UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SAN LUIS POTOS

Facultad de Ingeniera
Ingeniera Ambiental

Reporte 10: Extraccin

de ADN vegetal
LABORATORIO DE CIENCIAS AMBIENTALES III
Profesor: Cristbal Aldama Aguilera
Alumno: Saul Ortiz Almendariz

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Laboratorio de Ciencias Ambientales 3

INTRODUCCIN
El cido desoxirribonuclico (DNA) es un polmero que tiene la capacidad de almacenar y
transmitir informacin gentica. Este polmero est compuesto por cuatro tipos de
nucletidos (adenina, guanina, citosina y timina) unidos entre ellos por enlaces fosfodister;
cada nucletido estructuralmente contiene un grupo fosfato, una base nitrogenada (purina o
pirimidina) y un azcar desoxirribosa (Figura 1). En plantas, la biosntesis de nucletidos
de purina ocurre en el citoplasma. La forma predominante del DNA es una doble hlice
dextrgira, antiparalela, en la cual las bases nitrogenadas se aparean por dos o tres puentes
de hidrgeno: A=T; GT. sta hlice tiene direccionalidad 5'-3'. Adems del DNA nuclear,
en plantas encontramos DNA en mitocondrias y cloroplastos, estos genomas circulares,
pequeos codifican protenas importantes para el funcionamiento del organelo y el
mantenimiento de su material gentico. La expresin del genoma de organelos como la
mitocondria y el cloroplasto tambin se encuentra bajo control fino del genoma nuclear. En
plantas, existen mecanismos regulatorios que coordinan la expresin de genes nucleares, de
mitocondria y de cloroplasto que permiten la sntesis de protenas que funcionan en
organelos citoplsmicos. En esta prctica se aplicar una tcnica de rutina para la
extraccin de DNA vegetal empleando un detergente inico SDS (dodecilsulfato sdico).
OBJETIVOS

Conocer la tcnica de extraccin del DNA de muestras vegetales y electroforesis en gel para
su visualizacin.
Comprender el uso de las soluciones y reactivos utilizados para lograr la extraccin de DNA
vegetal
Obtener DNA de tejido vegetal empleando el mtodo de extraccin basado en SDS.
Discutir algunas aplicaciones de la extraccin de cidos nucleicos.

FUNDAMENTO
Los detergentes son molculas anfipticas que rompen la membrana al intercalarse dentro de las
bicapas fosfolipdicas y solubilizan lpidos y protenas en la clula. De esta forma se libera el
contenido celular. La sal (EDTA) permite que el DNA precipite en una solucin fra de alcohol y
que las cadenas de DNA no se corten.
MATERIALES Y EQUIPOS
Tubos eppendorf de 2 ml
Micropipetas de 100 y 1000 l
Puntas para micropipeta de 100 y 1000 l
Mortero
Nitrgeno lquido
Microcentrfuga
Vortex
Termoblock
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SOLUCIONES Y REACTIVOS
Material vegetal
Buffer de extraccin SDS (Tris-HCl 0.2M pH 8.0, NaCl 0.25M, EDTA 0.025M, SDS 0.5%)
Cloroformo
Fenol Cloroformo-Alcohol isoamlico (25:24:1)
Isopropanol (previamente enfriado a -20C)
Etanol al 70% (previamente enfriado a -20C)
Agua destilada estril
PARA ELECTROFORESIS EN GEL
Gel de agarosa 1%
Bromuro de Etidio
Buffer de carga
Marcador de peso molecular
TAE 1x
Termociclador
Fotodocumentador UV
Cmara de Electroforesis

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Figura1. Moler finamente el material vegetal en un mortero con nitrgeno lquido

Figura 2. Colocar aproximadamente 200 mg de material vegetal molido en un tubo eppendorf.

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Figura 3. Agregar 800 l del buffer de extraccin SDS. Mezclar en vortex.

Figura 4. Mezclar en vortex.

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Figura 5. Colocar la muestra en termoblock a 65C por 15 minutos. Centrifugar a 12,000 rpm
en microcentrfuga por un lapso de 10 minutos.

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Figura 5.
1. Recuperar fase acuosa y transferir a un
tubo nuevo.
2. Agregar dos volmenes de fenol,
cloroformo, alcohol isoamlico y un
volumen de isopropanol fro. Colocar en
refrigeracin a -20C por 10 minutos.
3. Centrifugar a 12,000 rpm durante 15
minutos. Una vez centrifugado, descartar el
sobrenadante.
4. Adicionar 1000 l de etanol al 70%.
5. Centrifugar 12,000 rpm por 5 minutos. Una
vez centrifugado, descartar el sobrenadante
y secar la pastilla a temperatura ambiente.
6. Una vez seca, resuspender la pastilla en 100
l de agua estril. Almacenar a -20C hasta
su utilizacin.

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Figura 6. La electroforesis de ADN es til para comparar patrones de bandas de diferentes

muestras biolgicas. El medio de separacin para esta prctica es un gel de agarosa, derivado de
las algas. Se debe disolver el gel en un buffer tris-borato-EDTA. Se homogeneiniza con agitacin
e incremento de temperatura. La utilizacin de marcadores nos permitir calcular los pesos
moleculares como el agente intercalante Bromuro de Etilo.
Cuando la temperatura disminuya, se obtiene la gelificacion y el resultado ser un polmero,
cuyos poros tendrn un tamao dependiente de la concentracin de agarosa presente y es
importante ya que el gel se comporta como un tamiz que permite separar molculas en funcin
de su tamao y forma. As molculas de ADN de diferente tamao van a migrar de forma
distinta. Esta imagen muestra una cmara de electroforesis, sitio donde deber gelificarse la
solucin de agarosa. Mientras este en estado lquido, ubicamos el peine, para que nos
proporcione los huecos donde colocaremos la muestra. Al gelificar se retira el peine del
polmero. El punto de partida seran los orificios de cada una de las muestras y guiaran los
carriles por donde viajaran gracias al paso de corriente.

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Figura 7. El buffer de carga lo cual da peso a la muestra para que el ADN precipite al fondo de los
pozos de siembra e identificar el efluente de corrido. Habra una relacin de muestra con buffer
de carga. Para cada gota con ayuda de micropipeta se suspende la muestra aspirando y
depositando varias veces para despus llevar al pozo.

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Figura 8. Se conecta las terminales con voltaje y se logra ver como la banda se mueve a travs del
gel. Aqu son sometidas a un campo elctrico y atrados hacia el polo opuesto a su carga neta. La
aceleracin impuesta por la fuerza elctrica es igual para cualquier molcula de cido nucleico.
La diferencia en velocidad de migracin esta dada por la forma y tamao de la molcula de ADN.

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Figura 9. Observamos como ha migrado las banda y se observa la luminosidad con luz
ultravioleta. La relacin de bromuro de etidio con ADN nos permite apreciar la fluorescencia. La
intensidad est relacionada con la cantidad de cidos nucleicos. El espectrofotmetro tiene la
capacidad de proyectar una haz de luz monocromtico de longitud de onda particular a travs de
una muestra y medir la cantidad de luz absorbida por la muestra. Esto permite obtener
informacin, midiendo la absorbancia a distintos largos de onda y graficando esos valores en
funcin de largo de onda. Formando un espectrograma. Nuestro blanco es el buffer, sustancia en
la que se encuentran disueltas nuestras muestras de ADN, la idea es que sus niveles de
absorbancia no interfieran con la medicin de material gentico.
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REPORTE

1. Cul es el papel del SDS (dodecilsulfato sdico) en la extraccin de DNA?

Diferentes formas de sodio se utilizan para la extraccin de ADN. Dodecil sulfato de sodio, o SDS.
es una sal de sodio que contiene detergente.
Los detergentes se utilizan para romper las paredes y membranas celulares.
2. Por qu recuperamos la fase acuosa en el paso 5?
En este paso se siguen destruyendo las protenas (debido a la presencia del fenol).
2. Por qu se tie el gel de agarosa cargado de DNA, con bromuro de etidio?
En la electroforesis en geles de agarosa, las molculas de ADN lineales migran segn su tamao y
se pueden visualizar mediante tincin. Los geles son teidos con diferentes colorantes para
visualizar el ADN. Los ms comunes son: el bromuro de etidio y el nitrato de plata.
El proceso de coloracin de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarse
entre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposicin con rayos ultravioleta. Su
sensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matriz
en el que se est visualizando.
4. Mencione algunas de las aplicaciones de la extraccin de DNA de cualquier
organismo en ingeniera ambiental.
La comparacin de vegetacin sana y vegetacin enferma, para la identificacin de cidos nucleicos
de agentes infecciosos o para la obtencin de un fragmento determinado de ADN, que una vez
localizado en el gel puede ser analizado para investigaciones posteriores.
Algunos microorganismos juegan un papel importante como indicadores de contaminacin, y otros
participan en gran medida en el tratamiento biolgico de residuos lquidos y slidos. Identificar
cidos nucleicos puede ayudar a potenciar resultados de ingeniera biolgica.

BIBLIOGRAFA
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis%2038.pdf
http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdf
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