APLICACIONES PCR

Aplicaciones de la PCR
- Clonar un gen (molde ADN o ARN)

- Secuencia conocida
- Genes homlogos en especies prximas (primers degenerados)
- Informacin de secuencia proteica (primers degenerados)
- Rastreos de genotecas en pools
- PCR inversa para clonar gen completo
- Herramienta en construcciones plasmdicas
- Anlisis de recombinantes y eventos infrecuentes en el ADN
- Mutagnesis in vitro
- Corte y ligacin de fragmentos de ADN in vitro
- Construccin de genes sintticos o fragmentos in vitro
- Conocer la CDS de un gen, localizar los intrones, (RT-PCR)
- Detectar expresin de un gen, semicuantitativo, (RT-PCR)
- Real Time, PCR cuantiativa, (RT-PCR)
- Clonar extremos 5 y 3 de un transcrito: RACE, (RT-PCR)
- Diagnstico e identificacin
- Tipado, clasificacin, taxonoma (RAPDs, AFLPs, SSRs, SNPs, etc)
- Aplicaciones forenses

RT-PCR
- Esencialmente es una reaccin de sntesis de cDNA ms una PCR con primers
especficos para amplificar un fragmento a partir de un ARN mensajero
- Tres tipos de primer para sntesis de cDNA
- Oligo dT: sntesis de cDNA inespecfica, el primer antisentido puede ser el
poli-T u otro especfico
- Primer especfico: el primer antisentido puede ser el mismo que el de la
reaccin de sntesis de cDNA u otro situado ms hacia 5 del transcrito
- Hexanucletidos al azar: se obtienen diversos fragmentos de distinto
tamao en la reaccin de la primera heba de cDNA
- Suelen obtenerse fragmentos de cDNA del transcrito, quedando fuera el extremo 5 y
a menudo el 3. Para amplificar el cDNA hasta los extremos 5 y 3 del transcrito se
utiliza la tcnica RACE.

RT-PCR

5 y 3-RACE
RACE: Rapid amplification of
cDNA ends
Nos permite conocer el sitio de inicio
de la transcripcin de un gen y las
secuencias 5UTR y 3UTR

PCR en tiempo real

- Es una RT-PCR en la cual no se detecta cuanto cDNA se acumula al final, sino que se va
midiendo de continuo para determinar en que ciclo de la PCR se alcanza un valor umbral.
Cuanto antes se alcance (nmero de ciclos ms bajo) mayor ser la concentracin inicial
del ARNm. Por comparacin con un control (gen de expresin constitutiva) pueden
determinarse las diferencias
de expresin de un gen en diferentes
tejidos, condiciones, poblaciones, etc.
CT: Threshold cycle. Ciclo en el cual
un incremento significativo de Rn es
detectado por primera vez
Rn+: Intensidad emisin en reacciones
Rn-: Intensidad emisin en controles
sin molde
Rn: Rn+ - Rn-

PCR en tiempo real

La cantidad de DNA se detecta mediante una sonda especfica que hibrida
con los fragmentos de DNA que se van amplificando y que lleva incorporado
un fluorocromo en su extremo 5. En cada ciclo de amplificacin la sonda
emite fluorescencia cuando es desprendida por la polimerasa, la cual es
detectada mediante lser por el termociclador. Este sistema detecta
especficamente la amplificacin de un determinado gen.
Tambin puede utilizarse SYBR green, que se une inespecficamente a
cualquier DNA que se est amplificando

PCR en tiempo real

Deteccin y clonacin de productos de PCR

El resultado de una PCR se visualiza en geles de agarosa o poliacrilamida dependiendo
del tipo de experimento y el nmero de bandas esperado
Para comprobar si se ha amplificado el fragmento correcto hay varios mtodos: Digestin
mediante enzimas de restriccin, secuenciacin, hibridacin, nueva PCR con otros
primers interiores.

Clonacin de fragmentos de ADN amplificados por PCR

- Ligacin de extremos
romos cuando se usa
Pfu o Pwo.

Clonacin de fragmentos de ADN amplificados por PCR

- La utilizacin de primers con una secuencia
diana para una enzima de restriccin en su
extremo 5 se usa como sistema de clonacin
eficiente de productos de PCR. Tiene adems
otras aplicaciones en tcnicas de ingeniera
gentica, construccin de plsmidos, etc.

Corte y ligacin de fragmentos: PCR recombinante

Corte y ligacin de fragmentos: PCR recombinante

- En este ejemplo se eliminan mediante PCR los intrones de un gen (I-1 y I-2)
- La parte 5 de los primers 1 y 6 contiene sitios de corte para enzimas de restriccin para
facilitar su clonacin
- La parte 5 de los primers 2, 3, 4 y 5 contiene secuencias pertenecientes al exn del otro
lado del intrn correspondiente.
- Se amplifican primero los fragmentos 1-2, 3-4 y 5-6 por separado
- Se mezclan los productos 1-2 y 3-4 y amplificando con los primers 1 y 4 se obtiene el
fragmento 1-4
- El producto final, 1-6, se obtiene mezclando 1-4 y 5-6 y amplificando con primers 1 y 6

- Clonacin

mediante PCR

- Primers degenerados, diseados a partir de:

- Genes homlogos de otras especies
- Secuencia aminoacdica obtenida a partir de la protena
Si con la secuencia aminoacdica se ha logrado identificar en las bases de
datos de que protena se trata, se hacen bsquedas para encontrar
secuencias de genes y protenas homlogas y se alinean para localizar
regiones conservadas.

- Clonacin

mediante PCR. Primers degenerados

- Clonacin

mediante PCR. Primers degenerados

CCN GCN GAR TTY GTN ATH GTN AAY CCN AAY AAR
GGN CGN CTY AAR CAN TAD CAN TTR GGN TTR TTY
P
A
E
F
V
I
V
N
P
N
K
GGC
GGC
GGC
GGA
GGA
GGT
GGT
GGT
GGT
GGA
GGT

CAA
CAA
CAA
CGA
CGA
CGA
CGA
GCA
CGA
CCA
ATA

CTC
CTC
CTC
CTT
CTT
CTT
CTT
CTT
CTC
CTC
CTT

GAC
GAC
GAC
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
AAG

AAT
AAT
GAT
CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
AGT
GTG

TAT
TAT
TAT
CAC
CAC
CAC
CAC
CAC
CAA
CAC
TAA

CAT
CAT
CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
CAC
CAC
CAC

TTG
TTG
TTG
TTA
TTA
TTA
TTA
TTA
TTA
TTA
TTG

GGC
GGC
GGT
GGT
GGT
GGT
GGT
GGT
GGT
GGA
GGC

TTG
TTG
GTT
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG

TTC
TTC
TTC
TAA
TAA
TAA
TAA
TAA
TTT
TTC
GCT

GGA CGA CTT AAA CAA TAT CAA TTA GGT TTG TTA
T
C
G
T
A
T
G
C
C
C
C
A

5-AT AAC AAA TTC AGC AGG-3

C
T
C
5-AC TAT AAC AAA TTC AGC-3
A
C

Ara
Ara
Bra
Lat
-Pisum
-Lens_cul
-Lens
-Euph
Cic
Gly
Ara

- Clonacin

mediante PCR. Primers degenerados

Nested PCR

- PCR

inversa

- Para clonar por PCR las

regiones adyacentes a
una regin previamente
clonada y secuenciada