Figura - . resulta en bajas eficiencias de transformacin.
Con
el fin
de
optimizar
los escrutinios,
decidimos
realizarlos
por
conjugacin. Esto implica u n a p r i m e r a transformacin en levaduras, a gran

escala., de las genotecas primarias. En el caso de las genoiecas Sau3Al.
se
utilizaron mezclas equivalentes de DNA de las seis genotecas obtenidas en

cada caso. E. coliy
K. pneumoniae.
con el fin de obtener ur.a n i c a geno:eca
en levaduras p a r a c a d a organismo y enzima. Las genotecas obtenidas en

P J 6 9 6 (MATaj fueron amplificadas, distribuidas en alcuotas, y g u a r d a d a s a
- 8 0 C p a r a u s o s posteriores. La Tabla 8 recoge ios d a t e s referentes a las
genotecas obtenidas en P J 6 9 6 . n o m b r a d a s en funcin dc gen. orna y enzima ele
restriccin utilizadas en la construccin de las genotecas primarias.
El escrutinio
de e s t a s
genotecas
se realiza
siguiendo
el
esquema
m o s t r a d o en la Figura 8. Para c a d a escrutinio a realizar, u n a alcuota de la

genoteca en P J 6 9 6 yMATaj se conjuga con u n cultivo de u n a estirpe de Y187
MATc
que expresa el cebo de inters. Dado que la eficiencia
de estos
protocolos depende f u n d a m e n t a l m e n t e del n m e r o de clulas de cada rirjo

sexual presentes, y no de su eslado de competencia, el n m e r o :1c clones
analizados en escrutinios de u n a m i s m a genoteca utilizando diferentes cebos
resulta m s reproducale.
En
resumen,
la
utilizacin
de
protocolos
de
corrugacin
permute
minimizar los efectos r e s u l t a n t e s de la toxicidad de algunos cebos -. a u m e n t a r

la eficiencia ele ios escrutinios u n a s 10 veces, respecto a protocolos anteriores.
Por otra parte, la menor sensibilidad a la activacin t r a n s c n p c i o n a i
que
p r e s e n t a n los genes testigo en el contexto de la clula ciiploice Kolontn el al..

2C0Q1. disminuye el n m e r o de falsos positivos observado con ciertos cebos en
las placas de seleccin.
101
Genoteca
PJ696
KPTsp
Origen insertos
N clones
E. coli
N clones
levaduras
2 x 10 6
1,54 x 10 6
2 x 10 6
2,66 x 10 5
6,03 x 10 5
6,06 x 10 5
K. pneumoniae
ECTsp
E. coli
ECSau
coli
Tabla 8. Genotecas doble hbrido en PJ696.
Genoteca PJ696
fusiones GAL4AD
Cultivo Y187
GAL4BD:Cebo
Mezcla 1:2
Siembra en YPD
CONJUGACIN
Recogida y lavado
--
DiploidesPJ696/Y187
Siembra en medio selectivo
para interaccin
Clones candidatos
Figura 8. Escrutinio de genotecas doble hbrido mediante conjugacin.
102
Anexo III
103
Mol Gen Genomics (2003) 269: 574-581

DO 10.1007/500438-003-0866-7
ORIGINAL PAPER
P. Salinas A. Contreras
Identification and analysis of Escherichia o//proteins that interact

with the histidine kinase NtrB in a yeast two-hybrid system
Received: 25 February 2003/ Accepted; 21 May 2003 / Publisfied oniine: 28 June 2003
Springer-Verlag 2003
Abstract In this work we tised the yeast two-hybrid

(Y2H) system to deepen our understandmg of proteinprotein interactions that are involved in the nitrogen
regutatory network in Escherichia coli. Three different
genes, encoding GlnB, GlnK and AspA, respectively,
were found among 64 positive clones identified from
E. coli Sau 3AI Y2H librarles using the rtitrogen regulator NtrB as bait. Structura and functional analysis of
the prey clones provided information on library features
and the degree of saturation achieved in the screens.
Further analysis revealed that the C-terrainal kinase
domain of NtrB is required for the interaction with
GlnK, whe AspA 91 " 31- interacts specifically with the
conserved histidine phosphotransfer domain of NtrB,
thus providing additonal evidence for the involvement
of the conserved transmitter module of the histidine
kinase NtrB in input sensory functions.
Keywords NtrB - GlnK Aspartase Nitrogen
interaction network
Introduccin
The NtrBC two-component system reglales cr54dependent transcription of nitrogen-regulated genes in
enteiic bacteria (Ninfa et al. 2000). NtrB and NtrC act
as the sensor and the response regulator, respectively, of
a two-component signal transduction system, based on
histidine-aspartate phosphotransfer. In the simplest such
systems, the transmitter module of the sensor protein
Communicated by A. Kondoros
P. Salinas A. Contreras (El)
Divisin de Gentica, Facultad de Ciencias,
Universidad de Alicante, Apartado 99, 03080 Alicante, Spain
E-mail: con trera@ ua.es
Tel.: +34-965-903957
Fax: +34-965-909569
autophosphorylates at a conserved histidine residue,

then transfers the phosphoryl group to a conserved
aspartate in the receiver domain of a response regulator,
which is often a transcriptional regulator. The transmitter or autokinase module consists of a histdinecontaining phosphotransfer or centra! domain and a
C-terminal kinase domain (West and Stock 2001).
Despite the structura conservacin in two-component
systems, and its possible implications for cross-talk, the
histidine phosphotransfer and receiver domains appear
to be responsible for the specificity of binding interactions between histidine kinases and ther cognate response regulators (Hoch and Varughese 2001).
Signis that indcate carbn and nitrogen status
determine the ability of PII proteins to reglate NtrB.
The PII proteins are encoded by two closely related
genes, glnB and glnK, which show different patterns of
expression, the latter beititg induced on(y under conditions of nitrogen starvation (Atkinson et al. 2002a,
2002b). The nitrogen status of the cell is primariiy sensed
by the tiridylyltranferase/uridyiyl-removing enzyme
(UTase/UR), encoded by glnD. Under nitrogen limitacin condtions, Le., when glutamine levis are low, the
UTase/UR uridylylates the PII proteins, while the enzyme de-uridylylates the proteins when nitrogen is
present in excess (Jiang et al. 1998a, 1998b). Nonuridylylated PIs interact with NtrB to determine the
balance between the phosphorylation and dephosphorylation reactions of NtrB (Atkinson and Ninfa 1999;
Jiang and Ninfa 1999; Pioszak et al. 2000), which in
turns catalyzes the phosphorylation and dephosphorylation of NtrC, the transcriptional regulator of the Ntr
regulon.
The N-terminal domain of NtrB is required to actvate the phosphatase fuoction of the central domain
after GlnB binding to the C-terminal kinase domain of
NtrB (Jiang et al. 2000; Martinez-Argudo and Contreras
2002; Pioszak and Ninfa 2003). The implication of its
C-terminal portion in signal recepton differentates
NtrB from most other histidine kinases, n which sensory
functions are provided by N-terminal domains (Zhulin
105
575
et ai. 2003). The N-terminal regin of NtrB is rather

unique and shows homology to PAS domains (Taylor
and Zhulin 1999), which are often involved in protenprotein interaction and ligand binding. So far, however,
there is no evdence for sensory functions assocated
with this, so-called sensor, N-terminal domain of NtrB.
In previous studies, we demotistrated the useftilness
of the yeast Y2H system for probing interactions mediated by NtrB domains, showing that the N-terminal
domain provides intersubunit contacts and that the
central and C-terminal domains specifically interact,
respectively, with the receiver domain of NtrC and with
the T-loop of G!nB (Martinez-Argudo et al. 2001, 2002;
Martinez-Argudo and Contreras 2002). We reasoned
that Y2H strategies would also alow us to search for
additional NtrB-binding proteins, such as proteins that
mght be involved in two-component cross-tatk or in
signaling particular stimuli to the N-terminal domain of
NtrB, and to further analyze interactions mediated by
NtrB.
Materials and methods

The strains and plasmids used in this work are usted in Table 1.
Unless otherwise indicated, cloning procedures were carried out
with E, coli DH5a, using standard techniques {Sambrook et al.
1989). AU constructs generated in this work were verified by
auomated dideoxy DNA sequencing.
Construction of plasmids
To oonstruct the plasmids pUAG331 and pUAG332, a pMD182
fragment was amplified by PCR with the primers NTRB-8F
(5'-CGGGATCCGTGCGCGACTATGACCC-3') and NTRB-1R
(5'-CGGGATCCTACTTCCGAATAGGCAG-3'), cleaved with
Bam HI, and cloned into pGAD424( + 2) and pGBT9( + 2). To
construct pUAG182, an Eco Rl-Sa fragment from pUAGISl was
cloned into pGBT9( + 2). To construct pUAG5!2, a Sma l-Sail
fragment from pUAG5ll was cloned into pGBT9(+ I).
Construction of Y2H libraries

GenomicDNA from E. coli MG1655 (20 g) was partially digested
with Sau 3AI (Amersham Pharmacia Biotech) under conditions
that gave the highest yield of fragments in the 500-1500 bp range.
After electrophoresis in preparative 0.8% agarose geis, portions
contanng DNA fragments ranging in size from 500-1000 bp and
from 1000-1500 bp were separately recovered, and the DNA was
extracted and suspended in ultrapure water. A second round of
electrophoresis indicated that size fractionation in the preparative
gel was imprecise, since fragments could be visuaiized outside the
selected size range (data not shown). Vector DNA was prepared by
digesting
5-10 jtig of pGAD424,
pGAD424(-l-1)
and
pGAD424( + 2) with Bam HI accordng to the enzyme manufacturera instructions. Digests were treated with shrimp alkaline
phosphatase (Roche) and the DNA was extracted and resuspended
in ultrapure water.
Lgation reactions were carried out in a final volume of 70 jul,
at a molar ratio (vector:inser) of 1:3. After overnight incubation
with 2 Weiss units of T4 ligase (New England Biolabs) at 6C.
reactions were precipitated with butanol, washed with absolute
ethanol and 70% ethanol and resuspended in 7 A of ultrapure
water. Aliquots (1 /d) of each lgation reaclion were transformed
into 200-/d samples of electrocompetent E. cali by electroporation (at 2.5 kV, 25 /uF and 400 O) in a Gene Pulser II (Biorad).
For each of the six vector-insert combinations, six transformation reactions were performed o genrate sufficient numbers of
transformants. LB mdium (i mi) was added to each transformation reaclion, then they were pooled and incubated at 37C
for l h. Small aliquots were plated to determine the total tiuraber of primary transformants originating from the same ligation
reaction and to analyze the efficiency of inser incorporation.
The proportion of insert-containing plasmids in each library,
estimated by PCR analysis using the primers ACT-A (5'-AGGGATGTTTAATACCACTAC-3') and ACT-B (5'-CAGTATCTACGATTAATAG-3'),
was
in
the
90-98%
range.
Transformations from each ligation reaction were piated on LB
Amp to give 20,000-40,000 cfu per 14-cm petri dish. After
incubation at 37C for 16 h, all colonies were scraped into iiquid
LB mdium. In each case, the library culture was incubated
at 37C for 2-4 h with shaking (200 rpm) and one-third of the
suspensin was used for plasmid preparation. The remainder of
the library culture was divided into 50-m! aliquots and stored
at -70C. The resulting DNA libraries were named according
to the range of insert sizes (L or S) and the reading frame (0, I
or 2).
Screening of libraries
Yeast methods
Yeast culture, transformaron and mating procedures were performed as described previousiy (Ausubel et al. 1999; Kolonin et al.
2000), except where otherwise indicated. Growth of the Saccharomycei cerevisiae strain Y190 on histidine deficient mdium was
monitored on solid YNB mnima! mdium without Leu, Trp, and
His, in the presence of different concentrations of 3AT (3-amino1,2,4-triazole), as previousiy described (Martinez-Argudo et al.
2001, 2002). jS-Galactosidase actvity was measured as described
previousiy (Schneider et al. 1996).
For Y2H interaction assays, derivatives of strain PJ696 carrying GAL4AD fusions were mated to derivatives of strains Y187
carrying GAL4BD fusions. To this end, the strains were streaked
in parad iities on YNB minimal mdium lacking Leu or Trp,
respectively, and incubated for 2 days. Plates were pressed onto
the same replica velvet so that the lines from both yeast strains
interseced at right angles. The resulting grid was then replica
plated onto YPD mdium and incubated overnight before replica
plating onto YNB plates without Leu and Trp, and (a) -Ade, (b)
- His + 5 mM 3-AT, (c) - His + 1 mM 3-AT, and (d) control
plates, thus imposing progressively less stringent selection conditions.
Plasmids corresponding to E. cot libraries SO, SI and S2 were

pooled in a 1:1:1 ratio and transformed into S, cerevisiae PI696
containing the bait plasmid pUAG212 (yeast library S0-1-2), 'lo
minmize losses due to a possible selection against longer insers,
the LO, U and L2 E. coli libraries were transformed separately
into the same strain. For each screen, 50 tg of plasmid DNA
was used to transform 5. cerevisiae PJ696 carrying pUAG212. In
each case, the resuiting 10 mi of transformants were plated on
YNB minimal mdium lacking Leu, Trp and His and containing
5 mg/1 Ade. Small aliquots were also plated on YNB lacking
Leu and Trp to determine the total number of transformante.
After 7 days of incubation on selectve plates, al! whitish
colonies bigger than 2 mm were streaked onto ffesh mdium.
Individual colonies from selection piafes were replica-plated
onlo YNB plates withou Leu and Trp, imposing different
stringency conditions for selection of interactions. To rescue
library plasmids from clones that gave rise to colonies on all
three media (candidate clones), plasmid DNA was extraeted
from yeast clones and used to transform PJ696 or electrocompetent E. coli HB01. E. coli Leu4" transformants were selecltsd
in E-glucose mdium, and used as a source of DNA for structural anaiyses.
106
576
Table 1 Srains and plasmids

Strain/plasmid
Gen o ty pe/rele va nt ch a racteri s tics
Source/reference
E. coli DH5a
F" <j>%0dlacZAMl5A( lacZA-argF)Ul69endAI recAl hsdRU

(rK~ mK + ) deoR thi-1 supE44 gyrA96 relAl /."
F~ A( gpt - proAyolleuB 6 gnV44 ara-14 galK2 lacYl A{mcrC-mrr)
rpsL20 (Strr) xyt-5 mil-1 recAil
Wild type
MATa ura3-52 his-200 ade2-Oi trpl-90 Ieu2-3,112 gaUA
galSOA URA3::CAL UA^-GAL TATA -lacZ
LYS2..GALI VAS -HIS3 TATA HS3 cvh r 2
MAT<x ura3-52 his3-200 ade2-10l trpt-901 !eu2-3. 112 gal4A met"
gal80A URA::GAL1 UAS-GALl
TATA-lacZ
MATa.ade2Atrpl-901 leu2-3,l2 ura3-S2 his3-20Q cvh R can R gal4A
galSOA met2 -GAU::ADE2 GALI::HIS3 GAL7::lcZ
K, pneumoniae glnA ntrBC
Ampr, LEU2 , GAL4(78-881) AD
As pGAD424, fusin in a different frame (+ 1)
As pGAD424, fusin in a different frame ( + 2)
Ampr, TRPl, GAL4(-47) BD
As pGBT9, fusin in a different frame (+ 1)
As pGBT9, fusin in a different frame ( + 2)
GAL4AD:NtrC
GAL4BD;NtrC
GAL4AD:CheA
GAL4AD:NtrB
GAL4BD;NtrB
GAL4AD:NtrB HNG
GAL4BD:NtrBHNC:
GAL4AD:NtrB s
GAL4BD:NtrBs
GAL4AD:NtrB SHN
GAL4BD:NtrBSHN
GAL4AD:GlnB
GAL4BD:GlnB
GAL4AD:NtrBSH
GAL4BD:NtrBSH
GAL4AD:NrBH
GAL4BD:NtrBH
GAL4AD:NtrB HN
GAL4BD:NtrBHN
GAL4AD:NtrB c
GAL4BD:NtrB
GAL4AD:nvZ MNG
GAL4BD:EnvZ HNG
GAL4AD:NtrB NG
GAL4BD:NtrB NG
GAL4AD:GInK
GAL4BD:G!nK
GAL4AD:AspA 9I - 3i2
GAL4BD:AspA91-312
Hanahan(1985)
E. CO/ HBOl
E. C>/MG1655
S, cerevisiae Y190
S. cerevisiae Y187
S. cerevisiae PJ696
pMDL82
pGAD424
pGAD424(+!)
pGAD424( + 2)
pGBT9
pGBT9(+l)
pGBT9( + 2)
pUAGll
pUAG12
pUAGlOl
pUAG211
pUAG22
pUAG221
pUAG222
pUAG251
pUAG252
pUAG261
pUAG262
pUAG171
P UAG172
pUAG281
pUAG282
pUAG29I
pUAG292
pUAG30I
pUAG302
pUAG31I
pUAG312
pUAG501
pUAG502
pUAG33I
pUAG332
pUAGISI
pUAG182
pUAG51!
pUAG512
Resulte
Construccin and screening of E. coli Y2H libraries
using NtrB as bait
In an attempt to further characterize the nitrogen regulad o n network, we constructed Sau3AI Y2H genomic
E. coli libraries and analyzed them for proteins that
could interact with NtrB. Because a good deal of ftmetional and Y2H data regarding NtrB interactions are
available, the recovery of known genomic restriction
fragments would provide empiricat informacin on how
re presenta ti ve these libraries were. With this in mind, a
Sambrook et al. (1989)

Guyeretal. (1981)
Harper et a!. (1993)
Harper et ai. (1993)
James et al. (1996)
Wootton and Drummond (1989)
Bartel et al. (993)
Roderet al. (996)
Roderet al. (1996)
Chienetal. (991)
Roderet al. (996)
Roderet al. (996)
Martinez-Argudo et al. (2001)
Martnez-Argudo et al. (2001)
Marti nez-Argudo et al. (2001)
This work
This work
This work
This work
This work
This work
total of six different DNA libraries from E. co!iMGl655

were generated after independent ligaton of the three
vectors (which allow insertion of insert fragments in all
possible reading frames) pGAD424, pGAD424(+ 1) and
pGAD424( + 2), to each of two DNA fractions corresponding to restriction fragments in the ranges of 0.5 . 0 ( S ) a n d 1.0-1.5 kb (L). The resultingi. coli libraries,
each containing a mnimum of 105 independent clones,
were named SO, SI, S2, LO, Ll and L2.
We performed co-transformaton experiments with
different combnations of known GAL4AD and
GAL4BD fusin proteins to optimize conditions to
select for nteracting fusin proteins in S. cerevisiae
107
577
Table 1 B. coli Sau 3AI librarles screened and clones reeovered

Library
Number of independen! E, coli clones
Yeast transformants
Candida le clones
True posilive clones
SO
SI
S2
LO
Ll
L2
620,000
150,000
620,000
100,000
300,000
100,000
300,000
32
29
1,300,000
3,000,000
6,200,000
11
21
32
0
II
24
PJ696. Smultaneous selecton of GAL2:DE2 and

GAL 1 :HIS3 markers greatly dminished the incidence of
clones giving relatively weak Y2H signis. Since the
addition of 5 mg/i Ade to YNB minimal mdium tacking Leu, Trp, Ade and His allowed the recovery of the
most postive clones (data not shown), these conditions
were chosen for subsequent NtrB screens.
Table 2 summarzes relevant data concerning the
construction and screening of libraries. Some 96 clones
(hereafter referred to as candidate clones) activated both
reportera, and were selected for further analysis. Differences n their ability to grow under the different
selective conditions tested suggested that these clones
were heterogeneous (data not shown).
To confirm that prey clones indeed promoted NtrBdependent reconstitution of GAL4 activity, plasmid
DNA from each of the candidate clones was rescued via
transformaron of E. coli HB101, and used to transform
PJ696. Bat-free transformants carrying ibrary derivatives were mated to Y187 strains carrying pUAG212 or
pGBT9 plasmids. Of the 96 candidate clones, 64 activated the reporters GAL2: ADE2 and GAL1: HIS3
specifically with the GAL4BD:NtrB fusin, and were
considered true positives at this stage. PCR analysis of
the insers present in a few, randomly picked, false
positives confirmed the presence of two different preys in

those clones (data not shown).
Grouping of prey clones by Y2H analysis
Previous Y2H analysis had shown that NtrB gave signis with NtrC, GlnB, NtrB and NtrB 3 (MartinezArgudo et al. 2001; 2002; and data not shown). The
pattern of interactions mediated by each protein or
protein fragment is unique, and can therefore be used to
analyze the heterogeneity of prey clones and their phenotypic resmblance to known nitrogen regulators.
Based on the interactions of GAL4AD fusions to NtrB,
NtrC, GlnB and NtrB s with GAL4BD fusions to NtrB,
GlnB and NtrC in the PJ96/Y187 diploid, we classified
NtrB binding partners into four major groups, each
represented by one of these proteins (Fig. 1). Since the
strength of the interactions varies between very strong
(NtrB/NtrC) and very weak (GlnB/GlnB), further differentiation within a given class is also possible.
Mating of PJ696 strains carrying positive clones to
Y187 strains carrying GAL4BD fusions to NtrB, NtrC
and GluB proteins, and subsequent analysis of GAL2.
ADE2 and GAL\:HIS3 reporters from diploid strains,
allowed us to group all 64 prey plasmids into two different interaction phenotypes. Forty-four of these
clones joirted class III (GlnB-lke). The remaning 20
clones were assigned to class IV (NtrBs-like), since they
dd not interact with any other of the fusin proteins
tested. Interestingly, alt clones in class IV gave stronger
signis with NtrB than the reference protein (data not
shown), suggesting that the corresponding prey plasmids encode proteins not previously known to interact
with NtrB.
Fig. 1 Interacton patterns of representative poiypeptides that

interact with NtrB. Growth of PJ696/Y187 diploids under different
selecton conditions for GAL2: ADE2 and GALl; HS3 reporters.
The GAL4AD and GAL4BD fusin proteins carred by diploids
are indicated on the left and at the top of panels, respectively. The
dashes indcate the absence of proteins fused to GAL4 domains.
Details of mdium composition and selecton intensity are
indicated below the panels. Photographs were taken 4 days after
replica plating
i 1i ' l l l '111
<
GAL4AD
..-. .-.
I;;;- Vi'--':
Ntr3
NlfC
l ':
GlnB
N!r6
:;...
:M
'.:. l
':.,.%
IS " '.'
1
' ' ' . -
Ade
lili
illli
mm:M!
iBSil
.j-:S;KijMbs"--;.\.VIi:
xMB^M
-His *5mM 3-AT
:^m^&':
H;s +1mM 3-AT
Strtngency levet
108
Phenotypi
dass
C ;
II
E.i" - -" Iff
ni
IV
578
Table 3 Analysis of prey clones
ntrB
Yeas library
Insert identity"
Number of clones rescued
SO-1-2
aspA 662(IV)
glnK 752(111)
i'/nAT 752-X (III)
/ 752-Y (III)
g/B476(III)
glnB 47-Z (III)
9
10
1
2
6
I
aspA662(lV)
ghK 1173(111)
11
24
Ll
L2
a
X, Y and Z represent non-contiguo as genomic Sau 3AI fragments.

The interaction class is indicated in parentheses (see text for details)
Identification of genomic fragments carried

by prey clones
Table 3 summarises the relevant features of all prey
clones found in the NtrB screen. Structurat features of
al 64 prey plasmids were analyzed by PCR and
restriction digests. Six different types of inserts were
found amongst class III prey plasmids from librarles S01-2 and L2, and only one type amongst class IV from
librarles SO-1-2 and Ll. At least one clone from each
class and library was sequenced to identify the corresponding preys.
As shown in Fig. 2, the seven different inserts in prey
clones identity four Sau 3AI fragments that encode
C-terminal fusions to GAL4AD, derived from three
different genes. Four class III clones contained glnK
seqtiences, the other two, glnB sequences. All glnK
clones contained the complete ORF, precisely fused at
Met and encoded on two different Sau 3AI fragments
(752 and 173 bp, respectively). In addition, two out of
the four glnK clones contained additional, non-contiguous, Sau 3AI genomic fragments fused 3' to the 752-bp
glnK fragment. All seven glnB clones detected contained
the complete ORF and 11 extra amino acids at the Ntermmus. One of these contained a non-conguous Sau
3AI fragment at the 3' end.
Only one type of insert was found amongst the nine
and eleven clones of class IV rescued in SO-1-2 and Ll
libraries, respectively. In agreement with its unique
pattern of Y2H interaction, these clones identify a previously unknown NtrB interactant, the enzyme aspartate-ammonia-lyase (aspartase), encoded by aspA. The
fused polypeptide corresponded to an nternaf regin of
AspA, hereafter referred to as AspA91-312 This polypeptide encompasses most of the large central domain of
AspA (Shi et al. 1997).
GlnK and AspA91-312 interact with conserved
domains of the NtrB transmitter module
To determine the specificity and determinants of the
Y2H interactions revealed in the screen, GlnK and
AspA91"312 were paired with different combinations of
truncated NtrB derivatives artd control proteins.
ntrC
"-<
fBBgrr--
glnB
_
nmpA
-^frr-"if
475
aspA
-H
glnK
t*"""""**""!
662
amtB
i---.-!"
"<
752
1173
Fig. 2 Physical maps of genomic regons encoding domains

involved in NtrB interactions, Relevant Sau 3AI sites in and
around ntrB, ntrC , glnB , glnK and aspA are indicaled. ORFs are
represented as boxes with the regions relevant for Y2H interactions
with NtrB shaded. Regions of GlnK and AspA relevant for
interaction with NtrB, previously unknown, are direciy derived
from the structure of prey clones. Genomic clones detected in the
screen are shown below each gene, The numbers indcate length in
bp
Additional GAL4BD fusions to GlnK and AspA9'"312

were generated to analyze interactions after exchanging
GAL4 domains for all pair combinations. The fusin
proteins carried by a given strain are always named in
the order GAL4AD:X/GAL4BD:Y (abbreviated X/Y),
where X and Y are any polypeptide fused to GAL4AD
and GAL4BD, respectively. Definition of domain
boundares and the nomenclature used for NtrB polypeptides and domains followed the conventions
described previously (Martinez-Argudo et al. 2001):
NtrBs, residues 1-115; NtrB HNG , 111-349; NtrB SHN , 1269. To determine the ability of two gven polypeptides
to interact in the Y2H system, the expresson of both
GAL\:HS3 and GALl."/cZ reportera was analyzed in
strains of S. cerevisiae Y190 by monitoring growth on
histidine-deficient mdium and by assaying (3-gaIactosidase activity, respectively. Growth rates were categorized into four classes (+ +, +, + / - and - ) , as
previously described (Martinez-Argudo et al. 2001).
As previously shown for its paralogue GlnB, the
interaction of GlnK with both NtrB and NtrB HNG ,
although relatvely weak, is easily detected in both orientations. In fact, there are no significant differences
between signis obtained in strain Y190 from any given
pair of fusin proteins when GlnB is substituted for
GlnK (Fg. 3, blocks 1-2, Martinez-Argudo et al. 2002).
Simarly, no signis were found when GlnK was
assayed with NtrB derivatives lacking the kinase domain,
with other histidine kinases, such as EnvZ llNG or CheA,
or with control protein NtrC. As previously shown for
GlnB, constructs containing only N and NG regions are
not sufficient to genrate Y2H signis with GlnK, suggesting that part of the H domain is also required for
contacts with PII proteins.
As previously noted in strain PJ696, the AspA91"312/
NtrB pair of fusin proteins gave strong signis in strain
Y190. Similar signis were obtained for AspA91-312/
NtrB HNG , while weak but significant signis were obtained when AspA91"312 was paired with NtrB SHN ,
NtrBSH, NtrB HN or NtrBH. In addition, no signis were
obtained with NtrB derivatives lacking the H domain,
suggesting that the phosphotransfer regin contains
109
579
A
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B
Fig. 3A, B Expression of GAL1: lacZ and GALI: HIS3 in strain
Y190carryngdinerent pairs of fusin proteins. The numbered mes
between panels A and B encompass blocks of data obtained from
experimenta of the same type: ], NtrB derivatives (or control
proteins) paired with GAL4AD:GlnK; 2, as 1, but with
GAL4BD:GlnK; 3, polypeptides paired with GAL4AD:AspA,)l"
n
; 4, as 3, bul with GAL4BD:AspAV1"312. Because GAL4BD:CheA activated both reporters by itself (data not shown), the
affected pair was not included. A Each bar represents the mean
/J-galactosidase activity from al least Tour independent transformants, each measured in triplcate. B Relative levis of growth on
histidine-deficient mdium (-, no growth)
most of the binding determinants for AspA. Reciprocal

pairing, that is, exchanging fusions to GAL4AD and
GAL4BD, resultad in loss of most signis, the exception
being the N t r B H N G protein, which gave strong signis
with AspA91"-112.
Discussion
Decades of classical genetic and biochemical studies

have deepened our understanding of components and
molecular mechanisms involved in the contro of nitrogen assimilation in enterobacteria, which has become
one of the classical paradigms for sgnal transduction.
Here we exploi the fact that interactions detected in the
Y2H system reflect most of the functional interactions
tested between nitrogen regulators (Martinez-Argudo
et al. 2001, 2002; Martinez-Argudo and Contreras 2002)
to begin to delinate the protein-proten interacton
network used by the bacterial cell to control nitrogen
assimilation. We reasoned that starting with weil known
nitrogen regulators would help us to uncover new regulatory or metabolic connections and faciltate the
analysis of prey clones, thus helping to assess the reliabilty and usefulness of the librarles used. With this in
mind, we constructed Y2H libraries using San 3AI to
partially digest the E. coli genome, and screened them

for proteins that nteract with the histidine kinase NtrB.
Generation of genomic expression libraries for Y2H
screens is a very convenent approach for bacteria, which
have small genomes, uninterrupted genes, and highly
unstable mRNAs. For genomic libraries, the number of
independently generated clones that must be screened in
order to obtain a given fragment with a given probabilty can be calctilated with the formula N = ln(I-P)/
ln[l-(insert size/genome sze)] (Clarke and Carbn
1976), assuming that fragments of equal size are generated randomly and cloned with equal efficieney.
However, expression libraries require additional considerations, since the inser needs to be n the appropriate orientation, the DNA in frame with vector
sequences, and protein domains properly expressed in
the nucleus. It foltows that proteins in which interaction
determinants lie in the N-terminus have less chance of
being recovered from a genomic expression library. In
this context, is worth notng that the four polypeptides
that could be identied using NtrB as bait (NtrB, NtrC,
GlnB and GlnK) require N-terminal sequences for
interaction in the Y2H system. Another importan!
consideration for Y2H libraries is that prey proteins that
give weak interactions may be not be detected in the
screens, thus eading to false negatives. To minimize this
latter effect, we used a very sensitve S. cerevisiae strain
(James et al. 1996) and optimzed the selection conditions in order to detect weak interactions with NtrB.
This alowed rescue of GlnB and GlnK clones, both of
whch give relatively weak signis with the bait NtrB
(Figs. 1 and 3).
For genomic Y2H libraries another importan! variable is introduced by the fact that the primary libraries
are obtained in E. coli and then amplfied and transformed into yeast, which further increases the number of
(yeast) clones that must be screened to ensure success
10
580
(Fitikel et al. 1994). This amplificaron, combmed with

clonng biases and possble growth disadvantage of
particular clones, reduces the effective number of clonable fragtnents in libraries. Given the number of different factors afiecting library yield, it is not surprising that
most, if not all, Y2H libraries suffer from one or other
type of bias, thus explaining the smal! overlap of datasets for Y2H interactions from difieren! studies (Deane
et al. 2002). Because simpler experimental procedures
should maximize yields from a given library, restriction
enzymes are convenient tools for generating genomic
expression libraries, in spite of the fact that marty protein domains will be absenl from any given library, due
to the non-random distribution of restriction sites. For
nstance, prey inserts containing ntrC sequences were
not expected from our Sau 3AI library, in spite of the
strength of the NtrB/NtrC interaction (Fig. I). In
addition, varations in the susceptibility of restriction
sites to enzyme action can also affect library yields. This
phenomenon, always ignored in statistical considerations, is very difrtcult to avoid, and probably constitutes
the major cause of bias in enzyme-generated libraries. It
could explain the failure to recover additional restriction
fragments for ginK, and especially gitiB, since longer 3'
ends should not affect the length of the plasmid encoded
fusin proteins (Fig. 2). Lower restriction and/or clonng efficiency couid also explain the absence of ntrB
fragments among preys. However, the possibifity that
the first 11 (N-terminal) amino acids of NtrB, which will
not be represented in any Sau 3AI-generated in frame
fusions, are required for interaction cannot be discarded
at present.
The relatively low complexity of the libraries generated here and the availability of Y2H information on
NtrB and ts domains allowed exhaustve analysis of all
prey clones found in the search. Although the presence
of additional preys for NtrB in the primary L libraries
cannot be excluded, the large number of yeast clones
screened (Table 2) and the fact that only two different
clones were found, each from a different library
(Table 3), indcates that the search for NtrB nteractants
n these libraries has been saturating. On the other hand,
three out of four double-insert clones encoding GInB or
GlnK were dtfferent, suggesting little ampUfication of
the primary S libraries, in agreement with the smaller
number of yeast clones screened (Tables 2 and 3).
Our library screen resulted in the identificaton of
three different polypeptides among 64 true positive
clones, one of which was not previously expected to
interact with the bat. It seems obvious that to identify as
many as possble of the proteins that interact with NtrB,
or with any given bait, the Sau 3AI libraries described
here need to be complemented with additional ones,
such as those generated using other restriction enzymes
and different vector/enzyme combinations (James et al.
1996; Kabani et al. 2000), or using a related genome with
the same bait. In particular, compementary library
searches are needed before we can exelude the possibility
of finding proteins that interact with the N-terminal
module of NtrB, while additional screens of the Sau3M

libraries with other nitrogen regulators would allow
extensin of the nitrogen interactome. In this context,
the use of functionally related bait proteins greatly increases the chance that spurious interactions can be
distmguished from those that are biologically sigmficant
(Fromont-Racine et al. 2000).
The determinants in NtrB required for interactions
with the nitrogen regulators NtrC and GlnB in the Y2H
system map to the central and C-terminal domains of
the conserved transmitter module, respectively (Martnez-Argudo et al. 2001, 2002; Fig. 2). We have shown
here that the C-terminal knase domain is also involved
in Y2H interactions with GlnK (Fig. 3). This result is
not surprising, in the light of the determinants required
for the interaction with GlnB and the similarity between
GlnB and GlnK T-Ioops, which have been implicated in
NtrB recognition. It is worth noting that, so far, all
known NtrB interactions with regulatory proteins
invoive the conserved transmitter module and not the
rather unique N-terminal module, which n most histidie kinases is membrane-bound and acts as a sensor.
The transmitter module is also involved in the interactions with GlnK. and AspA 9 1 - 3 1 2 interactions detected
and analyzed here. Although the physological significa nce of the interaction between NtrB and AspA
remains to be confirmed by other means, the involvement
of AspA in amino acid metabolism (Golby et al. 1998;
Viola 2000) and the strength and specificity of the
interactions of AspA '" 3I2 with the histidine phosphotransfer domain of NtrB (Fig. 3, and data not shown)
arge in favor of its biological significance.
Since input sensory functions have only been associated with the conserved transmitter module of NtrB, the
notion of input sensory and output (transmitter) modules does not seem to apply to this sgnal transduction
system. The known features of NtrB are best reconciled
with the idea that histidine kinases intgrate multiple
signis, with sensory functions being Iocalized in both
N-terminal and C-termtnat domains. Theue are, to our
knowledge, two reported cases of histidine kinases in
which transmitter modules are also regulatory targets. In
Bacillus subtilis, KipI, a protein reguiated by the availability of nitrogen, is a potent and specifie inhtbitor of
the autophosphorylation of kinase A, which is involved
in the regulation of development (Wang et al. 1997). In
the FixLJ two-component system from Sinorhizobium
meliloti, FixT, a protein that is modutated by a glutamine-amidotransferase-like protein prevens production
or accumulation of the phosphorylated form of FixL
(Berges et al. 2001; Garnerone et al. 1999). It is tempting
to speculate that, in enterobactea and under anaerobic
conditons, when AspA is induced (Golby et al. 1998),
direct interaction of AspA with the central phosphotransfer domain of NtrB leads to inhibiion of NtrC
phosphorylaon, This would prevent excessive energy
and metabolite consumpton from nitrogen assimation,
thus providing a metabolic link between oxygen availability and nitrogen requrements.
111
581
Acknowledgements We thank I. Fuentes for excelietit technical

assistance, I. Martnez-Argudo for the plasmids pUAG33l and
pUAG332, and R. Maldonado for the plasmid p(JAGI82. This
work was supported by a grant (BMC200I-0863) from the Ministerio de Educacin y Cultura.
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112
Conclusiones
113
Conclusiones
Conclusiones
1. El sistema
del doble hbrido
de levaduras
permiti
detectar
interacciones especficas entre la histidina quinasa NtrB y el regulador de

respuesta NtrC, pertenecientes al sistema de transduccin de seales de
nitrgeno.
2. El anlisis doble hbrido de variantes truncadas aport datos sobre los
determinantes de las interacciones (intra e intermoleculares) mediadas por las
protenas NtrB y NtrC y sobre los determinantes de las interacciones entre
NtrB y las protenas que actan aguas arriba en la transduccin de seales de
nitrgeno: GlnB y GlnK. Los resultados obtenidos han sido confirmatorios de
interacciones conocidas en unos casos e inesperados en otros.
NtrC-NtrC
\Azymmm>
-NtrC
>TT1
Resumen de las interacciones doble hbrido detectadas entre los

reguladores NtrB, NtrC y GlnB. Las lneas de color indican la
localizacin de los determinantes para cada interaccin descrita,
3. La construccin y escrutinio de genotecas Sau3Al de E. coli con NtrB

como cebo result en la identificacin de GlnB, GlnK y AspA como presas y
contribuy a obtener informacin emprica sobre escrutinios de genotecas
doble hbrido.
4. La utilizacin de genomas (K. pneumoniae),
enzimas de restriccin
(Tsp509l) y cebos (GlnB) adicionales, permiti aumentar la complejidad total
115
Conclusiones
de las genotecas a analizar e iniciar la construccin de un "interactoma del

nitrgeno" para enterobacterias .
anhidrasa carbnica
UTasa
AspA
as partas a
Interactoma
del
enterobacterias.
interacciones
Las
metabolismo
flechas
funcionales.
de
del
nitrgeno
doble
punta
indican
color
indican
Las barras
de
en
interacciones fsicas confirmadas en el doble hbrido. Las

flechas negras indican nuevas interacciones fsicas identificadas
mediante escrutinios doble hbrido.
116
Bibliografa
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131

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Paloma Salinas Bern

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Anlisis de interacciones reguladoras en transduccin

Trabajo realizado en la Divisin de Gentica del Departamento

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad d'Alacant. 2003

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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad d'Alacant. 2003

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ASUNCIN CONTRERAS DE VERA, Profesora Titular de

Que el presente trabajo h a sido realizado bajo mi direccin y

Alicante, Noviembre de 2003

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A Asuncin Contreras, por confiar en m capacidad para llevar a cabo este

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad d'Alacant. 2003

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entusiasmo y apoyo en el trabajo que realic all. Fue u n a experiencia

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-Hijo mo -dijo el padre-. Para volar, hay que

riesgos. Si no quieres, lo mejor quizs sea

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3. El sistema del doble hbrido de levaduras y transduccin de seales en

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3.1.2. Obtencin de minipreparaciones de DNA de S. cerevisiae.

1. Interacciones moleculares mediadas por NtrB, NtrC y sus dominios.

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1, Transduccin de seales y sistemas de dos

aparentemente no relacionadas (Drummond et al, 19S6; Kofoid & Parkinson,

pertenecientes a estos sistemas (Mizuno, 1997), 27 en Streptococcus (Throup

1996} y ninguna en organismos como Micoplasma

Methanoccoccus jannaschii (Mizuno, 1998). Recientemente, se ha creado u n a

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componentes est sometido a autorregulacin, actuando la forma fosforilada

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1.3. Organizacin y mecanismo.

funcionales, aunque estos mdulos pueden hallarse en solitario, es decir

Independientemente de su asociacin con otros, los mdulos conservados se

generalmente asociado a membrana, acta detectando la seal especfica del

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bioqumicos en diversos sistemas indican que esta actividad juega u n papel

reguladores de respuesta constituyen la base bioqumica de la transduccin

1.4. Relacin estructura-funcin en histidina quinasas.

entre las unidades

estructura de cuatro hlices {four-helix bundle), a la que cada monmero

histidina quinasa atpica, la misma