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INTRODUO

A caracterizao de protenas pode ser realizadas de vrias maneiras,


porm, apenas duas formas sero o embasamento para o relatrio:
caracterizao por reaes de colorao e reaes de precipitao[1]. A
caracterizao por meio da colorao pode ser analisada atravs da reao
com a ninhidrina e da reao com o Biureto.
A reao com a ninhidrina resulta em um produto de cor violeta, tanto
para protenas como aminocidos[2]. Nesta reao, duas molculas de
ninhidrina reagem com a molcula do aminocido ou protenas,
estequiometria da reao 2:1. Alm do produto formado (cor violeta), h a
formao de molculas de gua e dixido de carbono (gs carbnico). A
reao desta caracterizao est descrito no esquema a seguir:

R
H3N

HO

H
+

HO

O
R

3 H2O + 3

HO
O

Esquema 1: Reao do aminocido com a ninhidrina.


A reao com Biureto ocorre necessariamente com protenas, pois
identifica ligaes peptdicas[3]. A protena reage com o reativo de
Biureto, uma mistura da soluo de sulfato de cobre com hidrxido de
sdio que possui colorao azul, e forma um complexo violeta. A figura do
complexo formado mostrada em seguida:

Figura 1: complexo violeta formado atravs da reao de Biureto


Nas reaes de caracterizao atravs da precipitao pode ocorrer com
desnaturao ou sem desnaturao da protena. A desnaturao da protena
faz com que esta perca sua funo ativa, ou seja, sua atividade biolgica.
As reaes de precipitao com desnaturao ocorrem atravs do calor
e de cidos fortes. O calor aumenta a energia do sistema e quebra as
ligaes fracas. J a presena de cidos fortes, rompe a ponte salina (NH 3+
----- -OOC )e ocorre a protonao na carboxila, eliminando as ligaes
eletrostticas.

As reaes de precipitao sem desnaturao ocorrem atravs da adio


de sais, adio de solventes orgnicos (etanol e acetona) e do ponto
isoeltrico. A adio de sais provoca os efeitos de salting-ine de salting-out,
que aumenta a solubilidade da protena e diminui a solubilidade
respectivamente. Para explicar melhor, o efeito de salting-in ocorre at a
presena de uma concentrao do sal no qual a solubilidade da protena ir
aumentar. Ao ultrapassar essa concentrao, surge o efeito salting-out, no
qual os ons do sal iro solvatar a protena diminuindo a fora eletrosttica
das cargas das protenas e como consequncia, uma menor solubilidade e a
precipitao da protena.
A adio de solventes orgnicos na protena interfere na fora
eletrosttica da protena, que est eletricamente carregada.

F=

q 1 q 2
2
r

EQUAO I

Onde:
F = fora eletrosttica
q1 e q2 = cargas de interao
= constante dieltrica
r = distncia entre as cargas
Cada solvente possui uma constante dieltrica especfica, que interfere
no estado fsicoda protena. Enquanto a constante dieltrica da gua 80, o
valor da constante dieltrica do etanol, um solvente orgnico, 30.
Analisando a equao I, pode-se concluir que um solvente com maior
constante dieltrica diminua fora eletrosttica entre as cargas na protena,
solubilizando-a e como consequncia uma aparncia lquida. J no caso do
etanol, h um aumento da fora eletrosttica, ou seja, uma aproximao
das protenas e por seguinte a precipitao desta.
1. OBJETIVOS
Os objetivos para o experimento caracterizao de protenas por meio
de reaes de colorao e precipitao so:

Caracterizar a presena de protenas em material biolgico;


Demonstrar as reaes de colorao para protenas;
Relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades
gerais. Estrutura e isolamento de protenas.

2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1

REAGENTES

Soluo de protenas a 10%

Soluo de ninhidrina 0,1%


Hidrxido de sdio (NAOH) 2,5 mol/L
Soluo de sulfato de cobre a 1%
lcool etlico absoluto
Soluo saturada de sulfato de amnio ((NH 4)2SO4)
Soluo de cido tricloroactico (TCA)

3.2 MATERIAIS

Bquer de 50 mL
1 pipeta Pasteur
3 pipetas de 1 mL
4 pipetas de 5 mL
7 tubos de ensaio
Bquer de 250 mL
Basto de vidro
Trip e tela de amianto
Bico de Bunsen
Fsforo

2.3
PROCEDIMENTO
2.3.1 Reaes de colorao
A: Reao com a Ninhidrina
Em um tubo de ensaio (Tubo 1), adicionou-se 2 Ml de ninhidrina e 5
gotas de protenas a 10%. Aps a adio, manteve-se o tubo em banhomaria por 5 minutos a uma temperatura de 100C.
B: Reao de Biureto
Para esta reao, utilizou-se dois tubos. No primeiro, tubo 2, foram
adicionados 1 mL de protenas a 10%, 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas
de sulfato de cobre a 1%. No segundo tubo (Tubo 3), denominado branco,
adicionou-se 1 mLdegua destilada, 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de
sulfato de cobre a 1%.
2.3.2 Reaes de precipitao
A: Reao com solventes orgnicos
Em um tubo de ensaio (Tubo 4), adicionou-se 1 mL de protenas a 10%
e 3 Ml de lcool etlico (solvente orgnico).
B: Efeito da adio de sais
Colocou-se em um tubo de ensaio (Tubo 5) 2 mL de soluo de
protenas. Pelas paredes do tubo, adicionou-se 2mL da soluo saturada de
sulfato de amnio.

Aps observar e anota o resultado, adicionou-se 2 Ml de gua


destilada ao tubo e, atravs de um papel alumnio, misturou-se a soluo
por inverso.
C: Precipitao por cidos fortes
Da soluo de protenas foi coletado o volume de 1mL e colocado em
um tubo de ensaio (Tubo 6). Neste mesmo tubo, foram adicionados 0,5 mL
da soluo de cido tricloroactico e 0,5 mL de gua destilada.
D: Precipitao pelo calor (desnaturao)
Em um tubo de ensaio (Tubo 7) foi colocado 5 mL da soluo de
protenas. Este tubo foi levado a um banho-maria fervente por 5 minutos.
Retirou-se o tubo e avaliou-se os resultados.
3. RESULTADOS E DISCUSSO
Na reao de Ninhidrina, caracterizada pelo tubo 1, observou-se a
formao de um produto com colorao roxo escuro/azulado, explicada pela
reao do Esquema 1.
J no tubo 2, observou-se uma colorao lils claro, caracterizando
um resultado positivo para o teste, essa molcula pode ser observada na
Figura 1. Assim, o tubo 3 preparou-se a fim de identificar a diferena das
cores para resultados positivos e negativos. Nesse tubo, obteve-se uma cor
azul claro, j que no foi adicionada a protena, no ocorrendo a reao de
Biureto.
No tubo 4, onde obteve-se uma reao com solventes orgnicos, o
mesmo pode-se observar a formao de um precipitado branco. Isso se d
por uma reao sem desnaturao da protena, o mesmo referente ao tubo
5, que ao adicionar soluo saturada de (NH 4)2SO4 teve um precipitado na
interface, no misturando-se e obtendo-se a diminuio da solubilidade da
protena (Salting-out). Porm, com a adio de gua, o precipitado formado
anteriormente desapareceu, devido ao efeito de salting-in.
Referente ao tubo 6, aps a adio de gua em cido tricloroactico
(TCA), obteve-se outro precipitado branco. Esse efeito caracteriza-se por
precipitao com desnaturao da protena.
Outra desnaturao da protena pode ser observado no tubo 7,
quando o recipiente, contendo as substncias, foi levado a banho-maria por
aproximadamente 5 minutos e conseqente formao de um precipitado
branco tambm.
Todos os tubos 4, 5, 6 e 7 tiveram a presena de um precipitado
branco, confirmando a presena de protena nas composies, ou seja,
representando testes positivos em ambos os experimentos. J nos tubos 1 e
2 os testes positivos tambm estiveram presentes, porm, com a presena
da mudana de coloraes.

4. CONCLUSO
Com a realizao dos experimentos, pode-se concluir sucesso na
realizao da prtica, j que foram observados mudanas de coloraes e
precipitados, como o esperado. Com isso, a presena de protena nos
variados tubos, foram confirmados devido aos testes de: Reao da
Ninhidrina, Reao de Biureto e das precipitaes de protenas atravs de
solventes orgnicos, adio de sais, cidos fortes e de desnaturao por
calor.
5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] - Lvia Bracht. Apostila
experimental. 2015. Pg 9 10.

de

aulas

prticas:

Bioqumica

[2] - Oliveira, D. B. Determinao de aminocidos totais em amostras


de plantas empregando multicomtao.2005. Dissertao (Mestrado)
Universidade de So Carlos, Centro de Cincias Exatas de Tecnologia,
Departamento de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Qumica.Pg 1316.
[3] Almeida, V. V.; Canesin, E. A.; Suzuki, R. M.; Palioto, G. F. Anlise
qualitativa de protenas em alimentospor meio de reaode
complexao do on cprico. Qumica Nova na escola, Vol. 35, N 1,2013.
Pg 34-40.

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