Bioqumica II

Practica # 6
Enzimas Mitocondriales

Tern Olvera Mara Gabriela

3 semestre QFBt.

Yesica Lpez
Fecha de entrega: 14-11-2013.

Introduccin
Transporte Electrnico
La cadena de transporte electrnico (CTE) mitocondrial, que tambin se denomina sistema de
transporte electrnico, es un conjunto de transportadores electrnicos situados en la membrana
interna, en orden creciente de afinidad electrnica, que transfiere los electrones que proceden
de las coenzimas reducidas hasta el oxgeno.
Durante esta transferencia se produce una disminucin del potencial de oxidacin-reduccin.
Cuando el donador de electrones es el NADH y el oxgeno es el aceptor de electrones. Este
proceso, en el que se utiliza oxgeno para generar energa a partir de las molculas de
alimento, suele denominarse respiracin aerobia. La energa que se libera durante la
transferencia electrnica est acoplada a varios procesos endergnicos, de los que el ms
importante es la sntesis de ATP. Otros procesos que impulsan el transporte electrnico
bombean Ca2+ dentro de la matriz mitocondrial y generan calor en el tejido adiposo. Las
coenzimas reducidas, que proceden de la gluclisis, el ciclo del cido ctrico y la oxidacin de
los cidos grasos, son las principales fuentes de electrones.
La citocromo oxidasa, es un complejo proteico que cataliza la reduccin de cuatro electrones
del O2 para formar H20. El complejo que atraviesa la membrana en los mamferos puede
contener entre seis y trece subunidades, dependiendo de las especies. Puede contener
tambin dos tomos de cobre, adems de los tomos de hierro del hemo de los citocromos a y
a3. Los tomos de cobre se alternan entre los estados de oxidacin + I Y +2, Cu 1+ y Cu2+.
El tomo de hierro del cit a 3 est ntimamente asociado con un tomo de cobre denominado
CuB. El otro tomo de cobre (Cu A) se encuentra a corta distancia del hemo del cit a. El
citocromo c, una protena que est unida dbilmente a la membrana interna sobre su superficie
externa, transfiere los electrones de uno en uno al Cit a y al Cu A. Los electrones se ceden a
continuacin al cit a3 y al Cub, lo que se produce en el lado de la matriz interna de la membrana.
Durante cada reaccin redox secuencial de la CTE (cadena de transporte de electrones), un
electrn pierde energa. Durante la oxidacin del NADH hay tres pasos en los que la variacin
del potencial de reduccin es suficiente para sintetizar ATP. Las pruebas experimentales ms
recientes indican que aproximadamente se sintetizan 2.5 molculas de ATP por cada par de
electrones que se transfieren entre el NADH y el O 2 en la CTE. En la transferencia de cada par
donado por el FADH2 producido por la oxidacin del succinato se forman aproximadamente 1.5
molculas.
Las sustancias que se comportan como inhibidores competitivos, es decir, que reducen la
afinidad aparente de una enzima por el sustrato, suelen tener una estructura semejante a la del
sustrato. Entre estas molculas hay productos de reaccin o anlogos que no se metabolizan o
derivados del sustrato. La succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo del cido ctrico de
Krebs, cataliza una reaccin redox que convierte el succinato en fumarato. Esta reaccin est
inhibida por el malonato. El malonato se une al lugar activo de la enzima pero no puede
convertirse en producto.
La succinato deshidrogenasa no se encuentra dentro de la matriz mitocondrial, sino que est
firmemente unida a la membrana mitocondrial interna. La oxidacin de un alqueno requiere un
agente oxidante ms fuerte que el NAD+. La succinato deshidrogenasa es una flavoprotena
que emplea el FAD para impulsar la oxidacin del succinato a fumarato. La succinato
deshidrogenasa se activa por concentraciones elevadas de succinato, ATP se inhibe por el
oxalacetato. La enzima tambin se inhibe por el malonato, un anlogo estructural del succinato.

Cuadro 1- Muestras los componentes supramolecures de la cadena de transporte electrnico.

Material
Sustancias
10 Tubos de Ensayo

Buffer de Fosfatos 0,1M pH 7.4

2 Matraces Erlenmeyer de
PBS
Cianuro de Potasio
150ml
2 Vaso de Precipitado de
p-fenilendiamina
Succinato de Sodio
500ml
Azul de Metileno
1 Un mortero con mano
Aceite Mineral
Pipetas de 5ml
Agua Destilada
4 Pipetas de 2ml
5 Tubos de centrifuga (falcn)
1 Gradilla
Perilla
1 Piseta
Objetivo
Poder identificar algunas enzimas, como el citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa,
mediante el uso de sus aceptores electrnicos coloreados
Hiptesis
Con el uso de los aceptores electrnicos coloreados, podr identificar algunas enzimas con
citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa.
Material

Metodologa

Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa

Se preparar las siguientes soluciones

- Solucin salina de Fosfatos PBS (500ml) pH. 7.4
- Solucin de Cianuro de Potasio 0.05M (50ml)
- Solucin de p- fenilendiamina al 1% (100ml)
- Solucin de Succinato de Sodio al 1% (100ml)
- Solucin de Azul de metileno al 0.01% (100ml)
-Aceite Mineral (200ml
Se preparon los tubos como indica la tabla No. 1
Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas
Se tom una muestra de aproximadamente 5g de tejidos heptico,
limpio.
Se coloc en un mortero con arena lavada y se macer cuidadosamente
hasta formara una masa suave adicionando el PBS hasta completar un
volumen de 15ml
Se pas la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y se mantuvo en el
refrigerador por 15minutos, Se pas a los tubos y se centrifugo a
1500rpm por 10 minutos. Se tranfirio el sobrenadante a otro erlenmeyer
de 150ml.
Nota: Se mezcl bien el contenido de cada tubo y se incub a 37
C apareciera el complejo coloreado.

Reactivo (ml)

PBS

1.0

1,0

1,0

1,0

Cianuro de Potasio 0.05 M

0.0

0.0

1.0

0.0

Agua Destilada

2.0

1.0

0.0

0.0

Extracto Enzimtico

1.0

1.0

1.0

1.0

p-fenilendiamina

0.0

1.0

1.0

1.0

Tabla.1- Preparacin de los tubos

Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Tabla.1-Modo de preparacin de los tubos

Reactivo (ml)
B
1
2
3
4
Tabla.2-Modo de preparacin de los tubos
PBS los tubos segn las
3.0indicaciones2,5
2,02.
1,5
1.0
Se preparon
de la tabla No.
Succinato
%0.0 enzimtico,
1.0 y se dejo 1.0
1.0 C durante
1.0
Nota: Sodio
Antes se agreg el extracto
incubando a 37

10 minutos, y sin retirarlos del bao se agreg el extracto enzimtico,

inmediatamente se agit bien y se coloc el aceite mineral .
Azul de Metileno
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
%0.0 Resultados
0.0

Malonato de Sodio

0.0

0.0

1.0

Extracto Enzimtico
1.0
0.5
1.0
1.5
1.0
Aceite Mineral Se tom el 1.0
1.0
1.0 hasta que
1.0cambie de
1.0
tiempo en el extracto
enzimtico

coloracin.

TABLA.1
Reaccin catalizada por la citocromo oxidasa

Observaciones
Cuando se agreg las diferentes soluciones
de PBS, cianuro de potasio,
pfenilendiamina y el extracto enzimtico a
cada uno de los tubos, hubo ciertos cambios
de coloracin en algunos tubos:
Blanco: Es transparente
Tubo 1: Present un color rosa claro
Tubo 2: Es transparente
Tubo 3: Present un color caf claro

Reaccin catalizada por la succnico

deshidrogenasa

Al llevar los cuatro tubos a bao mara

algunos tubos experimentaron cambio de
coloracin:
Blanco: Es transparente
Tubo 1: Present una coloracin moradopastel con un aspecto como de leche
cortada.
Tubo 2: Present una coloracin moradopastel muy tenue, adems de ser
homognea.
Tubo 3: Se presentaron dos capas con una
coloracin morada-pastel, la primera tiene
una apariencia de leche cortada y la ltima
capa homognea del mismo color, sin ningn
precipitado.
Observaciones

Cuando se agreg el PBS, succinato de sodio,

azul de metileno, extracto y enzimtico y
aceite, tom una coloracin azul y en todos
los tubos se precipito el aceite mineral.
Nota: Se agreg el aceite mineral antes de
haberse incubado a 37C.

Despus de 45 minutos, se observ cierto

cambios de coloracin en algunos tubos:
Blanco: No hubo cambios de coloracin, se
conserv el color azul agua y se precipit el
aceite.
Tubo 1: Hubo un cambio, su coloracin fue
azul rey, transparente, se precipit el aceite.
Tubo 2: Hubo un cambio, su coloracin fue
azul rey muy ligero, transparente, se precipit
el aceite.
Tubo 3: Hubo un cambio, su coloracin fue
azul rey, transparente, se precipit el aceite.
Tubo 4: Hubo un cambio, su coloracin fue
azul rey, transparente, se precipit el aceite.

B
3

TABLA.2

Discusin
En el cuadro tres, cuando se prepararon los tubos, hubo cambios de coloracin muy leves, al
tubo que contena p-fenilendiamina, mostr una coloracin rosa claro y el tercer tubo mostro
una coloracin caf claro cuando se agregaron las sustancias de la tabla 1, tom una
coloracin caf claro, esto pudo ser porque pudo haber reaccionado la p-fenilendiamina con el
PBS.
Al llevar los tubos a bao mara, experimentaron cambios es su coloracin y en su aspecto.
Cuando se compara con la muestra blanco, se observ en el tubo una coloracin moradapastel con un aspecto de leche cortada, por lo que la reaccin de p-fenilendiamina con el
extracto enzimtico (tejido heptico), esto sucede, porque ocurre una reaccin de redox,
oxidando la fenilendiamina, y as se puede determinar as la presencia del citocromo oxidasa.
En el tubo dos, se present una coloracin homognea morado-pastel, el cul explica (2005,
Castro N.G.A. y Moreno S.R.) que el complejo de citocromo oxidasa, son inhibidas por el
cianuro de potasio y el malonato, debido por la translocacin de los protones, que hace que
nos d ese aspecto de con un aspecto de leche cortada.
Conforme a los resultados obtenidos del cuadro cuatro, cuando se agregaron las sustancias
correspondientes a la tabla dos, nicamente hubo un cambio de coloracin al agregar el azul
de metileno, dndole una coloracin azul agua. Un error cometido, fue que se agreg el aceite
mineral antes de incubarse, por lo tanto no ocurri la reaccin. Segn lo reportado en otros
equipos a los cuarenta y cinco minutos, se pudo apreciar un cambio de coloracin a un azul
ms intenso, por lo que les resulto la prueba catalizada por succnico deshidrogenasa. Algo que
cabe mencionar, que el H2 cedido de por el succinato puede ser transferido al FADH 2 al azul de

metileno cambia su estado de redox, en donde primeramente se oxida y despus se reduce,

tomando as una coloracin ms intensa o en donde puede llegar a veces a ser incolora.
Conclusin
Se pudieron identificar las enzimas citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa, mediante
las reacciones de aceptores electrnicos coloreados, usando un mtodo cualitativo,
observndose cambios de coloracin y se identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias
como el cianuro de potasio y p-fenilendiamina, sobre este sistema enzimtico.

Cuestionario
1.- Qu es una enzima y cules son sus caractersticas?
Es catalizador de origen biolgico y naturaleza proteica, de alto peso molecular y conformacin
tridimensional caracterstica, acelera la reaccin al disminuir la energa de activacin.
Caractersticas
Las enzimas catalizan la formacin o rotura de enlaces covalentes
Su elevada especificidad es su mayor caracterstica.
Actan en baja concentracin; No se necesita gran cantidad de ellas para realizar la
accin de manera eficiente, ya que son activas a concentraciones pequeas.
No sufren modificaciones durante la reaccin; su composicin y forma no son
transformadas en ninguna parte de la reaccin, se recuperan intactas.
No afectan el equilibrio de la reaccin, pero si su velocidad, debido a que su trabajo es
catalizar la reaccin.
Son sumamente especficas; tienen un trabajo especfico y solo son usadas para ello,
su actividad est regulada y actan en el mismo lugar donde se segregan.
Son molculas estrictamente proteicas; Son Protenas Globulares que regulan la mayor
parte de las reacciones metablicas de los seres vivos, debido a esto las enzimas
sufren desnaturalizacin, no dializan y sufren saturacin.
Lo sintetizan tanto los seres Auttrofos como Hetertrofos.
Pueden actuar a nivel intracelular o extracelular, dependiendo de la reaccin.
2.- Qu caractersticas tienen las enzimas mitocondriales?
Son responsables de la oxidacin de cidos grasos, transportes de electrones y sntesis de
ATP.

3.- Describa algunas enzimas presentes en el ciclo de Krebs.

Citrato sintetasa: Condensa el acetil CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato.
Acotinasa: Cataliza la transformacin intermedia del cido tricarboxilico cis-aconitato, que
normalmente no se disocia del centro activo.
Isocitrato deshidrogenasa: Cataliza la descarboxilacin oxidativa del isocitrato dando lugar a
la formacin de, -acetoglutarato.

-Acetoglutarato deshidrogenasa: Esta enzima hace una descarboxilacin oxidativa por

la que el, -acetoglutarato se convierte en succinil-CoA.
Succinil-CoA sintetasa: Es la enzima que cataliza esta reaccin reversible, en donde indican
la participacin de un nuclesido trifosfato en la reaccin.
Succinato deshidrogenasa: Es una flavoprotena que oxida el fumarato a partir de succinil
CoA.
Fumarasa: Cataliza la hidratacin reversible del fumarato a l-malato.
L-malato deshidrogenasa: La enzima L-malato deshidrogenasa ligada NAD, cataliza la
oxidacin del L-malato deshidrogenasa.
4.- Describa estructuralmente el ciclo de Krebs

5.- Qu funcin tiene el citocromo Oxidasa y Succinato Deshidrogenasa?

Citocromo Oxidasa: Cataliza la transferencia de electrones al oxgeno para dar agua
constituye lo que se conoce como complejo 4 de la cadena de transporte electrnico y est
presente en todos los organismos aerobios.
Succinato Deshidrogenasa: Ocurre en tres pasos: primeramente oxidacin, hidratacin y
segunda oxidacin. Estos tres pasos cumple la funcin de regenerar oxalacetato, permiten la
extraccin de energa mediante la formacin de FADH2 y NADH. Formando fumarato.
6.- Cul es la funcin de observar la cintica enzimtica.

La cintica enzimtica permite:

Distinguir unas enzimas de otra.
Distinguir entre isoenzimas
Conocer las diferencias entre la actividad en un tejido o en otro.
Permitir conocer su afinidad con el sustrato.
Bibliografa
Mckee T, Mckee James. (2003).Bioqumica la base molecular de la vida, 3 Edicin, Mc
Graw Hill, pg. 304-307, 311-320.
Nelson D.L. y Cox M.M. (2005). Lehninger Principios de Bioqumica. 4 edicin.
Omega.pg. 608-613.
lvarez S. al. (1994). La mitocondria: estructura, funcin y especies reactivas del
xigeno, Antioxidantes y Calidad de Vida 1994;1:26.
Recuperado 11 de noviembre del 2013:
http://computo.sid.unam.mx/Bioquimica/PDF/2005/03/j_104-105_ProblemaBioq.pdf
Recuperado 11 de noviembre del 2013:
http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/#inhibicin enzimtica
Recuperado 11 de noviembre del 2013:
http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa.htm