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Estudo da Permeabilidade da Membrana Mitocondrial Interna a Aniões

Introdução

No que toca à membrana mitocondrial interna sabemos que quando é atravessada por
solutos o movimento é acompanhado pela entrada simultânea de água que irá assegurar o
equilíbrio osmótico. Consequentemente o volume da mitocôndria aumenta ocorrendo
swelling, isto é, intumescimento destes organelos.
Para avaliarmos a permeabilidade da membrana mitocondrial a certos aniões
estudamos então o comportamento osmótico das mitocôndrias. Analisamos a turbidez das
suspensões mitocôndriais em meio isosmótico através de espectrofotometria, sujeitando a
suspensão a um feixe de luz monocromático de 540 nm. A variação da turbidez (ou
pseudoabsorvência) reflecte a permeabilidade da membrana em relação ao ião em estudo.

Equipamento e Soluções

► Espectrofotómetro e registador
► Banho termostatizado com circulador de água
► Agitador magnético e magnete
► Sistema de aspiração por vácuo (para remoção de soluções)
► Microsseringas (tipo Hamilton)
► Micropipetas (tipo Gilson)
► Soluções:
• Suspensão mitocondrial de fígado de rato ≈40 mg/mL (mantida em gelo)
• KNO3 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2
• KCH3COO 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2
• KCl 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2
• KSCN 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2
• NH4NO3 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2
• Rotenona 1mM (em etanol)
• FCCP 0,5 mM (em etanol)
• Valinomicina 1 mg/mL (em etanol)
• Nigericina 1 mg/mL (em etanol)

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Resultados

1º Ensaio

Legenda 1: Registo obtido por utilização de um espectrofotómetro e representativo


da actividade do ionóforo valinomicina num meio constituído por mitocôndrias de fígado
de rato na presença de KNO3. As mitocôndrias (25 µL) foram adicionadas a 2 mL de
solução de KNO3 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 µM, pH 7,2 onde
anteriormente já tinha sido adicionada Rotenona 1mM. De seguida foi inserido 1 µg de
valinomicina 1mg/mL no meio de reacção com mitocôndrias.

2º Ensaio

Legenda 2: Registo obtido por utilização de um espectrofotómetro e representativo


da actividade dos ionóforos valinomicina e FCCP num meio constituído por mitocôndrias
de fígado de rato na presença de KCH3COOH. As mitocôndrias (25 µL) foram adicionadas
a 2 mL de solução de KCH3COO 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM,
pH 7,2 onde anteriormente já tinha sido adicionada Rotenona 1 mM. De seguida foi
inserido 1 µg de valinomicina 1mg/mL no meio de reacção com mitocôndrias. Por último
foi ainda adicionado FCCP 1µM.

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3º Ensaio

Legenda 3: Registo obtido por utilização de um espectrofotómetro e representativo


da actividade do ionóforo nigericina num meio constituído por mitocôndrias de fígado de
rato na presença de KCH3COOH. As mitocôndrias (25 µL) foram adicionadas a 2 mL de
solução de KCH3COO 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2
onde anteriormente já tinha sido adicionada Rotenona 1 mM. Por último foi inserida no
meio de reacção com mitocôndrias 1 µg nigericina.

4º Ensaio

Legenda 4: Registo obtido por utilização de um espectrofotómetro e representativo


da actividade dos ionóforos valinomicina e FCCP num meio constituído por mitocôndrias
de fígado de rato na presença de KCl. As mitocôndrias (25 µL) foram adicionadas a 2 mL
de solução de KCl onde anteriormente já tinha sido adicionada Rotenona 1 mM. De
seguida foi inserido 1 µg de valinomicina 1mg/mL no meio de reacção com mitocôndrias.
Por último foi ainda adicionado FCCP 1 µM.

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5º Ensaio

Legenda 5: Registo obtido por utilização de um espectrofotómetro e representativo


da actividade do ionóforo valinomicina num meio constituído por mitocôndrias de fígado
de rato na presença de KSCN. As mitocôndrias (25 µL) foram adicionadas a 2 mL de
solução de KSCN 130 mM, HEPES 5 mM, EDTA 0,1 mM, rotenona 2 μM, pH 7,2 onde
anteriormente já tinha sido adicionada Rotenona 1mM. De seguida foi inserido 1 µg de
valinomicina 1mg/mL no meio de reacção com mitocôndrias.

6º Ensaio

Legenda 6: Registo obtido por utilização de um espectrofotómetro e representativo


da actividade do ionóforo FCCP num meio constituído por mitocôndrias de fígado de rato
na presença de NH4NO3. As mitocôndrias (25 µL) foram adicionadas a 2 mL de solução de
NH4NO3 onde anteriormente já tinha sido adicionada Rotenona 1mM. De seguida foi
inserido FCCP 1 µM no meio de reacção com mitocôndrias.

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Discussão

1º Ensaio
Neste ensaio pretendíamos estudar a permeabilidade da membrana interna da
mitocôndria ao anião nitrato (NO3-). Adicionámos o meio com suspensão mitocondrial à
solução de nitrato de potássio (KNO3) e, de seguida, rotenona, inibidor da cadeia
respiratória, para evitar a formação de gradiente eléctrico gerado pela respiração da
mitocôndria.
Analisando o registo obtido por espectrofotometria percebemos que a alteração da
turbidez da solução é muito reduzida, expressando apenas a entrada de água na mitocôndria
quando a suspensão mitocondrial é adicionada à solução com o sal e se estabelece um novo
equilíbrio osmótico.
Não ocorre a entrada de K+ porque a membrana mitocondrial interna é impermeável a
este catião e o anião NO3- não atravessa a membrana porque existe conflito entre a sua
carga e o gradiente eléctrico gerado por ela. Para dissipar este gradiente precisamos de
introduzir catiões no interior da mitocôndria, equilibrando as cargas. Com esse propósito
adicionámos o ionóforo valinomicina que promove a entrada de K+ ao mascarar a sua carga.
Após a adição deste ionóforo o registo apresenta uma diminuição acentuada da turbidez, o
que reflecte o carácter permeante do anião NO3-. Ocorre entrada de água para restabelecer o
equilíbrio osmótico e verifica-se o swelling das mitocôndrias.

2º Ensaio
No ensaio seguinte estava em causa a permeabilidade da membrana mitocondrial
interna ao anião acetato (CH3COO-). Neste caso a suspensão mitocondrial foi adicionada a
uma solução de acetato de potássio (KCH3COOH). Utilizámos novamente rotenona para
inibir a cadeia respiratória e a formação de gradiente eléctrico. Tal como no ensaio anterior
escolhemos a valinomicina como ionóforo transportador de K+, no entanto não é registada
uma alteração significativa de turbidez o que nos leva a deduzir a impermeabilidade da
membrana ao CH3COO-. Contrariamente ao ensaio anterior o impedimento à entrada do
anião não é um gradiente eléctrico mas sim um gradiente de pH. Aquando da adição da
valinomicina uma pequena quantidade de K+ entrou na mitocôndria, consequentemente
uma pequena quantidade do anião acetato na forma protonada (CH3COOH) acompanha
esse transporte. Acontece que o CH3COOH sofre dissociação no interior mitocondrial,

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formando-se CH3COO- e H+. Rapidamente a mitocôndria impede a entrada de mais
CH3COOH evitando a continua acidificação do seu meio interno. A quantidade de cargas
positivas no interior aumenta significativamente impedindo a entrada de K+ apesar da
presença de valinomicina.
Adicionando o protonóforo FCCP desfazemos o gradiente de pH. Estabelece-se o
transporte de H+ para o exterior, permitindo a entrada de mais CH3COOH. O número de
cargas positivas diminui e a valinomicina volta a ser capaz de promover o movimento de
K+ através da membrana. O registo revela a diminuição da turbidez associada a esta entrada
do sal e percebemos que ocorreu swelling das mitocôndrias.

3º Ensaio
Voltámos a utilizar KCH3COOH mas substituímos a valinomicina e o FCCP pelo
ionóforo nigericina que é capaz de transportar simultaneamente e em sentidos opostos um
K+ e um H+. Assim, à solução de KCH3COOH adicionámos novamente rotenona e a
solução mitocondrial. O registo revela que após a adição da nigericina a turbidez diminui
significativamente. Esta diminuição revela o transporte antiporta efectuado pela nigericina.
Ao transportar H+ para fora exerce a mesma função que o FCCP e possibilita o transporte
de K+ para dentro, promovido no ensaio anterior pela valinomicina. O sal é então capaz de
entrar na membrana mitocondrial acompanhado pelo fluxo de água, induzindo o swelling
da mitocôndria.

4º Ensaio
Neste ensaio pretendíamos avaliar a permeabilidade da membrana mitocondrial
interna ao anião cloreto (Cl-), por isso a uma solução de cloreto de potássio (KCl)
adicionámos a suspensão mitocondrial e rotenona. O registo mostra uma pequena
diminuição da turbidez, demasiado pequena para podermos assumir a entrada de Cl-.
Assim, esta alteração é justificada pela pequena entrada de água nas mitocôndrias,
estabelecedora do equilíbrio osmótico, aquando da adição da suspensão mitocondrial à
solução de KCl.
Apesar de não ter entrado Cl- na mitocôndria não podemos assumir para já que esta
seja impermeável a este anião pois pode estar a ocorrer um conflito de cargas entre o anião
carregado e o gradiente eléctrico gerado pela sua carga. Para eliminar esta hipótese
adicionamos a valinomicina que ao transportar K+ para dentro da mitocôndria vai dissipar o
gradiente. Registamos uma pequena alteração da turbidez mas demasiado pequena para

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assumirmos a entrada de Cl-. Esta diminuição é justificável pela quantidade reduzida de K+
que entra promovido pela adição da valinomicina.
Para além do impedimento eléctrico pode estar em causa um gradiente de pH gerado
pela forma protonada do anião (HCl). Adicionamos FCCP que induz a saída de H+ da
mitocôndria mas o registo não apresenta uma diminuição de turbidez suficientemente
assinalável, traduzindo desta forma o carácter não permeante tanto do anião na sua forma
carregada como protonada. Mais uma vez a diminuição de turbidez representa a entrada de
água na mitocôndria para reposição do equilíbrio osmótico, devido às pequenas alterações
induzidas na solução devido à adição dos ionóforos.

5º Ensaio
Utilizámos neste ensaio uma solução de tiocianato de potássio (KSCN) para perceber
o comportamento da membrana mitocondrial interna para com o anião SCN-. À solução de
KSCN adicionámos a suspensão mitocondrial e a rotenona. A turbidez não se altera
prevendo a existência de gradiente eléctrico gerado pelo anião carregado. Após a adição da
valinomicina que dissipa esse gradiente a turbidez diminui significativamente e ocorre
swelling. A membrana é permeável a SCN-.

6º Ensaio
Ao contrário dos outros ensaios em que pretendíamos identificar o comportamento da
membrana mitocondrial perante determinados aniões, neste caso analisamos o carácter do
catião NH4+. Para isso utilizamos uma solução de nitrato de amónio (NH4NO3) à qual
adicionamos rotenona e a suspensão mitocondrial. A pequena alteração de turbidez
detectada pelo registador deve-se mais uma vez à reposição do equilíbrio osmótico e não à
entrada do catião pois o registo é muito reduzido. Se tal acontecesse o anião iria entrar
também, acompanhado por um fluxo de água, induzindo o swelling das mitocôndrias e
reduzindo significativamente a turbidez. Tal não acontece.
Neste caso não adicionamos valinomicina porque, como vimos no primeiro ensaio, a
membrana é permeável a NO3-, não há necessidade de confirmar esta situação. Utilizamos
então o FCCP. O registo mostra uma diminuição acentuada da turbidez após a adição deste
protonóforo. Como sabemos a membrana é impermeável a NH4+ mas permeável a NH3. No
entanto esta molécula tem um carácter neutro por isso não seria suficiente para permitir a
entrada de NO3-. Ao adicionarmos o FCCP o protonóforo transporta H+ para o interior da
mitocôndria. Já dentro deste organelo o H+ reage com o NH3 e forma NH4+. Só quando este

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catião é formado no anterior da mitocôndria é que o NO3- consegue entrar. Ocorre então
swelling das mitocôndrias e diminuição da turbidez.

CONCLUSÃO:
Dos vários ensaios realizados podemos concluir que a membrana interna das
mitocôndrias é permeável a SCN-, NO3- e CH3COOH e impermeável a K+, CH3COO-, Cl-,
HCl e NH4+. Sabemos também que é mais permeável a SCN- do que a NO3-.
Apesar da classificação do tiocianato, do nitrato e do acetato protonado como aniões
permeáveis, estes iões não conseguiriam transpor a membrana sem a acção de ionóforos
como a valinomicina, nigericina e FCCP.

Relatório realizado por Ana Rita Gonçalves Graça


Turma P3, 1º turno

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