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Produccin de interfern-Beta

Objetivo
El presente trabajo se refiere a un procedimiento para preparacin de interfern-Beta. Ms
concretamente se refiere a un mtodo de obtencin para extraer una forma de secuencia de interfern
recombinante humano a partir de un preparado que E. Coli modificada genticamente.
Introduccin
Los interferones son unas protenas producidas naturalmente por el sistema inmunitario de la mayora
de los animales como respuesta a agentes patgenos, tales como virus y clulas cancergenas. Los
interferones son glicoprotenas de la clase de las citocinas. Reciben su nombre debido a su capacidad
para interferir en la replicacin de los virus en las clulas hospedadoras. Se unen a receptores en la
superficie de las clulas infectadas, activando diferentes vas de sealizacin en las que participan
diversas protenas antivirales (como la PKR), para impedir la replicacin de una amplia variedad de
virus de ARN y ADN. Cumplen, adems, otras funciones: activan clulas inmunes, como los
macrfagos y las clulas NK1(del ingls natural killer); incrementan el reconocimiento de clulas
cancergenas o infecciones al dinamizar la presentacin de antgenos a los linfocitos T y, finalmente,
incrementan la capacidad de las clulas sanas para resistir a nuevas infecciones vricas. Ciertos
sntomas como el dolor muscular y la fiebre estn relacionados con la produccin de interferones
durante la infeccin.
El descubrimiento de estas molculas, en 1950, proviene de la observacin de que los individuos
infectados por un virus son resistentes a la infeccin por un segundo tipo de virus.
En los seres humanos hay tres tipos principales de interfern:
1. El primer tipo est compuesto por 14 diferentes isoformas del interfern alfa, e isoformas
individuales beta, omega, psilon y kappa.
2. El segundo tipo consiste en el interfern gamma.
3. Recientemente se ha descubierto una tercera clase de interfern, el lambda, con 3 isoformas
diferentes.
Existen hongos en la naturaleza como Ganodermalucidum que favorecen en forma natural la
produccin de interfern gamma en el cuerpo humano. Los interferones se pueden producir de manera
natural pero tambin de manera artificial, es decir en laboratorios en forma de inyeccin o de pastillas
para las personas que padecen de alguna enfermedad autoinmune como la esclerosis mltiple y el
sndrome de sjogren.
En la mayora de casos, la produccin de interfern es inducido por otras citocinas, por ejemplo, IL-1,
IL-2, TNF y CSF, que son sintetizadas en respuesta a la aparicin de virus en el cuerpo. Su
metabolismo y excrecin se produce principalmente en el hgado y riones. Difcilmente atraviesan la
placenta y la barrera hematoenceflica 2. El interfern alfa y beta es producido por varios tipos
celulares: las clulas T y las clulas B, macrfagos, fibroblastos, clulas endoteliales y osteoblastos
entre otras, y son importantes componentes de la respuesta antiviral. Estimulan a los macrfagos y las
clulas NK y son activas contra los tumores.
El interfern gamma participa en la regulacin de las respuestas inmune e inflamatoria. En los
humanos, slo hay un tipo de interfern gamma. Se produce en clulas T activadas. El interfern
gamma tiene efectos antivirales y antitumorales, pero generalmente dbiles. Sin embargo, potencia los
efectos del interfern alfa y beta. Desafortunadamente, el interfern gamma necesita ser liberado en el
tumor en dosis muy pequeas y no es, actualmente, muy til en el tratamiento de la esclerosis mltiple.
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El interfern gamma es segregado por las clulas Th1 y enva leucocitos al punto de infeccin, dando
como resultado una inflamacin. Tambin estimula a los macrfagos para eliminar bacterias que han
sido fagocitadas. Este interfern es tambin importante en la regulacin de la respuesta de las clulas
Th2. Al estar ntimamente relacionado con la respuesta inmunitaria, su produccin puede derivar en
desrdenes inmunitarios.
El interfern omega es segregado por los leucocitos en las infecciones virales y en los tumores.
El interfern tiene 2 acciones bsicas:
1. Impide la replicacin en clulas infectadas que an no han sido destruidas por la accin vrica.
2. Activa unos linfocitos, clulas denominadas NK, capaces de reconocer clulas infectadas por
virus y eliminarlas.

Marco terico
La produccin de interfern era cara hasta 1980 cuando genes de interfern fueron introducidos en
bacterias usando tecnologa de recombinacin de ADN, permitiendo el cultivo masivo y purificacin de
las emisiones bacterianas.
Actualmente existen varios tipos de interfern que han sido aprobados para su uso en humanos, y la
terapia de interfern se utiliza junto con la quimioterapia y la radioterapia en el tratamiento del cncer.
Cuando se usa de esta manera, el interfern y el interfern se administran generalmente mediante
inyecciones intramusculares. La inyeccin de interfern en los msculos, venas o bajo la piel es
comnmente bien tolerada. Los efectos secundarios ms frecuentes son sntomas catarrales: aumento
de la temperatura corporal, malestar, fatiga, dolor de cabeza, dolor muscular y convulsiones. Eritema,
dolor y dureza en el punto de la inyeccin tambin se observan frecuentemente. Raras veces, los
pacientes experimentan cada del cabello, vrtigo y depresin. Todos los efectos conocidos son
reversibles y desaparecen a los pocos das de abandonar el tratamiento.
El interfern alfa est indicado en el tratamiento de la hepatitis C y de la leucemia mielgena crnica,
se utiliza habitualmente como interfern pegilado.
El interfern se utiliza en el tratamiento y control de la esclerosis mltiple. Por un mecanismo an
desconocido, inhibe la produccin de las citocinas de Th1 y la activacin de monocitos. Tambin tiene
una labor importante en el shock sptico.
Produccin de interfern para ser usado exclusivamente en pacientes con esclerosis mltiple
La esclerosis mltiple (E.M.), tambin conocida como mielopatadesmielinizante, es una enfermedad
caracterizada por la aparicin de lesiones desmielinizantes, neurodegenerativas y crnicas del sistema
nervioso central. Actualmente se desconocen las causas que la producen, aunque se sabe a ciencia
cierta que hay diversos mecanismos autoinmunitarios implicados.
Puede diagnosticarse con fiabilidad mediante una biopsia o una autopsia, aunque existen criterios no
invasivos para diagnosticarla con aceptable certeza. Los ltimos internacionalmente admitidos son
los criterios de McDonald3.
Por el momento se considera que no tiene cura, aunque existe medicacin eficaz, y la bsqueda de
sus causas, todava desconocidas, es un campo activo de investigacin. Puede presentar una serie de
sntomas que aparecen en brotes o que progresan lentamente a lo largo del tiempo. Se cree que en su
gnesis actan mecanismos autoinmunitarios.
Se distinguen varios subtipos de esclerosis mltiple, y muchos afectados presentan formas diferentes
de la enfermedad con el paso del tiempo.

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A causa de sus efectos sobre el sistema nervioso central, puede tener como consecuencia una
movilidad reducida e invalidez en los casos ms graves. Si no se trata tras la aparicin de los primeros
sntomas, al menos el 50% de los pacientes conservan un elevado grado de movilidad a los quince
aos de haber sido diagnosticada la enfermedad.
La esclerosis mltiple se caracteriza por dos fenmenos:
1. Aparicin de focos de desmielinizacin esparcidos en el cerebro y parcialmente tambin en
la mdula espinal causados por el ataque del sistema inmunitario contra la vaina de mielina que
recubre los nervios.
2. Las neuronas, y en especial sus axones se ven daados por diversos mecanismos (ver pgina
5).
Como resultado, las neuronas del cerebro pierden parcial o totalmente su capacidad de transmisin,
causando los sntomas tpicos de adormecimiento, cosquilleo, espasmos, parlisis, fatiga y
alteraciones en la vista.
En la variante remitente-recurrente tambin se ha detectado inflamacin en el tejido nervioso
y transeccinaxonal, o corte de los axones de las neuronas, lo que hace que las secuelas sean
permanentes.
Desde la casi completa erradicacin de la poliomielitis, la esclerosis mltiple es tras la epilepsia la
enfermedad neurolgica ms frecuente entre los adultos jvenes y la causa ms frecuente de parlisis
en los pases occidentales. Afecta aproximadamente a 1 de cada 1000 personas, en particular a las
mujeres. La mayora de los casos se presentan cuando los pacientes tienen entre 20 y 40 aos.
Se considera que la esclerosis mltiple aparece cuando se da una combinacin de factores
ambientales en personas genticamente predispuestas a adquirirla.
Factores genticos
La esclerosis mltiple (E.M.) aparece principalmente en caucsicos. Es 20 veces menos frecuente
entre los inuit de Canad que entre los dems canadienses que viven en la misma regin. Tambin es
rara entre las tribus indias americanas de Amrica del Norte, los aborgenes australianos y
los maor de Nueva Zelanda. Estos ejemplos sealan que la gentica tiene un papel importante en el
desarrollo de la enfermedad.
La esclerosis mltiple no es una enfermedad hereditaria. Sin embargo, la enfermedad est influenciada
por la constitucin gentica del individuo y se ha demostrado que existengenes que estn relacionados
con un mayor riesgo de contraer la enfermedad. Estos genes, que estn siendo estudiados, no son
suficientes para diagnosticar la enfermedad.
En general, uno de cada 25 hermanos de un individuo con la enfermedad tambin se ver afectado. Si
un gemelo univitelino se ve afectado, existe hasta un 50 % de probabilidad que el otro gemelo tambin
enferme. Pero solo uno de cada 20 gemelosbivitelinos se ver afectado si su hermano ha enfermado.
Si uno de los padres est afectado por la enfermedad, cada uno de los hijos tendr una probabilidad
de 1 entre 40 de desarrollarla de adulto.
Dos estudios realizados en Canad y Gran Bretaa muestran la siguiente tabla de probabilidades de
enfermar segn el grado de parentesco:
Grado de Parentesco

Probabilidad de enfermar

En la poblacin

0.2%

Familia en 1 grado

3%
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Familia en 2 grado

1%

Familia en 3 grado

0.9%

Gemelos univitelinos

35%

Hermanos

4%

Los orgenes de la enfermedad son desconocidos.


Se ha lanzado la hiptesis de que puede ser producida por una combinacin de varios factores
genticos y medioambientales. Esto incluye posibles infecciones virales u otros factores en la niez o
durante el embarazo que puedan preparar el sistema inmunitario para una reaccin anormal ms
tarde.
A nivel molecular, puede que exista una similitud estructural entre una agente infeccioso desconocido y
componentes del sistema nervioso central, lo que causara confusin ms tarde en el sistema
inmunitario (un proceso llamado mimetismo molecular). Con todo, an no se conoce ningn virus de la
esclerosis. Desde luego, la esclerosis mltiple no es contagiosa.
Otras hiptesis propuestas intentan establecer relaciones con enfermedades vasculares.
Recientemente ha sido propuesta una relacin con una enfermedad vascular conocida
como insuficiencia venosa cerebroespinal crnica.
Los tejidos del sistema nervioso y de la mdula espinal estn protegidos por un sistema de vasos
capilares, llamado barrera hematoenceflica, que en los pacientes de esclerosis mltiple no funcionan.
Por causas desconocidas, macrfagos y linfocitos pueden cruzar las barreras hematoenceflicas de
estos pacientes y comenzar un ataque autoinmune.
Se ha conseguido reconstruir el proceso del ataque del sistema inmunitario a la mielina a partir de
observaciones en los tejidos daados y el estudio de la Encefalomielitis Experimental Autoinmune (o
EAE, de sus siglas en ingls), que es una enfermedad similar a la EM que puede ser inducida en los
roedores.

Tipos de lesiones
La National Multiple Sclerosis Society (de Estados Unidos) ha lanzado un proyecto llamado TheLesion
Project para catalogar todos los tipos de lesiones posibles y desarrollar un modelo ms preciso de
cmo ocurren las cosas. Se han encontrado cuatro familias de lesiones diferentes pero no hay un
consenso en cuanto al significado de este hecho. Unos piensan que esto significa que la esclerosis
mltiple es realmente una familia de enfermedades. Otros piensan que las lesiones pueden cambiar de
un tipo a otro con el tiempo o segn el individuo. Las cuatro familias o "patterns" son los siguientes:
Patrn I: La lesin presenta clulas T y macrfagos alrededor de vasos capilares. Los oligodendrocitos
estn ms o menos intactos y no hay signos de activacin del sistema inmune complementario
(anticuerpos).
Patrn II: La lesin tambin presenta clulas T y macrfagos alrededor de los capilares. Los
oligodendrocitos tambin se preservan, pero aparecen signos de activacin del complemento.
Patrn III: Las lesiones son difusas y presentan inflamacin. Los oligodendrocitos presentes estn
daados (oligodendrogliopata distal). Hay tambin signos de activacin de la microglia y prdida de
MAG (protena constituyente de la mielina, del ingls myelinassociatedglycoprotein). Las lesiones no
rodean los vasos capilares y hay un anillo de mielina intacta alrededor de ellos. Tambin aparece una
remielinizacin parcial y apptosis de oligodendrocitos.
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Patrn IV: La lesin presenta bordes abruptos y oligodendrocitos degenerados, con un anillo de
mielina. Ausencia de oligodendrocitos en el centro de la lesin. No est activado el complemento ni
hay perdida de MAG.
Los dos primeros patrones se consideran ataques autoinmunes contra la mielina y los dos ltimos
contra los oligodendrocitos. Los dos primeros patrones son adems similares a los producidos en EAE.
Desmielinizacin
En estado normal, existe una barrera entre el sistema nervioso central y la sangre llamada barrera
hematoenceflica, que est formada por clulas endoteliales tapizando las paredes de los vasos
sanguneos. Por causas desconocidas, en los pacientes de esclerosis esta barrera no funciona bien, y
las clulas T autorreactivas la cruzan. A partir de este momento, estas clulas T van a atacar la mielina
del sistema nervioso, produciendo una desmielinizacin.
A la vez aparece un proceso inflamatorio. La inflamacin es facilitada por otras clulas inmunitarias y
elementos solubles, como la citocina y los anticuerpos. A causa de este comportamiento anormal del
sistema inmunitario, la esclerosis mltiple es considerada una enfermedad autoinmunitaria.
Ampliamente aceptado es que un subtipo especial de linfocitos, llamados clulas CD4-Th1-T, tienen
una funcin clave en el desarrollo de la enfermedad. Bajo circunstancias normales, estos linfocitos
pueden distinguir entre clulas propias y ajenas. En una persona con esclerosis mltiple, sin embargo,
las clulas reconocen partes sanas del sistema central como ajenas y las atacan como lo haran con
un virus. En la esclerosis, la parte atacada es la mielina, una sustancia grasa que cubre los axones de
las clulas nerviosas y que es importante para una transmisin nerviosa adecuada.
La inflamacin finalmente lleva a la apertura de la barrera hematoenceflica, lo que puede acarrear
problemas como edemas. Tambin causa la activacin de macrfagos, demetaloproteinasas y
otras proteasas y citocinas. Finalmente llevar a la destruccin de la mielina, proceso llamado
desmielinizacin.

Dao a los axones


A travs de la resonancia magntica y otros sistemas, se ha demostrado que el dao a los axones es
una de las principales causas del desarrollo de discapacidades permanentes. Se ha demostrado que
esta lesin interviene no solo en formas crnicas o en estadios tardos de la enfermedad, sino que est
presente desde el inicio.
Los mecanismos que llevan a este tipo de daos no estn explicados en su totalidad. Actualmente
parece que una regulacin anmala del glutamato as como la liberacin demonxido de
nitrgeno (NO) tienen una funcin importante.
Varios experimentos en animales con EAE, encefalitis inducida, enfermedad supuestamente similar a
la Esclerosis mltiple, han mostrado que a los que se les dieron medicamentos para la disminucin de
los niveles de glutamato en el cerebro tuvieron una disminucin significativa en los daos a los axones.
Otra posibilidad es la destruccin directa de los axones por las clulas T autorreactivas.

Remielinizacin
Los oligodendrocitos4 originales que forman la cubierta de mielina no son capaces de recrear la
cubierta una vez que ha sido destruida. Sin embargo, el cerebro es capaz de reclutar clulas madre
que migran de otras zonas del cerebro desconocidas, se diferencian en oligodendrocitos maduros y
recrean la cubierta de mielina. Esta nueva cubierta a menudo no es tan gruesa o efectiva como la
original y ataques repetidos tendrn como reaccin remielinizaciones cada vez menos efectivas, hasta
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que se forma una placa alrededor de los axones daados. Las clulas madre se diferencian y
remielinizan axones in vitro sin ningn problema, por lo que se sospecha que la inflamacin o el dao
al axn inhiben la diferenciacin de las clulas madre in vivo.
La remielinizacin es una de las razones por las que, especialmente en las primeras fases de la
enfermedad, los sntomas tienden a disminuir o desaparecer despus de das a meses.
Resultado
Sin embargo, el dao a los axones y la prdida irreversible de las neuronas aparecen muy pronto en el
transcurso de la enfermedad. Los sntomas de la esclerosis son causados por lesiones mltiples en el
cerebro y la espina dorsal y pueden variar mucho entre individuos, dependiendo de dnde ocurran las
lesiones. A pesar de todo, la plasticidad del cerebro a menudo puede compensar una parte del dao.
Datos experimentales indican que nervios daados pueden tambin recuperar parcialmente la funcin
a travs de la creacin de canales de sodio en las membranas celulares.
Factores que provocan una recada
En general, las recadas tienden a ocurrir con ms frecuencia durante la primavera y el verano que en
otoo o en invierno. Infecciones como un catarro, un resfriado o una diarrea aumentan el riesgo de
recada. Sin embargo, la vacuna contra la gripe es inocua y no provoca recadas como se ha
demostrado en diversos estudios recientes. La vacuna del ttanos tambin se considera inocua,
aunque no ha sido estudiada con detalle. En general, las vacunas con virus vivos atenuados aumentan
el riesgo de recada.
El embarazo puede afectar directamente la probabilidad de recada. Los ltimos tres meses de
embarazo ofrecen una proteccin natural contra la recada, mientras que los primeros meses y
especialmente las primeras seis semanas el riesgo aumenta entre un 20 y un 40 %. Segn estudios
modernos, el embarazo no afecta la incapacidad a largo plazo. La esclerosis mltiple no aumenta la
probabilidad de tener un nio disminuido, aunque s existe la posibilidad de transmisin de la
enfermedad.
Estadsticamente no hay evidencias de que accidentes u operaciones provoquen recadas. En
principio, la ciruga no precisa de cuidados especiales que no sean causadas por discapacidades
existentes.
El deporte es posible, aunque se desaconsejan extremos como maratones.
El estrs puede causar una recada, aunque los datos de los estudios son inconsistentes.
El calor y el agotamiento pueden aumentar los sntomas temporalmente, fenmeno conocido como
sntomas de Uhthoff. Esta es la razn de que algunos pacientes eviten saunas o incluso duchas
calientes. Sin embargo, el calor no es un factor demostrado de recada. Una fuerte exposicin al sol
debe ser evitada, ya que los rayos ultravioleta son un fuerte estmulo del sistema inmunitario.
Cuadro Clnico
Las lesiones del sistema nervioso central que causan la esclerosis mltiple no siempre se manifiestan
directamente como sntomas clnicos detectables y claramente atribuibles a la enfermedad, por lo que
en ocasiones se tiende a restar importancia a los primeros signos. Sin embargo, el origen de la
esclerosis mltiple ya est presente y comienza a progresar.
Aunque en algunas ocasiones al principio de la esclerosis mltiple se acumula poca discapacidad y la
calidad de vida no se ve demasiado afectada, la realidad es que el sustrato de la enfermedad ya se
est desarrollando. Existen abundantes evidencias clnicas y cientficas que indican que, de lo que
ocurra en las fases iniciales de la esclerosis mltiple, depende en gran medida su evolucin posterior.
En otras palabras, las lesiones de hoy en el sistema nervioso central, son la causa de la discapacidad
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de maana; de modo que si no se previenen hoy, maana ser demasiado tarde para conseguir la
recuperacin. Resulta clave detectar la esclerosis mltiple cuanto antes, para poder actuar a tiempo.
Normalmente, la Esclerosis Mltiple se detecta tras un primer brote de la enfermedad. Los sntomas de
este primer brote son muy variados, pero entre los ms fcilmente reconocibles, destacan hormigueo,
debilidad, falta de coordinacin (ataxia), alteraciones visuales, rigidez muscular, trastornos del habla
(disartria), andar inestable, entre otros. No en todos los pacientes se manifiestan todos los sntomas ni
durante el mismo tiempo.
Tras detectar estos sntomas es fundamental acudir al mdico para realizar las pruebas oportunas. En
la actualidad, aunque no existe ninguna prueba de laboratorio que de manera aislada permita
confirmar o eliminar por completo la posibilidad de padecer esclerosis mltiple, la tecnologa
disponible, particularmente la resonancia magntica nuclear, el anlisis del lquido cefalorraqudeo y
los potenciales evocados, s permiten un alto grado de seguridad en el diagnstico, incluso antes de
que haya una confirmacin clnica de la enfermedad.
Si se detecta que los sntomas son provocados por la Esclerosis Mltiple, el neurlogo podr iniciar un
tratamiento adecuado para que los brotes tarden ms en aparecer y sus efectos sean menores.
Se ha demostrado que el tratamiento precoz reduce significativamente el nmero de brotes y la
intensidad de los mismos.
Las personas afectadas pueden manifestar un amplio nmero de sntomas, pero varan mucho de
unas a otras, tanto en el tipo de sntomas como en su grado. En principio, pueden clasificarse segn la
zona del sistema nervioso afectada en: derivados del dao al nervio ptico, derivados del dao a la
mdula espinal (en concreto, los relativos a la movilidad son de este tipo) y derivados del dao al
cerebro.
Se presentan a continuacin los ms comunes:

Astenia (fatiga)

Prdida de masa muscular

Debilidad muscular

Descoordinacin en los movimientos

Disfagia (problemas al tragar)

Disartria (problemas de habla)

Insuficiencia respiratoria

Disnea (problemas al respirar).

Espasticidad (rigidez muscular).

Espasmos musculares

Calambres

Fasciculaciones musculares (pequeas pero generalizadas vibraciones musculares).

Disfuncin sexual

Problemas de visin: prdida, doble visin, nistagmo

Problemas cognoscitivos: dificultad de realizar tareas simultneas, de seguir instrucciones


detalladas, prdida de memoria a corto plazo, depresin.

Labilidad emocional (risas y llantos inapropiados sin afectacin psicolgica).


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Estreimiento secundario a inmovilidad.

Curso y formas de la enfermedad


En la mayora de los casos la esclerosis comienza con la aparicin aguda de sntomas en un espacio
que vara de horas a das, habitualmente llamado exacerbacin, ataque o episodio. Ms adelante se
habla de recada. El primer sntoma es a menudo la neuritis ptica, una inflamacin del nervio ptico
que causa deterioro de la visin y dolor al mover el ojo. Sin embargo, no todos los pacientes con una
neuritis ptica desarrollan esclerosis mltiple. Alteraciones sensoriales como entumecimiento
u hormigueo tambin son sntomas iniciales frecuentes. En principio, la esclerosis puede comenzar
con cualquiera de los sntomas asociados a la enfermedad.
Esclerosis mltiple benigna:
En los casos de EM benigna, tras uno o dos ataques, la recuperacin es completa. La enfermedad no
empeora a lo largo del tiempo y suele tener sntomas menos graves. Estos casos solo se identifican
cuando queda una incapacidad permanente pequea a los 10 o 15 aos del primer ataque, que fue
identificado en su da como esclerosis mltiple con recadas.
Esclerosis mltiple remitente-recurrente:
Especialmente en fases tempranas de la enfermedad, los sntomas disminuyen o desaparecen
espontneamente en un perodo que puede durar de das a meses. Este tipo de transcurso tambin se
denomina: "con recadas y remisiones". Nuevas recadas pueden aparecer en semanas o varios aos
y son imprevisibles. Estas recadas pueden incluir los sntomas anteriores y/u otros nuevos. Sin
embargo, estudios de resonancia magntica muestran que el dao a los nervios puede continuar en
estos pacientes incluso cuando los sntomas han remitido. Se sabe desde hace mucho tiempo que la
esclerosis mltiple nunca duerme, por lo que la importancia del tratamiento preventivo es grande.
Muchos enfermos permanecen en esta fase el resto de sus vidas.
Esclerosis mltiple progresiva secundaria:
En muchos casos la enfermedad cambia al cabo de varios aos y los sntomas comienzan a progresar
lentamente con o sin recadas sobreimpuestas. No se conoce an bien su etiologa.
Esclerosis mltiple progresiva primaria:
Un 10 % de todos los individuos afectados presentan un avance crnico desde el principio sin remisin
de los sntomas. Es la llamada forma progresiva primaria y a menudo aparece junto a debilidad en las
piernas y alteraciones en el andar y en la vejiga urinaria. Parece que son procesos degenerativos y no
inflamatorios los que tienen un papel preponderante en este tipo. En los casos en que la forma
progresiva primaria se sobreimponen a recadas se suele hablar de progresiva con recadas.
Existen tambin otras formas de esclerosis mltiple, que para muchos son enfermedades distintas, que
se agrupan bajo el nombre colectivo de formas frontera de la esclerosis mltiple.
Diagnstico
El diagnstico de la esclerosis mltiple es complejo. Se requieren evidencias de una diseminacin de
lesiones tanto temporal como aparentemente espacialmente en el sistema nervioso central. Eso quiere
decir que, no solo tiene que haber por lo menos dos lesiones distintas verificables por sntomas
clnicos o por resonancia magntica, adems tiene que haber evidencias de nuevos sntomas o
lesiones en un intervalo de 30 das.

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Fig.1. Resonancia Magntica Nuclear realizada con contraste. Se utiliz Gadolinio.


Se observan los tumores de mielina en la mdula espinal y cerebro.

Fig. 2. Cortes de cerebro de resonancia magntica de la Fig.1. Se observan tumores de


Mielina.

Una muestra de lquido cefalorraqudeo obtenida con una puncin lumbar sirve para obtener pruebas
de la inflamacin crnica en el sistema nervioso, a menudo indicada por la deteccin de bandas
oligoclonales (molculas de anticuerpos) en el lquido.
Los estudios de conductividad nerviosa de los nervios ptico, sensoriales y motores tambin
proporcionan pruebas de la existencia de la enfermedad, ya que el proceso de desmielinizacin implica
una reduccin de la velocidad de conduccin de las seales nerviosas. El estudio se realiza
comparando los tiempos de reaccin con mediciones preestablecidas.
El proceso de diagnstico se completa con la realizacin de pruebas para excluir otras enfermedades
que pueden imitar a la esclerosis como la Enfermedad de Devic5, lasarcoidosis6, la vasculitis7 y
la enfermedad de Lyme8.
Tratamiento de la esclerosis mltiple
Actualmente la esclerosis mltiple no tiene cura, pero existen varios medicamentos que pueden
retrasar su progresin y aliviar los sntomas.
Aunque ningn tratamiento consigue curar la enfermedad, existen varios medicamentos tiles que
pueden disminuir la frecuencia e intensidad de los ataques y proteger del dao axonal y neuronal.
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Interfern
Se ha demostrado que el interfern beta-1a o beta-1b (marcas comerciales: Betaferon, Avonex, Rebif)
reduce la frecuencia de recadas en un 30%, disminuye el nmero de nuevas lesiones nerviosas y
reduce la progresin de disminuciones fsicas. Algunos interferones se han mostrado eficaces, no solo
en la EM con recadas y remisiones, sino tambin en la forma progresiva secundaria.
El interfern beta es una citocina que bajo condiciones normales es producida por el cuerpo durante
infecciones virales. Como medicamento se extrae de clulas de mamferoso bacterias especiales.
Todos los preparados deben ser inyectados en el msculo o la piel, con frecuencia variable desde una
vez cada dos das hasta una vez por semana, dependiendo de los preparados. Se ha intentado
producir pastillas con interfern beta, pero todava no se ha conseguido.
Los principales efectos secundarios son sntomas similares a la gripe. Tambin puede haber
reacciones inflamatorias en la piel, en el punto de inyeccin. La mayora de los pacientes de esclerosis
mltiple toleran bien el preparado. Es necesaria una vigilancia continua de los valores sanguneos.
Acetato de glatiramer
El acetato de glatiramer (Copaxone) tambin ha demostrado sus efectos, reduciendo la frecuencia de
ataques un 30%, disminuyendo el nmero de lesiones nerviosas y reduciendo la progresin de
disminuciones fsicas. Su efecto teraputico es comparable con el del interfern beta.
El acetato de glatiramer consiste en pptidos compuestos de cuatro aminocidos diferentes. Intentos
de producir pastillas tampoco han tenido xito.
El acetato de glatiramer es efectivo en el tratamiento de EM con recadas y remisiones. Efectos
benficos en el tratamiento de la forma progresiva secundaria no han sido demostrados
suficientemente.
Los principales efectos secundarios incluyen reacciones inflamatorias en el lugar de la inyeccin.
Tambin se ha descrito un temporal efecto secundario tras la inyeccin: enrojecimiento de la piel,
presin en el pecho, palpitaciones, disnea y ansiedad. Tras una reaccin de este tipo no es necesario
interrumpir el tratamiento. En general se considera que el acetato de glatiramer tiene menos efectos
secundarios que el interfern. No es necesario el seguimiento de los valores sanguneos.
Azatioprina
La azatioprina (Imurel) es un frmaco que est aprobado en algunos pases para el tratamiento de la
EM. Sin embargo, su efectividad no ha sido demostrada tan claramente como la del interfern o el
acetato de glatiramer. No se ha demostrado un efecto en la forma progresiva secundaria.
En general, el medicamento se tolera bien. Tras una terapia larga el riesgo de cncer aumenta (tras 10
aos de terapia, el riesgo se multiplica por cuatro). Es necesaria una vigilancia continua de los valores
sanguneos.
Mitoxantrona
Se emplea en la EM progresiva con el nombre comercial de Ralenova. Se ha demostrado su
efectividad en la EM con recadas y remisiones y en la forma progresiva secundaria. En la mayora de
los casos se administra de forma intravenosa cada tres meses.
El tratamiento con mitaxantrona suelo ser bien tolerado por el cuerpo. Sin embargo el riesgo de daar
el msculo del corazn aumenta con el tiempo, por lo que el tratamiento slo se puede administrar 2 a
3 aos. Es un droga anticncerigena que debilita el sistema inmunitario. Por medio del debilitamiento
del sistema r la droga disminuye los sntomas de esclerosis mltiple. El tratamiento requiere una
vigilancia del corazn y de los valores sanguneos. Con estas precauciones el tratamiento es seguro.

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Natalizumab
Medicamento comercializado con los nombres Antegren y Tysabri, compuesto por anticuerpos
monoclonales. Es el que mejores resultados ha dado (disminucin del 68% de las recadas, 92% de
lesiones con gadolinio y 54% en la progresin del EDSS) pero fue temporariamente retirado del
mercado ya que raramente (1/1000) puede inducir una enfermedad llamada leucoencefalopata
multifocal progresiva o PML, que normalmente es mortal.
Sin embargo, este compuesto nunca ha producido este efecto solo (usado como monoterapia) sino en
combinacin con otras medicaciones inmunosupresoras, por lo que laFDA americana y la EMEA
(agencia europea de medicamentos) han reconsiderando su prohibicin y han aprobado su
comercializacin en 2006.
Fingolimod
Se administra por va oral. En la Unin Europea se aprob en marzo de 2011 para los pacientes con
esclerosis mltiple recidivante-remitente grave de evolucin rpida o muy activa.

Obtencin a escala piloto de Interfern Humano recombinante expresado en EscherichiaColi


Cepas Bacterianas:
La expresin de protenas recombinantes se ha favorecido con el uso de E.colidebido a su relativo bajo
costo, alta densidad de cultivo, su fcil manipulacin gentica y a las diversas herramientas
biotecnolgicas disponibles que son compatibles. En este trabajo se presentan algunas estrategias
para la expresin de E.coli; se destacan factores genticos y fisiolgicos que incluyen: nmero de
copias del vector de expresin, caractersticas del gen, estabilidad del cido ribonucleico mensajero,
promotor empleado, cepa utilizada, composicin del medio de cultivo, parmetros de operacin en el
fermentador y tambin se abordan la conservacin de cepas y la estrategia de cultivo y purificacin.
La bacteria E.colies ampliamente utilizada en la industria biotecnolgica para la produccin de
protenas recombinantes con fines diagnsticos, teraputicos o vacunales, por procedimientos
relativamente baratos, ya que ha sido muy bien caracterizada desde el punto de vista gentico y
fisiolgico. Es un bacilo corto gran negativo que se localiza en las heces fecales; habita en el conducto
intestinal normal del hombre y de los animales y en algunos casos puede ocasionar enfermedades
como: hepatitis, septicemia, cistitis y otras. Entre las ventajas que este microorganismo brinda como
hospedero estn: mayor velocidad especfica de crecimiento que las levaduras y clulas de mamferos;
fcil manipulacin gentica, no posee requerimientos costosos asociados a medios de cultivo o
equipamiento a diferencia de las clulas de organismos superiores; existencia de gran variedad de
vectores de expresin estables, y ser un microorganismo aprobado por las entidades reguladoras para
su utilizacin como hospedero en la produccin de biofrmacos.
Es conocido que las proteasas producidas en el microorganismo pueden destruir las protenas
recombinantes obtenidas. Su empleo para producir protenas tiles en la industria alimentaria no est
permitido, segrega toxinas, por lo que se considera un patgeno moderado; es incapaz de realizar
muchas de las modificaciones postraduccionales que son comunes en protenas de origen eucariota;
no es un eficiente secretor de protenas al medio de cultivo, es una fuente potencial de pirgenos y su
habilidad para promover la formacin correcta de numerosos puentes disulfuro eslimitada.
Pese a estas desventajas, numerosas protenas complejas se obtienen en este hospedero con la
actividad biolgica requerida para ser utilizadas. En las ltimas dcadas se han desarrollado cepas de
E. colimodificadas genticamente para solucionar algunas de sus desventajas. Entre ellas se
encuentran varias cepas mutantes de los genes lonAyompT, para disminuir la degradacin proteoltica
de los productos recombinantes; tambin se han obtenido cepas deficientes, o bien de la
tioredoxinareductasa (trxB), o de la glutatin reductasa (gor), o de ambas a la vez, por lo cual en ellas
se favorece la correcta formacin depuentesdisulfuro en el citoplasma. En otras cepas desarrolladas
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pueden obtenerse protenas complejas, conmodificaciones postraduccionales propias de clulas


eucariotas, como es el caso de las que portan el gen de la tirosina kinasa para producir protenas
fosforiladas por la tirosina. Para aprovechar las ventajas que ofrece el periplasma, en comparacin con
el citosol, para la expresin de protenas recombinantes se han desarrollado vectores plasmdicos en
los cuales es posible clonar los genes recombinantes fusionados a seales de secrecin que
posibilitan el transporte de la protena de inters a este compartimento.
Expresin de protenas recombinantes en E. Coli
Entre los parmetros ms importantes en la produccin exitosa de protenas recombinantes en E.
colise encuentran: la eficiencia transcripcional y traduccional, la estabilidad del vector de expresin y
de los cidos ribonucleicos (ARN) transcriptos, la estabilidad de las molculas ante el
ambienteproteoltico del hospedero y la localizacin y plegamiento de la protena. Tambin es
necesario hacer un estudio con diferentes cepas del organismo hospedero, con vistas a seleccionar la
ms adecuada para la expresin de la protena recombinante deseada, ya que estudios muestran que
estapuede variar al usar una cepa determinada u otra.
Con el objetivo de alcanzar altos niveles de expresin de la protena de inters es necesario estudiar la
influencia de diferentes factores en el proceso de produccin, los cuales pueden agruparse en
genticos y fisiolgicos.
Factores genticos:
Entre los factores genticos a considerar se encuentran: nmero de copias del vector de expresin,
caractersticas del gen, estabilidad del cido ribonucleico mensajero (ARNm), promotor empleado y
cepa utilizada.

Nmero de copias del vector de expresin o plasmidio:

En la seleccin del sistema de expresin que permita obtener altos niveles de produccin de la
protena recombinante, un aspecto importante es el nmero de copias del vector dentro de la cepa
hospedera. El nmero de copias del plasmidio en E. colipuede variar desde 1 hasta 2000 por clula, en
dependencia de su origen de replicacin en la bacteria. Generalmente la sntesis proteica aumenta
linealmente con el nmero de copias del plasmidio hasta aproximadamente 600 copias por clula. Este
aumento depende de lanaturaleza de la protena y del ambiente celular, en el que se incluye el balance
de sntesis/degradacin que puede ser afectado por elevadas cargas gnicas del vector. Por otro lado,
un alto nmero de copias incrementa las complicaciones relacionadas con la replicacin y expresin
intensivas como son las mutaciones, disminucin de la estabilidad del vector, problemas con el control
de la regulacin del promotor y dificultades en la purificacin de la protena de inters al incrementar
tambin los niveles de protenas codificadas por otros genes plasmdicos, por ejemplo, genes de
resistencia a antibiticos.

Caractersticas del gen heterlogo

Entre las caractersticas del gen heterlogo que pueden influir en los niveles de expresin se menciona
el uso de determinados codones especficos en el gen que son poco usados en E. coli, denominados
codones raros. Se ha observado que la presencia de estos, que codifican el aminocido arginina en
genes heterlogos, afectan considerablemente los niveles de sntesis de la protena. Adems, pueden
existir determinados codones, fundamentalmente, los que codifican arginina y prolina, en los genes
que favorecen el corrimiento del marco de lectura hasta en un 50% del total de protena sintetizada.
Esto puedeoriginar una terminacin prematura de la sntesis de laprotena recombinante o alterar
completamente la informacin gentica. Otra caracterstica del gen heterlogo determinante de
losniveles de expresin es la presencia de estructurassecundarias en el ARNm, que pueden afectar el
inicio de latranscripcin y de la traduccin al bloquear la unin de laARN polimerasa al promotor, o de
las subunidadesribosmicas al sitio de inicio de la traduccin, respectivamente.

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Estabilidad del ARN mensajero (ARNm):

Una vez sintetizado el ARNm correspondiente al gen deinters, la estabilidad del transcripto permite un
controlflexible y muy eficiente de los niveles de sntesis proteica.Por lo general los ARNm bacterianos
tienen una vida mediacorta. En clulas bacterianas que crecen y se dividen cada20 o 30 min, algunos
ARNm deben renovarse de 5 a 10 vecesen cada generacin. La vida media del ARNm est
reguladapor el control del inicio de la transcripcin y la velocidad dedegradacin del mismo. La
velocidad de degradacin de losARNm provenientes de algunos genes heterlogos es muyalta, siendo
muy bajos o nulos los niveles de sntesis de lasprotenas recombinantes.

Tipo de promotor bajo el cual se encuentra situado el gen de inters

El sistema de expresin es la unidad transcripcional que se inserta en un vector de cido


desoxirribonucleico (ADN) extracromosomal. Si el mismo es inducible, las clulas pueden crecer hasta
altas densidades y obtener cantidades del producto hasta de un 30% de la protena total de las clulas.
Algunos de los promotores ms empleados son:
Promotor triptfano: Es el responsable de la transcripcin de los genes trpE, D, C, B, A, los cuales
codifican para las enzimas que intervienen en la sntesis del triptfano. Se reprime por la presencia de
este aminocido en el medio de cultivo y se induce por su ausencia o al aadir cido 3-indolacrlico.
Constituye un promotor fuerte y ampliamente utilizado.
Promotor pL (Brazo izquierdo del fago lambda): Es inducible por cambios de temperatura, ya que
existe un represor termolbil que a temperaturas entre 28-30 C se une al promotor impidiendo la
transcripcin del gen. Su utilizacin ha confrontado problemas en algunos hospederos, ya que ante un
cambio sbito detemperatura, hasta aproximadamente 42 C, el represor sufre un cambio estructural
que impide su unin al promotor, permitiendo la transcripcin y la expresin de la protena de inters.
Este sistema tiene dos desventajas fundamentales: la primera, es que solamente puede ser empleado
en cepas de E. colique contengan en su genoma el gen que codifica para el represor cI 857 del fago
lambda y, la segunda, es que al trabajar a los niveles de temperatura de induccin es posible la
degradacin de la protena heterloga. Una de las alternativas para disminuir el efecto de la primera
desventaja es el empleo de cepas comerciales que contengan el gen del represor o cotransformar con
unvector que lo incluya.
Promotor Lac (lactosa): Este promotor se reprime en presencia de glucosa y se induce en presencia de
lactosa o su anlogo isopropil-tiogalactosido (IPTG). La primera puede ser empleada solamente en
cepas quecontengan en su genoma los genes que codifican para las tres enzimas involucradas en el
metabolismo de lalactosa (permeasa, beta galactosidasa y transacetilasa). IPTG es un reactivo caro,
por lo que su empleo se reduce fundamentalmente a las escalas de laboratorio y piloto.
Promotor Tac: Es un hbrido del promotor Lac y el promotor Trp y su funcin es similar a la del
promotor Lac.

Cepa hospedera

La cepa hospedera, la cual es transformada con el vector de expresin, debe ser deficiente en la
mayora de las proteasas naturales, mantener la estabilidad plasmdica y contener los elementos
genticos necesarios, de acuerdo con el sistema de expresin utilizado. Se recomienda el empleo de
cepas robustas capaces de crecer en medios de cultivo con un mnimo de nutrientes y que no sean
patognicas.
Una vez que se han establecido los factores genticos adecuados, se debe garantizar la estabilidad
del clon productor, evitando que existan mutaciones, contaminaciones y prdida de informacin
gentica. Por lo anterior se debe garantizar una forma correcta de conservacin del microorganismo
productor. Para ello se desarrollan los bancos de clulas.

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Estrategias de clonaje
A lo largo de ms de dos dcadas se han ido mejorando las estrategias genticas, con el objetivo de
aumentar los niveles de expresin de protenas, as como simplificar los procesos de recobrado. Estas
abarcan desde el diseo de vectores, multimerizacin de genes, mejoramiento de cepas basadas en
diferentes principios como la de seleccin de genes que codifican para proteasas, sobreexpresin de
codones raros para E. coli.
Tambin es posible adaptar la estructura de la molcula recombinante para potenciar una propiedad
especfica que facilite su purificacin, ya sea modificando su punto isoelctrico o sus constantes de
afinidad.
Composicin del medio de cultivo: Requerimientos nutricionales del crecimiento
Fuente de carbono y energa
Aproximadamente el 50% del peso seco del material celular es carbono, por lo que en todo medio de
cultivo debe existir un sustrato que proporcione el esqueleto carbonado bsico para la sntesis de las
unidades estructurales que dan origen a las macromolculas y estructuras de la clula. En la mayora
de los casos este compuesto es de origen orgnico y entre los ms usados se encuentran los
azcares como: glucosa,sacarosa, fructosa, lactosa, entre otros. Por lo general en los procesos
degradativos o catablicos de estos compuestos se produce tambin la energa necesaria para los
procesos biosintticos y el funcionamiento general de la clula.
La respiracin de las bacterias es un proceso complejo que se acompaa del desprendimiento de
energa que es indispensable para la sntesis de diferentes compuestos orgnicos. Segn el tipo de
respiracin los microorganismos se dividen en: aerobios estrictos, microaerfilos, anaerobios
facultativos y anaerobios estrictos.
Un representante tpico de los anaerobios facultativos es E. coli, la cual en los medios que contienen
fuentes de carbono, se desarrolla como bacteria anaerobia al comienzo del proceso; desintegra los
hidratos de carbono mediante la fermentacin, para despus comenzar a asimilar el oxgeno; crece
como aerobia y oxida los productos de la fermentacin hasta formar CO 2 y H2O. Este tipo de
microorganismo posee importantes ventajas, puesto que puede vivir tanto en ausencia como en
presencia de oxgeno.
Fuente de nitrgeno
En orden consecutivo es el segundo elemento en importanciaque debe formar parte del medio de
cultivo, ya que juega unpapel fundamental en la composicin de las estructurasprincipales de la clula.
Al nitrgeno le corresponde del 8 al15% del residuo seco.Es un factor esencial de las protenas y
forma parte de loscidos nucleicos, la pared celular, la membrana celular y otros componentes
importantes. En la mayora de los casos se suministra en forma de amonio o de algunas de sus sales,
aunque existen otros que requieren aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. Los requerimientos
orgnicos de nitrgeno son relativamentecaros, por lo que a veces se trata de encontrar la satisfaccin
de esta demanda en subproductos industriales (suero de leche) o en productos ms baratos (soya,
extracto de levadura), los cuales pueden aportar algunos factores del crecimiento que se requieren en
cantidades muy reducidas.
Clculo de F0 para la esterilizacin de medios de cultivos:
Para el clculo del F0 se utilizar un equipo autoclave por vapor. Se simular la temperatura del medio
de cultivo utilizando un sensor tipo PT-100 inmerso en agua.
El clculo procede as:

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dN
=kdt
N
log N=kt +cte .
donde

k=

K
2.303

a
t=0; N=N

log NN =cte
log N=kt +log N

log

N
=kt
N

N
=10kt
N
Donde:
N= nmero inicial de microorganismos
t= tiempo de exposicin o tiempo de esterilizacin
N= nmero de microorganismos luego de la exposicin
k= constante de reaccin
Esta expresin muestra que el nmero de microorganismos decrece exponencialmente dependiendo
del tiempo de esterilizacin.
Valor D:
El valor de D es definido como el tiempo de decaimiento. Es el tiempo requerido, a una temperatura
especfica, para reducir la poblacin de bacterias siendo considerada el valor inicial logartmico, por
ejemplo 100% a 10% de su valor inicial.
Es muy simple calcular el valor D; es el recproco de la constante de reaccin. A 121C, el valor de D
oscila entre 0.2 y 2 minutos. A falta de evidencia experimental asumimos que D121C es igual a 1.
Esto significa que al final de cada minuto, expuesto a una temperatura de 121C, el nmero de
microorganismos se reduce a un dcimo del valor inicial a ese tiempo. Es evidente que el resultado de
la esterilizacin a esta temperatura constante puede ser muy diferente dependiendo del valor de D.

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Nuestros datos entonces muestran que comenzando con un valor inicial de 1000 unidades de
microorganismos por botella, se logra una contaminacin residual de 1 luego de 3 minutos a 121C,
con D=1.
Luego de otro minuto (4 minutos en total) este razonamiento conduce a la conclusin de que la carga
se ha reducido a 1/10.
Sin embargo, esto no debe entenderse en el sentido de que cada unidad contiene una dcima parte de
un microorganismo (en cuyo caso las unidades seran estriles) sino significa que hay una probabilidad
de que un dcimo de las unidades todava estn contaminados.
Despus de 9 minutos de tratamiento a 121 C en las condiciones de operacin, la carga bacteriana
del lote en cuestin se reduce, en promedio, a 1 / 1.000.000 . Por lo tanto, la probabilidad de tener una
unidad todava contaminada en ese lote es de 1 en 1.000.000.
Esta es la garanta mnima de esterilizacin que debe ser alcanzada en el campo farmacutico.
Por lo tanto trataremos los medios de cultivos, duplicando el tiempo de exposicin, es decir 18
minutos, en estas condiciones.
Ejemplo de clculo:
Luego de 1 minuto:

N=100010(1 )

N=100
Luego de 2 minutos:

N=10010(1 )

N=10
Luego de 3 minutos:

N=1010(1 )

N= 1
Realizando el clculo utilizando clostridiumbotulinum:
En el caso de considerarse solamente este microorganismo por ser termoresistente, el tiempo de
esterilizacin se podra calcular de la siguiente forma:
Considerando:

N
=10kt
N

Despejando t:

log

N (1)
=t
N k

Siendo:

k =Ae

E
RT

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36

con valores de E= 65.000 cal/mol, y A= 110

min-1, R=1,98717 cal/mol.K y tomando como

temperatura de esterilizacin 121C (394 K) se obtiene un valor de k= 0.88 min-1.


Considerando que N0= 1000 y N= 1/1.000.000 (mismos valores que se consideraron en el clculo del
tiempo de esterilizacin utilizando el parmetro D), se obtiene:
t = 10,23 minutos
Duplicando el tiempo de exposicin para asegurar la muerte de microorganismo necesaria, se obtiene
t=20,46 minutos.
Se observa que por ambos mtodos de clculo, se obtienen resultados similares en cuanto al tiempo
necesario para realizar la esterilizacin. Con 18 minutos o 20,5 minutos (dependiendo el clculo
realizado) de esterilizacin se supera la garanta mnima de esterilizacin que debe ser alcanzada en
el campo farmacutico.

Fig. 3 Autoclave por vapor

Velocidad especfica de crecimiento:


La velocidad especfica de crecimiento () es funcin de: tipo de microorganismo, composicin del
medio de cultivo, temperatura, pH, concentracin de sustrato, velocidad de agitacin y aireacin. En
general se puede plantear que:
= f (T, pH, S, variables de operacin)
Con el objetivo de mejorar la productividad de la protena de inters, obtenida al usar una cepa de E.
coli, se puede correlacionar la velocidad especfica de crecimiento con la velocidad de produccin del
producto de inters. De esta manera se conoce que manteniendo la velocidad especfica de
crecimiento cerca del valor ptimo para la formacin del producto despus de la induccin, se obtienen
altos niveles de expresin de protena. Utilizando la alimentacin escalonada o constante, despus de
la induccin del cultivopor elevacin de la temperatura, se obtiene una extensin del perodo de
produccin de la protena de manera significativa.
Efecto de la temperatura y el pH:
La temperatura de crecimiento ptima para diferentes microorganismos vara en un amplio intervalo.
Por ejemplo: microorganismos psicrfilos: 0-25 C; microorganismos mesfilos: 25-45 C, y
microorganismos termfilos: > 45 C.
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La dependencia de la temperatura de crecimiento microbiano se podra comprender como el efecto de


la temperatura sobre las distintas reacciones enzimticas que ocurren en las clulas. Este efecto se
describe por la ecuacin de Arrhenius:
=Ae-E/RT
donde:
A : Constante de Arrhenius (h-1).
E : energa de activacin (kJ kmol-1)
T : temperatura absoluta (K)
R : constante de los gases (kJ kmol-1K-1).
El efecto del pH es similar al efecto de la temperatura. La velocidad de las reacciones enzimticas
depende del valor del pH y vara de un microorganismo a otro. La mayora de las bacterias crecen a
una temperatura alrededor de 37 C y un pH neutro. Manteniendo el cultivo a estas condiciones se
logra que la velocidad especfica de crecimiento dependa solamente de la concentracin de sustrato y
de las variables de operacin.
Efecto de la concentracin de sustrato:
La dependencia de la velocidad especfica de crecimiento () sobre la concentracin de sustrato
limitante la obtuvo por primera vez por J. Monod.
= mxS/(Ks+S)
donde:
mx: Velocidad especfica mxima de crecimiento que se alcanza en la fase exponencial y depende
del tipo de sustrato limitante empleado y de las variables de operacin (h-1).
S: Concentracin de sustrato limitante (g.L-1).
Ks: Constante de saturacin (g.L-1). Esta constante da unamedida de la afinidad del microorganismo
hacia el sustrato.
Mientras ms pequeo sea Ks, ms afn es el microorganismo al sustrato en cuestin.
Actualmente existen numerosos modelos que relacionan la velocidad especfica de crecimiento con la
concentracin de sustrato, pero el de Monod sigue teniendo gran utilidad.
Estrategias de cultivo: operacin continua
La fermentacin continua sigue siendo actualmente elmtodo ms usado en la industria farmacutica y
biotecnolgica. Esta operacin consiste en que se cargan el medio de cultivo y el inculo en un tanque
con agitacin y aireacin, donde ocurre una transformacin biolgica. Teniendo esto se est en
presencia de un biorreactor. La operacin discontinua tiene entre sus ventajas: el ser una
operacinsimple, presentar bajo riesgo de contaminacin y facilidadpara ser utilizada como patrn para
estudios previos. Comodesventaja se encuentra que con su uso, se obtiene bajaproductividad.
Limitaciones de la operacin continua:
Existe una concentracin de sustrato limitante inhibitoria al crecimiento. Esto se conoce comnmente
como efecto CrabbTree y consiste en que el microorganismo en vez de consumirla fuente de carbono
para crecer, produce cido actico yotros metabolitos que son txicos para las clulas, por lo quese
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limita la obtencin de altas densidades celulares. En la fermentacin discontinua existe una


contradiccin, alinicio habitan pocas clulas y existe alta concentracin desustrato, mientras que al
final ocurre lo contrario.
En numerosas ocasiones en la produccin de protenas recombinantes la velocidad especfica mxima
de crecimiento no es la ptima para la formacin del producto. Se conoce como crtica a la velocidad
especfica a la que se elimina casi totalmente la produccin de cido actico, la cual perjudica tanto al
crecimiento como a la formacin del producto. Esto puede variar de una cepa a otra (si es auxotrfica
o prottrofa), como tambin influye el medio en que se cultivan (si es medio complejo o definido).
Kleman reporta que en un mediodefinido o salino: crit = 0,35 h-1 mientras en un medio complejo: crit =
0,2 h-1.
Medio complejo se le llama a los medios ricos en extractos, suplementados con fuentes orgnicas,
aminocidos, vitaminas y trazas. Son medios muy ricos por lo que los microorganismos tienden a
producir ms metabolitos que en un medio salino definido. Por otra parte, se requiere conocer la
velocidad especfica de crecimiento para la formacin del producto (prod). Existen tres formas de
determinarla:

En un cultivo discontinuo manipulando la aireacin y la agitacin.

En un cultivo discontinuo con alimentacin variando el flujo de incremento.

En un cultivo continuo variando la velocidad de dilucin, siempre que no se pierda la


informacin gentica.

Crecimiento celular:
Microorganismo
E. colise obtiene del instituto DSMZ situado en Leibniz, Alemania; codificado como DMS 4509.
El traslado del microorganismo se realiza va area. Contenido en una ampolla y dentro de un
recipiente especial para dicho tipo de transporte.
Se conserva en ultrafreezer a una temperatura de -86C.
Clculos para la cintica microbiana:
Se cuenta con los siguientes valores inciales, obtenidos experimentalmente en el Instituto Malbrn:
0,64

Cs

max

g
L

=3

de masa celular.

g
L
1

=0, 35 h

Productividad mxima de Biomasa (terica): P= 0,2

g
L

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= N =1,0540
Donde alfa representa N=

1+

CA 0
CM

. Esto significa que arrastre, tiempo ptimo de procesamiento,

velocidad mxima de produccin depende de Ca0 (composicin de alimentacin al inicio) y CM


(constante de Monod)
Con estos datos iniciales, calculamos el tiempo ptimo de acuerdo a la siguiente frmula:

t op=

t op=

( 1 ) max
1,054

( 1,05401 ) 0,35

1
h

t op=55,77 h 56 h
Con los valores inciales y el valor del , calculamos:

C s=

Cs
+1
o

g
L
C s=
1,0540+1
3

C s=1,461

g
L

k s+ C s
ks

Despejando Ks

k s=

Cs

21

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k s=27,047

ks

Un

g
L

(K de monod) alto indica que el valor de la concentracin es despreciable respecto al

sustrato, es decir, que la velocidad de reaccin es independiente de la concentracin de sustrato, la


reaccin es de orden cero y la velocidad es mxima.
Con el dato de la productividad:

P=

CX
t

C X =0,2

g
56 h
Lh
g
C X = 11,2
L

C X =Y X ( C s C s )
o

g
g
g
11,2 =Y X 3 1,46
L
L
L
S

Y X =7,27
S

Y S =0,14
X

Luego que el proceso se encuentra estril, su mantenimiento en esa condicin se logra por medio de
la aplicacin de sellos de vapor, los cuales suministran una barrera efectiva contra los
microorganismos. (Aclaracin: el suero contiene a E.coli).
Sabiendo que 1 g de Biomasa equivale a 0.001 g de Interfern. Entonces:

y P=
X

0,001 g CpCp0
=
1g
CxCx0

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Despejando, podemos obtener la concentracin final del producto dentro del reactor:

Cp=0,011

g
L

Purificacin del Interfern:


Este proceso consiste en hacer circular la corriente de producto de manera paralela a la superficie de
la membrana permeable, y debido a la diferencia de presin (controlada) se produce el
fraccionamiento. La concentracin obtenida en un proceso de ultrafiltracin viene definida por el factor
de concentracin volumtrica (FCV), que indica cuantas veces el volumen original de alimentacin ha
sido reducido y sus datos dependen de:

FCV =

V alimentado
V
=1+ permeado
V retenido
V retenido

En todos los casos se debe agregar solucin de Hidrxido de Sodio al 10% o solucin de cido
clorhdrico al 10% para ajustar el pH.
Dimensionamiento del reactor:
Considerando los valores de Cp y tiempo ptimo obtenidos, y teniendo en cuenta que se estima la
produccin de interfern en 40 gr/da, se puede calcular el volumen de la siguiente forma:

Produccin=

Cp
V
t op

Reordenando,

V =

t op
Cp

Reemplazando con los datos de Cp, tiempo ptimo y produccin, obtenemos:

V =9333,3 L
Por lo que sera necesario utilizar un biorreactor de 10 m3.

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Conclusiones:
Uno de los objetivos fue alcanzar altos rendimientos en la produccin de Interfern expresados en E.
coli, con vistas a hacer estos procesos ms factibles econmicamente y cumplir con las regulaciones
vigentes en esta rama de la industria.No obstante, existen retos que deben abordarse en un futuro,
entre los que se encuentran: superar los niveles de expresin de protenas alcanzados; realizar un
adecuado estudio del espacio de diseo durante la etapa de desarrollo de los procesos de obtencin y
recobrado, para establecer los parmetros que influyen significativamente en su eficiencia; realizar una
adecuada seleccin del medio de cultivo quefacilite tanto la expresin como el crecimiento celular.
Aunque en este trabajo se han dado consideraciones generales, el desarrollo del producto requerir un
estudio de las caractersticas particulares de las molculas recombinantes y de las cepas productoras.

Referencias:
Clulas NK1: (por las siglas de su denominacin en ingls, natural killer, "asesina natural" en espaol)
son un tipo de linfocito pertenecientes al sistema inmunitario.
Barrera hematoenceflica2: es una formacin densa de clulas endoteliales y glales entre los vasos
sanguneos y el sistema nervioso central. La barrera impide que muchas sustancias txicas la
atraviesen, al tiempo que permite el pasaje de nutrientes y oxgeno. De no existir esta barrera muchas
sustancias nocivas llegaran al cerebro afectando su funcionamiento y tornando inviable al organismo.
Las clulas de la barrera poseen protenas especficas que transportan de forma activa sustancias
como la glucosa a travs de la barrera.
Criterios de McDonald3: son una serie de criterios destinados a decidir si se considera o no a una
persona como afectada por la esclerosis mltiple, sin necesidad de recurrir a biopsias.
Oligodendrocitos4: son un tipo de clulas de la macroglia (son clulas del sistema nervioso que
desempean, de forma principal, la funcin de soporte de las neuronas).
Enfermedad de Devic5: es una enfermedad heterognea que consiste en la inflamacin secuencial y
recurrente del nervio ptico y la mdula espinal.
Sarcoidosis6: es una enfermedad granulomatosasistmica, de carcter autoinmune, que afecta a todas
las poblaciones y etnias humanas, y fundamentalmente a adultos entre 20 y 40 aos.
Vasculitis7: enfermedades que cursan coninflamacin de los vasos sanguneos.
Enfermedad de Lyme8: una enfermedad infecciosa que afecta varios rganos del ser humano, causada
por la espiroqueta Borreliaburgdorferi, que es transmitida por las garrapatas.

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