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A nova grande promessa da inovao em frmacos:

RNA interferncia saindo do laboratrio para a clnica

Carlos Frederico Martins Menck

RESUMO
A descoberta de que nossas clulas dispem de um mecanismo de silenciamento
gnico empregando RNA interferncia ainda muito recente. Apesar disso, em
menos de uma dcada a investigao cientfica j alcanou progresso, suficiente
para muito brevemente nos apropriarmos desse conhecimento com fins
teraputicos. Duplexes de RNA so potenciais frmacos e h investimentos altos
nessa nova abordagem. Aparentemente, a promessa de terapia gnica parece
finalmente atingir sua maturidade com essas novas ferramentas.
Palavras-chave: RNA interferncia, Silenciamento gnico, Cncer, Terapia gnica,
Infeco viral.

ABSTRACT
The discovery of gene silencing mechanisms in our own cells using RNA interference
is very recent. However, in less than a decade, the scientific investigation have
progressed enough to make us see that, very soon, we will use this knowledge for
therapeutic purposes. RNA duplexes are potential pharmaceutical drugs and there
are high investments in this new strategy. The promising gene therapy seems to
finally reach maturity with these new tools.
Keywords: RNA interference, Gene silencing, Cancer, Gene therapy, Viral infection.

Introduo
A MOLCULA de RNA foi recentemente identificada como um possvel frmaco
capaz de revolucionar a forma com que realizamos terapias de um elevado nmero
de doenas humanas. As atividades biolgicas dessas molculas, empregadas

normalmente na forma de dupla fita, foram descobertas na dcada de 1990 graas


identificao dos mecanismos de interferncia do RNA e baseiam-se na
capacidade de essas molculas reduzirem (interferirem) a expresso de
determinados genes-alvo. O potencial teraputico do RNA dupla fita enorme,
sobretudo em processos genticos que requerem inibio de produtos de genes.
Entre as doenas-alvo, destacam-se as terapias tumoral e de agentes infecciosos,
especialmente vrus, mas vrias outras doenas humanas tambm podero ser
controladas pela ao dessas molculas. O tamanho relativamente grande das
molculas de RNA, sobretudo em comparao com algumas drogas qumicas, pode
representar um dos problemas a serem enfrentados pelas pesquisas no tema,
porm chama a ateno a facilidade com que essas molculas podem ser
projetadas, dependendo apenas da sequncia das bases do gene-alvo. Vrios
protocolos clnicos tm sido testados em humanos nos ltimos anos, e os resultados
so promissores. possvel que em breve esse tipo de frmaco seja encontrado em
farmcias: vale a pena saber o porqu!

O RNA no s um mero mensageiro do DNA


Na dcada de 1980, a comunidade cientfica se espantou com a revelao de que a
molcula de RNA tem atividade cataltica, como as enzimas. Assim, essas molculas
foram chamadas de ribozimas e demonstraram que o RNA pode desempenhar
funes que superam em muito a de simples mensageiro para sntese de protenas.
Mas isso foi s o comeo. Na dcada de 1990, resultados com plantas transgnicas
comearam a gerar dados completamente inesperados: plantas que
superexpressavam genes para produo de pigmentos (e que, portanto, deveriam
gerar flores com mais pigmentos, ou seja, com colorao violeta-escuro)
apresentaram flores brancas, em razo da ausncia de sntese do pigmento! No
caso, houve o inesperado silenciamento do transgene e do gene endgeno das
clulas dessas flores.
O mecanismo molecular que levava ao silenciamento gnico permaneceu
desconhecido por alguns anos, at que, trabalhando com o verme
nematoide Caenorhabditis elegans, os grupos dos pesquisadores americanos
Andrew Z. Fire e Craig C. Mello descobriram que molculas de RNA dupla fita
(RNAdf) poderiam silenciar a expresso de genes (Fire et al., 1998). Os
experimentos realizados para essa descoberta so extremamente simples: ao
analisarem o efeito de silenciamento gnico de molculas de RNA simples fita
antissenso e tambm senso (em relao ao sentido da molcula do RNA
mensageiro do gene-alvo), os pesquisadores descobriram que o uso da molcula
dupla fita tinha um efeito cem vezes maior. Pela capacidade do RNAdf de interferir
na expresso gentica, o mecanismo comeou a ser chamado de RNA interferncia
ou simplesmente RNAi.

O mecanismo de RNA interferncia funciona em clulas


humanas
Esse mecanismo de silenciamento foi demonstrado inicialmente em vermes, plantas
e insetos, mas demorou trs anos para ter sua existncia demonstrada em clulas
humanas (Elbashir et al., 2001). Esses experimentos indicaram a importncia
evolutiva dos mecanismos de RNAi em eucariontes em geral e acenderam ideias do
uso potencial tecnolgico para molculas de RNAdf como base para silenciamento

gnico com fins teraputicos em humanos. Alm disso, houve a identificao de


pequenas molculas de RNAdf (na forma de grampos) sintetizadas pelas prprias
clulas, a partir do seu genoma cuja funo controlar a expresso de genes
celulares. Esses RNA endgenos ficaram conhecidos como microRNA (miRNA) e
demonstram que as funes do RNA na clula vo muito alm da simples
mensagem. Pela descoberta, os doutores Fire e Mello receberam o Prmio Nobel de
Medicina em 2006.

Como funciona a RNA interferncia na clula


Os mecanismos de RNA interferncia j so bem conhecidos. Basicamente, genes
endgenos so transcritos como um RNAm longo contendo vrios miRNA
agrupados. Esses miRNA primrios so conhecidos como pri-miRNA e contm
sequncias de bases palindrmicas, de modo que o emparelhamento entre elas
gera estruturas de RNAdf na forma de grampo. Essas molculas so processadas
ainda no ncleo da clula, sendo clivadas por RNAse (Drosha), formando estruturas
com cerca de 70 bases, conhecidas como pr-microRNA (pr-miRNA). Essas
molculas so exportadas ao citoplasma (pela enzima Exportina-5) e so
novamente processadas por uma RNAse, Dicer, que produz os miRNA maduros que
so duplexes de 19 a 23 pares de base. O complexo Risc (do ingls RNA induced
silecing complex) a plataforma proteica que se associa aos miRNA e promove a
interao de uma das fitas do RNAdf (RNA-guia) com molculas de RNA
mensageiros. Essa interao ocorre por complementaridade na sequncia do RNAguia e do RNAm, e normalmente ocorre na regio 3' no traduzida (3'-UTR),
resultando no silenciamento do RNAm-alvo, seja por degradao desse, seja pelo
bloqueio da traduo em protenas. No caso de bloqueio de traduo, a
complementaridade no necessita ser completa, o que indica que um nico miRNA
pode regular centenas de genes, e cada gene-alvo pode ser regulado por mltiplos
miRNA, demonstrando a complexidade dessa rede de regulao gnica. A Figura
1 apresenta um esquema que descreve de forma simplificada como funciona o
mecanismo de RNA interferncia (para uma reviso, ver Liu, 2008).

A descoberta do processo de regulao gnica atravs de RNA interferncia


revolucionou tambm a forma como se estuda o papel de genes especficos na
biologia. O uso de molculas de RNAdf exgenas como ferramenta pode reduzir a
expresso de genes especficos (efeito conhecido como knock-down), de forma que
as alteraes causadas por essa estratgia possibilitam avaliar quais funes esse
gene desempenha na clula. Nesses experimentos, a sequncia da molcula de

RNAdf definida pelo pesquisador para interferir no seu gene- alvo preferido. Essa
estratgia tambm pode ser usada diretamente in vivo (em animais ou mesmo em
humanos), e da a possibilidade de desenvolvimento de frmacos (Tiemann & Rossi,
2009).
Basicamente, duas abordagens distintas podem ser usadas. Na primeira, vetores
genticos, em geral derivados de vrus (como adenovrus, retrovrus ou vrus
adenoassociados), so transduzidos nas clulas, de modo a expressar genes que
so transcritos em molculas de RNAdf na forma de grampo (similares aos miRNA).
Essas molculas so conhecidas como shRNA (do ingls short hairpin RNA) e tm
como alvo o gene que se deseja silenciar. O shRNA clivado pela protena Drosha e
assim processado pela maquinaria de RNA interferncia celular. Apesar de esse
tipo de abordagem requerer a produo de vetores virais, o que no um processo
simples do ponto de vista de produo de frmacos, ainda assim, como veremos
adiante, h algumas estratgias teraputicas que esto sendo testadas, como
protocolos clnicos em humanos, empregando vetores que expressam shRNA.
Em uma segunda abordagem, pequenas molculas de RNAdf podem ser
introduzidas diretamente nas clulas em cultura, visando degradao especfica
do gene-alvo. Essas molculas so conhecidas como siRNA (small interfering RNA)
e podem ser introduzidas na clula, por vrios tipos de metodologias, para o
silenciamento de seu gene-alvo. Atualmente, vrias empresas de biotecnologia
oferecem molculas de siRNA, para qualquer gene humano (ou camundongo) que o
pesquisador pretenda silenciar. Uma caracterstica importante o tamanho da
duplex que deve ter de 19 a 30 pares de base, uma vez que tamanhos maiores
podem induzir respostas interferon inespecficas em clulas animais.
Em cultura de clulas, a introduo de molculas de siRNA , em geral, feita
atravs da formao de complexos dessas duplexes com polmeros qumicos ou
lipdeos, normalmente catinicos. O complexo endocitado pelas clulas e as
duplexes de RNA so liberadas no citoplasma, sendo processadas pela maquinaria
de RNA interferncia, promovendo o silenciamento do gene-alvo. A utilizao de
siRNA tem sido largamente empregada em estudos de genmica funcional e em
distintos testes clnicos em razo do silenciamento gnico especfico e robusto
induzido por essas molculas. A fcil manipulao e a existncia de sequncias de
siRNA para qualquer gene do genoma humano tornaram acessvel o uso dessa
ferramenta por diferentes grupos de pesquisa bsica e aplicada.

Interferindo na expresso gnica in vivo


A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia em clulas humanas
relativamente recente, mas, apesar disso, rapidamente verificou-se que o uso de
RNAdf como ferramenta tambm pode ser feito in vivo, diretamente em animais.
Obviamente, a maior parte desses testes pr-clnicos tem sido feita em
camundongos, mas animais maiores, como macacos, tambm tm sido usados, e
os resultados tm sido promissores. Isso estimulou o desenvolvimento de estudos
diretamente em humanos, e vrios protocolos clnicos j esto sendo testados. O
potencial teraputico de silenciamento atravs de RNA tem sido investigado tendo
como alvo vrios tipos de doenas, como cncer, doenas respiratrias, inflamao,
doenas neurolgicas, autoimunes e no combate a processos infecciosos (Figura 2).
Alguns protocolos clnicos em fase I, que testam a segurana do uso de terapias em
humanos, j foram concludos e se verificou que molculas de siRNA foram
introduzidas em pessoas sem que se verificasse efeito txico. Mais do que isso, em

vrios casos identificou-se o funcionamento dessas duplexes no silenciamento do


gene-alvo, como desejado.

O desenvolvimento de terapias baseadas em RNAi tornou-se um campo de pesquisa


atrativo e promissor sobretudo nos casos em que a inibio de determinadas
protenas no teve sucesso pelos mtodos farmacolgicos tradicionais. Alm disso,
como o desenvolvimento de duplexes de RNA s depende do conhecimento da
sequncia do gene-alvo, o desenvolvimento dessas drogas extremamente simples
em relao ao tradicional drug design, no qual h necessidade de conhecimento da
estrutura cristalogrfica da protena-alvo, o que no garantia de sucesso em
determinar os ligantes ativos nessas estruturas. Apesar de existirem casos nos
quais as duplexes podem atuar em alvos diferentes do previsto (efeito conhecido
como off-target), vrios protocolos experimentais tm demonstrado a
especificidade dada pela sequncia dessas molculas, o que estimula novas
pesquisas na rea.
Em geral, os trabalhos empregam as metodologias j bastante investigadas para
introduo de DNA em organismos, em procedimentos de terapia gnica tradicional.
Entretanto, algumas diferenas entre o uso dessas duas abordagens so claras e
devem ser levadas em conta na escolha da metodologia. A molcula de siRNA
muito menor (entre 19 e 30 pares de bases), o que facilita sua entrega em relao
aos vetores genticos dependentes de DNA ou RNA (em geral alguns milhares de
pares de base). Apesar disso, RNA uma molcula muito mais instvel, sendo

degradada in vivo por RNAse. Essa caracterstica exigiu diversos estudos em


modificaes qumicas que aumentam sua estabilidade no organismo, sem
prejudicar a ao dessas molculas com frmacos.
Os testes com animais empregam siRNA ou shRNA atravs de vrias vias de
administrao, o que depende do gene e do tecido-alvo. Por exemplo, aplicaes
intravenosas possibilitam que a duplex seja direcionada especialmente ao fgado,
onde interiorizado nas clulas. Por sua vez, introduo de siRNA por injeo
intraocular garante um efeito direto nesse rgo, com a vantagem de o olho ser um
compartimento de tamanho limitado, o que possibilita o uso de poucas molculas,
que ainda so efetivas no silenciamento gnico. Tambm tem tido muito sucesso o
emprego de aplicao de duplexes de RNA atravs de inalao quando o alvo so as
vias areas. Alm disso, molculas de siRNA tm sido aplicadas diretamente na
pele, o que possibilita um alcance em vrios pontos do organismo, ainda que
preferencialmente em tecidos mais superficiais. Em geral, essas aplicaes in
vivo utilizam, como em cultura de clulas, complexos com polmeros ou lipdeos
(poliplexos ou lipossomos) que constituem as nanopartculas que so endocitadas
para interiorizao das duplexes nas clulas. Curiosamente, no entanto, em vrias
aplicaes, solues salinas de siRNA so diretamente usadas e essas ainda so
eficientes, promovendo o silenciamento do gene-alvo no organismo. Entretanto,
bastante provvel que, em muitos desses casos, o uso das nanopartculas melhore
a eficincia do frmaco. Nos casos de shRNA, em geral so empregados vetores
genticos derivados de vrus para sua expresso nas clulas. Como em outros
procedimentos de terapia gnica, alguns dos casos so diretamente aplicados in
vivo (por aplicao intravenosa, por exemplo), mas tambm h casos de
aplicao ex vivo, que permite a modificao de clulas-tronco do prprio
organismo com o vetor que expressa o shRNA (e promove o silenciamento do genealvo). Posteriormente, a clula modificada reintroduzida no organismo, de modo a
obter o benefcio teraputico.

Interferindo no genoma humano com fins teraputicos


Apesar de sabermos que o mecanismo de RNA interferncia existe em clulas
humanas h relativamente pouco tempo (desde 2001), surpreendente como
rapidamente foram iniciados protocolos clnicos em seres humanos empregando
RNAi. Essa rapidez e relativo sucesso em alguns desses protocolos permitem prever
que, em poucos anos, teremos essas molculas sendo comercializadas em nossas
farmcias e/ou aplicadas em nossos hospitais (Tiemann & Rossi, 2009).
Entre as principais indicaes de uso de RNA interferncia, destacam-se aquelas
envolvidas em terapias oftalmolgicas. Isso se deve basicamente
compartimentalizao ocular, que permite a administrao direta com injees na
cavidade vtrea. O compartimento ocular livre de nucleases e molculas de siRNA
so internalizadas nas clulas-alvo. Essas vantagens tm sido exploradas por
drogas teraputicas que usam oligonucleotdeos, j comercializadas (Vitravene,
Novartis e Macugen, Pfizer). Com duplexes de RNA (siRNA), os testes clnicos tm
se concentrado no tratamento de doena macular relacionada idade (AMD, do
ingls age-related macular disease). O desenvolvimento de vascularizao no fundo
do olho, sobretudo em pessoas acima de sessenta anos de idade, prejudica a viso
nesses pacientes com AMD, e o tratamento com siRNA visa silenciar a expresso de
genes relacionados ao desenvolvimento de vasos, como o receptor de VEGF-I
(VEGF vascular endothelial growth factor). Testes clnicos de fase II/III,
empregando 217 pacientes, indicaram uma melhora na acuidade visual em dois
teros desses, demonstrando que essa tecnologia pode estar prxima de ser

aprovada para comercializao. Entretanto, existem alguns problemas relacionados


ao sistema de administrao (injeo intraocular), e, curiosamente apesar dos
resultados positivos, h polmica quanto ao fato de parte dos efeitos se dever a
respostas imunolgicas no especficas, e no ao silenciamento especfico pela
siRNA (Hubschman et al., 2009). Estudos similares tm sido realizados empregando
siRNA contra VEGF-A em pacientes diabticos com edema macular.
Protocolos clnicos em fase II tambm esto sendo realizados para combater
infeces respiratrias por vrus respiratrio sincicial (RSV). Nesse caso, molculas
de siRNA contra genes virais so administradas atravs de inalao nos pacientes.
Aparentemente os vrus RSV replicam clulas epiteliais superficiais do pulmo, que,
por sua vez, so capazes de endocitar as duplexes de RNA, de modo que o
silenciamento viral eficiente. Testes clnicos com 88 indivduos adultos sadios
demonstraram que as molculas de siRNA foram seguras e houve nveis
significativamente menores de infeco em relao a indivduos que receberam
placebo (De Vincenzo et al., 2010).
O uso de RNA interferncia como antiviral tambm est sendo testado clinicamente
em terapia contra Aids. Nesses estudos, curiosamente, tm-se usado vetores virais
derivados de HIV (agente etiolgico da Aids) para expresso de shRNA em clulastronco de pacientes. Esses vetores, conhecidos como lentivrus, so capazes de se
integrar permanentemente no genoma das clulas, as quais so ento
reimplantadas nos pacientes. Esse processo de transplante autlogo produz clulas
(e principalmente linfcitos T4, alvo do vrus HIV) resistentes aos vrus, o que
permite a recuperao do paciente. Dados tm sido promissores indicando que,
mesmo dezoito meses aps incio da terapia, as clulas implantadas continuam a
expressar o shRNA (Singh & Gaur, 2009).
Alm dos protocolos clnicos citados aqui, a tecnologia de RNA interferncia ainda
est sendo empregada em protocolos clnicos para outras doenas, como hepatite
B, diferentes tipos de tumores (incluindo melanoma), hipercolesterolemia, injria
renal aguda etc. Vrios so os genes-alvo testados para combate o cncer:
oncogenes, mediadores de ciclo celular e apoptose, genes envolvidos em
degradao e estabilidade proteica, angiognese, molculas relacionadas invaso
metasttica e adeso celular. Alm disso, nossa proposta o uso de siRNA como
coadjuvantes nos tratamentos teraputicos com radiao ionizante e agentes
quimioterpicos. Para tanto, estamos testando o silenciamento de genes-alvo como
aqueles que codificam protenas antiapoptticas, de multirresistncia a drogas e
mesmo envolvidas no reparo de DNA. Certamente, pelo nmero de testes prclnicos que esto sendo realizados, a lista de doen-as-alvo a serem testadas
diretamente em humanos, empregando diferentes estratgias de uso de RNA
interferncia, dever ser bastante ampliada.

A corrida do ouro no desenvolvimento de novas terapias com


RNAi
A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia, apesar de recente, provocou
uma verdadeira revoluo na forma como estudado o funcionamento dos genes
nas clulas e tambm abriu perspectivas de interveno direta na ao gnica in
vivo. Em vrios casos de doenas humanas, ocorre aumento de expresso de
determinados genes, e o controle desses pelo silenciamento aparece como uma
esperana na obteno de novas formas de terapia. A obteno de inibidores
qumicos continua sendo uma alternativa extremamente interessante em vrias
dessas doenas, porm o mecanismo de RNA interferncia fornece uma abordagem

simples (busca de complementaridade de sequncia) para obter frmacos,


ampliando seu potencial de uso e alcance. Esforos para uso dessa nova
biotecnologia na clnica tm correspondido a um dos mais importantes exemplos
recentes de medicina translacional, na qual o teste de laboratrio transferido
rapidamente para o leito do paciente. Os desafios ainda so grandes, havendo
necessidade de novas estratgias para maximizar a ao das molculas efetoras
dentro das clulas, assim como dos mecanismos de administrao e entrega da
molcula aos rgos-alvo. Vrias so as estratgias propostas, na teoria, para o
direcionamento dessas molculas de modo a garantir uma melhor especificidade no
tecido-alvo, mas h necessidade de testes que possibilitem a demonstrao de
efetividade na prtica.
Os desafios, porm, no parecem assustar as grandes empresas farmacolgicas do
mundo inteiro. Pequenas empresas montadas por pesquisadores esto sendo
adquiridas por empresas multinacionais, que esto investindo bilhes em pesquisas
de desenvolvimento, acreditando que as drogas e estratgias desenvolvidas com a
abordagem de RNA interferncia possam ter sucesso no s para doenas
especficas, como tambm criem modelos para outras doenas. Esses investimentos
tm sido to flagrantes que parecem uma nova corrida do ouro no uso do
conhecimento adquirido com dcadas de estudo do genoma humano, na elaborao
de novos frmacos. Entretanto, a aplicao de terapia baseada em RNA
interferncia deve ser analisada com cautela, visto que ainda requer intenso
trabalho de pesquisa em todo o processo de elaborao de protocolos teraputicos.
O Brasil continua incipiente nesses estudos, de modo que apenas alguns grupos de
pesquisa, nas universidades, tm o domnio da tecnologia para uso de RNA
interferncia. Um nmero ainda menor est envolvido diretamente no
desenvolvimento de tecnologias novas empregando essa abordagem. Se esse
verdadeiro silenciamento intelectual continuar na rea, teremos que pagar caro
pelas patentes e pelo uso dos novos medicamentos que muito provavelmente nos
sero vendidos nas prximas dcadas.

Referncias
DE VINCENZO, J. et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an
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