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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

AGUSTN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA
QUMICA

GUA DE PRCTICA
BIOQUMICA APLICADA

AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
Mg. Liz Andrea Gutierrez
Quequezana
Mg. Jakeline Zanabria Galvez

AREQUIPA PER
2012

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Gua de Prctica con el objeto


de hacer llegar al interesado los alcances actuales de la bioqumica
aplicada en el laboratorio.
Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano
tienen como base el desarrollo de la biologa molecular, lo que a su
vez ha generado el desarrollo de la bioqumica como consecuencia
natural.
La aplicacin de los nuevos conocimientos de la bioqumica han
determinado el gran impulso que la bioqumica aplicada ha dado a la
nueva tecnologa de los bioprocesos.
Todos los avances de la biotecnologa tienen como sustento el
conocimiento previo de la biologa y de la bioqumica aplicada.
La presente Gua de Prcticas brinda a los estudiantes de
Ingeniera Qumica las destrezas bsicas para el empleo de los
diferentes instrumentos requeridos para el estudio prctico de la
bioqumica.

Los Autores

NDICE
PROLOGO
NDICE
PRCTICA

.............................................................................
DETERMINACIN
ESPECTROFOTOMTRICA
PROTENAS.

1:
DE

PRCTICA

2:
.............................................................................
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR
DILISIS.

PRCTICA

3:
.............................................................................
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICROKJELDAHL.

PRCTICA

4:
.............................................................................
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE
AMINOCIDOS.

PRCTICA

.............................................................................
REACCIONES
DE
IDENTIFICACIN
CARBOHIDRATOS.

5:
DE

PRCTICA

6:
.............................................................................
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS
DE LAS PROTENAS.

PRCTICA

7:
.............................................................................
METABOLISMO
DE
CARBOHIDRATOS:
FERMENTACIN.

PRCTICA

8:
.............................................................................
INMOBILIZACION
DE
ENZIMAS
Y
CELULAS.
PRODUCCION DE ETANOL POR Saccharomyces
cerevisiae INMOVILIZADA.

PRCTICA

PRCTICA

PRCTICA

PRCTICA

.............................................................................
EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES.

9:

10:
.............................................................................
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA.
.............................................................................
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.
.............................................................................
EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO.

11:

12:

PRCTICA 1
DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE
PROTENAS
I.

OBJETIVO
Determinar la concentracin de una solucin de protenas
mediante la reaccin de Biuret y el espectrofotmetro

II.

FUNDAMENTO:

La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar


mediante la reaccin del Biuret. El reactivo Biuret contiene
CuSO4 en solucin alcalina. La reaccin se basa en la formacin
de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un
complejo de coordinacin entre los iones Cu (+2) y los pares de
electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los
enlaces peptdicos.

Los compuestos que contienen 2 o ms enlaces peptdicos


producen un color violeta
Caracterstico con soluciones diluidas de sulfato de cobre
(CuSO4) en solucin alcalina.
El color se debe al compuesto de coordinacin formado al existir
enlaces qumicos entre los pares de electrones libres del tomo
de nitrgeno presente en los enlaces peptdicos de las cadenas
proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones de


Cu+2 y las diferentes protenas son similares pero no idnticas
por lo tanto, se puede utilizar una protena como patrn de
calibracin. La curva de calibracin obtenida por este mtodo, se
har utilizando como patrn solucin de peptona, cuya
concentracin es de 8 mg/mL preparada con agua destilada.

Espectrofotometra. Principios bsicos


La reaccin de biuret es cuantificable, es decir a mayor
concentracin de protenas, mayor intensidad de color violeta,
estas reacciones en las que el color formado es proporcional a la
cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas.

Midiendo la intensidad de color se podra conocer la


concentracin de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican
tcnicas fotomtricas, empleando un aparato llamado colormetro
(si mide slo un determinado color) o espectrofotmetro (si
realiza una medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se propaga
de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se
diferencian unas de otras por sus longitudes de onda que se mide
en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre
380-750 nm, que corresponden a los colores del arcoris, de tal
forma que cada color corresponde a una radiacin con una
longitud de onda especfica. El espectrofotmetro dispone de una

lmpara que emite luz monocromtica, de una longitud de onda


determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a
medir, y de un detector, que medir la cantidad de luz que no es
absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se
utilizar la radiacin de longitud de onda a la que absorba ms
cantidad de luz (a la longitud de onda de mxima absorbancia).

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fraccin


de luz incidente que es absorbida por una solucin es
proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la
sustancia atravesada por la luz. La relacin entre luz incidente
(Io) y la reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin
que ha sido absorbida por la muestra. Esto es lo que se denomina
Absorbancia (Abs) Densidad ptica (DO)

La ley de Beer-Lambert se formula como:


Abs (DO) =e x C x 1
Siendo e el coeficiente de extincin molar (especfico para cada
sustancia a una longitud de onda y en unas condiciones
determinadas (M-1, cm-1), C es la concentracin de la muestra a
medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayora de los
espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de
espesor, por lo que 1 se puede ignorar. As la concentracin
desconocida de la sustancia ser:
C = Abs /e

III.

MATERIALES Y EQUIPO

Espectrofotmetro
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probetas, Pipetas
Materiales: peptona, reactivo biuret
IV. PROCEDIMIENTO
Realizacin de una curva patrn: Como se desconoce el
coeficiente de extincin molar () de las protenas coloreadas con el
reactivo biuret, se proceder a construir una curva patrn, midiendo
la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de
protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin
problema y determinar su concentracin grficamente y tambin
por regresin lineal. Para ello se dispone de una solucin de 10
mg/ml de protena (peptona) a partir de ella se realizan diluciones
conocidas aplicando la frmula:

Ci x Vi =

Cf x Vf

Donde:
Ci = concentracin de la solucin madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial
Cf= concentracin final de la solucin a preparar
Vf= volumen total final de la solucin a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre
(Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla.

Conc.Fnal.
Sol.a
preparar

Volum
en
Sol.
Madre
inicial

Volum
en
agua

Volume
n
Rx.Biur
et

Volum
en
Final

Tubo

Mg/ml

ml

ml

ml

ml

Blanc
o

0,0

4,0

0,5

3,5

1,0

3,0

1,5

2,5

2,0

2,0

2,5

1,5

3,0

1,0

3,5

0,5

4,0

0,0

Mues
tra

4,0

0,0

Abs
570n
m

Al aadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la


absorbancia.
Medicin de la absorbancia en el espectrofotmetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de mxima
absorbancia para la reaccin del biuret)
b) Poner en la cubeta del espectrofotmetro el contenido del tubo
blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el
espectrofotmetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia
de las soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor
concentracin.

e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del
tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0),
se construye una recta en papel milimetrado, representando las
concentraciones en el eje de abscisas y las Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y calcular
su concentracin.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a
la concentracin y que la relacin es lineal: Y = a + b X
(Y
= A + B x Conc.). Utilizando regresin lineal se obtiene el
valor de los coeficientes A y B y se puede despejar concentracin
que en este caso es de la muestra desconocida.

V.

CUESTIONARIO
5.1 Cul es la concentracin de protenas de la muestra?

5.2 Se podra determinar la concentracin de cualquier muestra


de protenas con esta curva patrn?

5.3 Los aminocidos y los dipptidos daran positiva la reaccin


del Biuret?

5.4

VI.

Investigue si existe alguna protena en la que no este presente


ninguna aminocido con anillo bencnico en su cadena lateral,
e indique que consecuencias tendra sobre la determinacin
espectrofotomtrica

OBSERVACIONES
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______________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 2
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS
POR DILISIS
I.

OBJETIVO
Aumentar la concentracin de las protenas en un extracto o
solucin que las contenga.

II. FUNDAMENTO
La dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a su
tamao usando membranas semipermeables que contienen poros de
dimensiones menores que las macromolculas que se deseen
separar como las protenas, los poros permiten la difusin de las
molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas, pero
bloquean el paso de protenas por su gran tamao.
Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa), nitrocelulosa,
colodin, u otras de naturaleza semipermeable.

Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusin por


diferencia de concentracin.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
01 pliego de papel celofn.
1Kg de azcar.
Solucin de extracto proteico al 0.5%.
Pipeta de 10 ml.
Vaso de precipitados.
Piceta.
IV. MTODO
Preparar una bolsa con el papel celofn, de modo que no se
presenten fugas al llenarla con una solucin.
Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solucin de
protena al 0.5%.
Comprobar
la
concentracin
espectrofotmetro a 280 nm.

de

protena

con

el

Llenar la bolsa de celofn con 50 ml de solucin proteica, usando


para tal fin la pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo
que no presente fugas.
Preparar un tazn con azcar, y colocar all la bolsa de celofn
conteniendo la solucin proteica.
Untar toda la bolsa de celofn, con el azcar, cubrindola por
completo.
Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azcar, observando los
cambios ocurridos.
Medir el volumen de lquido que qued en la bolsa de celofn y
comparar con el volumen inicial.
Mediar nuevamente la concentracin
espectrofotmetro a 280 nm.

de

protenas

en

el

V. CUESTIONARIO
Seale las principales tcnicas de separacin de solutos por
membrana, y las principales aplicaciones de cada una de ellas.
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________

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_________________________________________________________________
Investigue la composicin qumica de la membrana utilizada y
explicar las razones de su porosidad.
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_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Efecte los clculos de variacin en el volumen y la concentracin
de la protena en solucin.

Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de


solventes por osmosis.
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_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solutos
por difusin debida a diferencias de concentracin.
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_________________________________________________________________
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VI. OBSERVACIONES
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VII. CONCLUSIONES
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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 3
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICROKJELDAHL
I.

OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una
muestra desconocida.

II. FUNDAMENTO
El mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por HACH
en el proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo anlisis en
un tiempo corto y con pequeas muestras.
Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las
protenas a nitrgeno inorgnico. Para ello se siguen tres etapas
claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por accin del cido sulfrico
en presencia de oxidantes fuertes (peroxido de hidrgeno), de
esta manera todo el carbono presente se libera como CO2 y
nitrgeno como NH3, luego este se combina con el exceso de
cido sulfrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la
accin de un lcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe
en una solucin de cido dbil en presencia de colorante
indicador.
3. En la tercera se titula la solucin
cuantificando el nitrgeno presente.

con

un cido

Luego se aplica la relacin siguiente:


%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
donde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestra
ml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml)
N. normalidad del cido
Fc. Factor de correccin del cido
meq.= peso del miliequivalente del nitrgeno

fuerte

Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con


16% de N, el porcentaje de protenas ser:
Protena = 6.25xN
III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinacin se hace en tres etapas:

DIGESTIN.
Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y
colocar en el matraz de digestin
Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz
Verificar que el control automtico del digestor este en
440C y que haya succin en la columna de fraccionamiento.
Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado la
temperatura indicada.
Aadir 10 ml de peroxido de hidrgeno al 50% a la muestra
a travs de un embudo de la columna de fraccionamiento. Si
el digesto no se torna incoloro, aadir porciones adicionales
de 5 ml hasta que el digesto se aclare.
Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la
columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un
bloque y tapar hasta que se haya enfriado.
Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.
DESTILACIN
El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un baln
de destilacin.
Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de cido
borrico al 4% ( en volumen) adicionndole indicador azul de
metileno y rojo de metilo, dando una coloracin violeta.
El baln de destilacin que contiene el digesto se aade 13 a
15 ml de hidrxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de
zinc.
Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto
durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor tenga
una coloracin verdusca y su volumen sea mas o menos 3
veces del volumen inicial)
TITILACIN.
Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y valorizarla.
Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de
verde a violeta
IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre protenas simples y conjugadas.

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_____________________________________________________________________
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Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas simples y
dos protenas conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas


durante el proceso de determinacin del nitrgeno

Efectu los clculos y determine el contenido de protenas en la


muestra

Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la


etapa de digestin

Explique el objetivo de la etapa de destilacin.


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Explique porque la titilacin se hace con cido sulfrico y no con un


lcali.
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V. OBSERVACIONES
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VI. CONCLUSIONES
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VII. BIBLIOGRAFA

PRCTICA 4
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE
AMINOCIDOS
I.

OBJETIVO:
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la identificacin
de aminocidos presentes en una muestra biolgica.

II.

FUNDAMENTO TERICO:
AMINOCIDOS
Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas.
Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una
hidrlisis ya sea cida o alcalina; ste proceso rendir una mezcla de
sus aminocidos constituyentes, los cuales pueden ser susceptibles
de ser analizados o identificados por mtodos cromatogrficos.
Todas las protenas son polmeros y los monmeros que se
cambian para formarlos son los a -aminocidos.

Los diferentes aminocidos se diferencian por sus cadenas


laterales.
In vivo el pH fisiolgico es prximo a la neutralidad.
El pKa de los grupos carboxlo y amino de los alfa
-aminocidos es aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo
carboxilato habr perdido un protn y el grupo amino habr
captado un protn para dar la forma ZWITTERION.
En los genes, de todos los organismos estn codificados 20
aminocidos que se incorporan a las protenas.
Todos los aminocidos son enantimeros (L)
Existen otros aminocidos (no proteicos) y tambin hay
aminocidos modificados que se hallan en las protenas.
La variedad de las cadenas laterales (hidroflicas,
hidrfobas, cidas, bsicas, neutras) permite una gran
complejidad funcional en las protenas.
CROMATOGRAFA
Mtodo de Separacin
Permite separar, aislar e
estrechamente
relacionados
complejas.

identificar
presentes

componentes
en
mezclas

En estos mtodos se emplea:


- Fase estacionaria

: Slido/lquido

- Fase mvil

: liquido/gas

Los componentes de una mezcla se transportan a travs de


una fase estacionaria por medio de una fase mvil que
fluye.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad
de migracin entre los componentes de la muestra.
Cromatografa en Capa Fina
Tiene 2 partes: Fase mvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria.
Es un slido poroso capaz de retener solvente y slido
pueden ser.

El soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias a la


presencia de SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de slica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay


alguna marcha de la migracin de muestra o estndares esta
marcha ya no es verde sino violeta.
III.

PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
Se siembra los estndares y la muestra con un capilar
bastante fino.
Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener
una mancha entre 1 y 2 mm de dimetro.
La distancia entre las siembras puede ser no menor de 67mm aproximadamente.
Segundo Proceso: Elusin
Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil con
la ayuda de un solvente de elusin.
Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin

El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra.


El solvente comienza a subir por capilaridad.
Las muestras se comportan diferente segn el solvente
utilizado y sus componentes algunos migrarn rpidamente
otros no.
Tercer Proceso: Visualizacin o Revelado
El producto puede verse:
Por s mismo porque tiene color.
Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple
vista.
Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna donde est la
mancha dando coloraciones amarillas profundas.
Usando mtodos qumicos, usando una sustancia qumica como
revelado, ( en este caso ninhidrina en butanol)
Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en funcin de su


factor de retardo RF que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con


la de una sustancia patrn en idnticas condiciones.
La razn de estas distancias se designa por Rstd
IV.

PARTE EXPERIMENTAL:
Sembrado de estndares de aminocidos y muestras
Corrida cromatogrfica. Elusin
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar hermticamente y dejar que proceda el desarrollo de la
separacin cromatogrfica, hasta que el solvente haya alcanzado el
frente trazado en la parte superior de la placa.
Revelado del cromatograma
-

Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.

Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello.

Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol


sobre la placa. Secar la placa con una secadora.

Identificacin
Luego proceder a identificar las manchas existentes que debern
corresponder a aminocidos para ello se debern hacer los
clculos de los Rfde los estndares y luego los Rf correspondientes
a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a travs
de una coloracin azul violeta.
V.

CUESTIONARIO:
5.1.

Haga un esquema de los resultados observados.

5.2.

Calcular los Rf de los estndares y muestras.

5.3.

Identificar que aminocidos estn presentes en las muestras


problemas.

5.4.

5.5.

Qu es la cromatografa de exclusin molecular y la


cromatografa de intercambio inico y cules son sus
aplicaciones.
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__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
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5.6.

Qu mtodos existen para el anlisis de aminocidos de las


protenas.
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5.7.

Indicar tipos de solventes de elusin para la fase mvil tanto


para silica y almina.
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__________________________________________________________________
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_________________________________________________________________

5.8.

Haga el mecanismo de reaccin de la Ninhidrina con los


aminocidos.

5.9.

La cromatografa en capa fina separa las sustancias segn su


peso molecular.? Fundamente.
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VI.

OBSERVACIONES
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VII.

CONCLUSIONES
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VIII.

BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 5
REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
I.

OBJETIVOS:

Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.


Diferenciar experimentalmente monosacridos, disacridos y
polisacridos.
Familiarizarse con la clasificacin de los hidratos de carbono en
reductores y no reductores.
Estudiar las propiedades del almidn.

II. FUNDAMENTO TERICO:


Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados
aldehdicoscetnicos, reales o potenciales de alcoholes polivalentes
o sus productos de condensacin segn la cantidad de glucsidos o
azcares sencillos que se obtengan por hidrlisis de los
policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacridos (celulosa, almidn)
Trisacridos (rafinosa)
Disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacridos
Los monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o
cetosas por el. nmero de tomos de oxigeno, pueden ser hexoaas
(glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa,
ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones
carbonilo y oxhidrilo y, adems, algunas especficas. Todos son
ptimamente activos. Por el calor y la accin de cidos fuertes se
deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.
Los hidratos de carbono ms abundantes de la bisfera estn
constituidos por el almidn y celulosa que son polmeros de glucosa
presentes en plantas.
El almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo
almacenan en granos y en tubrculos como reserva alimenticia para
el momento de la germinacin. Todos los tipos de almidn producen
un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador cualitativo
sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidn.

La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en varias


clases de dextrinas, en maltosa y por ltimo en D (+) glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrlisis
puesto que la coloracin va cambiando de azul a rojo a medida que
decrece el peso molecular delcompuesto orgnico.
Los grupos funcionales existentes en el almidn y en la celulosa son
los grupos hidroxilo y acetal. Estos polisacridos tienen diferente
configuracin, siendo el almidn un glucsido y la celulosa un f
-glucsido. Tambin difieren en el tamao teniendo lacelulosa un
peso molecular medio mucho mayor que el del almidn.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivo Molisch

Tubos de ensayo

Reactivo Fehling

Pipetas

Reactivo Tollens

Bao de agua hirviente

Reactivo Seliwanof

Pinzas

Reactivo Barfoed

Bao hirviente

Sol. glucosa 1%

Vaso de precipitados

Sol. fructuosa 1%

Luna de reloj

Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1%
Sol. almidn 1%
Sol. sacarosa 5%
Sol. HCl

10%

Sol. NaOH 10%


Sol. yodo - yodurado
IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genricas de los carbohidratos
Reaccin de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una
solucin de glucosa al1%, 1 ml. de solucin de fructuosa o
levulosa al 1%, 1 ml. de una solucin de sacarosa al 1%, 1 ml. de
una solucin de lactosa al 1%, 1 ml. de una solucin de almidn
al 1% y en el ltimo 1 ml. de agua (testigo). A cada una
agrguele 2 gotas

de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las


paredes 2 ml. de cido sulfrico concentrado.
Observe el color violceo del anillo formado en la interfase entre
los dos lquidos. Anote aquellas soluciones que den positiva la
prueba.
Reacciones Especficas
Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solucin A
de Fehling con 0.5 ml. de la solucin B de Fehling, agrgueles 1
ml. de la solucin de los carbohidratos utilizados en el
experimento anterior.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay cambios
de color, formacin de precipitados.

Reaccin de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de
Tollens recientemente preparado, aadir a cada uno 2 ml. de las
soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay
formacin de espejo de plata y cuales carbohidratos dan
negativa esta reaccin.
Realice una comparacin de estos resultados con los de la
prueba de Fehling.
Reaccin de Seliwanof
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanof,
luego aada 3 gotas de solucin de los carbohidratos utilizados
anteriormente, luego lleve los tubos a bao hirviente. Anote el
tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido.
Reaccin de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego
aada 1 ml. de solucin de los carbohidratos utilizados
anteriormente, luego llevar los tubos a bao hirviente y observar
la formacin de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que
indicar la presencia de monosacridos.
Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy
lentamente.
Hidrlisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al
5%, llvelos a bao hirviente y a cada tubo aada volmenes
iguales de agua para el primer tubo, cido clorhdrico al 10% en
el segundo tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en el tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a
continuacin la reaccin de una porcin de cada mezcla con la
solucin de Fehling. Qu conclusiones deduce?
Ensayo del Almidn frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al 1%,
aada una gota de solucin de Iodo - lodurada, observe el color
de la solucin. Luego caliente la solucin coloreada a ebullicin y
observe el efecto, observe tambin qu efecto produce el
enfriamiento de la solucin.
Hidrlisis del Almidn
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de almidn
al 1%, aada 1 ml de cido dorhdrico concentrado. Hierva la

solucin y retire muestras de Y ml. a intervalos prximos,


ensayando su reaccin frente al iodo. Anote el color en los
diferentes ensayos.
Cuando la solucin ya no produzca coloracin con el iodo,
neutralcela y ensaye la reaccin de una muestra frente al
Fehling. Formule estructuralmente los productos finales de la
hidrlisis del almidn (un disacrido y un monosacrido).

V. CUESTIONARIO:
5.1.

Indique la composicin de los reactivos utilizados en la prctica


(R. Molish, R. Seliwanof, R Barfoed, R Fehling).

5.2.

Elabore un diagrama de flujos del proceso de produccin de la


glucosa a nivel industrial.

5.3.

A qu se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras


de almidn?
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________

5.4.

Cmo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrlisis del


almidn?
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________

VI. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES
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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 6
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS
DE LAS PROTENAS
I.

OBJETIVOS:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir y
demostrar de manera cualitativa las propiedades qumicas de las
protenas en base a los siguientes aspectos:
Solubilidad de las protenas.
Las propiedades electroqumicas de las protenas.
El efecto cido-bsico en la solubilidad de las protenas.

II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de protenas.
3. Propiedades fisicoqumicas del agua.
4. Ecuacin de Henderson-Hasselbach.
III. INTRODUCCIN:
Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de
aminocidos. En las protenas existen 20 tipos de aminocidos
diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia determinados
por el cdigo gentico.
Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular
de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable
variacin de formas y estructuras. Para su estudio se consideran
cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms simple la
estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya
conformacin depende de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y
repulsin que son ejercidas sobre la estructura molecular de la
protena y por lo tanto son responsables de su estabilidad.
Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos:
protenas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias en
sus propiedades qumicas y fsicas. Sin embargo, para los fines que
se persiguen en esta prctica se les mencionara en forma general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son:
La fuerza inica del medio, el pH. la temperatura y la constante
dielctrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de

estos factores, la protena responde con una intensidad proporcional


al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una
manera superficial o lo hace tan drsticamente que desnaturaliza a la
protena. Por fortuna, en nuestro organismo, la variacin de tales
factores es mnima por lo que son imperceptibles los cambios en la
protena.

IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla
V. METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en
protenas que se encuentran en el organismo, mediante la
modificacin las propiedades de los solventes, para establecer una
relacin con los efectos que se pueden presentar en el organismo.
Fundamento Qumico:
Las protenas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH
de la solucin
en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta
precipitacin proteica.
La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante
dielctrica del solvente permitiendo una mayor solubilidad de la
protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de una sal, se
neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a precipitar. Este
mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas cargadas
electropositivamente. Con la adicin de un cido o una base a una
solucin proteica se alcanza un estado en que hay el mismo nmero
de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la
protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual
de cargas de signos opuestos se denomina punto isoelctrico.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de
un cido.
Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando 250 mg de
casena, 20 mLde agua destilada y 5 mL de NaOH 1N. Cuando la
solucin sea perfecta, se agregan 5 mL de cido actico 1 N. Mezclar
bien, diluir a 50 mL con agua destilada. Si la solucin no est
suficientemente clara, se puede filtrar.
Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuacin
Tub
o
1

p
H

Agua
destilad
a
8.38

Ac.
Acetico
0.01N
0.62

Ac.
Acetico
0.1
0

Ac.
Acetico
1.0N
0

Casein
ato de
Sodio
1.0

2
3
4
5
6
7
8
9
10

7.75
8.75
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
5.8

1.25
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0.25
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
1.6
3.2

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que


presente la solubilidad de la casena en cada tubo. Reportar el punto
isoelctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor
precipitacin.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de HendersosnHasselbach.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de
un cido.
Tubo
pH
Solubilidad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Cul es el punto isoelctrico de la protena ?
____________________________________________________________________
VI. CUESTIONARIO:
6.1.

De qu factores depende la solubilidad de una protena en el


agua.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

__________________________________________________________________
___________________________________________________
6.2.

Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la


adicin de un cido o una base fuerte.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________________________________________

6.3.

Explique cmo afecta un cambio en la constante dielctrica del


agua a la solubilidad de una protena.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.4.

Qu es el Salting in y qu tipo de compuestos pueden


promoverlo.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.5.

Qu es el Saltingout y qu tipo de compuestos pueden


promoverlo.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.6.

Qu relacin existe entre el punto isoelctrico y la solubilidad de


una protena.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.7.

Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos


est indicado utilizarse.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________
6.8.

Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le


permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto
incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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VIII. CONCLUSIONES
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_______________________________________________________________________
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_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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IX. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 7
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS:
FERMENTACIN.
I.

OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin
celular anaerbica (fermentacin) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la
respiracin celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos,
inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH
e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la
reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por
lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2.
III. PROCEDIMIENTOS.
3.1.

Complete la siguiente batera de tubos:

Tubos

Suspensin 1 ml
de levadura
7%

1 ml

1 ml

1 ml

Sol.
Glucosa

1 ml

1 ml

1 ml

Sol. NaF

1 ml

Agua
destilada(4
3C)

2 ml

1 ml

Sol.Rojo
Neutro

1 ml

Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada


tubo.
3.2.

Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido,


presionndolo girar rpidamente de manera que el tubo quede
invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la burbuja en la
parte superior del tubo y amarrando con un elstico los 4
frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua a 43C.

3.3.

Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solucin en el


tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con
agua.

3.4.

Cul es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con


papel pH.

3.5.

Anote y discuta sus resultados.

Soluciones:
1 Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura
en 10 ml de agua destilada a 43C y completar a 100 ml con
agua destilada a 43C.
2 Solucin de glucosa 0,1 M
3 Solucin de NaF0,1 M
4 Solucin rojo neutro 0,02 M
Papel pH.
IV. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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V. CONCLUSIONES
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VI. BIBLIOGRAFA
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______________________________________________________________________
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PRCTICA. 8
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE
ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA.
I.- OBJETIVOS
1 Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2 Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3 Evaluar por refractometra el grado alcohlico del producto de la
fermentacin
II.- ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la
reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por
lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO 2 y
por la concentracin del producto formado o por la disminucin de
la concentracin del sustrato (en grados Brix)
III.- MATERIALES.
-

Material biolgico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas


Reactivos: Agar-agar, solucin de glucosa 5%
Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodrmicas de
20cc, esptulas, picetas, papel toalla.
Equipos: Balanza, refractmetro, bao mara.

IV.- PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificacin en 50 ml de agua
destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada,
con calentamiento y agitacin constante.
Calibrar el bao de mara a 40C, para mantener dentro del agar
licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en
refrigeracin (aproximadamente 4C), por 30 minutos.
Inmovilizacin de la enzima:

Mezclar 50 ml de la suspensin de levaduras y 50 ml de agar agar


licuado y homogenizar.
Tomar con una hipodrmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar
caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal
refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con
movimientos rotatorios suaves.
Secar los pellets en papel toalla.

Obtencin del mosto de uva:


Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alcuota y leer los grados brix o porcentaje de azcar en el
refractmetro.
Obtencin de etanol:
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de
uva, (o 50ml de una solucin de glucosa al 5%). To0mar una alcuota,
considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o
porcentaje de azcar en el refractmetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alcuotas cada 15 minutos. Leer
los grados brix en el refractmetro para cada alcuota.
V .- CUESTIONARIO.
1.-Indique la importancia de la inmovilizacin de enzimas y/o clulas.
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

2- Cul es el fundamento de la inmovilizacin de levaduras en agar?.


________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

3.- Explique las caractersticas coagulantes del agar-agar.


________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las clulas
de levadura, si estas estn atrapadas en la matriz de agar-agar.
_______________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

5-

Presente

al

menos

un

caso

detallado

de

aplicacin

de

la

inmovilizacin de enzimas.
________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

6- Qu otros mtodos para la inmovilizacin se utilizan?


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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS


_________________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
___________________________________________________________________
VI.- CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
VIII.- BIBLIOGRAFA
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

PRCTICA 9
EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES
I.

OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cscara de frejol y comprobar su
actividad cataltica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son protenas con accin cataltica.
Las protenas se encuentran en el interior de las clulas en un
estatus particular, a pH fisiolgico, y con estructura nativa
estabilizada por diversas mezclas de sustancias.
La extraccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven
las caractersticas estructurales y las propiedades funcionales de
las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica,
debido a la enzima ureasa presente en la cscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato rea provoca la
hidrlisis de esta con la consiguiente liberacin de amoniaco y
anhdrido carbnico, segn la siguiente reaccin.
NH2
O=C

H2O ----------

2NH3 + CO2

NH2
La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar el
amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K2Hg14). Este
reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y
Potasio, que al
reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color
amarillo-anaranjado (complejo cuya frmula se supone sea
HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de
onda de 405 a 420 nm.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
150 gr. De cubierta de frejol, solucin de rea0.3 M, agua
destilada
Bufer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
Espectrofotmetro, Bao Mara, Balanza, Equipo de filtracin,
papel filtro, Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de

ensayo de 10 ml. Baln de 500ml. Vaso de precipitados de 500


ml.
IV. PROCEDIMIENTO.
Extraccin de la Enzima.
Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua
hervida fra) , despus de 24 horas remover la cscara por
friccin, y proceder a escurrir el agua.
Preparar 200 ml. De bufer fosfato de sodio 0.005 M.
( PO4HNa2) , y 200ml. De solucin EDTA 0.001 M. Usando en
ambos casos agua destilada fra, mezclar ambas soluciones, y
enfriar a 4C. En un baln de 500 ml.
Pesar 20 gr de cscara de frejol y colocarlo en un vaso de
precipitados de 500 ml.
Agregar 90 ml. De bufer fosfato previamente preparado, y
licuar cuidando se mantenga baja la temperatura.
Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua
destilada.
Centrifugar la suspensin a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la
solucin por un filtro rpido y enjuagar el papel filtro con 10
ml. De agua destilada.
Separar el sobrenadante y medir el volumen final del
extracto obtenido, llevar a refrigeracin.
Preparar un cuadro de resultados.
CASCARA

BUFFER

AGUA

EXTRACTO

FINAL (ml)

Determinacin de presencia de protenas en el extracto


por espectrofotometra.
Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de
reactivo biuret.
Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml
de agua y 4 ml de reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotmetro y leer la absorbancia a 570 nm.
Para comprobar la presencia de protenas.
Anotar la lectura de Absorbancia.
Comprobacin de La actividad enzimtica.

Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo


muestra y el otro como tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M
y 1.5 ml de bufer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de
agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para
lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por
15 min.
Despus de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler
a los tubos; (0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8 ml.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Calibrar el espectrofotmetro a 420 nm.
Medir la absorbancia. La muestra de extracto dar
coloracin y un alta absorbancia por el amoniaco liberado.
V. CUESTIONARIO.
Explique por qu es necesario licuar la cscara durante la
extraccin de la enzima ureasa.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Diga que pruebas se tienen de haber extrado realmente enzimas
vegetales.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________________________________________________________
Haga los clculos de reactivos para las soluciones que se
prepararon.

Explique el papel que juegan en la extraccin el bufer fosfato y la


refrigeracin.
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extraccin utilizado


en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES
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_____________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRACTICA 10
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA
I.

OBJETIVO
Determinar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la
enzima ureasa.(enz. Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimtica (U) es la expresin del poder cataltico de
la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reaccin que
cataliza.
La actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima
contenida en 1 ml de solucin que transforma o produce 1 mg de
sustrato producto por minuto medidas en las condiciones optimas
de operacin de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos
vivos, mas no en el organismo humano. Algunas fuentes comunes
son las bacterias, o la cscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposicin de la rea segn la reaccin:
NH2
CO

+ H2O

2NH3 + CO2

NH2
La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de
cualquier reaccin puede ser determinada midiendo:
1 la cantidad de sustrato transformado en un determinado
tiempo de reaccin
2 la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer el
ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo
cualquiera de los productos (CO2 NH3) producidos en un tiempo
determinado.
Por facilidad se medir la cantidad de amoniaco formado, lo cual se
hace por medios espectrofotomtricos utilizando el reactivo Nessler
que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al reaccionar con
el amoniaco en medio alcalino forma un complejo de color
anaranjado castao.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH

HgONH2I + 7KI + 2H2O

La intensidad del color formado ser directamente proporcional a la


cantidad de amoniaco presente en cada tubo y se medir la
absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro morado).
III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Materiales.
Preparar 50 ml de solucin de urea 0.3 M.
Preparar 100 ml bufer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA
0.001M
Reactivo Nessler.
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/ml en bufer fosfato pH,
7.4 ( a 4C)
100 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x104milimoles/ml)
Material de vidrio.
02 fiolas de 50 ml.
02 fiola de 100ml.
08 tubos de ensayo.
01 gradilla para tubos.
01 espectrofotmetro.
bao de hielo.
Incubadora a bao mara.
Determinacin de la curva de calibracin.
Se preparan en los tubos de ensayo
amonio segn la tabla siguiente:

soluciones

de sulfato de

Patr
n
N

Concentra SO4(NH ml
de Buf
cin (NH3) 3)2
SO4(NH er
mol/ml
nmol/ml 3)2
(ml)

Nessl Volum
er
en
(ml ) final
ml

Blan
co

00

0.0

0.0

7.50

0.5

8.0

5.0

0.01

7.49

0.5

8.0

10

0.02

7.48

0.5

8.0

Absorban
cia
420 nm.

15

0.03

7.47

0.5

8.0

20

0.04

7.46

0.5

8.0

25

0.05

7.45

0.5

8.0

30

0.06

7.44

0.5

8.0

Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o


curva de calibracin.
Medida de la actividad ureasica.
Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra
y el otro como tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y
1.5 ml de bufer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solucin de ureasa y 4.8 ml
de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para
lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15
min.
Despus de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubacin e
introducir en bao de hielo para detener la reaccin.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo).
Volumen total 8 ml, agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.
IV. CUESTIONARIO
1.- Efecte los clculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reaccin enzimtica.

3.- Calcule la actividad enzimtica de la solucin de ureasa en nmol de


NH3 producido/min.

4.- Explique por qu durante la reaccin debe incubarse a 37C

5.- Realizar los clculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y


urea para cada tubo
patrn usados en la construccin de la curva
de calibracin.

6.- Encontrar la equivalencia por el clculo del factor de


equivalencia y por la
determinacin analtica de la ecuacin de
la curva.

7.- Diga si la curva de calibracin obtenida obedece a la ley de Beer.


Explique por qu.

8.- Explique por qu es necesario contar con un blanco en las


determinaciones de
actividad enzimtica.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimtica y actividad


especfica.

I.

OBSERVACIONES

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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

II. CONCLUSIONES
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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III. BIBLIOGRAFA
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________________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________________
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PRACTICA 11
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA
I.

OBJETIVO.
Verificar la variacin de la velocidad de las reacciones enzimticas
con la concentracin del sustrato.

II. FUNDAMENTO.
La rea puede descomponerse por accin de la enzima Ureasa,
para formarse amoniaco y bixido de carbono segn la
siguiente ecuacin.
NH2
CO

+ H2O

2NH3 +

CO2

NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por
espectrofotometra a
= 420 nm, si previamente se le
compleja con reactivo Nessler.
Cintica de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la
concentracin del sustrato segn una cintica autosaturante
que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.
V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representacin grfica de tal ecuacin tiene la forma:

La ecuacin de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo


uso de la Linearizacin de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma
la forma.

Donde los parmetros anteriores se relacionan por la ecuacin


de una recta.
1

[S]

vVmaxKs
III. MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales.
20 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/l. En bufer fosfato de
pH=7.4, con EDTA, 0.5 nM.
Agua destilada.
reactivo Nessler.
Bao de hielo.
Equipos y material de vidrio.
fiolas de 50 y 100 ml.
07 tubos de ensayo de 10 ml.
02 matraz de 100 ml.
pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
Equipo de bao mara.
01 espectrofotmetro Espectronic 20D+
01 termmetro de 0- 100 C
IV. PROCEDIMIENTO.
Preparacin de muestras.
Hacer los clculos y preparar la solucin patrn de sulfato
de amonio al 5x10-4 M
Hacer los clculos y preparar la solucin de urea 0.3 M
Calibracin del Espectrofotmetro.

A fin de transformar los valores de intensidad de color en


valores de concentracin del producto formado (NH 3), y por
tanto de actividad de la enzima se trazar una curva de
equivalencia de Densidad ptica (Abs) vs. Concentracin. Con
ese fin se preparan soluciones de amoniaco de concentracin
conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para
obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso
del NH3 se usar soluciones de sulfato de amonio.
Preparar solucin madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M
Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de
Sulfato de Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan
cada una y su equivalencia con nmol de rea. Completar la
siguiente tabla.
Tabla N 1
PATRON n

Sol.
de Contenido
Contenido
Equivalencia
sulfato(ml)
nmol
de nmol
de en nmol de
sulfato
NH3
rea

50

100

150

200

250

300
Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de la
prctica anterior.
Completar la siguiente tabla.
Tabla N 2

Muestra N

Blanco
1
2
3

Volumen
de NH3
en
sulfato tomado ( muestra
ml)
(nmol)

la Absorbancia

4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuacin que
relaciona DO vs
[NH3], haciendo
necesarios.

los

tratamientos

estadsticos

que

sean

Pruebas cinticas.
A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6
muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se
muestra.
Preparar solucin madre de ureasa 6gr/l en bufer fosfato

Tabla N 3
Tubo

Ure
a
M
ol

Ure
a
o.3
M
ml

Bufe Incub Urea


r
ar
sa
fosfa 37C ml
to ml
3
min

Incub
ar
37C

Ba Nessl Repos
o
er
ar
hiel ml
5
o
15
min.
min

Volum
en
final
ml

Blan
co

7.0

0.5

0.5

60

0.2

6.8

0.5

0.5

120

0.4

6.6

0.5

0.5

180

0.6

6.4

0.5

0.5

240

0.8

6.2

0.5

0.5

300

1.0

6.0

0.5

0.5

360

1.2

5.8

0.5

0.5

Ab
s
42
0
nm
.

Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que


reacciona ( de la curva de calibracin), y completar la tabla
4

Muestra

1
2
3
4
5
6
Blanco

Tabla N 4
[urea]
en Densidad
Nmol
de Nmol
de
nmol/ml x10 ptica
NH3
urea
que
2
(Abs)
producidos
reaccionan
0.1
1.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-

Tratamiento de datos.
Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin
mediante la relacin v = P/t, donde (p) es nmol de NH3
producidos, y (t) es el tiempo de reaccin enzimtica ( 15
min.) y completar la siguiente tabla.

Tabla 5
Muestra

[S] nmol/ml. 1/[S]

V(nmol/min.) 1/v

1
2
3
4
5
6
Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

Estimar el valor de Vmax.

Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una lnea recta.

Determinar grficamente los valores de Vmax. Y Ks.

Escribir la ecuacin que representa a esta reaccin


enzimtica.

V. OBSERVACIONES

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VI. CONCLUSIONES
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________________________________________________________________________________________
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VII. BIBLIOGRAFA
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PRACTICA 12

EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE


POLLO
I.

OBJETIVO
Extraer ADN de un tejido animal

II.

MARCO TEORICO
El ADN y ARN son biomolculas que intervienen en el
almacenamiento y la transferencia de la informacin gentica.
Son componentes fundamentales de la clula y constituyen en
conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.
Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando
ncleo protenas, ya que suelen unirse a determinados tipos de
estas, como las histonas.
El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el
ncleo , mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sita
fundamentalmente en el ncleo de la clula y tambin
cloroplastos y mitocondrias en pequeas cantidades.
Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos
dirigen y llevan a cabo la sntesis de protenas, y por tanto de las
enzimas necesarias para el funcionamiento celular.
Por otra parte el ADN es el vehculo de la herencia que se
transmite de padres a hijos de generacin en generacin.

III.

FUNDAMENTO:
El ADN se puede aislar mediante una tcnica relativamente
sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas
celulares para liberar los ncleos, para ello se tritura el hgado de
pollo en un mortero.

Al aadir una solucin hipertnica, como el NaCl 2M, se produce


el estallido de los ncleos, el detergente forma un complejo con
las protenas y las separa del ADN, El alcohol tiene como funcin
precipitar el ADN que se va agrupando para dar lugar a la
formacin de unas fibras blancas visibles a simple vista, que se
pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como
el anaranjado de acridina.

IV.

V.

MATERIALES

Hgado de pollo 10 gr
Cloruro de sodio 2M

Etanol 96|

SDS 20%

Arena

Varilla de vidrio

vasos de precipitados

Mortero

Embudo

Pipetas

Probetas

Gasa

METODOLOGA
1.- Triturar 10 gr de hgado de pollo, dentro de un mortero, con la
adicin de 5gr de arena lavada, para promover el rompimiento
de las membranas celulares.
2.- Aadir al triturado de hgado 50 ml de agua destilada hasta
obtener una papilla.
3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando
separar los restos de tejido que quedaron sin romper
membranas.
4.- Medir el volumen del filtrado final.
5.- Aadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo
a un vaso de precipitados.
6.- Aadir 1 ml de SDS 20%.

7.- Aadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol fro, por las


paredes, logrando se formen dos capas, en la interface
precipita el ADN.
8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la
misma direccin tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la
varilla se van adhiriendo unas fibras blancas de ADN visibles a
simple vista, que es el resultado de la agrupacin de muchas
fibras de ADN.
VI. CUESTIONARIO
1. De qu est formada la cromatina?
2. Durante la extraccin del ADN Cul es la razn de triturar el
hgado?, para qu aadimos arena al triturado?
3. Por qu crees que estallan los ncleos al aadir NaCl 2M?
4. Qu accin tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extraccin del ADN se utiliza un detergente y etanol,
con que finalidad
VIII. OBSERVACIONES
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IX. CONCLUSIONES
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X. BIBLIOGRAFA
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