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mvel?
Bom, os nomes so auto-explicativos, mas tentarei exemplificar mais. Por hora esquea os
componentes da mistura que voc quer separar e pense no sistema. A "parte" fixa a fase
estacionria e o eluente ("parte" mvel) a fase mvel. De acordo com a polaridade dos
componentes da sua amostra, eles ou interagiro mais com a fase estacionria ou com a fase
mvel (na maioria das vezes mais apolar que a fase estacionria).
A fase estacionria possui conceitos previamente estabelecidos, ou seja, se essa fase for mais
polar que a fase mvel ela chamada de fase normal (nessa fase muito utilizada a slica gel,
alumina e celite). Se a fase estacionria for mais apolar que a fase mvel chamada de fase
reversa (fase estacionria quimicamente ligada). Dessa forma, dependendo da fase estacionria
que est sendo utilizada, a substncia mais retida ou mais polar ou mais apolar. Na figura 1
temos um exemplo utilizando a CCD.
J o eluente "pode" ser pensado como um tipo de solvente, entretanto, ele no vai dissolver ou
reagir com as amostras, e sim, interagir com elas. Ele a fase mvel e por isso, promove a
separao dos componentes.
Para qu a cromatografia
utilizada, de forma geral?
A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com
padres previamente existentes; para a purificao de compostos, separando-se as substncias
indesejveis; e para a separao dos componentes de uma mistura.
Quais
os
estacionria?
tipos
de
fase
A fase estacionria distingue-se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas.
No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente
adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so
considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos
outros dois em seus mecanismos de separao.
Modos de Separao:
Cromatografia Planar
1. Cromatografia em Papel (CP)
A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido, estando um deles fixado
a um suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre
duas fases imiscveis, sendo geralmente a gua um dos lquidos. O solvente saturado em gua e
a partio se d devido presena de gua em celulose (papel de filtro). Este mtodo, embora
menos eficiente que a CCD, muito til para a separao de compostos polares, sendo
largamente usado em bioqumica.
extremamente polares, no devem ser utilizados solventes pouco polares, que no removeriam os
compostos do ponto de aplicao, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os
componentes da amostra at o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados so obtidos
com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade mdia em relao polaridade
dos componentes da amostra.
Ao ascender, o solvente ir arrastar mais os compostos menos adsorvidos (que interagiram
menos) na fase estacionria, separando-os dos mais adsorvidos. A linha de chegada da fase mvel
deve ser marcada e a placa deve estar seca. Como a maioria dos compostos orgnicos incolor,
faz-se necessria a utilizao de um processo de revelao para que se possa analisar o resultado.
Cromatografia em Coluna
1. Cromatografia Lquida Clssica
Esta tcnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de
reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes
adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases
estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por
partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm sido usados, sendo o processo de
separao misto neste caso.
O uso de slica de partcula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a
utilizao de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluio, sendo conhecido
como Cromatografia Flash.
A principal etapa ao se utilizar essa tcnica o empacotamento, o qual, entre outros fatores,
definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina empacotada em sua forma original, a
slica deve s-lo na forma de suspenso.
Aps o empacotamento, conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a trs
vezes o volume da coluna) a ser utilizado atravs da coluna antes da introduo da amostra. Esta
adicionada coluna com o auxlio de uma pipeta no momento em que o nvel do eluente esteja o
mais prximo possvel do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a
serem eludas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente ento adicionado cuidadosa
e continuamente.
A escolha do eluente segue os princpios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado
durante o processo cromatogrfico. Se, por exemplo, a amostra constituda por duas
substncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida
um eluente polar.
O volume das fraes a serem recolhidas funo da quantidade de amostra e do grau de
dificuldade da separao. Para anlise das mesmas, recorre-se a alguma tcnica auxiliar,
usualmente CCD.
Em vista de que geralmente algumas partculas da amostra permanecem irreversivelmente
adsorvidas fase estacionria, a cada separao necessrio um tratamento para a recuperao
do adsorvente.
As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio
ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.
A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade,
possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado.
As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra
com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao
para a coluna.
As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca
de 045 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento
varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm.
Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo
necessria sua regenerao aps cada separao.
O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm
empregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros.
Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos
quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada.
O registro de dados pode ser feito atravs de um registrador, um integrador ou um
microcomputador.
3. Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa um mtodo fsico de separao dos componentes de uma mistura
atravs de uma fase gasosa mvel (gs inerte) sobre um solvente estacionrio. A cromatografia
gasosa utilizada para a separao de compostos volteis, isto , os analitos (solues a serem
analisadas) a serem separados devem apresentar uma razovel presso de vapor temperatura
de separao, uma vez que a coluna colocada dentro de um forno, o que exige estabilidade
trmica da amostra. Durante a anlise, a temperatura da coluna pode permanecer constante ou
sofrer uma variao que pode alcanar cerca de 300C, para que solutos de baixo ponto de
ebulio possam ser eludos. Dessa forma, quanto maior for o carter inico do composto, menor
ser sua volatilidade o que reduzir tambm a possibilidade de separao via CG. Por outro lado,
na cromatografia lquida separam-se compostos polares e no polares nos quais a pouca
volatilidade no inconveniente limitante.
Questionrio:
Pra terminar, temos um questionrio da apostila de cromatografia da UFF (uma das fontes deste
post). Sei que alguns dos assuntos das perguntas no foram abordados durante essa publicao,
tentarei ento exemplificar ao mximo as respostas.
1. Que caractersticas devem apresentar as amostras separadas por cromatografia
gasosa?
As amostras separadas por CG devem ser volteis, estveis termicamente na temperatura de
trabalho e apresentar baixo peso molecular. A cromatografia gasosa apresenta dificuldade em
analisar substncias no volteis, que se decompem em altas temperaturas ou possuem elevado
peso molecular.
2. Que caractersticas devem apresentar as amostras separadas por HPLC?
A amostra deve ser solvel na fase mvel, sendo ela lquida (inica ou covalente) ou slida (inica
ou covalente).
3. Quais as limitaes que a cromatografia gasosa e HPLC apresentam?
Enquanto a CG mais rpida e 10x mais eficiente que o HPLC, ela pobre em capacidade
preparativa e possui menor sensibilidade (10^-12 g DIC/DCE). O HPLC possui boa capacidade
preparativa e sensibilidade igual a 10^-9 g (UV) e 10^-15 g (coulomtrico).
4. Quais so os principais componentes de um equipamento de HPLC?
Reservatrio da Fase Mvel, bomba, injetor, pr-coluna, coluna, detector e computador.
5. Qual o grau de pureza da fase mvel usada na tcnica de HPLC?
O grau de pureza deve ser maior que 99,9%.
6. Por que necessrio filtrar e desgaseificar o eluente?
As fases mveis, principalmente as polares, tem tendncia a dissolver oxignio e outros gases.
Quando estes gases so liberados, dentro do equipamento, formam bolhas que podem afetar o
funcionamento do detector e a eficincia da coluna. Desta forma necessrio remover os gases
dissolvidos na fase mvel. Muitos equipamentos de HPLC j trazem a soluo deste problema
desgaseificando a fase mvel em um compartimento especfico, antes que ela entre na bomba.
7. Qual a funo da pr-coluna?
O uso de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica. A filtrao da fase
mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a eliminao de impurezas prejudiciais
coluna. Dependendo das caractersticas da fase estacionria e da natureza da amostra, pode
acontecer o que se chama de "reteno irreversvel", ou seja, a afinidade do contaminante pela
coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros centmetros do empacotamento.
Retido na cabea da coluna, o contaminante pode provocar perda da eficincia, aumento de
presso e cauda nos picos. Com o uso da pr-coluna, o contaminante no atingir a coluna
analtica. Ao perceber os sintomas de contaminao (os mais comuns so aumento de presso e
elevao no nvel de rudo), o analista substitui a pr-coluna, que em mdia custa 10 vezes menos
que a coluna analtica.
8. Qual a diferena entre as separaes cromatogrficas com bombeamento isocrtico e
de gradiente?
No bombeamento isocrtico a composio da fase mvel permanece constante, e capaz de
separar um nmero limitado de picos. Enquanto que no bombeamento gradiente a composio da
fase mvel varia durante a anlise. Aplica-se esse sistema quando a polaridade dos compostos
muito diferente e quando se separa amostras complexas.
9. Por que o detector de UV o mais usado em HPLC?
Esses detectores apresentam como principal atrativo o fato de se poder escolher diferentes
comprimentos de onda. Permitem a anlise de amostras complexas que absorvem em diferentes
comprimentos de onda; assim como permitem a obteno do espectro completo de um pico
cromatogrfico eludo da coluna
10. Qual a diferena entre cromatografia em fase normal e fase reversa?
Na fase normal a fase estacionria mais polar que a fase mvel, enquanto que na fase reversa a
fase estacionria menos polar que a fase mvel.
11. A tcnica de HPLC s trabalha com cromatografia em fase normal?
No. O HPLC em fase normal utiliza as fases estacionrias quimicamente ligadas que consistem
em uma fase imvel apolar e uma fase mvel de polaridade moderada.
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Fontes: