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O que a fase estacionria e a fase

mvel?
Bom, os nomes so auto-explicativos, mas tentarei exemplificar mais. Por hora esquea os
componentes da mistura que voc quer separar e pense no sistema. A "parte" fixa a fase
estacionria e o eluente ("parte" mvel) a fase mvel. De acordo com a polaridade dos
componentes da sua amostra, eles ou interagiro mais com a fase estacionria ou com a fase
mvel (na maioria das vezes mais apolar que a fase estacionria).
A fase estacionria possui conceitos previamente estabelecidos, ou seja, se essa fase for mais
polar que a fase mvel ela chamada de fase normal (nessa fase muito utilizada a slica gel,
alumina e celite). Se a fase estacionria for mais apolar que a fase mvel chamada de fase
reversa (fase estacionria quimicamente ligada). Dessa forma, dependendo da fase estacionria
que est sendo utilizada, a substncia mais retida ou mais polar ou mais apolar. Na figura 1
temos um exemplo utilizando a CCD.

Figura 1: Cromatograma obtido por CCD no qual se pode observar a diferena de


afinidade das
substncias 1 e 2 pela fase estacionria. Considerando o uso da slica gel como fase
estacionria, a
substncia 1 ficou mais retida, isso significa que ela mais polar que a substncia 2, que
por sua vez
conseguiu uma distncia maior devido a sua menor interao com a fase estacionria.

O que eluio? O que um


eluente?
Eluio a corrida cromatogrfica propriamente dita.

J o eluente "pode" ser pensado como um tipo de solvente, entretanto, ele no vai dissolver ou
reagir com as amostras, e sim, interagir com elas. Ele a fase mvel e por isso, promove a
separao dos componentes.

O que so as fases estacionrias


quimicamente ligadas?
As fases estacionrias quimicamente ligadas so as fases mais importantes da cromatografia
lquida. Obtidas pela reao dos grupos silanis da slica com compostos contendo grupos polares
(Fase Normal) ou apolares (Fase Reversa).
Na Fase Quimicamente Ligada, a slica gel, atravs dos grupos Si - OH se liga quimicamente a um
grupo funcional que lhe confere grande estabilidade qumica. Este grupo pode ser polar como por
exemplo, NO2, CN, NH2... ou apolar como n-alquil, n-aril... obtendo-se uma fase monomrica ou
polimrica. Dentro deste ltimo grupo temos as colunas conhecidas como C8 e C18 (ou RP 8 e RP
18) responsveis pela maioria das separaes em fase reversa. A figura 2 apresenta um esquema
de uma colunda C18.

Figura 2: Fase reversa C18.

Para qu a cromatografia
utilizada, de forma geral?
A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com
padres previamente existentes; para a purificao de compostos, separando-se as substncias
indesejveis; e para a separao dos componentes de uma mistura.

Quais os tipos de cromatografia?


As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critrios.

1. Em relao forma fsica do sistema:


Nesse caso, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia
planar.
Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP), cromatografia
por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em camada delgada (CCD) tambm
chamada de cromatografia em camada fina (CCF), so diversos os tipos de cromatografia em
coluna, os quais sero mais bem compreendidos quando classificados por outro critrio.

2. Em relao fase mvel empregada:


Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa
(CG), a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC), usando-se na ltima
um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma
importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel
arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e acromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo
necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel. A CLAE foi
inicialmente denominada cromatografia lquida de alta presso, mas sua atual designao mostrase mais adequada. No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por
cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena
entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a
fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro
empacotadas com a fase estacionria.

Quais
os
estacionria?

tipos

de

fase

A fase estacionria distingue-se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas.
No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente
adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so
considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos
outros dois em seus mecanismos de separao.

Modos de Separao:

Separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas


desses mecanismos.
Para se ter uma viso mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os mesmos esto
dispostos no diagrama da Figura 3.

Figura 3: Representao esquemtica dos diferentes tipos de cromatografia.

Cromatografia Planar
1. Cromatografia em Papel (CP)
A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido, estando um deles fixado
a um suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre
duas fases imiscveis, sendo geralmente a gua um dos lquidos. O solvente saturado em gua e
a partio se d devido presena de gua em celulose (papel de filtro). Este mtodo, embora
menos eficiente que a CCD, muito til para a separao de compostos polares, sendo
largamente usado em bioqumica.

2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)


ou Cromatografia em Camada Fina (CCF)
A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de adsoro lquidoslido. Nesse caso,
a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase
estacionria.
O parmetro mais importante a ser considerado em CCD (acompanhe a figura 1) o fator de
reteno (Rf), o qual a razo entre a distncia percorrida pela substncia em questo e a
distncia percorrida pela fase mvel. Os valores ideais para Rf esto entre 04 e 06.
Fases estacionrias mais utilizadas: Slica gel, alumina, terra diatomcea e celulose.
Fases mveis: A escolha da fase mvel, que geralmente constituda por um ou mais solventes,
no tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionrias mais usadas so

extremamente polares, no devem ser utilizados solventes pouco polares, que no removeriam os
compostos do ponto de aplicao, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os
componentes da amostra at o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados so obtidos
com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade mdia em relao polaridade
dos componentes da amostra.
Ao ascender, o solvente ir arrastar mais os compostos menos adsorvidos (que interagiram
menos) na fase estacionria, separando-os dos mais adsorvidos. A linha de chegada da fase mvel
deve ser marcada e a placa deve estar seca. Como a maioria dos compostos orgnicos incolor,
faz-se necessria a utilizao de um processo de revelao para que se possa analisar o resultado.

Cromatografia em Coluna
1. Cromatografia Lquida Clssica
Esta tcnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de
reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes
adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases
estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por
partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm sido usados, sendo o processo de
separao misto neste caso.

Figura 4: Ilustrao de uma coluna cromatogrfica.


Esses suportes so acondicionados em tubos cilndricos geralmente de vidro, de dimetros
variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A Fig. 4 uma ilustrao
de uma coluna cromatogrfica empacotada com slica, sendo mostrados seus demais constituintes.
Os adsorventes possuem partculas na faixa de 60-230 mesh (unidade de medida de malha de
peneiras; quanto maior no nmero, menor o tamanho do furo e portanto menor a granulometria
do material peneirado), de modo a possibilitar um fluxo razovel do solvente atravs da coluna.

O uso de slica de partcula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a
utilizao de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluio, sendo conhecido
como Cromatografia Flash.
A principal etapa ao se utilizar essa tcnica o empacotamento, o qual, entre outros fatores,
definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina empacotada em sua forma original, a
slica deve s-lo na forma de suspenso.
Aps o empacotamento, conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a trs
vezes o volume da coluna) a ser utilizado atravs da coluna antes da introduo da amostra. Esta
adicionada coluna com o auxlio de uma pipeta no momento em que o nvel do eluente esteja o
mais prximo possvel do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a
serem eludas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente ento adicionado cuidadosa
e continuamente.
A escolha do eluente segue os princpios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado
durante o processo cromatogrfico. Se, por exemplo, a amostra constituda por duas
substncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida
um eluente polar.
O volume das fraes a serem recolhidas funo da quantidade de amostra e do grau de
dificuldade da separao. Para anlise das mesmas, recorre-se a alguma tcnica auxiliar,
usualmente CCD.
Em vista de que geralmente algumas partculas da amostra permanecem irreversivelmente
adsorvidas fase estacionria, a cada separao necessrio um tratamento para a recuperao
do adsorvente.

2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia


O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilizao de suportes com
partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de
bombas de alta presso para a eluio (corrida cromatogrfica propriamente dita) da fase mvel,
devido a sua baixa permeabilidade. A Fig. 5 mostra um equipamento tpico de CLAE.

Figura 5: Equipamento bsico de CLAE. a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta


presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.

As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio
ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.
A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade,
possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado.
As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra
com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao
para a coluna.
As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca
de 045 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento
varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm.
Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo
necessria sua regenerao aps cada separao.
O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm
empregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros.
Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos
quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada.
O registro de dados pode ser feito atravs de um registrador, um integrador ou um
microcomputador.

Figura 6: Cromatograma mostrando a separao


dos enantimeros do tetramisol, princpio ativo de vrios
medicamentos usados para ascaridase.

A Fig. 6 ilustra uma separao enantiomrica por CLAE.


A versatilidade desta tcnica reside no grande nmero de fases estacionrias existentes, as quais
possibilitam anlises e separaes de uma ampla gama de compostos com alta eficincia. Tem
sido utilizada em vrias reas da cincia, no acompanhamento de snteses, em anlises de
pesticidas, feromnios, no isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e controle
de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes.
As separaes em CLAE podem se dar por adsoro, partio ou ambos. O suporte mais
comumente utilizado a slica. O uso de fases estacionrias lquidas adsorvidas a um suporte no
tem grande aplicao devido perda de fase estacionria, mas o uso de suportes modificados, os
quais foram desenvolvidos como conseqncia do problema acima, possibilita a produo de uma
imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim
obtidas so chamadas de quimicamente ligadas.
Essas fases, dependendo da modificao feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso
ou ambos (modos discutidos no tpico "o que a fase estacionria e a fase mvel" deste post).
Separaes analticas so predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase
C18 (octadecilslica) a mais usada, ao passo que so preferidas fases que atuem no modo
normal para fins preparativos, em vista de que separaes no modo reverso utilizam fases mveis
aquosas.
Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado s fases
estacionrias quirais, as quais possibilitam a separao direta de enantimeros. Para
tanto, necessria a presena de um seletor quiral como parte integrante da fase
estacionria.

3. Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa um mtodo fsico de separao dos componentes de uma mistura
atravs de uma fase gasosa mvel (gs inerte) sobre um solvente estacionrio. A cromatografia
gasosa utilizada para a separao de compostos volteis, isto , os analitos (solues a serem

analisadas) a serem separados devem apresentar uma razovel presso de vapor temperatura
de separao, uma vez que a coluna colocada dentro de um forno, o que exige estabilidade
trmica da amostra. Durante a anlise, a temperatura da coluna pode permanecer constante ou
sofrer uma variao que pode alcanar cerca de 300C, para que solutos de baixo ponto de
ebulio possam ser eludos. Dessa forma, quanto maior for o carter inico do composto, menor
ser sua volatilidade o que reduzir tambm a possibilidade de separao via CG. Por outro lado,
na cromatografia lquida separam-se compostos polares e no polares nos quais a pouca
volatilidade no inconveniente limitante.

4. Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo


Em contraste CLAE, o principal mecanismo de separao da cromatografia gasosa est baseado
na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria
lquida. A utilizao de fases estacionrias slidas, as quais levariam separao por adsoro,
apresenta poucas aplicaes.
A cromatografia gasosa uma das tcnicas analticas mais utilizadas. Alm de possuir um alto
poder de resoluo, muito atrativa devido possibilidade de deteco em escala de nano a
picogramas (109 - 10-12 g). A grande limitao deste mtodo a necessidade de que a amostra
seja voltil ou estvel termicamente, embora amostras no volteis ou instveis possam ser
derivadas quimicamente. Pode ser utilizada para separaes preparativas apenas na faixa de
microgramas a miligramas, no sendo muito empregada para esse fim. A Fig. 7 mostra os
componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.

Figura 7: Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso. a) cilindro do gs de arraste

mantido sob alta presso; b) injetor; c) coluna; d) detector e e) registrador.


Como dito anteriormente, a diferena entre CG e CGAR est na coluna. Colunas de CGAR so
maiores em comprimento, menores em dimetro, possuem a fase lquida como um filme aplicado
diretamente s paredes do tubo da coluna e so mais eficientes.
Essas colunas so tubos longos de metais como ao ou cobre, vidro ou teflon. Colunas de CG tm
dimetro de cerca de 3 mm e comprimento em torno de 3 m, ao passo que colunas de CGAR tm
dimetro na faixa de 015-0,75 mm e comprimentos variados, usualmente entre 10 m e 100 m.
Os gases utilizados como fase mvel devem ter alta pureza e ser inertes em relao fase
estacionria. Hidrognio, nitrognio e hlio so os mais usados.
A injeo da amostra feita atravs de microsseringas ou vlvulas semelhantes s utilizadas em
CLAE.
Os detectores de maior aplicao so o detector por ionizao em chama e o detector de
condutividade trmica. Os dados podem ser obtidos atravs de um registrador potenciomtrico,
um integrador ou um microcomputador, sendo as amostras identificadas por seus tempos de
reteno.
Nesses equipamentos necessrio o controle da temperatura do injetor, da coluna e do detector,
as quais so mantidas por termostatos. Como a temperatura um fator extremamente
importante, grande parte das anlises por cromatografia gasosa feita com programao de
temperatura, obtendo-se melhor separao com picos mais simtricos em menor tempo.
Para o empacotamento de colunas de CG, geralmente empregam-se terras diatomceas como
suporte. A escolha da fase estacionria de fundamental importncia, sendo ela o componente
crtico da coluna. As fases estacionrias podem ser polares, apolares ou quirais. Fases polares so
baseadas em polietileno glicol puro ou modificado e apolares em metilsiloxano puro ou modificado.
As fases quirais mais comuns so compostas de ciclodextrinas.
Atualmente, espectrmetros de massa tm sido acoplados a equipamentos de cromatografia
gasosa, possibilitando a identificao imediata das substncias presentes na amostra.

Questionrio:
Pra terminar, temos um questionrio da apostila de cromatografia da UFF (uma das fontes deste
post). Sei que alguns dos assuntos das perguntas no foram abordados durante essa publicao,
tentarei ento exemplificar ao mximo as respostas.
1. Que caractersticas devem apresentar as amostras separadas por cromatografia
gasosa?
As amostras separadas por CG devem ser volteis, estveis termicamente na temperatura de
trabalho e apresentar baixo peso molecular. A cromatografia gasosa apresenta dificuldade em
analisar substncias no volteis, que se decompem em altas temperaturas ou possuem elevado
peso molecular.
2. Que caractersticas devem apresentar as amostras separadas por HPLC?
A amostra deve ser solvel na fase mvel, sendo ela lquida (inica ou covalente) ou slida (inica
ou covalente).
3. Quais as limitaes que a cromatografia gasosa e HPLC apresentam?

Enquanto a CG mais rpida e 10x mais eficiente que o HPLC, ela pobre em capacidade
preparativa e possui menor sensibilidade (10^-12 g DIC/DCE). O HPLC possui boa capacidade
preparativa e sensibilidade igual a 10^-9 g (UV) e 10^-15 g (coulomtrico).
4. Quais so os principais componentes de um equipamento de HPLC?
Reservatrio da Fase Mvel, bomba, injetor, pr-coluna, coluna, detector e computador.
5. Qual o grau de pureza da fase mvel usada na tcnica de HPLC?
O grau de pureza deve ser maior que 99,9%.
6. Por que necessrio filtrar e desgaseificar o eluente?
As fases mveis, principalmente as polares, tem tendncia a dissolver oxignio e outros gases.
Quando estes gases so liberados, dentro do equipamento, formam bolhas que podem afetar o
funcionamento do detector e a eficincia da coluna. Desta forma necessrio remover os gases
dissolvidos na fase mvel. Muitos equipamentos de HPLC j trazem a soluo deste problema
desgaseificando a fase mvel em um compartimento especfico, antes que ela entre na bomba.
7. Qual a funo da pr-coluna?
O uso de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica. A filtrao da fase
mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a eliminao de impurezas prejudiciais
coluna. Dependendo das caractersticas da fase estacionria e da natureza da amostra, pode
acontecer o que se chama de "reteno irreversvel", ou seja, a afinidade do contaminante pela
coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros centmetros do empacotamento.
Retido na cabea da coluna, o contaminante pode provocar perda da eficincia, aumento de
presso e cauda nos picos. Com o uso da pr-coluna, o contaminante no atingir a coluna
analtica. Ao perceber os sintomas de contaminao (os mais comuns so aumento de presso e
elevao no nvel de rudo), o analista substitui a pr-coluna, que em mdia custa 10 vezes menos
que a coluna analtica.
8. Qual a diferena entre as separaes cromatogrficas com bombeamento isocrtico e
de gradiente?
No bombeamento isocrtico a composio da fase mvel permanece constante, e capaz de
separar um nmero limitado de picos. Enquanto que no bombeamento gradiente a composio da
fase mvel varia durante a anlise. Aplica-se esse sistema quando a polaridade dos compostos
muito diferente e quando se separa amostras complexas.
9. Por que o detector de UV o mais usado em HPLC?
Esses detectores apresentam como principal atrativo o fato de se poder escolher diferentes
comprimentos de onda. Permitem a anlise de amostras complexas que absorvem em diferentes
comprimentos de onda; assim como permitem a obteno do espectro completo de um pico
cromatogrfico eludo da coluna
10. Qual a diferena entre cromatografia em fase normal e fase reversa?
Na fase normal a fase estacionria mais polar que a fase mvel, enquanto que na fase reversa a
fase estacionria menos polar que a fase mvel.
11. A tcnica de HPLC s trabalha com cromatografia em fase normal?
No. O HPLC em fase normal utiliza as fases estacionrias quimicamente ligadas que consistem
em uma fase imvel apolar e uma fase mvel de polaridade moderada.
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Fontes:

Introduo cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE - HPLC). Apostila da Universidade


Federal Fluminense (UFF) - Departamento de Qumica Orgnica. Apostila utilizada na disciplina de
Qumica Orgnica Experimental I. Autoria: Luci Martins Viana (Professora Associada - GQO - UFF)
e Priscila Alvares Pinto (Programa de Monitoria GQO/2012).

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