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1.

INTRODUO
Por as enzimas serem os catalisadores utilizados pelos seres vivos na
maioria das reaes, muito importante saber quais leis regem a cintica destes
biocatalisadores e quais variveis afetam a taxa de reao, pois esse conhecimento
vai projetar e operar processos enzimticos. [3]
Cintica Enzimtica estudada para determinar as constantes de afinidade
do substrato e dos inibidores (Km e Ki), conhecer as condies timas da catlise (T,
pH, [S] etc), ajudar a elucidar os mecanismos de reao (estudo ordem reao e tipo
cintica); e determinar a funo de uma determinada enzima em uma rota
metablica (para um dado S). [2]
O mecanismo mais simples para explicar a ao enzimtica o modelo de
Michaelis-Menten:
E +S ES E + P
Neste modelo, a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um
complexo enzima-substrato (ES). Este pode separar-se novamente em enzima e
substrato livre ou transformar o substrato em produto (P). Como em qualquer reao
elementar (uma reaco que ocorre por simples coliso entre reagentes), a
velocidade de cada passo ser proporcional concentrao dos reagentes desse
passo. Em cada caso, a constante de proporcionalidade ser uma funo da energia
de ativao desse passo. Na maior parte das enzimas, verifica-se que o equilbrio E
+S ES se atinge muito rapidamente (em poucas dezenas de milissegundos). Uma
vez atingido o equilbrio, a concentrao de ES mantm-se constante, uma vez que
sempre que um complexo ES se dissocia em produto e enzima livre, esta se liga
muito rapidamente a uma nova molcula de substrato, regenerando o complexo ES.
Nestas condies, a velocidade de degradao de ES igual velocidade da sua
formao. [1]

2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Analisar o efeito dos diferentes pHs e da concentrao de substrato sobre a
velocidade da reao, determinando a velocidade mxima da reao e sua
constante de Michaelis.
2.2. Objetivo especfico
Realizar um ensaio com oito amostras distintas para a anlise do efeito do pH e
outro ensaio com seis amostras para a anlise da concentrao de substrato;
Efetuar a leitura das absorbncias de cada amostra no espectrofotmetro na
faixa de 540nm;
Traar um grfico de absorbncia por pH e outro de absorbncia por
concentrao de substrato, para a anlise do comportamento da enzima;
Determinar a constante de Michaelis e a velocidade mxima obtida.

3. MATERIAIS E MTODOS
3.1. Efeito do pH
3.1.1. Materiais

Tubos de ensaio;
Estante para tubos de ensaio;
Pipetas automticas;
Pipeta graduada de 10ml;
Pipetador;
Bquer;
Espectrofotmetro;
Chapa de aquecimento com banho-maria.

3.1.2. Reagentes

Soluo de enzimas 0,1mg/ml: sobrenadante de uma soluo de


leveduras secas suspendidas em bicarbonato de sdio 0,15mol/L aps 6

horas em banho-maria;
Soluo de sacarose 0,2mol/L;
gua destilada;
Soluo tampo acetato 0,05mol/L com pHs 4 e 5;
Soluo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS): mistura de cido dinitrosaliclico
dissolvido em NaOH 2mol/L e tartarato duplo de sdio e potssio

dissolvido em gua destilada;


Soluo tampo fosfato 0,05mol/L com pHs 6, 7 e 7,8.

3.1.3. Metodologia
Em nove tubos de ensaios distintos, adicionaram-se os reagentes conforme
a tabela abaixo:

Incubaram-se os tubos de ensaio a temperatura ambiente por 5 minutos.


Aps o tempo de incubao, adicionou-se 1,0ml de DNS em todos os tubos
e levou-se ao banho-maria por 5 minutos.
Deixou-se esfriar por 5 minutos e adicionou-se 6,5ml de gua destilada em
todos os tubos para diluir as solues.
Calibrou-se o espectrofotmetro a 540nm com o tubo de ensaio 1 e realizouse a leitura das absorbncias dos demais tubos.
Traou-se um grfico Michaelis & Menten de absorbncia por pH e outro
grfico duplo recproco.
Calculou-se a constante de Michaelis e a velocidade mxima da reao.
3.2. Efeito da concentrao de substrato
3.2.1. Materiais

Tubos de ensaio;
Estante para tubos de ensaio;
Pipetas automticas;
Pipeta graduada de 10mL;
Pipetador;
Bquer;
Espectrofotmetro;
Chapa de aquecimento com banho-maria.

3.2.2. Reagentes

Soluo de enzimas 0,1mg/mL: sobrenadante de uma soluo de


leveduras secas suspendidas em bicarbonato de sdio 0,15mol/L aps 6

horas em banho-maria;
Soluo de sacarose 0,2mol/L;
Soluo de sacarose 0,1mol/L;
Soluo de sacarose 0,05mol/L;
Soluo de sacarose 0,02mol/L;
Soluo de sacarose 0,01mol/L
gua destilada;
Soluo tampo acetato 0,05mol/L com pH 4,7;
Soluo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS): mistura de cido dinitrosaliclico
dissolvido em NaOH 2mol/L e tartarato duplo de sdio e potssio
dissolvido em gua destilada;

3.2.3. Metodologia
Em seis tubos de ensaios distintos, adicionaram-se os reagentes conforme a
tabela abaixo:

Incubaram-se os tubos de ensaio a temperatura ambiente por 5 minutos.


Aps o tempo de incubao, adicionou-se 1,0ml de DNS em todos os tubos
e levou-se ao banho-maria por 5 minutos.
Deixou-se esfriar por 5 minutos e adicionou-se 6,5ml de gua destilada em
todos os tubos para diluir as solues.
Calibrou-se o espectrofotmetro na faixa de 540nm com o tubo de ensaio 1
e realizou-se a leitura das absorbncias dos demais tubos.
Traou-se um grfico Michaelis & Menten de absorbncia por concentrao
de substrato e outro grfico duplo recproco.
Calculou-se a constante de Michaelis e a velocidade mxima da reao.

4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Resultados
4.1.1. Efeito do pH
Leitura de absorbncia no espectrofotmetro na faixa de 540nm:

4.1.2. Efeito da concentrao de substrato


Leitura de absorbncia no espectrofotmetro na faixa de 540nm:

Linearizando os dados obtidos, possvel encontrar a equao da reta:

Sabe-se que o coeficiente linear igual ao inverso da velocidade mxima,


enquanto que o coeficiente angular igual razo da constante de Michaelis pela
velocidade mxima. Ento:
B=

1
V mx

=1,1239

1
V mx = =0,8898
B

A=

Km
=0,0847
V mx

K m= AV mx =0,0754
4.2. Discusso

5. CONCLUSO

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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] http://homepage.ufp.pt/pedros/bq/Enzimas.htm
[2] http://www.eq.ufrj.br/biose/nukleo/aulas/Enzimol%20Grad/aula2.pdf
[3] CINTICA ENZIMTICA 2 MATERIAL DIDTICO

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