ALTERACIN DE LAS VAS DE TRANPORTE DE MEMBRANAS POR

PATGENOS VACUOLARES
Los fagocitos de mamferos controlan eficazmente las infecciones bacterianas a travs
de la fagocitosis, proceso por el cual las partculas que se envuelven en la superficie
celular son transportadas a los lisosomas para su destruccin.
Sin embargo, los patgenos intracelulares han desarrollado mecanismos para evitar
este destino. Muchos patgenos bacterianos utilizan sistemas de secrecin
especializados para entregar a las clulas husped protenas que destruyen las vas
de sealizacin que controlan el transporte de membrana. Estos efectores bacterianos
modulan la funcin de las protenas que regulan el transporte de membrana y alteran
el contenido de fosfolpidos de las membranas. Esclarecer la funcin bioqumica de
estos efectores ha proporcionado una mayor comprensin de cmo las bacterias
controlan el transporte de membrana para crear un nicho de replicacin en el husped
y proporcionan informacin sobre la regulacin del transporte de membrana en las
clulas eucariotas.

INTRODUCCIN
Cuando las clulas fagocticas encuentran bacterias, ellas tienen la capacidad de
fagocitarlas y transportarlos dentro de una vacuola llamada fagosoma, un
compartimento que tiene similitudes con los endosomas tempranos y adquirir
secuencialmente protenas del husped que regulan la biognesis y el transporte de
este orgnulo. Rab5 es una GTPasa fundamental para las decisiones inmediatas de
transporte de la membrana despus de la fagocitosis. El Rab5 activado es reclutado
en el fagosoma poco despus de la fagocitosis y es necesario para la maduracin del
fagosoma a travs de la contratacin de un gran nmero de protenas efectoras. Rab5
se sustituye por Rab7 en un proceso llamado conversin de Rab, que se requiere para
la posterior fusin del fagosoma con los lisosomas para generar el fagolisosoma.
El fagolisosoma es cido y enriquecido en proteasas, condiciones que promueven la
degradacin bacteriana. Las bacterias patgenas intracelulares han evolucionado
diferentes estrategias para contrarrestar la va endoctica y evitar ser degradadas en
los lisosomas. Algunas bacterias, tales como Coxiella burnetii, son capaces de
sobrevivir en un compartimento que se deriva de la fusin de la vacuola con los
lisosomas.
Otras bacterias han adquirido mecanismos para escapar de la va lisosomal. Shigella
flexneri y Listeria monocytogenes escapan del fagosoma antes de su fusin con el
lisosoma para alcanzar el citosol del hospedador, donde pueden replicar
intracelularmente.
Muchas bacterias, como Salmonella enterica serovar Typhimurium o Legionella
pneumophila, modifican de forma activa las vas de transporte vesicular del hospedero
para evitar la fusin de la vacuola en la que residen con los lisosomas, un proceso que
es necesario para la creacin de un orgnulo especializado favorable para la
replicacin.
El estudio de los mecanismos utilizados por las bacterias patgenas para subvertir
(ALTERAR) las vas del hospedero tiene dos objetivos principales. En primer lugar, la
comprensin de cmo estas protenas efectoras funcionan, proporciona informacin

importante sobre el mecanismo de infeccin de la clula husped y podra conducir al

desarrollo de nuevos enfoques teraputicos para tratar estos patgenos.
En segundo lugar, porque las bacterias interrumpen los procesos de eucariotas, por lo
que ellas pueden ser utilizadas como herramientas para diseccionar las vas de
eucariotas. Informes procedentes de estudios sobre muchos patgenos diferentes
muestran que las vas de transporte vesicular son manipuladas de diversas maneras
por bacterias intracelulares, y la comprensin de cmo las bacterias manipulan estas
vas podra proporcionar una comprensin ms profunda de la regulacin
homeosttica de transporte de membrana en las clulas eucariotas.
Por lo tanto, esta revisin se centrar en las estrategias generales utilizadas

por diferentes bacterias para crear un orgnulo especializado que

promueve la supervivencia y la reproduccin , con ejemplos concretos de caer
en el amplio contexto de la manipulacin patgena de la composicin fosfoinositida de
las membranas, la manipulacin del citoesqueleto del hospedero, y la modulacin de
las pequeas GTPasas.

SUBVERSIN FOSFOINOSITIDA POR PATGENOS VACUOLARES

La subversin de lpidos por patgenos se est convirtiendo en un proceso crtico para
la infeccin microbiana. Las bacterias son capaces de subvertir los lpidos del host
para el metabolismo o para la formacin de las vacuolas en las que residen. En
muchos patgenos, las protenas efectoras que pueden detectar los lpidos del host y
modificar los componentes fosfoinositidos en las membranas se estn encontrando por
el papel crtico que juegan en el control de transporte vesicular en la clula.
El Fosfatidilinositol (PI) y los fosfatos (PIP) tienen funciones importantes en la
regulacin de las vas implicadas en la transduccin de seales y en el transporte
vesicular. El anillo de PIP fosfoinositol puede ser fosforilado de forma reversible en las
posiciones 3, 4, y 5, pudiendo generar hasta siete especies diferentes de PIP. Las
firmas de PIP en la membrana median el reclutamiento de protenas por orgnulos
especficos que regulan el transporte vesicular. Quinasas y fosfatasas especficas
actan en conjunto para regular ajustadamente el estado de fosforilacin de los PIP,
por lo que la regulacin de la localizacin de estas enzimas es crtico para controlar el
transporte vesicular en la clula. Los agentes patgenos han desarrollado mecanismos
para modificar las firmas de membrana, tanto directa como indirectamente, mediante
el control del estado de fosforilacin de PIPs en las vacuolas en el que residen, lo cual
es crtico para modular el transporte de este orgnulo -ocupado por el patgeno-.
Las especies PI(4,5)P2 y PI(3,4,5)P3 se encuentran principalmente en la membrana
plasmtica y son crticos para el reclutamiento de la maquinaria celular importante
para la fagocitosis (Figura 1 A). Una vez que los fagosomas se han formado, las
principales especies de PIP que se encuentran en el orgnulo son PI3P. Las protenas
que contienen motivos de reconocimiento PI3P son reclutados para el endosoma,
induciendo la maduracin de las etapas finales endosomales y fagolisosmico. Las
bacterias han desarrollado diferentes mecanismos para manipular los niveles de PI3P
en las vacuolas de membranas. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tiene como objetivo
disminuir el nivel de PI3P en la vacuola para prevenir la maduracin de la fagosoma en
una etapa temprana en el transporte endoctico, mientras que S. typhimurium aumenta
los niveles de PI3P en la vacuola para estimular la biognesis de un compartimento
nico con propiedades de endosomas tardos.

Agotamiento PI3P por Mtb

Mtb sobrevive en clulas husped por retrasar la maduracin fagosoma en una etapa
temprana (Fig. 1B) . Las vacuolas que contienen Mtb se enriquecen de Rab5 pero en
gran medida desprovisto de Rab7 , lo que sugiere que la maduracin endoctica de
este compartimento se estanc poco despus de la fusin con los endosomas
tempranos en la clula ( Va et al . , 1997 ) . Los mecanismos por los cuales Mtb
controla el transporte de membrana parecen ser diversos y an no se entienden
completamente. Muchos factores bacterianos, protenas , as como lpidos , se han
asociado con el deterioro de la vacuola para madurar. Curiosamente, adems de la
presencia de Rab5 , se demostr la presencia de los efectores EEA1 de Rab5. Tanto
las protenas reguladoras de unin PI3P, fallan a acumularse en las vacuolas
contenidas de Mtb ( MCV ) y que la ausencia de estos factores afecta la maduracin
endoctica de esta vacuola . Sabiendo que PI3P es importante para la localizacin de
protenas implicadas en la maduracin de los compartimentos endosomales, se
demostr que los niveles de PI3P en vacuolas que contienen de Mtb en vivo fueron
reducidos en comparacin con vacuolas que contienen perlas o bacterias muertas, lo
que indica que Mtb puede prevenir activamente la adquisicin o agotar PI3P de la
vacuola en el que reside.
Dos estrategias complementarias parecen ser utilizadas por Mtb para reducir los
niveles PI3P sobre la MCV. La micobacteria, derivada del lpido manosa - capsulado
lipoarabinomanano- (ManLAM ) detiene la maduracin de la MCV por un mecanismo
que implica la supresin de la PI3 quinasa hVPS34 , la quinasa implicada en la
produccin de PI3P en los endosomas tempranos. ManLAM suprime hVPS34 al
interferir con los flujos de Ca2 + , que inducen una cascada de sealizacin que activa
hVPS34 ( y por lo tanto la produccin PI3P ) en la membrana fagosoma. Sin embargo,
el aumento de Ca2 + a nivel intracelular de la clula no es suficiente para restablecer
el nivel PI3P en el fagosoma, lo que sugiere que Mtb tiene actividades adicionales que
suprimen la maduracin endosomal. SAPM es una fosfatasa producida por Mtb que
puede desfosforilar PI3P in vitro. SAPM es secretada por Mtb y es suficiente para
bloquear la fusin endosoma fagosoma-tardo in vitro en un mecanismo de PI3P dependiente. El consumo de fosfato por una protena bacteriana entonces puede
representar otro mecanismo utilizado por Mtb para disminuir los niveles PI3P en la
vacuola.
Es intrigante que la Mtb vacuola recluta vesculas endosomal tempranas mientras que
bloquea la fusin con endosomas tardos y lisosomas. Mtb produce un lpido superficie
llamada mansido PI (PIM) que es muy similar a los PIP. PIM se ha demostrado que
induce la fusin de la fagosoma con los endosomas tempranos in vitro e in vivo
(Vergne et al., 2004), y se cree que la fusin estimulado-PIM de los endosomas
tempranos ayuda a mantener la integridad vacuola para equilibrar las actividades
inhibidoras que previenen la adquisicin de membranas adicionales a travs de la
fusin con endosomas tardos y lisosomas.
Aunque la protena SAPM es secretada por Mtb, y los lpidos ManLAM y PIM han sido
reportados por cruzar la membrana de la vacuola (Beatty et al., 2000), el cmo estos
productos ejercen su funcin en la cara citoslica de la membrana de la vacuola no
queda claro. Otra posibilidad es que SAPM y los lpidos ManLAM y PIM alteren las
propiedades biofsicas de la membrana de la vacuola de la cara luminal del
compartimiento.

Metabolismo de PI por la protena S. Typhimurium SopB.

S. typhimurium tambin es capaz de subvertir el trfico normal hacia el compartimiento
de fagolisosoma, a pesar de que un estudio indica al menos una fusin parcial con
lisosomas. Efectores entregados por dos islas de patogenicidad codificados T3SSs
diferentes son fundamentales para el desarrollo de la vacuola contenida de S.
typhimurium ( SCV ) y para la creacin de un orgnulo que permita la supervivencia
intracelular.
SopB es un efector T3SS con homologa con las fosfatasas de inositol eucariotas y ha
demostrado tener una actividad de la fosfatasa contra diferentes PIP in vitro ( Norris et
al . , 1998 ) . Las vacuolas que contienen S. typhimurium adquieren PI3P muy
rpidamente despus de la fagocitosis, y PI3P permanece asociado con la vacuola
durante un perodo prolongado (Fig. 1 C ) . En contraste , una cepa SopB reside en
una vacuola que contiene PI3P slo transitoriamente ( Hernndez et al . , 2004 ) .
SopB parece suficiente para generar PI3P en vacuolas , dado que la expresin de la
protena SopB en clulas de mamfero inducir la formacin de grandes vesculas
macropinocticas en el que PI3P est presente ( Hernndez et al . , 2004 ) .
El mecanismo de la produccin PI3P por SopB est claro. Se ha sugerido que PI3P
resulta de la actividad de la fosfatasa de SopB en PI (3,5 ) P2 y PI ( 3,4,5 ) P3 . Sin
embargo , tambin se ha demostrado que la generacin de PI3P en el SCV es
sensible a la wortmanina , que bloquea la actividad quinasa PI3P del host , lo que
sugiere PI3P origina a partir de la fosforilacin de acogida de PI . Esto puede indicar
que SopB recluta indirectamente la PI3P quinasa hVPS34 en el SCV ( Mallo et al . ,
2008 ) , tal vez mediante la creacin de firmas PIP que mejoran el reclutamiento de los
reguladores hVPS34 , incluyendo Rab5 . Los datos recientes pueden dar una idea de
por qu la generacin PI3P beneficiara maduracin del SCV. Clasificacin nexin 1
( Bujny et al. , 2008 ) y la clasificacin nexin 3 ( Braun et al. , 2010 ) es reclutado a la
SCV en un PI3P - y de manera SopB dependiente (Fig. 1 C). Se requiere que estos
reguladores del host de transporte de membrana para la replicacin normal del S.
Typhimurium en las clulas. Tambin se ha demostrado que se requiere el
reclutamiento de los PtdIns ( 5 ) quinasa PIKfyve , un efector de PI3P , a la SCV para
la formacin de la SCV ( Kerr et al . , 2010 ) . Por ltimo, se ha sugerido que el cambio
en la carga electrosttica en la superficie de la SCV resultante de actividades
mediadas por SopB podra ser suficiente para alterar el reclutamiento de efectores
especficos ( Bakowski et al 2010 ).
Las actividades de SopB tambin ayudan en el proceso de absorcin de S.
typhimurium por las clulas no fagocticas. Curiosamente, SopB posee mltiples sitios
de ubiquitinacin, y un estudio reciente indica que el estado de la ubiquitinacin de la
protena permite que la protena tenga funciones distintas al afectar la localizacin de
SopB a las membranas (Patel et al., 2009). La ubiquitinacin de SopB ha demostrado
ser importante para la localizacin de la protena a la SCV y para promover el
reclutamiento de Rab5 a la vacuola, pero la ubiquitinacin de SopB no parece ser
necesario para las actividades que promueven la entrada de bacterias. Por lo tanto,
este efector S. typhimurium utiliza la maquinaria de modificacin postraduccional de
acogida para regular espacialmente funciones que afectan a los diferentes procesos
de la clula husped.
LA SUBVERSIN DEL CITOESQUELETO POR PATGENOS VACUOLAR
Lo central para la mayora de los procesos de transporte de membrana son el
movimiento de vesculas y tbulos lo largo de la actina y microtbulos del

citoesqueleto. En la actualidad hay varios ejemplos documentados en los que las

bacterias patgenas se dirigen el citoesqueleto para modular la biognesis vacuola y
mantener un orgnulo que apoya su supervivencia intracelular. Estas estrategias
incluyen el control sobre los procesos de acogida que son fundamentales para el
montaje de redes citoesqueleto y la modulacin de las protenas motoras que
transportan la carga a lo largo de estas estructuras.
En ciertas clulas husped, las vacuolas que contienen S. typhimurium mostrarn
largos tbulos de membrana llamados filamentos inducidos por S. typhimurium (FIS
Fig. 2 ; Garca - del Portillo et al , 1993 . ) . Aunque varios efectores S. typhimurium
T3SS estn presentes en los SIF, un efector llamada SIFA es necesario para la
formacin de estas estructuras. Se encontr que la protena SIFA interacta
directamente con la protena humana SKIP, que es una protena de acogida que se
une a la protena motora quinesina - 1. SKIP parece funcionar como un enlazador que
regula la quinesina - 1 en el aparato de Golgi y finales de endosomal y compartimentos
lisosomales. Estudios estructurales han demostrado que SIFA tambin tiene un
dominio que media las interacciones con las GTPasas de la familia Rho , y esta
interaccin puede activar estas protenas mediante la estimulacin del intercambio de
GDP por GTP ( Ohlson et al . , 2008 ) . Por lo tanto, SIFA puede generar filamentos de
membrana mediante la coordinacin de ambas dinmicas y el transporte de las
membranas del citoesqueleto por protenas motoras de acogida a lo largo de estas
estructuras, lo que podra dar una idea de cmo las protenas del husped controlan
los procesos de transporte vesicular que involucran tbulos de membrana.
Un segundo efector T3SS llamada PipB2 tambin se encontr que era importante para
la generacin de los FIS durante la infeccin, como un mutante de S. typhimurium
deficiente para PipB2 se encontr a ocupar vacuolas con ms cortos FIS ( Kndler y
Steele - Mortimer , 2005 ) . PipB2 tambin interacta con kinesin- 1 puede participar en
la contratacin de este motor a la SCV. Por lo tanto, se piensa que SIFA y PipB2
ayudar en el posicionamiento de la SCV y pueden regular el transporte de membranas
entre el SCV y orgnulos de host mediante el control espacialmente la actividad de
quinesina - 1 y la modulacin de la dinmica del citoesqueleto mediante la regulacin
de las funciones de Rho GTPasa . Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la
dinmica de SIF son probablemente ms complejo como experimentos genticos
indican de que varios otros efectores estn implicados en la biognesis de SCV y
transporte. Adems de la caracterizacin de los efectores S. Typhimurium y sus
objetivos en las clulas eucariotas podra entonces conducir a una mejor comprensin
de transporte de membrana citoesqueleto impulsada especfica en eucariotas.

La mayora de las bacterias se inactivan cuando son fagocitadas por

macrfagos y leucocitos polimorfonucleares. Sin embargo, muchos
microorganismos han desarrollado estrategias para sobrevivir y
replicarse en estas clulas. Algunos usan los mecanismos fagocticos
preexistentes para su internalizacin, como Mycobacterium sp. y
Legionella pneumophila, que se unen a fragmentos C3b del
complemento lo que favorecen su captacin por las clulas fagocticas.
Una vez dentro de la vacuola fagoctica, algunos patgenos disuelven la
membrana vacuolar y acceden al citoplasma celular rico en nutrientes,

evadiendo los mecanismos bactericidas del fagocito; por ejemplo

Shigella flexneri, algunas Rocketsias y L. monocytogenes; sta ltima
produce una hemolisina (listeriolisina O) que forma poros en la
membrana del fagosoma.
Otros microorganismos como Mycobacterium y Legionella, son capaces
de inhibir la actividad bactericida de los fagocitos impidiendo la fusin
del fagolisosoma (impiden la acidificacin
del fagosoma) y algunos como Coxiella burnetti, sobreviven a los
agentes bactericidas liberados en el fagolisosoma (incluso requieren de
factores all presentes como seales que disparan su multiplicacin
intracelular).

Mtb y S. Typhimurium manipulan el destino de su vacuola travs de la modificacin del

metabolismo phosphoinositide . ( A) fagosoma ofa maduracin normal contiene
bacterias no patgenas . Despus de la fagocitosis , bacterias residen en una vacuola
que muestra similitudes con los endosomas tempranos , en particular la presentacin
de la pequea GTPasa Rab5 . Rab5 recluta la PI3 quinasa hVPS34 que produce PI3P
en la superficie del fagosoma . Se requerir la presencia de PI3P para la maduracin
del fagosoma a fagolisosoma por la contratacin de un subconjunto de protenas ,
incluyendo EEA1 . (B ) Mtb crea un nicho de replicacin mediante la manipulacin del
metabolismo PI3P . Bloques de Mtb la activacin de hVPS34 en su vacuola por
ManLAM , impidiendo de este modo la produccin PI3P . El mecanismo para este
bloque implica la inhibicin de aumento de Ca2 + , que es necesaria para la activacin
hVPS34 a travs de una cascada que implica la calmodulina . Por otra parte, Mtb
segrega SAPM , una fosfatasa que podran estar involucrados en el ozono de la
vacuola de cualquier PI3P residual. Por ltimo , Mtb puede ampliar su vacuola por el
reclutamiento de vesculas endosoma . Este reclutamiento se podra lograr por el PIM
de lpidos de Mtb , un anlogo de fosfoinositida . (C ) El efector S. Typhimurium T4SS

SopB genera PI3P en la membrana de la vacuola . Un posible mecanismo para el

enriquecimiento PI3P a la temprana S. Typhimurium vacuola es una modulacin
indirecta de contratacin hVPS34 por SopB . Esto da como resultado una presencia
prolongada y una mayor de PI3P en la superficie vacuola . La presencia de una alta
cantidad de PI3P induce posterior contratacin de las protenas PI3P vinculantes ,
incluyendo SNX1 , SNX3 y PIKfyve , que fueron demostrado ser necesarios para la
maduracin de la vacuola S. Typhimurium que contienen ( SCV) .
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