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Relatrio: Identificao

de lipdeos por mtodos cromatogrficos e


espectromtricos

2015
Curso Biomdico, turma 49
Alunas: Dbora Cabral de C. Corra
Gisele Beltramini Ruiz
Jlia Rodrigues
Introduo:
Os lipdeos so um grupo muito variado de compostos do corpo. Dentre eles, h os cidos
graxos, os acilgliceris, os fosfoacilgliceris, os esfingolipdeos e os esterides. Os cidos graxos
so cadeias alifticas com um grupo metila em uma extremidade e um grupo carboxila na outra.

Os cidos graxos saturados contm apenas ligaes simples entre os carbonos, enquanto os
insaturados contm uma ou mais ligaes duplas. Nos cidos graxos que ocorrem naturalmente,
suas ligaes duplas encontram-se sempre na configurao cis, ou seja, os hidrognios esto no
mesmo lado da ligao, enquanto as cadeias acil esto no lado oposto. Quando se encontram na
configurao trans, so produzidos por hidrogenao qumica de cidos graxos poliinsaturados
em leos vegetais, no sendo um alimento natural.1
Os acilgliceris so compostos por um glicerol ligado a um ou mais cidos graxos (1 no
monoacilglicerol, 2 no diacilglicerol e 3 no triacilglicerol) por ligao ster. Os triacilgliceris
dificilmente contm o mesmo cido graxo nas trs posies, sendo chamados de triacilgliceris
mistos. Frequentemente, o glicerol esterificado por cidos graxos insaturados no carbono 2.
No sendo idnticos os carbonos 1 e 3, as enzimas so especficas para cada carbono. Os
fosfoacilgliceris compreendem cidos graxos esterificados nas posies 1 e 2 do glicerol e um
fosfato, sozinho ou com substituto, no carbono 3. A fosfatidilcolina um dos maiores
fosfatidilgliceris encontrados em membranas. uma molcula anfiptica, visto que possui
grandes regies polares e apolares.1
J os esfingolipdeos no possuem um esqueleto de glicerol: so formados a partir da
esfingosina, derivada da serina e do palmitato. As ceramidas, por exemplo, so amidas formadas a
partir de esfingosina pela ligao de um cido graxo ao grupo amino. Assim, vrios
esfingolipdeos podem ser formados a partir da ligao de diferentes grupos hidroxila da
ceramida. Alguns esfingolipdeos derivados da ceramida so os gangliosdeos e os cerebrosdeos,
que contm carboidratos ligados hidroxila da ceramida por ligaes glicosdicas. A
esfingomielina est presente em grande quantidade no tecido nervoso, principalmente, j que,
alm de ser um componente de membranas celulares, tambm faz partes da bainha de mielina nos
neurnios. Os esterides so compostos que possuem uma estrutura de quatro anis chamada
ncleo esteride. Nas clulas humanas, o precursor de esterides, a partir do qual so sintetizados
todos os hormnios esterides, o colesterol. Essas snteses ocorrem por modificaes no anel ou
na cadeia lateral C20.1
O uso da cromatografia permitir a separao, identificao e quantificao das
estruturas qumicas presentes na amostra. A espectrometria de massas, que ser utilizada
posteriormente, consiste em uma tcnica fsica que utiliza do movimento de ons em campos
eltricos e magnticos para anlise, deteco e identificao de molculas de interesse por meio
da mensurao da massa - a relao massa/carga, uso de tabelas e comparao entre os picos
resultantes permite essa anlise - e a caracterizao da sua estrutura qumica. O espectrmetro
requer um percurso de coliso livre para os ons e, por tanto, funciona a vcuo. 2
So quatro partes bsicas que constituem um espectrmetro: um sistema de manipulao
para introduzir a amostra desconhecida no equipamento; uma fonte de on, na qual produzido
um feixe de partculas proveniente da amostra; um analisador que separa partculas de acordo
com a massa; um detector, no qual os ons separados so recolhidos e caracterizados. 3
Alm do que foi mencionado, os designs de analisador mais comuns incluem os
analisadores de quadrupolo. Um campo quadrupolo formado por quatro rolos dispostos em
losango aos quais aplica-se uma corrente contnua que afeta o percurso dos ons viajando pelo
trajeto centralizado entre os 4 rolos. Para as voltagens dadas, somente os ons de uma relao
massa- carga determinada podem passar atravs do filtro do quadrupolo, enquanto os outros so
varridos como molculas descarregadas. 3
J o sistema de recolhimento de ons mede a abundncia relativa de fragmentos de cada
massa. Diferentes tipos de detectores so disponveis para espectrmetros de massas. O detector

usado para a maioria dos experimentos de rotina o multiplicador de eltrons. Os dados so


guardados em um computador atravs de um modem. O mtodo utilizado a ionizao por
electrospray (ESI). A ionizao por electrospray envolve a formao de um spray eletrosttico, a
partir do qual so geradas pequenas gotas carregadas e destas so liberados os ons. A
implementao de uma fonte de electrospray relativamente simples, comparando-se com outras
fontes para espectrometria de massas. No experimento em questo, foram analisadas diferentes
estruturas lipdicas, analisando o tamanho das cadeias de cido graxo, a presena de carboidratos
e a composio da cabea polar. 3
Objetivo:
Identificar os tipos de lipdeos presentes na amostra atravs da cromatografia mtodo de
separao e quantificao das espcies - e da espectrometria de massas.

Mtodos e Procedimentos:

Cromatografia:

Para a extrao dos lipdeos, os tecidos/rgos de ratos (fgado, crebro e tecido adiposo)
foram homogeneizados com 10 volumes de mistura de isopropanol:hexano saturado em gua e 10
volumes de clorofrmio:metanol. Os extratos foram filtrados e secos em rotaevaporador. O
resduo foi ressuspenso em clorofrmio:metanol. Aplicou-se na placa de HPTLC (placa de
cromatografia em camada delgada de alta resoluo de slica gel 60) os extratos orgnicos de
glicolipdeos, fosfolipdeos e triacilgliceris com os respectivos solventes e corantes:

Glicolipdeos:

30 mL de clorofrmio

20 mL de metanol

4,5 mL de CaCl (0,02 M)

Fosfolipdeos:

29,5 mL declorofrmio

16,0 mL de metanol

4,5 mL de metilamina

Triacilgliceris:

40,0 mL de hexano

10,0 mL de ter etlico

0,5 mL de cido actico

Aps a aplicao, as lminas foram colocadas na cuba de cromatografia saturada com o


solvente correto. Ressuspendeu-se em 5 mL de clorofrmio etanol o tubo de ensaio com o fgado
e 2,0 mL os tubos com tecido adiposo e crebro. Quando a frente do solvente atingiu a parte
superior da lmina, retirou-se as mesmas da cuba, secando a placa de HPTLC. Borrifou-se o
revelador adequado para cada cromatografia. O revelador utilizado para a lmina de glicolipdeos
foi o orcinol, na de fosfolipdeo foi o molibdnio e na de triacilglicerl foi o cido sulfrico.

Aqueceu-se as lminas de glicolipdeo e triacilglicerol 120C.

Espectrmetro de massas:

As amostras contendo glicolipdeos, fosfolipdeos e triacilgliceris no foram


introduzidas no espectrmetro de massas, utilizou-se, ento, amostras padro. Para a identificao
das molculas de interesse, foram realizados experimentos de ons precursores, perda neutra e
dissociao por coliso.
Solventes das amostras:

1,0 mL de metanol

100 umL de formiato de amnio

300 umL de gua

2 umL de cada amostra

Resultados:
Placas de Cromatografia (HPTLC):

Espectrmetro de massas:

Fosfolipdeos:

Fosfocolina (PC):

on Precursor de 184 m/z:

Otimizado para Fosfocolina 678,4 m/z:

Fragmentao de ons:

Fosfoetanolamina (PE):

Perda neutra de 141 m/z:

Otimizado para Fosfoetanolamina 580,4 m/z:

Fragmentao de ons:

Fosfoserina (PS)

Perda neutra - modo positivo: 185 m/z;

Perda neutra modo negativo: 87 m/z:

Otimizado para Fosfoserina 624,3 m/z:

Fragmentao de ons: modos positivo e negativo, respectivamente:

Fosfoinositol (PI):

Otimizado para fosfoinositol: modos positivo e negativo, respectivamente:

on precursor de 241 m/z (fosfoinositol):


(fosfoinositol.H2O):

Fragmentao de ons no modo negativo:

Glicolipdeos:

on precursor de 259 m/z

GM3 (gangliosdeo):

FraPadro Full Scan: modo positivo

Fragmentao de ons:

Triacilgliceris:

Padro Full Scan de triacilglicerol 902 m/z:

Perda neutra de cidos graxos: 18:1 299 m/z:

Discusso
Atravs da cromatografia em camada delgada foi possvel comparar o perfil de lipdeos
presentes no crebro, tecido adiposo e fgado de ratos. Ao observar a placa de HTPLC
possvel
perceber
que
o
crebro
apresentou
uma
maior
quantidade
de fosfolipdeos e glicolipdeos. No tecido adiposo observou-se uma maior concentrao
de triacilgliceris, pois estes ficam armazenados neste tecido at que sejam hidrolisados. J a
placa de HPTLC do fgado apresentou uma abundncia em fosfolipdeos e glicolipdeos.
A partir de uma anlise mais minuciosa por meio do espectrmetro de massas foi possvel
esmiuar os tipos de cada lipdeos presentes nas amostras. Nos fosfolipdeos havia presente
fosfocolina, fosfoetanolamina, fosfoinositol e fosfoserina, com as respectivas cabeas apolares:
colina, etanolamina, inositol e serina. Nos glicerolipdeos havia a presena de GM3
(gangliosdeo) que um tipo de esfingolipdeo com cabea apolar muito longa formada por
oligossacardeos. Os triacilgliceris encontrados, predominantemente, foram 18:1 e o 18:0.

Bibliografia:
1 "Bioqumica Mdica Bsica" - SMITH, Colleen; MARKS, Allan D.; LIEBERMAN, Michael Editora Artmed, 2007
2 http://hiq.linde-gas.com.br/international/web/lg/br/like35lgspgbr.nsf/docbyalias/appl_mass
Acesso em 20/11/15 s 15:58
3 http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422003000400019&script=sci_arttext Acesso em
20/11/15 s 16:32