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Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas,
de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.
ndice
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1.1Preparacin de la muestra
1.2Electroforesis en gel
1.3Transferencia
1.3.1Difusin simple
1.3.2Transferencia al vaco
1.3.3Electrotransferencia
1.4Bloqueo
1.5Deteccin
1.5.1Mtodo en dos pasos
1.5.1.1Anticuerpo primario
1.5.1.2Anticuerpo secundario
1.5.1.2.1Radiactividad
1.5.1.2.3Marcaje fluorescente
1.5.1.2.4Sistema avidina/estreptavidina
1.6Anlisis
1.6.1Deteccin colorimtrica
1.6.2Deteccin quimioluminiscente
1.6.3Deteccin radioactiva
1.6.4Deteccin fluorescente
1.7Exploraciones secundarias
2Aplicaciones
2.1Investigacin
2.2Diagnstico
3Protocolos
4Vase tambin
5Enlaces externos
6Referencias
Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin
pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y
solubilicen las protenas. A veces se
aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las
enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.7
Electroforesis en gel[editar]
Artculo principal: Electroforesis en gel
Transferencia[editar]
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF.
Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo
elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad
de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con
idntica afinidad):
Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son
tambin ms frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden
ser sometidas a varias pruebas consecutivas.8
Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.
Difusin simple[editar]
En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel
electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro.
Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto
pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia
el papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn
retenidas en ella.
Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia.
Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener
mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias
pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es
necesaria una transferencia cuantitativa de protena.9 10
Transferencia al vaco[editar]
Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant
Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante
del material proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a
la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere
(especialmente en comparacin con las otras tcnicas).
Bloqueo[editar]
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma
inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la
transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la
deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo antgenoantgeno que se forma con la protena que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente
de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls,
BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween
20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de
unin de la membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De
este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el
ruido de fondo y los falsos positivos.
Deteccin[editar]
Anticuerpo primario[editar]
El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena
buscada. ste se consigue inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones
capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o
una cabra) o a un cultivo celular. Adems, como la protena se ha desnaturalizado
durante laelectroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca
especficamente la protena desnaturalizada. La presencia del elemento extrao
debera desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la produccin del
anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena.
As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una
disolucin de anticuerpo primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn
salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una
pequea fraccin de detergente y, en ocasiones, protenas disueltas,
como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolucin pueden ser
introducidas en una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin puede durar desde 30
minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente
variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones ms especficas.
Anticuerpo secundario[editar]
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se
expone al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin
concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unin
a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rbano
(HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario,
amplificando la seal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de
origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de
reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay
anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econmicas,
por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios; y
dan resultados mucho ms consistentes.
Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G.
Radiactividad[editar]
Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una
reaccin quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas
en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscentediferente. En el caso
de la peroxidasa, cataliza la oxidacin del luminol en presencia de perxido de
hidrgeno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano
fosfato, reaccin que genera luz. Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la
membrana, la exposicin a la luz que se desprende en la reaccin permite detectar la
actividad enzimtica.
Marcaje fluorescente[editar]
Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos
a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz
constante (estado esttico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una
deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta que la de la
quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinmico.
El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin
embargo es posible realizar la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la
membrana de PVDF. Esto ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario
realizar una tincin del gel para comprobar la transferencia proteica.15
Sistema avidina/estreptavidina[editar]
Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas
de biotina. Despus la deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la
misma, como la estreptavidina o la avidina.
Deteccin con oro[editar]
Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos
primarios con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con
manchas rojas, causadas por el oro, all donde est la protena. 16 La sensibilidad del
mtodo puede incrementarse con una tincin fotoqumica de plata: el oro cataliza la
reduccin de los iones plata a plata metlica en presencia de otro agente reductor,
como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo
microscopio ptico. Se consigue as una sensibilidad comparable a la de las tcnicas
radiactivas.10 17
Mtodo en un paso[editar]
Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que
supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto
ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se
refiere, y aade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de
los anlisis de protenas de alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha
crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que
aumentaran la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto
requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una
"etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso
en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.
Anlisis[editar]
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de
aquellas que s se han unido a la protena de inters.
Deteccin colorimtrica[editar]
La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato
que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al
anticuerpo secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de
Deteccin radioactiva[editar]
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca
una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador
provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las
bandas de las protenas de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la
seguridad han provocado su desuso en los ltimos tiempos.
Deteccin fluorescente[editar]
En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de
stos que les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una
cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una
imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso
molecular o la cuantificacin proteica. La fluorescencia es considerada uno de los
mtodos de anlisis ms sensibles.
Exploraciones secundarias[editar]
Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa,
es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros
anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de
nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminacin de los anticuerpos,
permitiendo ms reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide
continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa,
el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser
usado. Adems, las membranas de PVDF tienden a ser ms delgadas y ms
resistentes a los daos durante su uso.
Aplicaciones[editar]
Investigacin[editar]
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la
biologa molecular.18
Diagnstico[editar]