UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS BSICAS

ASIGNATURA: BIOQUIMICA
PRCTICA 05: Actividad Enzimtica
INTEGRANTES

Bustamante Boggiano Bruno

Campos Vargas Rosa
Farje Chambergo Jerson
Llanos Luna Siomara
Marn Acua Cinthia
Rivas Rojas Ana
Rojas Vallejos John

DOCENTE

CICLO

:V

Ledesma Sandoval Arturo

Pimentel octubre, 2015

INTRODUCCION

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica de gran eficiencia,

elevada especificidad y susceptibles de ser reveladas en su funcin
Poseen un sitio activo en el que se une ntimamente con el sustrato. La cinetica
enzimtica mide la velocidad de reaccin y la formacin de un producto a partir
de un sustrato, existen factores que modifican la velocidad de reaccin
enzimtica:
a) Concentracin de la enzima

b) concentracin del sustrato

c) concentracin de la enzima

d) grado de la acidez o alcalinidad del medio

e) temperatura

f) inhibicin enzimtica

Mtodos de purificacin enzimticos:

a) Precipitacin isoelctrica y salina

b) Electroforesis

c) Cromatografa

d) Ultracentrifugacin preparativa

MATERIALES:
-bao mara

-gradillas

-tubo de ensayo

-mechero

-KCl

-cido Tricloroacetico

-almidn 5%

-H2O

-PBS PH 6.9, pH 8.9

ENZIMAS A ESTUDIAR
-alfa amilasa..sustrato: almidon
RECOLECCION DE SALIVA: Recolectar en un beaker ms de 2 cc de
saliva,
luego adicionar 10 cc. de H2O bidestilada y mezclar
PRACTICA A: EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA SOBRE LA
VELOCIDAD DE REACCION
REACTIVO
Buffers pH

Tubo I
0.1 cc

Tubo II
0.1 cc

Tubo III
0.1 cc

Tubo IV
0.1 cc

6.9
KCl
Almidon
H2O
Enzima

0.2 cc
0.5 cc
1.2 cc
0.1 cc

0.2 cc
0.5 cc
1.1 cc
0.2 cc

0.2 cc
0.5 cc
1 cc
0.3 cc

0.2 cc
0.5 cc
0.8 cc
0.4 cc

Controlar el tiempo de reaccin: agregar a cada tubo la solucin de enzima con

un lapso de 30 segundos y agitar c/uno de ellos.
Para detener la reaccin se aade 0.2 cc de cido tricloroacetico (TCA)
despus de haber transcurrido 4 minutos de reaccin con intervalos de 30 seg.

Despues de haber retenido la reaccin en todos los tubos de ensayo se

procede a agregar a c/tubo 2 gotas de Lugol

RESULTADOS:

-Se observa que en el tubo 1 al contener mayor cantidad de agua y menor

cantidad de enzima la reaccin es mucho mas lenta y de mayor coloracin azul
intensa debido a la poca accion de la enzima sobre el almidon (degradacin
menor y lenta)

-Al observar el tubo 4 que contiene menor cantidad de agua y mayor cantidad
de enzima la reaccin es mucho mas rpida y de menor coloracin azul intensa
debido a la mayor accion de la enzima sobre el almidon.
FUNDAMENTO TEORICO:
La saliva contiene 2 tipos principales de secrecin proteica:
a) secrecin serosa rica en ptialina (alfa-amilasa): enzima destinada a digerir
los almidones hidrolizando enlaces alfa 1,4 glucosidicos
b) secrecin mucosa mucina- que cumple funcin de lubricacin y proteccin
El pH de la saliva vara entre 6 a 7 (siendo un pH ideal 6.9 para mejor
desarrollo de la accin de la ptialina)
Estudios indica que la alfa-amilasa contiene en los restos aminoacidicos de su
sitio activo Cl - , y por ello, al agregar KCl, los aniones cloruro se unen al sitio
activo aumentando la actividad enzimtica. Es decir, el cloro acta como
cofactor de la enzima.
Esta enzima hidroliza el almidn (amilosa-amilopectina) al que convierte en un
disacrido (maltosa) y otros pequeos polmeros de glucosa formados por 3-9
pequeos polmeros de la misma.
La accin del cido tricloroacetico (es un cido orgnico, derivado del cido
actico) simula la accin del cido clorhdrico, el cual bloquea la accin de la
amilasa salival ya que la actividad de esta enzima desaparece cuando el pH
desciende por debajo de 4
El reactivo de Lugol se utiliza para reconocer la presencia de almidn, el iodo
se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa (en las regiones
hidrofbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la alfa-amilasa
acta, degrada la amilaso, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de
Iodo ya no dar una coloracin azul violcea.
Dependiendo del tiempo de exposicin y concentracin de la enzima, de la
concentracin del sustrato as como del grado de acidez o alcalinidad y

temperatura se evidenciara la degradacin del almidn as como el tiempo en

que esto ocurre.
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino
-NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos.
Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva,
negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte,
de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms
adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo.
La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden
afectar drsticamente su actividad alterando el carcter inico de los grupos
amino y carboxilo.
ENZIMA
Pepsina
Tripsina
Catalasa
Arginasa
Fumarasa
Ribonucleasa

pH OPTIMO
1,5
7,7
7,6
9,7
7,8
7,8

DETERMINACION DEL PH PTIMO DE LA AMILASA SALIVAL.

MATERIALES:

lugol
almidn
KCL
cido tricloroacetico
Buffer 9,5
Agua
Enzima (amilasa salival)
2 tubos de enzallo

PROCEDIMIENTO:
REACTIVO
BUFFER 9,5
KCl
ALMIDN 5%
H2O

TUBO 1
0.1 cc
0.2 cc
0.5 cc
1 cc

SALIVA

2 cc

TUBO 2
0.1 cc
0.2 cc
0.5 cc
1 cc
2cc

Se adiciona la Enzima secuencialmente c/ 30 segundos agitando c/tubo y

adicionar despus de 4 minutos el cido Tricloroactico (TCA). Luego
Adicionar 2 gotas de Lugol en cada Tubo de ensayo. Escriba el valor del PH
optimo de la Enzima y explique como llega Ud. a esa conclusin.

RESULTADOS:
Pasado los 4 minutos se le agrego el cido tricloroacetico para poder
detener la actividad de la amilaza salival y poder comparar ambos tubos por
igual.
Luego se agreg lugol y se observ:
Tubo 1 => debido a que se le agrego BUFFER de 9,5 ph, la enzima amilasa
salival no reacciono observndose el tubo de ensayo de un color azul
oscuro, debido a que al no reaccionar la enzima, esta no degrado el almidn
(polisacrido), hacia monosacrido o disacrido y el lugol pudo incluirse en
las espigas del almidn, tiendo la solucin.

Tubo 2 => en este tubo no se observ ningn cambio de color, debido a que
se le agrego KCL con pH 7, que es el pH ptimo de la amilasa salival, por lo
cual esta enzima si reacciono y degrado el almidn hacia monosacrido y
disacrido, por lo que el lugol no pudo teir la solucin.
PH OPTIMO => 7

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas:
por cada 10C de incremento, la
velocidad de reaccin se duplica.
Las reacciones catalizadas por
enzimas siguen esta ley general.
Sin embargo, al ser protenas, a
partir de cierta temperatura, se
empiezan a desnaturalizar por el
calor.
La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura
ptima Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la
reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad
cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica
decrece rpidamente hasta anularse.
ENZIMAS SALIVALES
Las enzimas presentes en la cavidad oral son:
Amilasa Salival => Denominada ptialina o tialina, diastasa. Son enzimas
hidrolasas dependientes de cloruro es decir que son completamente
afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Esta enzima se produce
principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas
partidas), e inicia la degradacin del almidn.
La funcin de la amilasa salival es comenzar con la digestin del almidn a
cualquier punto de la cadena en los enlaces (1,4), desdoblndolo en molculas

ms pequeas como el disacrido maltosa, el trisacrido maltotriosa o los

polmeros de glucosa de cadena corta llamados - dextrina.
Su pH ptimo est entre 6.7 y 7.0 lmite favorable para su accin digestiva.
Secretada por los 3 pares de glndulas salivales (partidas, submaxilares y
sublinguales).

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION

ENZIMATICA
MATERIALES:

3 tubos ensallo
Agua
Buffer 6.9
KCL
Almidon
Enzima
Agua caliente
Agua fria

REACTIVOS
H2O
Buffer 6.9
KCl
Almidn 5%
ENZIMA

Tubo I
1.0 cc
0.1 cc
0.2 cc
1.0 cc
0.5 cc

Tubo I
1.0 cc
0.1 cc
0.2 cc
1.0 cc
0.5 cc

Tubo III
1.0 cc
0.1 cc
0.2 cc
1.0 cc
0.5 cc

Antes de Adicionar la ENZIMA coloque: tubo I durante 5 minutos al

recipiente con hielo y al Tubo III al bao Maria en Ebullicin durante 5
minutos, alego aada la Enzima sin sacar estos tubos de sus baos
respectivos y espere 4 minutos luego adicione el cido Tricloroactico
(TCA), Aada a cada tubo 2 gotas de Lugol, Observe los Resultados.
Comente.

RESULTADOS:

Las enzimas son estructuras que funcionan correctamente a la temperatura

corporal de 37 37,5. Cuando esta temperatura cambia, genera
cambio en la enzima desde: desnaturalizacin (temperaturas mi
elevadas) hasta inactivacin (temperaturas muy bajas).
Tuvo 1 => la enzima fue puesta en un PH optimo, por el buffer de 6,9 sin
embargo al someterse a hielo, la temperatura muy baja llego a
desactivarla, observndose que no logro degradar en gran cantidad el
almidon y por ende el lugol pudo teir la solucin.
Tuvo 2 => la enzima tambin fue puesta a un ph optimo por el buffer
de 6,9 y al estar a una temperatura ambiente, pudo reaccionar sin
inconvenientes, degradan el almidn, por lo que el lugol no reacciono en gran
cantidad.
Tuvo 3 => como la enzima fue sometido a temperaturas de ebullicin (100 C),
sufri un proceso de desnaturalizacin por lo cual no degrado en lo absoluto al
almidn, y el lugol pudo reaccionar, tiendo la solucin.

CUESTIONARIO
FUNCION DE LAS COENZIMAS?
En 1907, Gabriel Bertrand propuso el trmino coenzima, para referirse a las
molculas orgnicas,
de naturaleza no protenica, necesarias para la actividad de las enzimas
Se definen como cofactores enzimticos de naturaleza orgnica
las coenzimas se clasifican en dos grupos, segn la fuerza con que se unen a
su enzima:

*coenzimas libres: que se pueden separar por dilisis

*grupos prostticos: que no se pueden separar por dilisis debido a que
estn unidos con enlaces covalentes.
Funcin: transportar grupos qumicos o equivalentes reductores entre
molculas diferentes.
Usando como criterio su funcin, las coenzimas se clasifican como enzimas de
oxidoreduccin (Cuando transportan equivalentes reductores) y coenzimas
de transferencia (cuando transportan grupos qumicos)
Varias coenzimas son derivadas de vitaminas.

POR QU LAS CELULAS PANCREATICAS NO SECRETAN TRIPSINA?

Las

clulas

quimiotripsina

pancreticas
y

sintetizan

carboxipolipeptidasa)

enzimas
en

proteolticas
sus

formas

(tripsina,
inactivas

TRIPSINOGENO, QUIMIOTRIPSINOGENO Y PROCARBOXIPOLIPEPTIDASA

todas estas carentes de actividad enzimtica, ya que de lo contrario podran
digerir el pncreas (pancreatitis)
Recin

se

activan

en

TRIPSINA,

QUIMIOTRIPSINA

CARBOXIPOLIPEPTIDASA, cuando alcanzan la luz del intestino para degradar

protenas