ESPECTROSCOPA LUMINISCENTE:

Existen tres tipos de mtodos pticos relacionados entre s llamados: fluorescencia y

fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las molculas de analito
se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisin suministra informacin para el
anlisis cualitativo y cuantitativo.

Los mtodos
moleculares.

se

conocen

colectivamente

como

procedimientos

luminiscentes

La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitacin se consigue

mediante la absorcin de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a los dos
fenmenos con el trmino ms general de fotoluminiscencia.

La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones electrnicas

responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espn del electrn. Como
consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta cesando la luminiscencia casi
inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia estn acompaadas por un cambio en el

espn del electrn, que hace que la radiacin se mantenga durante un tiempo fcilmente
detectable, despus de haber acabado la irradiacin a menudo varios segundos
despus o ms. En la mayora de los casos, la emisin fotoluminiscente, tanto si es de
fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que la radiacin
utilizada para su excitacin.

Uno de los aspectos ms atractivos de la luminiscencia es su inherente sensibilidad, con

lmites de deteccin que suelen ser de uno a tres rdenes de magnitud inferiores a los
encontrados en la espectroscopia de absorcin. Los lmites de deteccin caractersticas
son del orden de partes por billn.

Debido a su alta sensibilidad, los mtodos luminiscencia cuantitativos suelen sufrir serios
efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.
Por esta razn las medidas luminiscentes se suelen combinar con las extraordinarias
tcnicas de cromatografa y electroforesis.

En general los mtodos luminiscentes se aplican menos que los mtodos de absorcin en
los analitos cuantitativos debido a que el nmero de especies que absorben radiacin
ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que presentan fotoluminiscencia
tras la absorcin de radiacin en esta regin del espectro.

Teora de la Fluorescencia y de la Fosforescencia

La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, lquidos y slidos, tanto sencillos

como complejos.
El tipo ms sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atmicos diluidos.
Por ejemplo:
Los electrones 3s de los tomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p
mediante la absorcin de radiacin de longitudes de onda de 5 896 a 5 890 .
Despus de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo
radiacin de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.

Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiacin absorbida es reemitida sin cambio de

frecuencia, se conoce como radiacin de resonancia o fluorescencia de resonancia.

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para diferenciar entre los fenmenos de fotoluminiscencia se requiere una revisin del
spn del electrn y de los estados excitados singulete / triplete.

Espn del electrn

El principio de exclusin de Pauli establece que en

un tomo no puede haber dos

electrones con los cuatro nmeros cunticos iguales. Esta restriccin requiere que no
haya ms de dos electrones en un orbital, y adems, los dos deben tener los estados de
espn opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines estn apareados. Debido al
apareamiento de espines, la mayora de las molculas no presentan un campo magntico
neto y se dice, por tanto, que son diamagnticas, es decir, no son atradas ni repelidas por
campos magnticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un
momento magntico y, consecuentemente, son atrados cuando se encuentran en un
campo magntico; por ello, se dice que los radicales libres son paramagnticos

Estados excitados singlete/triplete

Un estado electrnico molecular en el cual todos los espines de los electrones estn
apareados se llama singlete y cuando la molcula se expone a un campo magntico no se
produce un desdoblamiento de niveles de energa. Por otro lado, el estado fundamental
para un radical libre, es un estado doblete, porque el electrn impar puede tomar dos
orientaciones en un campo magntico, lo que comunica ligeras diferencias de energa al
sistema.
Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado a un nivel de energa superior,
se forma un estado singlete o triplete. En el estado singlete excitado, el espn del electrn
promocionado continua apareado con el electrn del estado fundamental; sin embargo, en
el estado triplete las espiones de los dos electrones se han desapareado y, por tanto,
estn paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las flechas
representan la direccin del espn.

Velocidades de absorcin y de emisin

La velocidad a la cual se absorbe un fotn de radiacin es enorme, el proceso requiere
del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisin fluorescente, tiene lugar a una
velocidad significativamente ms lenta. El tiempo de vida del estado excitado se relaciona
inversamente con la absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al proceso
de excitacin. Por tanto, para absortividades molares comprendidas entre 10 3 y 105, los
tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7 s. Para sistemas dbilmente
absorbentes, donde la probabilidad del proceso de transicin es ms pequea, los
tiempos de vida pueden ser tan largos como de 10 -6 a 10-5 s. Como se ha sealado, la
velocidad promedio de una transicin triplete a singulete es menor que la correspondiente
transicin singulete a singulete. Por ello, la emisin fosforescente requiere tiempos
comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores.

Procesos de desactivacin

Una molcula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinacin
de varias etapas mecansticas. Como muestran las flechas verticales rectas de la Figura,
dos de estas etapas, fluorescencia y fosforescencia, conllevan la emisin de un fotn de
radiacin. Las otras etapas de desactivacin, indicadas por flechas onduladas, son
procesos no radiantes. El camino ms propicio hacia el estado fundamental es aquel que
minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Por ello, si la desactivacin por
fluorescencia es ms rpida que los procesos no radiantes, se observa tal emisin.
Por otro lado, si la desactivacin no radiante tiene una constante de velocidad ms
favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensa

La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente pequeo de sistemas que

incorporan caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los
procesos de relajacin desactivacin no radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la
reaccin de emisin puede competir cinticamente con ellos. La informacin referente a
los procesos de emisin es suficientemente completa para permitir un clculo cuantitativo

de estas velocidades. Sin embargo, la comprensin de los otros caminos de desactivacin

es, en el mejor de los casos, rudimentaria; para estos procesos, slo se pueden realizar
afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las velocidades y los mecanismos.
Fosforescencia

La desactivacin del estado electrnico excitado tambin puede incluir la fosforescencia.

Despus del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado, la desactivacin posterior
puede tener lugar por conversin interna o externa o por fosforescencia.
Una transicin triplete singlete es mucho menos probable que una conversin
singlete/singlete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio de un estado triplete excitado
respecto a la emisin oscila entre 10-4 y 10 s o ms. Por tanto, la emisin causada por una
transicin de este tipo puede persistir durante algn tiempo despus que la irradiacin se
haya interrumpido.
Las conversiones externas e internas compiten con tanto xito con la fosforescencia que
este tipo de emisin se observa normalmente slo a bajas temperaturas, en medios
altamente viscosos o por molculas que estn adsorbidas sobre superficies slidas.

Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia

Tanto la estructura molecular como el entorno qumico van a influir en que una sustancia
sea o no luminiscente; estos factores tambin determinan la intensidad de emisin cuando
tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.

Rendimiento cuntico

El rendimiento cuntico, o la eficacia cuntica, de fluorescencia de fosforescencia es

simplemente la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia respecto

al nmero total de molculas excitadas. Para molculas altamente fluorescentes como la

fluorescena, la eficacia cuntica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la
unidad. Las especies qumicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen
eficacias que se aproximan a cero.

Tipos de transiciones en fluorescencia

Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorcin de

radiacin ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya que tal radiacin es
suficientemente energtica como para producir la desactivacin de los estados excitados
por predisociacin o disociacin. Por ejemplo, una radiacin de 200 nm corresponde a
aproximadamente 140 kcal/mol; la mayora de las molculas tienen al menos algn enlace
que se puede romper con energas de esta magnitud.
Como consecuencia, rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones * , en
cambio, este tipo de emisin est asociada a los procesos menos energticos * y
* n.

Fluorescencia y estructura

La fluorescencia ms intensa y la ms tiles la que presentan los compuestos que

contienen grupos funcionales aromticos con transiciones * de baja energa. Los
compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas y alicclicas o
estructuras con dobles enlaces altamente conjugados tambin pueden presentar
fluorescencia, pero el nmero de estos compuestos es pequeo comparado con el
nmero de sistemas aromticos.
La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en
disolucin, la eficacia cuntica normalmente aumenta con el nmero de anillos y con su
grado de condensacin. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y
el pirrol,

no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con stas
normalmente s la presentan. En los heterociclos con nitrgeno, se cree que la transicin
electrnica de ms baja energa implica a un sistema n * que rpidamente se
transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.
Sin embargo, la condensacin de anillos bencnicos para dar ncleos heterocclicos, da
lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorcin. En estas estructuras,
el tiempo de vida del estado excitado es ms corto, as, se observa fluorescencia en
compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indo!.

Efecto de la concentracin en la intensidad de fluorescencia

La potencia de la emisin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de

excitacin absorbido por el sistema. Esto es,
F = K'(Po- P)

Donde Po es la potencia del haz que incide sobre la disolucin y P es su potencia despus
de atravesar una longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuntica del
proceso de fluorescencia.
Con el objeto de relacionar F con la concentracin de la especie fluorescente, se escribe
la ley de Beer de la forma .

Atenuador
del haz
INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA
FOSFORESCENCIA
Fotomultiplicador
de la muestra
Fotomultiplicador
de referencia

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son

similares a los que se encuentran en los fotmetros o espectrofotmetros
AmplificadorLadiferencial
ultravioleta/visible.
siguiente grfica muestra una configuracin caracterstica de estos
componentes en los fluormetros y los espectrofluormetros. Casi todos los
instrumentos de fluorescencia utilizan pticas de doble haz tal como se muestra, para
compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.
Dispositivo de lectura

El haz de la muestra pasa primero a travs de un filtro o un monocromador de excitacin,

que transmite la radiacin que provocar la fluorescencia pero excluye o limita la radiacin
de la longitud de onda de la emisin fluorescente.

La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo ms

conveniente es observar la que forma un ngulo recto con el haz de excitacin; a otros
ngulos, la dispersin producida en la disolucin y en las paredes de las cubetas aumenta
y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La radiacin emitida
llega a un fotodetector despus de haber pasado por un segundo filtro o monocromador
que asla la fluorescencia para su medida.

El haz de referencia pasa a travs de un atenuador que reduce su potencia a

aproximadamente la de la radiacin fluorescente (normalmente la potencia se reduce en
un factor de 100 o ms. Las seales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y del
de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un
medidor o en un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta
condicin se consigue con atenuadores pticos o elctricos. Los instrumentos ms
modernos utilizan un circuito divisor analgico o un sistema de adquisicin de datos digital
seguido de tratamiento de los datos para obtener la relacin entre la intensidad de la
emisin fluorescente y la intensidad de la fuente de radiacin.
Espectrometra de luminiscencia molecular

Diseos de instrumentos

Fluormetros

Los fluormetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de llevar a
cabo anlisis cuantitativos por fluorescencia. Como ya se ha sealado para seleccionar
las longitudes de onda de la radiacin de excitacin y de emisin se utilizan filtros de
interferencia y de absorcin. Generalmente, los fluormetros son compactos, robustos y
fciles de usar.

La Figura muestra un esquema de un fluormetro de filtros caracterstico que consta de

una lmpara de mercurio para la excitacin de la fluorescencia y un par de tubos
fotomultiplicadores como detectores. El haz que sale de la fuente se divide cerca de ella
en un haz de referencia y en un haz de muestra. El haz de referencia se atena mediante
el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente la misma que la
intensidad de fluorescencia. Ambos haces pasan a travs del filtro primario y a
continuacin el haz de referencia se refleja hacia el tubo fotomultiplicador de referencia.

El haz de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y provoca la

emisin de fluorescencia. La radiacin emitida pasa a travs de un segundo filtro que
posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador. Las seales de salidas
elctricas de los dos detectores se dirigen hacia un divisor analgico, para obtener la
relacin entre las intensidades de la muestra y de referencia, que sirve como parmetro
analtico.

Espectrofluormetros

Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluormetros capaces de obtener los

espectros de excitacin y los de emisin. En la Figura se muestra el diseo ptico de uno
de ellos, que utiliza dos monocromadores de red. La radiacin que procede del primer
monocromador se divide en dos, una parte se dirige hacia el fotomultiplicador de
referencia y la otra hacia la muestra. La radiacin fluorescente resultante, despus de ser
dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo fotomultiplicador.
Un instrumento como el que se muestra en la Figura suministra perfectamente espectros
satisfactorios para el anlisis cuantitativo. Sin embargo, los espectros de emisin
obtenidos no son necesariamente comparables con los de otros instrumentos, ya que la
seal de salida depende no slo de la intensidad de fluorescencia sino tambin de las
caractersticas de la lmpara, del detector y de los monocromadores. Todas estas
caractersticas instrumentales varan con la longitud de onda y difieren de un instrumento
a otro. Se han desarrollado varios mtodos para obtener el espectro corregido, que es el
verdadero espectro de fluorescencia.

Fosformetros

Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseos similares
a los fluormetros y a los espectrofluormetros antes considerados, slo difieren en que
requieren dos componentes adicionales. El primero es un dispositivo que irradia
alternativamente la muestra y, despus de un retraso en el tiempo adecuado, mide la
intensidad de fosforescencia. El retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la
emisin fosforescente de larga vida de la emisin fluorescente de corta vida que podran
originarse en la misma muestra. Se utilizan dispositivos mecnicos y electrnicos y
muchos instrumentos de fluorescencia comerciales tienen accesorios para medidas de
fosforescencia. Un ejemplo de un tipo de dispositivo mecnico se muestra en la Figura.

APLICACIONES Y MTODOS FOTOLUMINISCENTES

Es inherente a los mtodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a intervalos de

concentracin ms bajos que las medidas espectrofotomtricas de absorcin y se
encuentran entre las tcnicas analticas ms sensibles de las que puedan disponer los
cientficos. El aumento de sensibilidad surge del hecho de que el parmetro relacionado
con

la

concentracin

en

fluorimetra

en

fosforimetra

se

puede

medir

independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el contrario, una medida de

absorbancia requiere la evaluacin de Po y de P, ya que la absorbancia, que es
proporcional a la concentracin, depende de la relacin entre estas dos cantidades. La
sensibilidad de un mtodo fluorimtrico puede mejorarse aumentando Po o mediante la
amplificacin

adicional

de

la

seal

de

fluorescencia.

Por

el

contrario,

en

espectrofotometra, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P y, por ello,

no afecta a la A. Por tanto, los mtodos fluorimtricos tienen, generalmente,
sensibilidades que son de uno a tres rdenes de magnitud superiores a los
correspondientes de absorcin. Por otro lado, la precisin y la exactitud de los mtodos
fotoluminiscentes son habitualmente ms pobres que las de los procedimientos
espectrofotomtricos en un factor entre, quizs, dos y cinco. Generalmente, los mtodos
fosforescentes son menos precisos que sus correspondientes mtodos fluorescentes.

Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas

Los mtodos inorgnicos fluorimtricos son de dos tipos. Los mtodos directos que
conllevan la formacin de un quelato fluorescente y la medida de su emisin. Un segundo
grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la accin
amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.
La ltima tcnica se ha utilizado ms en la determinacin de aniones.

Determinacin fluorimtrica de especies orgnicas

El nmero de aplicaciones del anlisis fluorimtrico a especies orgnicas y bioqumicas es

impresionante.
Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los mtodos para la determinacin de ms
de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de compuestos orgnicos, enzimas y
coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas. Es
incuestionable que las aplicaciones ms importantes de la fluorimetra se encuentran en el
campo del anlisis de productos alimentarios, farmacuticos, muestras clnicas y
productos naturales. La sensibilidad y la selectividad del mtodo hacen que sea una
herramienta particularmente valiosa en estos campos.

Espectro de dispersin
El color azul del cielo durante el da y el color rojo del sol en el ocaso se deben a la
dispersin de la luz por las pequeas partculas de polvo, molculas de agua y otros
gases de la atmosfera .La eficiencia con que se dispersa la luz depende de su longitud de
onda. El cielo es azul porque las luces violetas y azules se dispersan en mayor medida
que otras longitudes de onda mayores de la luz. Por la misma razn, el sol parece rojo al
atardecer porque la dispersin de la luz roja es menos eficiente y , por tanto , se transmite
mejor que las dems longitudes de onda de la luz .La dispersin de la radiacin ha sido
objeto de estudios desde finales del siglo xix y sus aplicaciones se iniciaron poco despus
.Las primeras aplicaciones a cuantitativas de la dispersin , que datan de principios del
siglo xx, usaron la dispersin elstica de la luz para determinar la concentracin de
partculas coloidales en suspensin.
Origen de la dispersin
Un haz de radiacin monocromtico enfocad de longitud de onda , que pasa a travs de
un medio en el que existen partculas cuyas motores dimensiones son inferiores a

3
2

se dispersa en todas direcciones. Por ejemplo, la reducir visible de 500 nm es dispersada

por partculas de incluso 750 nm de dimensiones mximas. Si las partculas son motores,
la radiacin puede ser reflejada o refractada. SE reconocen dos categoras generales de
dispersin. En la dispersin elstica el analito absorbe la radiacin y la vuelve a emitida
sin cambio alguno de la energa de la radican .Cuando la radiacin es remitida con
cambio de su energa, se dice que la dispersin es inelstica. En este texto solo se
considera la dispersin elstica.
La dispersin elstica puede ser de dos tipos: dispersin de pequeas partculas o
Rayleigh y dispersin de grandes partculas La dispersin Rayleigh se pr5oduce cuando
la dimensin mxima de las partculas que producen la dispersin es inferior al 5% de la
longitud de onda de la radiacin. La intensidad de la radiacin dispersa se distribuye de
manera simtrica (Fig.10-53) y es proporcional a su frecuencia a la cuarta ( v

), lo que

significa que la dispersin de la luz azul sea mayor que la dispersin de la luz roja
.Cuando las partculas son mayores, la distribucin de la luz dispersada aumenta en
sentido antergrado y disminuye en sentido. Retrogrado, a causa de las interferencias
constructivas y destructivas.

Turbidimetria y nefelometra

La turbidimetria y la nefelometra son dos tcnicas relacionadas en las que una fuente de
radiacin incidente sufre una dispersin elstica ejercida por una suspensin de partculas
coloidales. En la turbidimetria, el detector se coloca en lnea con la fuente de racin y se
mide la disminucin de la potencia trasmitida de la radican .En la nefelometra, la
radiacin dispersada se mide en un ngulo de 90 en relacin con la fuete de radiacin.
La similitud de las medidas de la turbidimetria con la absorbancia y de la nefelometra con
la fluorescencia resultan evidentes en los diseos de los aparatos de bloques .De hecho,
la turbidez puede medirse con un espectrofotmetro uv/Vis, por ejemplo un spectronic-20,
mientras que en nefelometra puede utilizarse un espectrofluorimetro.
Turbidimetria .Mtodo en que se mide la disminucin de la radiacin transmitida debido a
la dispersin
Nefelometra: Mtodo para medir la intensidad de una radiacin dispersa en un ngulo de
90 c con respecto a la fuente.
Turbidimetria o nefelometra. La eleccin entre turbidimetria y nefelometra depende de
dos factores. El ms importante es la intensidad de la traicin transmitida o dispersada en
relacin con la intensidad de la radiacin procedente de la fuente.

Fuente

Fuente

Cuando la concentracin de partculas dispersantes presentes en la disolucin es

pequea, la intensidad de la radiacin transmitida
de radiacin,

I 0.

I T . Sera muy similar a la de la fuente

Como ya se dijo en la seccin de absorcin molecular la

determinacin de una pequea diferencia entre dos seales intensas est sometida a una
notable incertidumbre. Por tanto, la mejor eleccin cuando las muestras contienen pocas
partculas dispersantes es la nefelometra. Por el contrario, la turbidimetria es una tcnica
mejor para las muestras que contienen concentraciones elevadas de partculas
dispersantes.
La segunda consideracin a tener en cuenta se elige entre turbidimetria y nefelometra es
el tamaa de las partculas dispersas. EN el caso de la nefelometra la intensidad de la
radiacin dispersada a 90 ser mayor si las partculas son bastante pequeas para que
se produzca una dispersin Reyleigh .Si las partculas son mayores la intensidad de la
dispersin disminuir a 90. Cuando se utiliza una fuente de tradicin ultravioleta o visible
el tamao ptimo de las partculas es de 0.1-1um .El tamao de las partculas
dispersadas provoca un incremento de la reflexin y la refraccin (aunque en este caso es
posible perder la relacin lineal entre la seal y la concentracin de partculas
dispersantes).
Determinacin de la contraccin mediante turbidimetria .En turbidimetria la transmitancia
medida,

T , es el cociente entre la intensidad de la fuente de radiacin transmitida,

IT

y la intensidad de la radiacin de la fuente transmitida por un blanco , I 0

T=

IT
I0

La relacin entre la transmitancia y la concentracin de las partculas

similar a la proporcionada por la ley de Beer

dispersas es

logT kbC
Donde C es la concentracin de las partculas dispersantes expresada como masa por
unidad de volumen (p/v), b es la longitud del camino ptico y k es una constante que
depende de varios factores entre ellos el tamao y la forma de las

Fuentes
bb

Fuente

Selector de
longitud de
honda

Selector
de
longitud
de onda

Muestra

Detector

Procesad
or de la

Muestra
Detector

Procesador
de la seal

Partculas dispersantes y la longitud de onda de la fuente de radiacin. Igual que sucede

en la ley de Beer, la ecuacin sealada anterior puede sufrir importantes desviaciones con
respecto a la lnea recta. La relacin exacta se establece mediante una curva de
calibracin que se prepara usando un conjunto de patrones con concentraciones
conocidas.
Determinacin de la concentracin por nefelometra.
En nefelometra la relacin entre la intensidad de la radiacin dispersada

Is

, y la

concentracin (% p/v ) de las partculas dispersantes se expresa como

I s=K s I 0 C
Donde K es una constante emprica del sistema e
radiacin .El valor de

Ks

I0

es la intensidad de la fuente de

depende de una curva de calibracin preparada usando una

serie de patrones de concentracin conocida.

Seleccin de la longitud de onda de la radiacin incidente. La seleccin de la longitud de
la onda de la radiacin incidente depende, sobre todo, de la necesidad de reducir al
mnimo las posibles interferencias. En el caso de la turbidimetria, en la que la radiacin
incidente se transmite a travs de la muestra, hay que evitar la radiacin absorbida por la
muestra. Como la absorcin es un problema habitual, la longitud de onda debe
seleccionarse con cierto cuidado, usando para ello un filtro o un selector monocromtico.
En el caso de la nefelometra, la absorcin de la radiacin incidente no constituye un
problema, a menos que induzca fluorescencia en la muestra. Si la muestra no es
fluorescente, no ser necesario seleccionar una longitud de onda determinada y podr
usarse una fuente de luz blanco como radicon incidente. Cundo se usa un filtro o un
selector monocromtico, otros factores a tener en cuenta son la dependencia de la
intensidad de la fuente en la longitud de onda.
La mayor parte de los mtodos turbidimtricos y nefelmetros se basa en la formacin de
partculas dispersantes mediante precipitacin las propiedades de un precipitado
depende de las condiciones en que se produce la precipitacin depende de las condicin
en que se produce la precipitacin. Para mantener una distribucin reproducible de los
tamaos de las partculas entre muestras y patrones, es necesario controlar parmetro
tales como la concentracin de los reactivos, el orden en que aaden , el pH , la
temperatura , la velocidad de agitacin , la fuerza inica y el tiempo entre la formacin
inicial del precipitado y el momento en que se miden la transmitancia o la dispersin .
En muchos casos, se aaden agentes tensoactivo como la glicerina, la gelatina o la
dextrina, para estabilizar el precipitado en un estado coloidal y evitar la coagulacin de las
partculas.

Espectroscopia de emisin

Un analtico en estado excitado posee una energa

E2

mayor que la pose cuando se

E1 . Cuando el analito se relaja o retorna al

encuentra en un estado de menor energa

estado de energa ms baja, el exceso de energa.

E= E2

E1

El tiempo y vida de un analito en estado excitado,

105 a

109

A.

es breve y dura, en general, de

segundos para los estados excitados electrnicos y

1015

segundos

para los estados excitados vibratorios. La relajacin se produce mediante colisiones entre

A.

y otras especies de la muestra, por reacciones fotoqumicas y por la emisin de

fotones. En el primero de estos procesos, llamado desactivacin vibratoria o relajacin no

radiactiva, el exceso de energa se libera en forma de calor as:

+ Calor

La relajacin por reaccin fotoqumica puede suponer una reaccin de

descomposicin en la

O una reaccin de

A.

que

se divide:

X+Y

y otra especie:

A.

+Z

X+Y

En todo caso, el exceso de energa se utiliza en la reaccin qumica o se libera

en forma de calor.

En el tercer mecanismo, el exceso de energa se libera como un fotn de

radiacin electromagntica:

A.

A + hv

Tiempo de vida
Tiempo durante el cual un analito se mantiene en el estado excitado antes de
regresar a su estado de menor energa

Relajacin
Cualquier proceso por el que el anilito recupera un estado de baja energa
desde un estado de alta energa

La liberacin de un fotn tras una excitacin termia denomina emisin y la que

sigue a la absorcin de un fotn es conoce como fotoluminiscencia, en el
quimioluminiscencia y en la bioluminiscencia, la excitacin de lugar,
respectivamente a una reaccin qumica obioqumica. Los mtodos
espectroscpicos basados en la fotoluminiscencia.