Revilla Gonzalez Ursula Salome 2013

UNIVERSIDAD AUTNOMA CHAPINGO
DIVISIN DE CIENCIAS FOR ESTALES

PROGRAMA ACADMICO DE
INGENIERA EN RESTAURACIN FORESTAL
Hongos Ophiostomatales asociados a Dendroctonus

mexicanus en Pinus leiophylla var. leiophylla
TESIS PROFESIONAL
Que como requisito parcial
para obtener el ttulo de:
INGENIERO EN RESTAURACIN FORESTAL

Presenta:
URSULA SALOME REVILLA GONZLEZ
Chapingo, Texcoco, Estado de Mxico, septiembre de 2013
JURADOEXAMINADOR
Esta tesis, titulada"HongosOphiostomatalesasociadosa Dendrodonus mexicanusen
Pinusleiophylla var. leiophylla"fue realizada por Ursula Salome Revilla Gonzlez,y
dirigidapor el Dr. MarcosMiguelGonzlezPea. Ha sido revisaday aprobadapor el
siguientecomit revisory jurado examinador,como requisitoparcialpara obtenerel
Forestal:
ttulode Ingenieroen Restauracin
PRESIDENTE
SECRETARIO
VOCAL
M. C: SilviaEdthGarca
SUPLENTE
SUPLENTE
Texcoco,Estadode Mxico,septiembrede 2013
tl
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Marcos Miguel Gonzlez Pea, por el financiamiento otorgado para realizar esta
tesis, y por compartir sus conocimientos de microbiologa y biologa molecular.
Al Dr. Omar Alejandro Prez Vera, por orientarme en la identificacin morfolgica de
los hongos y en la edicin de las secuencias del ADN.
A la M. C. Silvia Edith Garca Daz, por sus consejos en lo correspondiente a la
identificacin morfolgica de los hongos al microscopio de luz.
Al Dr. Benito Reyes Trejo, por su generosa disposicin de permitirme trabajar en su
laboratorio, y por su colaboracin en la cuantificacin de los cidos nucleicos.
Al M. C. Rodolfo Campos Bolaos, por la orientacin proporcionada para la colecta e
identificacin del descortezador.
Al Dr. Enrique Guzar Nolasco, por corroborar la identificacin de la especie de pino
utilizada en el presente trabajo.
A la Comisin Forestal de Michoacn, y en especial a la M. C. Ivn Lpez Prez, por su
apoyo en la colecta del material biolgico utilizado en este trabajo.
A la Bil. Greta H. Rosas Saito, del Colegio de Postgraduados, por su colaboracin en
el trabajo de microscopa electrnica de barrido.
A Mara Marcos Martnez, del Laboratorio de Fisiologa Forestal de la DICIFO, por
permitirme el uso de la cmara de ambiente controlado.
Al CENID-COMEF del INIFAP, por concederme tiempo de uso de su microscopio
electrnico de barrido.
A la Direccin General de Investigacin y Postgrado de la Universidad Autnoma
Chapingo, por el financiamiento parcial para realizar este trabajo (Proyecto
137906004).
A la Secretara de Educacin Pblica, por el apoyo brindado mediante el Programa de
Becas para la Educacin Superior (convocatoria 2012).
iii
DEDICATORIA
A mi familia que me ha apoyado en todo momento.

A mi mam Irma Gonzlez Santos por todos sus sacrificios y generosidad.
A mi pap Arnulfo Revilla Bautista por sus enseanzas.
A mis hermanos (as): Margarita, Jorge, Adolfo, Felipe, Cecilia, Joel,
Elizabeth y Diego, por estar siempre conmigo.
iv
CONTENIDO
JURADO EXAMINADOR .................................................................................................ii
AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... iii
DEDICATORIA ................................................................................................................iv
CONTENIDO ................................................................................................................... v
NDICE DE CUADROS ................................................................................................. viii
NDICE DE FIGURAS .....................................................................................................ix
NDICE DE ANEXOS ......................................................................................................xi
RESUMEN ..................................................................................................................... xii
ABSTRACT ................................................................................................................... xiii
1.
INTRODUCCIN.................................................................................................. 1
2.
OBJETIVOS ......................................................................................................... 3
3.
2.1.
Objetivo general ............................................................................................ 3
2.2.
Objetivos especficos .................................................................................... 3
REVISIN DE LITERATURA................................................................................ 4
3.1.
Pinus leiophylla ............................................................................................. 4
3.1.1.
Distribucin ............................................................................................ 4
3.1.2.
Descripcin ............................................................................................ 4
3.1.3.
Usos ....................................................................................................... 4
3.1.4.
Plagas y enfermedades.......................................................................... 5
3.2.
Descortezadores ........................................................................................... 5
3.3.
Dendroctonus mexicanus Hopkins ................................................................ 6
3.4.
Manchado de la madera ................................................................................ 8
3.5.
Asociacin descortezador-hongo .................................................................. 9
3.6.
Hongos ophiostomatoides ........................................................................... 11
3.6.1.
Ophiostoma .......................................................................................... 14
3.6.2.
Ceratocystiopsis ................................................................................... 16
3.6.3.
Fragosphaeria ...................................................................................... 16
3.6.4.
Grosmannia .......................................................................................... 16
3.6.5.
Graphilbum........................................................................................... 16
3.6.6.
Leptographium ..................................................................................... 16
3.6.7.
Pesotum ............................................................................................... 17
3.6.8.
Sporothrix ............................................................................................. 17
3.6.9.
Hyalorhinocladiella ............................................................................... 18
3.6.10. Raffaelea .............................................................................................. 18

3.7.
4.
Identificacin de hongos microscpicos ...................................................... 18
MATERIALES Y MTODOS ............................................................................... 20

4.1.
Colecta de insectos y galeras ..................................................................... 21
4.2.
Identificacin del descortezador .................................................................. 22
4.3.
Identificacin del hospedante ...................................................................... 23
4.4.
Aislamiento de los hongos........................................................................... 23
4.5.
Identificacin morfolgica de los hongos ..................................................... 26
4.5.1.
Microscopa de luz ............................................................................... 26
4.5.2.
Microscopa electrnica de barrido ...................................................... 27
4.6.
Identificacin de hongos por mtodos moleculares ..................................... 28
4.6.1.
Extraccin de ADN ............................................................................... 28
4.6.2.
Purificacin ........................................................................................... 29
4.6.3.
Cuantificacin ....................................................................................... 29
vi
5.
4.6.4.
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 31
4.6.5.
Secuenciacin ...................................................................................... 32
4.7.
Anlisis filogentico ..................................................................................... 32
4.8.
Anlisis estadstico ...................................................................................... 33
RESULTADOS Y DISCUSIN ........................................................................... 34

5.1.
Identificacin del descortezador .................................................................. 34
5.2.
Identificacin del hospedante ...................................................................... 35
5.3.
Aislamiento de los hongos........................................................................... 35
5.4.
Identificacin morfolgica ............................................................................ 35
5.5.
Identificacin molecular ............................................................................... 50
5.6.
Anlisis filogentico ..................................................................................... 55
6.
CONCLUSIONES ............................................................................................... 57
7.
RECOMENDACIONES ...................................................................................... 58
8.
LITERATURA CITADA ....................................................................................... 59
9.
ANEXOS ............................................................................................................ 64
vii
NDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Caractersticas morfolgicas de especies Ophiostomatales aisladas. ......... 39
Cuadro 2. Especies identificadas morfolgicamente, con la alineacin de mayor
similitud de su amplicn de la -tubulina. ..................................................... 49
Cuadro 3. Frecuencia de ocurrencia (%) de anamorfos de especies
Ophiostomatales aisladas de Dendroctonus mexicanus y sus galeras. ...... 50
Cuadro 4. Alineacin de las secuencias de la PCR directa de peritecios. .................... 52
Cuadro 5. Especies alineadas en BLAST ..................................................................... 54
viii
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribucin geogrfica de Dendroctonus mexicanus. .................................... 7
Figura 2. Rodaja de Pinus leiophylla con mancha azul. ................................................ 8
Figura 3. Ascomata representativos del orden Ophiostomatales ................................ 12
Figura 4. Ascosporas acumuladas en la punta del cuello del peritecio. ...................... 13
Figura 5. Formas de anamorfos del orden Ophiostomatales....................................... 15
Figura 6. Esquema de actividades realizadas para la identificacin de hongos
Ophiostomatales. ......................................................................................... 20
Figura 7. Pinus leiophylla var. leiophylla con Dendroctonus mexicanus...................... 21
Figura 8. A) Cmara de incubacin. B) Trozas de Pinus leiophylla var. leiophylla en
la cmara de incubacin............................................................................... 22
Figura 9. Dendroctonus mexicanus.. ........................................................................... 23
Figura 10. Corteza con galeras.. .................................................................................. 24
Figura 11. Dendroctonus mexicanus sembrado en EMA al 2%l. ................................... 25
Figura 12. Cubos de madera inoculados con hongo. .................................................... 26
Figura 13. Laboratorio de microscopa electrnica del Colegio de Postgraduados. ...... 28
Figura 14. Espectro UV del ADN extrado de los aislamientos. ..................................... 30
Figura 15. Dendroctonus mexicanus, A) perfil del cuerpo. B) acercamiento al declive
elitral. C) antena. .......................................................................................... 34
Figura 16. Ophiostoma nigrocarpum.. ........................................................................... 36
Figura 17. Ophiostoma conicola .................................................................................... 37
Figura 18. Ophiostoma ips.. .......................................................................................... 38
Figura 19. Leptographium terebrantis 1......................................................................... 40
Figura 20. Leptographium terebrantis 2......................................................................... 41
Figura 21. Similar a Leptographium elegans.. ............................................................... 42
ix
Figura 22. Similar a Leptographium sibiricum ............................................................... 43

Figura 23. Leptographium sp.1 ...................................................................................... 44
Figura 24. Hyalorhinocladiella sp.1 ............................................................................... 45
Figura 27. Sporothrix sp.1. ............................................................................................ 48
Figura 28. Electroforesis de productos de PCR de especies Ophiostomatales............. 51
Figura 29. Resultado que se muestra en BLAST. ......................................................... 52
Figura 30. Secuencias de ITS alineadas en Clustal Omega ......................................... 55
Figura 31. Uno de los rboles ms parsimoniosos obtenido del anlisis de ADNr ........ 55
Figura 32. rbol filogentico de 16 especies Ophiostomatales (ADNr). ........................ 56
NDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Localizacin del rea infestada por Dendroctonus mexicanus. .................... 64
Anexo 2. Certificado de esterilizacin de los cubos de madera del Instituto
Nacional de Investigaciones Nucleares. ....................................................... 65
Anexo 3. Ejemplo de grfica de calidad de la secuenciacin en Macrogen. ............... 66
Anexo 4. Ejemplo del resultado de la secuenciacin del ITS. ..................................... 67
Anexo 5. Ejemplo del resultado de la secuenciacin del gen de la -tubulina. ........... 68
Anexo 6. Secuencias del gen -tubulina ..................................................................... 69
Anexo 7. Secuencias consenso del ADNr ................................................................... 73
xi
RESUMEN
Los bosques de pino en Mxico son atacados por varios escoltidos descortezadores,
entre los que se encuentra Dendroctonus mexicanus, que es considerada una de las
plagas forestales comercialmente ms dainas del pas. La mayora de los
descortezadores, incluyendo Dendroctonus, actan como vectores de los hongos
ascomicetos causantes del manchado azul de la madera, comnmente del orden
Ophiostomatales. En el presente trabajo se aislaron los hongos Ophiostomatales
asociados a Dendroctonus mexicanus infestando a Pinus leiophylla var. leiophylla, en
Plutarco Elas Calles, Michoacn. Se obtuvieron 19 aislamientos de hongos los cuales
se identificaron usando caractersticas morfolgicas, ADN ribosomal y secuencias
parciales del gen que codifica para la -tubulina. Se encontraron once especies de
Ophiostomatales en galeras y cuerpo de Dendroctonus mexicanus, Ophiostoma
nigrocarpum, una especie similar a O. ips, una especie similar a O. conicola,
Graphilbum
rectangulosporium,
Leptographium
terebrantis,
tres
especies
de
Hyalorhinocladiella, una especie de Sporothrix, y dos especies de Leptographium sin

identificar. Las especies con mayor frecuencia de ocurrencia fueron O. nigrocarpum y
L. terebrantis, lo que indica una relacin especfica entre el descortezador y estas dos
especies de hongo. Es el primer reporte de L. terebrantis, O. nigrocarpum y Graphilbum
rectangulosporium asociadas a D. mexicanus.
Palabras clave: Ophiostoma, descortezador, ITS, -tubulina, ADNr, pino.
xii
ABSTRACT
Pine forests in Mexico are infested by many bark beetles, among which is located
Dendroctonus mexicanus, which is consider one of the most damaging forest pest of
the country commercially. Most bark beetles, including Dendroctonus, act as vectors of
ascomycetes
fungi
cause
discolorations
in
wood,
commonly
of
the
order
Ophiostomatales. In this study Ophiostomatales fungi were isolated from Dendroctonus

mexicanus infesting Pinus leiophylla var. leiophylla in Plutarco Elias Calles, Michoacan,
in Central Mexico. We obtained 19 fungal isolates which were identified using
morphological characters, and by comparison of known sequences form ribosomal DNA
and partial -tubulin gene DNA. Eleven Ophiostomatales species were found in
galleries and body of Dendroctonus mexicanus, Ophiostoma nigrocarpum, an O. ipslike, an O. conicola-like, Graphilbum rectangulosporium, Leptographium terebrantis,
three Hyalorhinocladiella species, one Sporothrix specie and two unidentified
Leptographium species. Species with higher frequency of occurrence were O.
nigrocarpum and L. terebrantis, indicating a specific relationship between the bark
beetle and these two fungi species. Is the first report of L. terebrantis, O. nigrocarpum
and Graphilbum rectangulosporium associated to D. mexicanus.
Keywords: Ophiostoma, bark beetles, ITS, -tubulin, rDNA, pine.
xiii
1.
INTRODUCCIN
Las gimnospermas comprenden alrededor de 900 especies, la mayora localizadas en

el hemisferio norte; de stas, alrededor del 60% son conferas. El gnero Pinus es el
ms abundante de las conferas; en Mxico y Amrica Central se localizan 47 especies,
3 subespecies y 22 variedades de pino, las cuales tienen gran relevancia ecolgica,
econmica y social (Plomion et al., 2007; Snchez-Gonzlez, 2008).
Los bosques de pino en Mxico son atacados por varios descortezadores que se
alimentan del floema y del cambium vascular del rbol, entre los que destacan
Dendroctonus adjunctus Blandford, D. approximatus Dietz, D. mexicanus Hopkins, D.
parallelocollis Chapuis, D. valens LeConte, Ips bonanseai Hopkins, I. integer Eichhoff, I.
mexicanus Hopkins, Hylurgops spp., y Pissodes zitacuarence Sleeper (Prez-Vera et
al., 2009). D. mexicanus infesta y mata 21 especies de pino nativas de Mxico (Zhou et
al., 2004).
El comercio internacional de madera entre pases de varios continentes se est
expandiendo continuamente, y con ello el riesgo de la introduccin de nuevas plagas y
patgenos. Los ms importantes de stos son los insectos descortezadores y sus
hongos asociados. La mayora de las especies de descortezadores actan como
vectores de hongos ascomicetos, en particular de especies ubicadas en el orden
Microascales y, ms comnmente, en el orden Ophiostomatales (Grobbelaar et al.,
2010). La mayora de las especies de este orden causan el manchado de la madera en
angiospermas y gimnospermas, lo que reduce notablemente su valor comercial. La
comprensin de la biologa poblacional y el origen de los hongos ophiostomatoides
podrn asistir en la evaluacin del riesgo de las importaciones, as como en la
formulacin de las medidas cuarentenarias adecuadas.
Las especies de ophiostomatoides son difciles de identificar morfolgicamente, por lo
que es muy deseable reforzar la identificacin morfolgica mediante enfoques
moleculares, realizando comparaciones de secuencias de ADN de hongos conocidos, y
tambin para clarificar las relaciones filogenticas entre estas especies de hongos
(Massoumi et al., 2006).
Existe poca informacin de los ophiostomatoides que existen en Mxico, y slo se han
identificado los hongos asociados a tres especies de descortezadores utilizando
comparaciones de secuencias de ADN (Zhou et al., 2004; Prez-Vera et al., 2009). El
presente estudio tuvo como propsito fundamental identificar y caracterizar los hongos
Ophiostomatales asociadas al descortezador D. mexicanus en P. leiophylla Schiede ex
Schlechtendal & Chamisso var. leiophylla.
2.
OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Aislar e
identificar los
hongos Ophiostomatales asociados al descortezador
Dendroctonus mexicanus, que ataca a Pinus leiophylla var. leiophylla en Plutarco Elas
Calles, Michoacn.
2.2. Objetivos especficos
Corroborar que la especie del descortezador colectada sea Dendroctonus

mexicanus.
Aislar los hongos asociados a D. mexicanus, causantes del manchado azul de la

madera.
Identificar los hongos Ophiostomatales asociados a D. mexicanus morfolgica y

molecularmente.
3.
REVISIN DE LITERATURA
3.1. Pinus leiophylla
3.1.1.
Distribucin
El gnero Pinus es el gnero ms abundante de la familia Pinaceae. En Mxico, los

pinos se distribuyen a lo largo de la Sierra Madre Occidental, el eje Neovolcnico y la
Sierra Madre del Sur. Pinus leiophylla es nativo de Mxico, extendindose a lo largo de
la Sierra Madre Occidental y del eje Neovolcnico, encontrndose en un rango
altitudinal de (1500-)1900-2900(-3300) msnm, incrementndose gradualmente de norte
a sur (Farjon y Styles, 1997; Lpez-Upton, 2002).
3.1.2.
Descripcin
Esta especie crece en un rango de 15 a 30 m de alto (Lpez-Upton, 2002; Muslem y

Martnez, 2003), presenta hojas en fascculos de 5, con longitud de 8 a 13 cm, y vaina
caediza. Los conos son ovoides, con frecuencia puntiagudos, ligeramente asimtricos,
de 4 a 6 cm de longitud, rara vez ms; los conos son persistentes, y solitarios o en
grupos desde 2 hasta 6, con pednculos de 5 a 15 mm (Muslem y Martnez, 2003). La
madera de P. leiophylla es relativamente densa, pesada, dura, resinosa, de color plido
o algo amarillenta o anaranjada (Lpez-Upton, 2002; Muslem y Martnez, 2003).
3.1.3.
Usos
La madera de P. leiophylla es usada para construcciones, traviesas de ferrocarril, lea,

cajas de empaque, postes para cerca, durmientes, pilotes, madera aserrada, as como
para duelas y muebles rsticos. Su producto ms relevante ha sido la resina, y durante
muchos aos fue una fuente importante de carbn vegetal (Farjon y Styles, 1997;
Lpez-Upton, 2002; Muslem y Martnez, 2003).
Por su gran habilidad para sobrevivir a los incendios, esta especie de pino puede ser
utilizada en los programas de reforestacin en Mxico, con fines de proteccin y
recuperacin de suelos degradados, as como para cortinas rompe vientos (Muslem y
Martnez, 2003).
3.1.4.
Plagas y enfermedades
Los rboles de P. leiophylla presentan conos muy susceptibles al hongo Caeoma

conigenum Heds. et Hunt. Tambin son susceptibles al ataque del murdago enano
(Arceuthobium spp.) (Muslem y Martnez, 2003). Entre los insectos que se alimentan
de floema y corteza, destacan por su importancia, los gneros Dendroctonus e Ips. De
acuerdo con Cibrin et al. (1995) las especies de Dendroctonus que atacan ms
frecuentemente a P. leiophylla son D. approximatus, D. mexicanus, D. parallelocollis, y
D. valens.
3.2. Descortezadores
Los descortezadores de la familia Scolytidae se ubican entre los insectos forestales
ms significativos econmicamente (Paine et al., 1997). El gnero Dendroctonus es el
ms importante dentro de este grupo; en Mxico se encuentran 11 de las 19 especies
de este gnero, varias de ellas tienen gran importancia econmica, al grado de que se
les conoce como las plagas forestales ms dainas del pas en trminos comerciales
(Cibrin et al., 1995). La mayor parte de estos descortezadores no son considerados
como plagas en su ambiente nativo, pero cuando se introducen a nuevas reas, y
particularmente donde hay plantaciones de Pinus spp., pueden devenir rpidamente en
plagas (Zhou et al., 2004).
Aunque
se
distribuyen
en
un
amplio
rango
de
rboles
hospedantes,
los
descortezadores primarios y secundarios que se alimentan del tejido subcortical de las

conferas son particularmente interesantes por lo siguiente:
-
El uso de feromonas de agregacin, que asegura la colonizacin masiva del

rbol hospedante (Paine et al., 1997); y
Sus interacciones con los hongos asociados (Paine et al., 1997).
Se han investigado tres estrategias generales en la vida de los escoltidos en relacin a

su asociacin con los hongos: primaria, secundaria, y saproftica. Los descortezadores
primarios incluyen el gnero Dendroctonus (e.g. D. frontalis Zimmermann, D. vitei
Wood, D. mexicanus, D. adjunctus, D. brevicomis LeConte, D. ponderosae Hopkins, y
D. jeffreyi Hopkins) y del gnero Ips (e.g. Ips typographus (Linnaeus)), los cuales
atacan rboles vivos sanos, y los matan como resultado de la colonizacin en masa.
Cuando las poblaciones de descortezadores estn a una densidad baja, colonizan los
rboles de bajo vigor (Paine et al., 1997).
Los descortezadores secundarios (e.g. Ips pini (Say), Scolytus ventralis LeConte, D.
rufipennis (Kirby), D. pseudotsugae Hopkins, Dendroctonus simplex LeConte, o
Tomicus piniperda (Linnaeus)) son parsitos facultativos capaces de colonizar rboles
debilitados, estresados y muertos recientemente (Paine et al., 1997).
El tercer patrn general de historia de vida es la saproftica; es la ms comn y agrupa
el mayor nmero de especies. Los escoltidos de este grupo colonizan rboles muertos
y su interaccin con rboles vivos es mnima (Paine et al., 1997).
El proceso de colonizacin de rboles por descortezadores puede ser dividido en
dispersin y seleccin, concentracin y establecimiento. La produccin de feromonas
de agregacin durante la concentracin contina en tanto los rboles se resistan a la
colonizacin del escarabajo. La fase de establecimiento comienza cuando se detiene la
resistencia del hospedante y la muerte del rbol es segura; slo entonces los
escarabajos producirn galeras e iniciarn la oviposicin. As, la construccin de la
galera del escarabajo y la oviposicin pueden ser usados como bioensayos para
indicar cuando la mortalidad del rbol ha ocurrido (Paine et al., 1997).
El comportamiento de la colonizacin de los escarabajos puede vincularse
directamente a la resistencia del rbol: cuando la densidad del ataque del escarabajo
est por debajo del umbral de resistencia y las defensas del rbol no se reducen, los
insectos continan produciendo feromonas de agregacin, pero la agregacin finaliza
una vez que la resistencia del hospedante ha sido agotada (Paine et al., 1997).
3.3. Dendroctonus mexicanus Hopkins
En Mxico, D. mexicanus presenta una amplia distribucin geogrfica, donde sea que
prosperen bosques de pino, y es casi continua en el eje Neovolcnico (Figura 1), en un
rango amplio de elevaciones, que va de 1600 a 2800 msnm (Ziga et al., 2006).
Dendroctonus mexicanus tiene gran importancia econmica, ya que sus infestaciones
contribuyen a la deforestacin de regiones completas del centro del pas. D. mexicanus
tiene como hospedantes a Pinus ayacahuite Ehren, P. lawsoni Roezl, P. leiophylla, P.

montezumae Lamb., P. oocarpa Schiede, P. ponderosa Douglas ex Lawson, P.
pseudotrobus Lindl., P. rudis Endl., y P. teocote Schiede ex Schltdl. (Wood, 1982), y el
impacto que causa en la produccin de madera es relevante, ya que con frecuencia
obliga a realizar cortas de saneamiento y aprovechamiento de rboles muertos (Cibrin
et al., 1995). D. mexicanus se reporta como el insecto descortezador que mayor dao
causa a los bosques de pino en Mxico (Snchez y Torres, 2007).
Figura 1.
Distribucin geogrfica de Dendroctonus mexicanus (Ziga et al., 2006).
Los adultos de D. mexicanus presentan un tamao promedio 3.2 mm (Wood, 1982). La

coloracin es caf muy oscuro, casi negro y brillante. El declive elitral es convexo, con
las estras fuertemente marcadas. Las setas del declive son de ms de dos tamaos y
son moderadamente abundantes (Cibrin et al., 1995). Esta especie presenta tres a
cinco generaciones por ao. La mayor parte de la vida juvenil de D. mexicanus
transcurre en el interior del floema y de la corteza externa del rbol (Cibrin et al.,
1995).
3.4. Manchado de la madera

El manchado azul es la coloracin de la albura (Figura 2), en forma radial, en tonos de
azul, gris, rojo, verde, o negro, que puede ser causada por alrededor de 100 a 250
especies de hongos pertenecientes a los ascomicetos y deuteromicetos. Existen tres
grupos generales de hongos de la mancha azul: 1) Ophiostoma, Ceratocystis y
Ceratocystiopsis; 2) levaduras negras tales como Hormonema dematioides Lagerberg
&. Melin, Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud, Rhinocladiella atrovirens
Nannfeldt, y especies de Phialophora; 3) mohos oscuros como Alternaria alternata (Fr.)
Keissl., Cladosporium sphaerospermum Penz., y C. cladosporioides (Frescenius)
(Williams, 2005; Schmidt, 2006).
Figura 2.
Rodaja de Pinus leiophylla con mancha azul.
Las hifas penetran en la madera a travs de secciones transversales o radiales de

fisuras de la corteza y pasan a travs de los rayos medulares. Los nutrientes de fcil
acceso (azcares, carbohidratos, almidn, protenas, grasas, extractivos) los hongos
los toman a partir de las clulas de los radios del parnquima. Despus de colonizar las
clulas de los rayos, las hifas penetran en las traqueidas longitudinales con presin
mecnica a travs del torus de las puntuaciones con reborde, y crecen all de clula a
clula a travs de las puntuaciones (Schmidt, 2006). Esta habilidad de los hongos de
invadir la albura es considerada como la caracterstica ms importante relacionada con
la mortalidad de los rboles, an ms importante que la habilidad que tienen de
producir lesiones necrticas en la corteza interna (Yamaoka, 2004).
Aunque hay micro hifas especiales en los hongos de la mancha azul, que pueden
traspasar la pared celular de la madera, probablemente por la presin fsica y/o accin
enzimtica, en la mayora de los casos las propiedades de resistencia de la madera no
son afectadas, y el dao a la madera causado por los hongos de la mancha azul es
principalmente cosmtico (Schmidt, 2006). Tambin se generan problemas en el
material, por ejemplo, al dar el acabado a la madera que ha sufrido de la mancha azul,
ya que la permeabilidad de la madera es dispareja, y la aplicacin de tintas y barnices
es problemtica.
A pesar de que los hongos de mancha azul no reducen significativamente la calidad de
la madera, la decoloracin es considerado como un dao sustancial y es un problema
perpetuo en la madera. A pesar de las medidas que se toman para evitar la mancha
azul (tala durante la temporada de fro, apilado de la madera con ventilacin), el dao
llega a producirse (Schmidt, 2006).
Para un control efectivo de la mancha azul, es necesario que se entienda la biologa de
las especies de hongos involucradas, as como el papel del posible descortezador
vector durante el proceso de infeccin (Zhou, 2002). Las especies del gnero
Ophiostoma son los hongos ms comnmente asociados a los descortezadores que
tienen importancia econmica, puesto que causan la mancha azul de la madera y/o la
mortalidad en conferas (Zhou, 2002; Lim et al., 2004).
3.5. Asociacin descortezador-hongo
Muchos
descortezadores
que
infestan
rboles,
son
vectores
de
hongos
ophiostomatoides, particularmente del genero Ophiostoma y Ceratocystis, estos

hongos esporulan en las galeras de los descortezadores, los propgulos de los hongos
son transportados en los micangios, o exoesqueleto, o en el aparato digestivo de los
escarabajos (Jacobs et al., 1997; Paine et al., 1997; Zhou, 2002; Zhou et al., 2004;
Yamaoka, 2004; Massoumi et al., 2007).
En el gnero Dendroctonus, hay dos tipos principales de micangio: micangio maxilar y
micangio torcico. Estas estructuras consisten de invaginaciones de cutcula a lo largo
del margen interior del pronoto (Wingfield et al., 1993; Paine et al., 1997). Los hongos
son adquiridos en los micangios cuando los individuos son adultos (Wingfield et al.,
1993).
La relacin entre hongos ophiostomatoides y sus descortezadores vectores varan
entre los diferentes hospedantes, especies de hongos, y la especie de descortezador.
La relacin entre los escarabajos y los hongos de la mancha azul ha sido descrita como
simbitica o mutualista (Paine et al., 1997; Zhou, 2002). Los descortezadores
asociados con hongos, se benefician de los hongos porque pueden proveer parte de
los nutrientes requeridos para la reproduccin y desarrollo del descortezador. Tambin
les ayudan a superar las defensas de rboles hospedantes vivos mediante la
penetracin del micelio y la liberacin de toxinas, as como para acondicionar
fsicamente el tejido del hospedante, y modifican la qumica o el contenido de humedad
del floema, hacindolo favorable para el desarrollo de los insectos, y limitando el
crecimiento de otras especies de hongos (Wingfield et al., 1993; Paine et al., 1997;
Zhou, 2002; Massoumi et al., 2007). Los hongos presumiblemente se benefician por
estar consistentemente diseminados por los descortezadores a nuevos rboles
hospedantes (Paine et al., 1997; Zhou, 2002; Massoumi et al., 2007).
Por otro lado, la respuesta de los rboles a la inoculacin con hongos de
descortezadores ha sido usada como un indicador de resistencia a la invasin de los
insectos (Wingfield et al., 1993). Aunque la respuesta inducida ha sido descrita como
inespecfica, la inoculacin por diferentes especies de hongos produce diferentes
intensidades de respuesta. Sin embargo, es aparente que los hongos solos no son
responsables de la muerte del rbol, y que es la interaccin dinmica de los
descortezadores, los hongos inoculados, la intensidad de respuesta del rbol (tamao
de las lesiones, composicin qumica y propiedades fsicas de la presin, flujo y
cristalizacin de la resina), y la tasa de formacin de la lesin los que determinan el
xito del ataque (Paine et al., 1997). Una colonizacin rpida por un gran nmero de
descortezadores puede matar al rbol antes de que la reaccin inducida pueda
formarse, a pesar de que puede ser altamente efectiva en prevenir exitosamente el
ataque de unos cuantos individuos (Wingfield et al., 1993).
10
Los marchitamientos vasculares causados por hongos se caracterizan por el bloqueo

que stos hacen al sistema de conduccin de lquidos de los rboles, dando como
resultado la muerte de partes o de toda la planta. En rboles muertos, los hongos
pueden continuar su desarrollo mientras exista alto contenido de humedad en la
madera (Cibrin et al., 2007).
3.6. Hongos ophiostomatoides
Los hongos ophiostomatoides se encuentran agrupados artificialmente en gneros
similares morfolgicamente, incluyendo Ophiostoma, Ceratocystis, Ceratocystiopsis,
Gondwanamyces, y Cornuvesica. Aunque morfolgicamente similares, estos gneros
son relativamente distantes filogenticamente. Los anamorfos asociados con estos
gneros son: Pesotum, Leptographium, Sporothrix, Thielaviopsis, Hyalorhinocladiella,
Knoxdaviesia, y Xenochalara (Zhou, 2002).
El gnero Ceratocystis se distingue de otros hongos ophiostomatoides por su ascomata
en forma de frasco, su anamorfo Thielaviopsis tpico, y su susceptibilidad a la
cicloheximida, que es un antibitico que impide la sntesis de protenas en la mayora
de los eucariotas (Harrington, 1981; Loppnau y Breuil, 2003).
En los ophiostomatoides, en la clase Sordariomycetes se encuentra el orden
Ophiostomatales, integrado por la familia Ophiostomataceae, en la que se encuentran
los gneros Ophiostoma, Ceratocystiopsis, Graphilbum, Grosmannia, Fragosphaeria,
Pesotum, Leptographium, Raffaelea, Hyalorhinocladiella y Sporothrix (Seifert et al.,
2013).
La mayora de los ascomicetos, incluyendo el gnero Ophiostoma, se caracterizan por
tener un ciclo de vida que incluye dos estados reproductivos: el sexual (teleomorfo), y
el asexual (anamorfo). En el estado sexual las ascosporas se producen en ascas que
estn contenidas dentro de un cuerpo fructfero, llamado peritecio (Figura 3). En la
forma asexual, el micelio haploide vegetativo produce uno o dos tipos de conidiforos
portando esporas asexuales (conidios), que germinan para producir micelio haploide
(Lim et al., 2004).
11
Los hongos ophiostomatoides son agrupados colectivamente como ascomicetos con

peritecio de cuello largo, asca evanescente y ascosporas hialinas que carecen de poros
o ranuras, y todas estas especies parecen ser dispersadas por artrpodos (Zhou,
2002).
Figura 3.
Ascomata representativos del orden Ophiostomatales (Seifert et al., 2013).
La mayor parte de los hongos ophiostomatoides producen sus ascosporas en una

gotita de lquido mucilaginoso en la punta del ostiolo del cuello del peritecio (Figura 4),
el cual parece ayudar a la fijacin de las esporas a la superficie del vector. Los hongos
12
ophiostomatoides producen una gran variedad de anamorfos, a menudo incluso dentro

de la misma especie (Wingfield et al., 1993).
Figura 4.
Ascosporas acumuladas en la punta del cuello del peritecio.
Al menos 24 especies de ophiostomatoides se han reportado en Mxico: Ophiostoma

abietinum Marm. & Butin, O. nigrocarpum (Davidson) de Hoog, O. conicola Marm. &
Butin, O. hyalothecium (Davidson) Hausner, Reid & Klassen, O. ips (Rumbold) Nannf.,
O. minus (Hedgcock) H. & P. Sydow, O. piceae (Mnch) Syd. & P. Syd., O. piliferum
(Fr.) Syd. & P. Syd., O. pluriannulatum (Hedgc.) Syd. & P. Syd., O. angusticollis (Wright
& Griffin) Villarreal, O. olivaceapini (Davidson) Seifert & Okada, similar a O. galeiformis,
similar a O. adjuncti (Davidson) Harr., similar O. montium (Rumbold) Arx (O.
pulvinisporum Zhou & Wingf.), Ceratocystis tubicollis Olchow. & Reid, C. adiposa
(Butler) Moreau, C. fimbriata Ellis & Halst., Ceratocystiopsis collifera Marm. & Butin, C.
fasciata (Olchow. & Reid) Upadhyay, C. minuta (Siemaszko) Upadhyay & Kendr.,
Pesotum sp., Leptographium guttulatum Wingf. &. Jacobs, L. terebrantis Barras & Perry
y Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins (Marmolejo y Butin, 1993; Zhou et al., 2004;
Terrazas, 2006; Prez-Vera et al., 2009; Prez et al., 2011).
13
3.6.1.
Ophiostoma
En el mundo se han reportado 207 especies del gnero Ophiostoma (Index Fungorum,
2013), el cual se caracteriza por su peritecio oscuro de cuello largo, que contiene ascas
evanescentes, y ascosporas unicelulares hialinas rodeadas por una envoltura
mucilaginosa (Wingfield et al., 1993; Jacobs y Wingfield, 2001). Ophiostoma tiene
anamorfos de los gneros Pesotum, Leptographium, Hyalorhinocladiella, y Sporothrix
(Figura 5), que se distinguen por la diferencia en la estructura del conidiforo y en los
patrones de desarrollo de conidios (Aghayeva et al., 2004).
Por muchos aos, Ophiostoma fue tratado como un sinnimo de Ceratocystis, basado
en caracteres morfolgicos. Sin embargo, en la dcada de 1960, se fueron encontrando
caracteres bioqumicos para distinguir entre estos dos taxa. Las especies con anamorfo
Thielaviopsis y sin celulosa y ramnosa en sus paredes celulares, fueron tratadas como
Ceratocystis sensu stricto, mientras aquellas con anamorfos Leptographium, Sporothrix
y Pesotum, con celulosa y ramnosa en sus paredes celulares, fueron colocados en
Ophiostoma. Asimismo, para apoyar las agrupaciones taxonmicas, fue introducida la
alta tolerancia a la cicloheximida para distinguir entre Ophiostoma y Ceratocystis
(Harrington, 1981; Zhou, 2002).
Basados en las pequeas secuencias del ADNr (18S), el gnero Pesotum, fue
reestructurado para incluir a todos los anamorfos similares a Graphium del gnero
Ophiostoma, y se estableci el gnero Xenochalara para agrupar las especies similares
a Chalara (Zhou, 2002).
Los
integrantes
del
gnero
Ophiostoma
representan
un
grupo
importante
econmicamente que incluye algunos patgenos de plantas. Quizs los conocidos

como ms destructivos son Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf., y O. novo-ulmi Brasier
(Jacobs et al., 1997), que han diezmado notablemente las poblaciones de olmos en
Europa y Norte Amrica.
14
Figura 5.
Formas de anamorfos del orden Ophiostomatales (Seifert et al., 2013).
15
3.6.2.
Ceratocystiopsis
El gnero Ceratocystiopsis fue establecido por Upadhyay y Kendrick, tipificado por C.

minuta, es caracterizador por su ascocarpo hialino, color marrn oscuro o negro, con
base globosa a subglobosa, y cuello relativamente corto, que es usualmente ahusado
hacia la punta, con hifas ostiolares convergentes, dispuestas cnicamente o a veces
divergentes, asca evanescente y ascosporas hialinas aseptadas, rodeadas por una
masa mucilaginosa, y con conidios holoblsticos o heteroblsticos (Wingfield et al.,
1993; Upadhyay, 1981).
3.6.3.
Fragosphaeria
Este gnero fue descrito por Shear en 1923, y fue asociado con los Ophiostomatales
por Suh y Blackwell en 1999. Se caracteriza por su ascocarpo en forma de cleistotecio,
ascosporas reniformes con poca pigmentacin y sus anamorfos Sporothrix (Seifert et
al., 2013).
3.6.4.
Grosmannia
Este gnero se caracteriza por su ascocarpo con base globosa, cuellos de longitud
variable, y ascosporas con una envoltura mucilaginosa cuculada (Linnakoski et al.,
2012).
3.6.5.
Graphilbum
Este gnero se caracteriza por sus peritecios caf oscuro a negro, con bases globosas;
cuello caf oscuro a negro, recto a ligeramente curveado, cilndrico a cnico; ostiolo a
veces rodeado por hifas ostiolares. Ascas evanescentes. Ascosporas hialinas
aseptadas, cilndricas a oblongas, rodeadas por una envoltura mucilaginosa osiforme a
rectangular. Con anamorfos sinematosos y mononematosos (Seifert et al., 2013).
3.6.6.
Leptographium
Leptographium es grupo heterogneo de especies que incluye diversos anamorfos de

Ophiostoma spp., y de muchas otras especies que nunca han mostrado un estado
sexual. A menudo, Leptographium spp. exhiben alto pleomorfismo, con caractersticas
morfolgicas inestables, y por lo tanto son confundidas frecuentemente con otras
especies de hongos relacionadas (Lim et al., 2004). Debido a que muchas especies de
16
Leptographium tienen como teleomorfos a Ophiostoma, el gnero puede ser restringido

slo a anamorfos de Ophiostoma (Wingfield et al., 1993), y por tanto se encuentran
asociados a los descortezadores e insectos relacionados que infestan rboles; muchos
de estos hongos causan el manchado azul de la madera (Wingfield et al., 1993;
Yamaoka, 2007). Al igual que Ophiostoma, las especies de Leptographium son
tolerantes a altas concentraciones del antibitico cicloheximida en medio de cultivo, y
son caracterizadas por la presencia de celulosa, ramnosa y quitina en sus paredes
celulares (Jacobs y Wingfield, 2001).
Las especies de Leptographium se identifican por su conidiforo mononematoso
grande, oscuro y solitario, que da lugar a una o ms series de brazos (mtulas),
terminando en clulas conidigenas en cabezas parecidas a un pincel; los conidios se
acumulan en una masa mucilaginosa en el pice del conidiforo, situndose as de
forma ideal para su dispersin por insectos (Wingfield et al., 1993; Jacobs y Wingfield,
2001; Lim et al., 2004; Massoumi et al., 2007).
Ninguna clave integra todas las especies de Leptographium u Ophiostoma con estados
Leptographium existentes, lo que hace que este grupo de hongos sea difcil de
identificar morfolgicamente (Wingfield et al., 1993; Jacobs y Wingfield, 2001).
3.6.7.
Pesotum
El gnero Pesotum se cre para dar cabida a las especies que producen tanto
conidiforos sinematosos como mononematosos, con proliferacin de clulas
conidigenas simpodiales, que sostienen una masa de conidios pegajosos en sus
pices (Lim et al., 2004; Kamgan, 2008).
3.6.8.
Sporothrix
Las especies de Sporothrix asociados con las especies de Ophiostoma representan

slo uno de una serie de linajes morfolgicamente similares pero filogenticamente
diferentes (Aghayeva et al., 2004). La invariable presencia de ramnosa en sus paredes
celulares, un azcar relativamente poco comn en el reino de hongos, justifica la
suposicin de que las especies de Sporothrix son anamorfos de Ophiostoma (Wingfield
et al., 1993). Los conidiforos de Sporothrix son micronematosos, con clulas
17
conidigenas que tienen dentculos prominentes en el punto de desprendimiento del

conidio (Harrington, 2001).
3.6.9.
Hyalorhinocladiella
Hyalorhinocladiella es caracterizada por conidiforos micronematosos que carecen de

dentculos prominentes como puntos de separacin del conidio que son tpicos de
especies de Sporothrix, con conidios ssiles con bases truncadas; la forma del conidio
puede ser cilndrica, clavada o en forma de Y (Wingfield et al., 1993; Harrington, 2001;
Massoumi et al., 2007). Sin embargo, la distincin entre Hyalorhinocladiella y Sporothrix
basado en morfologa no es claro por las formas intermedias entre los dos gneros
(Wingfield et al., 1993; Aghayeva et al., 2004). El anamorfo Hyalorhinocladiella se
encuentran principalmente en la seccin Ips, descrita por Seifert et al. (2013),
caracterizados por la presencia de ascosporas enfundadas rectangulares y en el
gnero Ceratocystiopsis, caracterizadas por ascosporas falcadas con una capa de
pared celular parecida a una vaina (Wingfield et al., 1993).
3.6.10. Raffaelea
Raffaelea fue introducido por Arx y Hennebert en 1965, para un grupo de hongos
anamrficos que viven en simbiosis con descortezadores. El gnero Raffaelea no tiene
teleomorfos conocidos, y se caracteriza por sus estructuras conidigenas pequeas
parecidas a las del gnero Hyalorhinocladiella (Seifert et al., 2013).
3.7. Identificacin de hongos microscpicos
Hasta hace poco, las especies de Ophiostoma se haban identificado con base en la
forma de sus ascosporas y su peritecio, y por la morfologa del anamorfo. Por ejemplo,
Ophiostoma clavigerum (Rob.-Jeffr. & Davidson) Harr., O. robustum Rob.-Jeffr. &
Davidson) Harr., y O. aureum (Rob.-Jeffr. & Davidson) Harr., aisladas de pinos
atacados por descortezadores, se clasificaron originalmente por la morfologa de sus
teleomorfos y anamorfos. Sin embargo, debido a que el teleomorfo ha sido
escasamente reportado desde que estas especies se describieron originalmente, su
identificacin
se
ha basado
tpicamente
en
sus anamorfos,
particularmente
Leptographium y Pesotum (Lim et al., 2004).
18
Sin embargo, sta identificacin puede ser subjetiva y las comparaciones moleculares
muestran que algunas identificaciones tempranas basadas slo en el fenotipo fueron
inexactas (Chen et al., 2011). La identificacin por medios moleculares utilizando
isozimas y secuencias de ADN se emplea actualmente cuando la identificacin
morfolgica de los hongos no es concluyente (Lim et al., 2004).
Los mtodos moleculares para caracterizar, identificar y clasificar los organismos se
basan en la informacin objetiva (molecular) que se deriva de los organismos; por ello
los mtodos moleculares se utilizan cada vez ms para identificar organismos y para la
investigacin taxonmica (sistemtica molecular). En la dcada de 1980, se
establecieron los mtodos moleculares para los hongos que causan pudricin y el
manchado de la madera. Para stos se usan las protenas de hongos (enzimas) y los
cidos nucleicos (Schmidt, 2006).
El procedimiento de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), multiplica una parte
de ADN por un ciclo de temperatura de tres etapas repetidas (amplificacin): la doble
cadena se divide en sus cadenas simples a ~94C (desnaturalizacin), dos cebadores
de nucletidos (15-30 bases) se unen a la regin de cido nucleico complementaria a
35-60C (hibridacin), y una polimerasa termoestable sintetiza dos nuevas cadenas
simples a ~72C (extensin). En las tcnicas de PCR en tiempo real, se detecta la
acumulacin de producto de PCR en cada ciclo de amplificacin, ya sea mediante el
uso de un colorante o una sonda fluorescente (Schmidt, 2006).
Las unidades repetitivas del ADNr nuclear de eucariotas constan de los dominios
conservados de codificacin 18S y 28S. Las regiones conservadas se utilizan
preferentemente para los anlisis filogenticos de los gneros, familias y rdenes. Las
secuencias de ADNr se pueden utilizar para el diagnstico y para el anlisis filogentico
de las relaciones entre los hongos (Schmidt, 2006). El ADNr es una secuencia molde
comn que ha sido usada extensivamente para la diferenciacin de especies que
causan el manchado de la madera (Loppnau y Breuil, 2003).
19
4.
MATERIALES Y MTODOS
El procedimiento consisti en obtener especmenes de Dendroctonus mexicanus en

Pinus leiophylla var. leiophylla, y de las galeras que produce el insecto en el rbol. Lo
anterior, con el propsito de colectar las esporas de los hongos asociados con el
descortezador. Posteriormente, se prepararon cultivos puros de cada uno de los
hongos en condiciones axnicas. Finalmente, se identificaron los hongos mediante un
estudio morfolgico microscpico, y mediante la comparacin de una parte de su
genoma con la base de datos de secuencias depositadas en el GenBank (Figura 6).
Figura 6.
Esquema de actividades realizadas para la identificacin de hongos

Ophiostomatales.
20
4.1. Colecta de insectos y galeras

En el verano de 2012, se seleccionaron tres rboles de P. leiophylla var. leiophylla de
27 aos de edad aproximadamente, con presencia evidente de ataque de D.
mexicanus, en Plutarco Elas Calles, Michoacn (Anexo 1), en una localizacin
geogrficas de 19272.3 latitud Norte y 1014610.1 longitud Oeste, a una altitud de
2143 msnm. Los rboles seleccionados presentaban una coloracin amarilla a rojizo en
el follaje (Figura 7), con algunas ramas verdes en el pice del rbol, el fuste presentaba
grumos de resina de coloracin lechosa a rojizo, dependiendo del tiempo que haba
pasado desde que el descortezador haba atacado el rbol.
Figura 7.
Pinus leiophylla var. leiophylla con Dendroctonus mexicanus. A) rboles con
follaje amarillento a rojizo. B) Grumo de resina con aserrn. C) Pupas y pre adultos.
Los tres rboles se derribaron, y se levant la corteza de las partes con afectacin por
el descortezador. All se colectaron 20 insectos adultos de D. mexicanus, y se
conservaron en frascos con etanol al 95%; otros individuos vivos se depositaron
individualmente en micro-viales estriles de 1.5 ml. Tambin se tomaron muestras de
corteza con las galeras correspondientes al lugar de donde se colectaron los insectos.
No se detect la presencia de otro descortezador en las galeras.
21
Los rboles derribados se cortaron en trozas de 50 cm de longitud. En el campo se

seleccionaron tres trozas por rbol con ataque del descortezador, y se colocaron en
cmaras de incubacin de acero galvanizado. Estas cmaras se transportaron a la
Divisin de Ciencias Forestales, para colocarlas en un invernadero a una temperatura
mayor a 20C, y se mantuvieron en observacin durante 15 das (Figura 8). Lo anterior,
con el fin de colectar ms ejemplares adultos del descortezador, los que se usaran
posteriormente en el laboratorio para los aislamientos. La colecta de insectos en las
cmaras de incubacin se realiz diariamente durante 15 das; se obtuvieron un total
de 430 insectos adultos.
Figura 8.
A) Cmara de incubacin. B) Trozas de Pinus leiophylla var. leiophylla en la

cmara de incubacin.
4.2. Identificacin del descortezador

Los insectos de los frascos con etanol se observaron con un microscopio de diseccin
Leica ZOOM 2000 (Leica Microsystems, Alemania) (Figura 9) y un microscopio de luz
Leica DM500 (Leica Microsystems), equipado con una cmara CCD, y un equipo
adicional de fibra ptica para la iluminacin. Las mediciones se realizaron con el
software las EZ. Los ejemplares se compararon con la clave Wood (1982) y con la
clave de Cibrin et al. (1995). Esto se realiz para verificar que el insecto colectado
fuera D. mexicanus. Tambin se analiz la forma de las galeras del descortezador en
la corteza interna de los rboles derribados.
22
Figura 9.
Dendroctonus mexicanus. A) D. mexicanus en el microscopio de diseccin. B)

Declive elitral en microscopio de luz.
Por otra parte, el insecto fue analizado sin preparacin en un microscopio electrnico
de barrido, Carl Zeiss EVO MA15 (Alemania) operando a bajo vaco.
4.3. Identificacin del hospedante
En el campo se colectaron conos y ramillas de los tres rboles derribados, y en el
laboratorio se corrobor la identidad del hospedante con la clave de Guzar (2009).
4.4. Aislamiento de los hongos
Las cortezas con galeras se colocaron en cmaras al 95-100% de humedad relativa a
25C en oscuridad durante 20 das para inducir la produccin del teleomorfo y
ascosporas (Figura 10A). En condiciones estriles, se examinaron las galeras del
descortezador (Figura 10B), se seleccionaron las estructuras sexuales (peritecios), y se
colocaron en medio selectivo para especies de Ophiostoma: extracto de malta-agar
(EMA) al 2% adicionado con cicloheximida al 0.05% y sulfato de estreptomicina al
0.04%, que haba sido previamente vertido en cajas de Petri estriles desechables; se
sembraron 128 cajas en total. Las cajas se incubaron en una en una cmara de
ambiente controlado KBW720 (Binder, Alemania) con humedad relativa del 75% a 25C
en la oscuridad.
23
Figura 10.
Corteza con galeras. A) Corteza en cmara de humedad. B) Desarrollo de

peritecios en corteza.
Por otra parte, se prepar una solucin estril de lavado, consistente en Tween 20 al
0.01%, y se verti 1 ml en 30 micro-viales, que contenan un escarabajo adulto cada
uno, siguiendo el procedimiento de Massoumi et al. (2007). Enseguida se agitaron en
un vortex por 3 minutos para remover las esporas del cuerpo de los insectos. Se
prepar una solucin serial de la solucin de lavado (1:5, 1:25 y 1:125), y se aplic 0.1
ml de cada una de las soluciones en cajas de Petri con medio de cultivo selectivo para
Ophiostoma con EMA al 1%. Las cajas se incubaron a 75% de humedad relativa a
25C en la oscuridad; 30 cajas en total.
Tambin se sembraron 79 insectos adultos individualmente en cajas de Petri con medio
de cultivo selectivo para Ophiostoma con EMA al 2% (Figura 11), las que tambin se
incubaron en las condiciones anteriormente descritas.
24
Figura 11.
Dendroctonus mexicanus sembrado en EMA al 2%, con desarrollo de la fase

anamrfica de un hongo ophiostomatal.
Cuando se observ crecimientos del micelio en cada una de las cajas, las puntas del
micelio se transfirieron a cajas nuevas con EMA al 2%, con el fin de obtener cultivos
tentativamente puros.
Finalmente,
se
obtuvieron
cultivos puros
mediante
la
transferencia de discos de 3 mm de dimetro de la orilla del micelio de cada cultivo, a

cajas nuevas con 2% EMA. Posteriormente, los cultivos se agruparon de acuerdo a la
coloracin de las colonias y a su tipo de crecimiento, para facilitar el uso de las claves
para su identificacin. De los cultivos puros se registraron los incrementos de
crecimiento y la coloracin de las colonias cada dos das, hasta que el micelio cubri la
caja; el periodo de crecimiento vari de 8 a 15 das.
Por otro lado, para inducir el teleomorfo, se inocularon con micelio unos cubos de
madera esterilizados en una fuente de
60
Co (Anexo 2). Para facilitar la produccin de
peritecios, las cajas se colocaron en cmaras de humedad (Figura 12), en la oscuridad

a 25C, hasta que se observ la presencia de peritecios (ca. 30 das).
25
Figura 12.
Cubos de madera inoculados con hongo.
4.5. Identificacin morfolgica de los hongos

Al final del proceso de aislamiento, los cultivos se agruparon de acuerdo a la
coloracin, tipo de crecimiento, y se determin de manera tentativa la existencia de 19
especies diferentes, de las cuales se seleccionaron las diez ms distintivas para el
estudio morfolgico. La identificacin morfolgica se realiz mediante la observacin y
medicin de las estructuras reproductivas (sexual y asexual), con el apoyo de los
microscopios de luz y electrnico de barrido. Para la evaluacin del color de las
colonias se utilizo la tabla de Munsell.
4.5.1.
Microscopa de luz
Para la microscopa de luz, se coloc una gota de lactofenol azul de algodn en un

portaobjetos, y en el lquido un fragmento del micelio de las cajas que se obtuvieron
con cultivos puros, y se cubri con un cubre-objetos. En el microscopio se efectuaron
10 mediciones de los conidiforos por preparacin, tomando los siguientes datos:
forma, largo y ancho del conidio, tipo de ramificacin del conidiforo (slo para
Leptographium), presencia o ausencia de rizoide (slo para Leptographium), y largo y
ancho del conidiforo. Los promedios y rangos de estos parmetros se utilizaron para
la identificacin del hongo con la ayuda de la clave de Jacobs y Wingfield (2001).
26
De las cortezas con galeras del descortezador, se obtuvieron ejemplares del hongo en
su fase sexual, mismos que se prepararon para observarse al microscopio de luz
usando el procedimiento de tincin arriba descrito para el micelio. De los peritecios se
registr el largo y ancho de la base, el largo y ancho del cuello ostiolar, y la presencia o
ausencia de hifas ostiolares. Las mediciones se hicieron en 25-30 peritecios. Para la
identificacin del teleomorfo se utiliz la clave de Upadhyay (1981).
4.5.2.
Microscopa electrnica de barrido
Para realizar la observacin y mediciones en el microscopio electrnico de barrido, se

tomaron muestras de micelio de 30 das, creciendo en EMA al 2%, y de los peritecios.
Las muestras se fijaron con glutaraldehdo al 2.5% durante 24 horas. Despus se
lavaron tres veces con amortiguador de fosfato de Sorensen, por 5 minutos cada uno.
Posteriormente, los tejidos se deshidrataron en una serie de diluciones de etanol (30,
40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100%) durante 45 minutos en cada una. Los especmenes
deshidratados se secaron con la tcnica del punto crtico de CO2, en una secadora
Sandri-780A (TOUSIMIS Research Corporation, USA) por 45 min, y se colocaron en un
portamuestra de aluminio con cinta adhesiva de carbn. Finalmente, los especmenes
se recubrieron con oro durante 8 minutos en una ionizadora de metales Fine Coat JFC1100 (JEOL Ltd., Japn), (Figura 13A). Las observaciones se realizaron en un
microscopio electrnico de barrido JSM-6390 (JEOL Ltd., Japn), operando a 10 kV, en
el Laboratorio de Microscopa Electrnica del Colegio de Postgraduados, en Montecillo,
Estado de Mxico (Figura13B).
27
Figura 13.
Laboratorio de microscopa electrnica del Colegio de Postgraduados. A)
Ionizadora de metales en funcionamiento. B) Microscopio electrnico de barrido Jeol-6390.
4.6. Identificacin de hongos por mtodos moleculares

La identificacin morfolgica fue reforzada mediante la secuenciacin parcial de ADNr y
parcial del gen que codifica para la -tubulina de aislamientos representativos de las 19
especies. La identificacin molecular incluy la extraccin, amplificacin, purificacin y
secuenciacin del ADN. Para obtener micelio para la identificacin molecular, se
transfirieron discos de 3 mm de dimetro de micelio de los cultivos puros a nuevas
cajas de Petri de 14 cm con EMA al 2%, y se incubaron a 25C en oscuridad hasta que
cubrieron por completo la caja de Petri.
4.6.1.
Extraccin de ADN
La extraccin de ADN se realiz con el kit comercial ZR Fungal/bacterial DNA MiniPrep

(Catlogo D6005, Zymo Research Corporation, USA). Se tomaron aproximadamente
200 mg del micelio, y se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Despus se
adicionaron 750 l de la solucin lisis, y con la ayuda de un micropistilo de plstico
desinfectado, se tritur el micelio. El micelio macerado se coloc en el tubo del kit que
contena esferas blancas de cermica (tubo de lisis), y se vortexe por 5 min para
romper las clulas y disolver las membranas. El tubo se centrifug a 10,000 x g por 1
min en una microcentrfuga GenFuge 24D (Progen, Inglaterra), y luego se transfirieron
400 l del sobrenadante a un tubo con una malla molecular de slice. Este tubo se
28
coloc dentro de un tubo colector, y este arreglo se centrifug a 7,000 rpm por 1 min.
Con este procedimiento se filtr el ADN, que se qued en solucin en el tubo colector,
mientras que en la malla se quedaron atrapadas las impurezas. Al tubo colector se le
adicionaron enseguida 1.2 ml de DNA Binding Buffer (adicionado con -mercaptoetanol
a una concentracin final de 0.5%). Posteriormente, de la mezcla contenida en el tubo
colector, se transfirieron 800 l a la columna Zymo-Spin (mini columna porosa de
slice), la cual se puso dentro de otro tubo colector, y se centrifug a 10,000 x g por 1
min; el sobrenadante se desech, y se repiti el procedimiento; con esto se adhiri el
ADN a la columna de slice, y las impurezas se desecharon en el lquido. En seguida se
adicionaron 250 l del buffer DNA-pre-wash a la columna Zymo-Spin que se haba
colocado sobre otro tubo colector, y se procedi a centrifugar a 10,000 x g por 1 min,
desechndose el lquido del tubo colector. Con este procedimiento se limpi el ADN de
protenas (el ADN todava estaba adherido a la columna). Posteriormente se
adicionaron 500 l del buffer DNA-wash a la columna Zymo-Spin, y se centrifug a
10,000 x g por 1 min, para terminar de limpiar el ADN, que todava se encontraba
adherido a la columna de slice. La columna Zymo-Spin se coloc en un tubo
Eppendorf de 1.5 ml, se adicionaron 40 l del buffer de elusin de DNA directamente a
la columna, y se centrifug a 10,000 x g por 30 s para elur el ADN, quedando el ADN
en solucin en el tubo Eppendorf.
4.6.2.
Purificacin
Para purificar y concentrar el ADN, se utiliz el kit comercial OneStep PCR Inhibitor
Removal (catlogo D6030, Zymo Research Corporation). El tubo de tapa verde se
acondicion colocndolo en un tubo colector, y centrifugndolo a 8,000 x g por 3 min,
desechndose el lquido; ya acondicionado se coloc en un tubo Eppendorf de 1.5 ml.
El ADN se pipete al tubo acondicionado, y este arreglo se centrifug a 8,000 x g por 1
min, quedando el ADN limpio en el Eppendorf.
4.6.3.
Cuantificacin
Con el fin de obtener buenos resultados en pasos posteriores y estandarizar la

concentracin, se prepar un gel al 1% de agarosa para biologa molecular (catlogo
161-3100, Bio-Rad, USA) en buffer Tris-borato-EDTA 1x (TBE) (catlogo 161-0733,
29
Bio-Rad), y se cargaron en cada pocito del gel 20 l de ADN mezclados con 5 l de

una solucin buffer para cargar el ADN (catlogo 161-0767, Bio-Rad), adicionado con
0.06 g l-1 de bromuro de etidio (catlogo 161-0433, Bio-Rad). En uno de los pocitos
se carg una escalera molecular Lambda DNA/HindIII (catlogo SM0101, Thermo
Scientific, USA), mezclada con el mismo buffer y con el bromuro de etidio. La
electroforesis del gel se corri durante 3 h a 75 V en una celda Mini-Sub Cell GT (BioRad). El gel se observ en un transiluminador TFX-20M (Life Technologies, Francia) a
312 nm y se registraron los datos de concentracin y tamao aproximado de la
molcula de ADN. Tambin se midi la calidad y la concentracin del ADN con el
espectrmetro de microplacas Synergy 2 (Biotek, USA), equipado con el aditamento
Take3 de 16 posiciones; se utilizaron 2 l de ADN de cada muestra para tomar la
lectura.
El tamao de la molcula de ADN extrada fue en general > 9.5 kb. La calidad del ADN
sin purificar, basada en la relacin A260/A280 fue en promedio de 1.98 (Figura 14), la
cual se encuentra dentro del rango de buena calidad (rango 1.5-2) para una reaccin
exitosa de la polimerasa. La concentracin del ADN extrado purificado fue en promedio
de 42 ng l-1, pero antes de hacer la PCR, la concentracin se estandariz a 30-40 ng
l-1, excepto para tres extracciones, que estaban dos a 26 ng l-1 y una a 24 ng l-1.
2
1.8
Absorbancia
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
200
220
240
260
280
300
320
340
Longitud de onda (nm)
Figura 14.
Espectro UV del ADN extrado de los aislamientos.
30
4.6.4.
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Para amplificar la regin ITS1-5.8S-ITS2 del espaciador transcrito interno (ITS, por su
siglas en ingls) del ADNr, se utilizaron los oligonucletidos iniciadores (primers) ITS1F (5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3) e ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)
(Zhou et al., 2004), y para amplificar una regin del gen de la -tubulina se utilizaron los
primers
T10
(5-ACGATAGGTTCACCTCCAGAC-3)
BT12
(5-
GTTGTCAATGCAGAAGGTCTC-3) (Loppnau y Breuil, 2003). Los primers se

sintetizaron en Integrated DNA Technologies (Iowa, USA), y se purificaron con el
mtodo de HPLC. La amplificacin se realiz con la tcnica de PCR de punto final
utilizando el kit comercial Phire Plant Direct PCR (catlogo F-130X, Finnzymes, Thermo
Fisher Scientific).
A tubos estriles de 0.5 ml para PCR (catlogo 0030124537, Eppendorf, Alemania), se
agregaron los siguientes componentes para un volumen final de la reaccin de 50 l:
21 l de H2O libre de nucleasas (catlogo R0581, Thermo Scientific), 25 l de 2x Phire
Plant PCR Buffer (incluye los dNTPs y una concentracin de 1.5mM de MgCl 2 en la
reaccin final), 1 l del primer mix de ITS o -tubulina segn fue el caso, con una
concentracin final en la reaccin de 0.5 M, 1.5 U de Phire Hot Start II DNA
polymerase, y 2 l de ADN. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador
Genius (Techne, Gran Bretaa), primero aplicando una temperatura de 98C por 5 min
para activar la polimerasa, seguido de 40 ciclos de: 1) 5 s a 98C; para romper los
puentes de hidrgeno entre las dos cadenas del molde de ADN y as separarlas; 2) 5 s
a 52.7C para ITS y 59C para -tubulina, para que se asocien los primers a los sitios
complementarios del molde y, 3) 20 s a 72C para que la polimerasa lleve a cabo la
sntesis de una hebra nueva que corresponde a la regin de inters. Despus de
terminar los ciclos, se mantuvieron los tubos a 72C por 1 min para asegurar que la
amplificacin de las secuencias en los extremos sea terminada, y de inmediato se
pusieron a 4C; un control negativo (sin ADN) se corri en cada PCR. Para todas las
manipulaciones de ADN y de los reactivos para las reacciones de PCR se utilizaron
puntas ART Barrier para micropipeta, grado PCR, con filtro para aerosoles (catlogos
2065E y 2140-05, Thermo Scientific).
31
Por otro lado, se realiz de tres especies tentativamente encontradas la PCR directa
(sin extraccin de ADN) de los peritecios. Se colocaron 10 peritecios morfolgicamente
similares en un tubo Eppendorf estril de 1.5 ml, y se adicionaron 20 l del buffer de
dilucin del kit para PCR, y se trituraron; del producto resultante se utilizaron 2 l para
hacer la PCR, con el mtodo anteriormente descrito.
Para remover los residuos de dNTPs, primers, magnesio y polimerasa, los productos
de PCR se purificaron con el kit comercial DNA clean & concentrator (catlogo D4033,
Zymo Research Corporation). Finalmente, para determinar la calidad y concentracin
del producto de la PCR, se corrieron electroforesis con agar para PCR (catlogo 1613113, Bio-Rad) al 3%, cargando 10 l del producto de la PCR purificado con 5 l de
buffer para cargar que contena 0.06 g l-1 de bromuro de etidio. Para medir
tentativamente el tamao del amplicn, en uno de los pocitos se carg la escalera
molecular a 100 pares de bases ZR 100 bp DNA Marker (catlogo M5002-50, Zymo
Research Corporation), mezclada con el mismo buffer y con el bromuro de etidio. Las
electroforesis se corrieron a 75 volts por 2 horas; adicionalmente se midi la calidad y
concentracin en el Sinergy 2, con el fin de cumplir los requerimientos para la
secuenciacin de la empresa Macrogen (50 ng l-1).
4.6.5.
Secuenciacin
La secuenciacin se realiz para los productos de la PCR de los 19 aislamientos y tres

de peritecios, en ambas direcciones (5-3 y 3-5), en un ABI Autosequencer (Applied
Biosystems, USA) en Macrogen (Sel, Corea) (Anexo 3), con los primers empleados
para la PCR. Las 88 secuencias obtenidas se editaron en BioEdit. Posteriormente, las
secuencias consenso se compararon con la base de datos del GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),
utilizando
la
herramienta
BLAST,
se
descargaron las secuencias con los valores ms altos tanto de cobertura como de
similitud para su anlisis posterior.
4.7. Anlisis filogentico
La alineacin mltiple de las secuencias de ADNr (seis obtenidas en este estudio y 10
obtenidas del GenBank), se realiz en Clustal Omega con sus opciones automticas.
Para determinar la relacin filogentica se hicieron anlisis de distancias en el
32
programa MEGA 5.2, con los mtodos de parsimonia y de Neighbor-Joining, con un

anlisis de bootstrap de 1000 rplicas para determinar los niveles de confianza de los
nodos. Los espacios fueron tratados como datos faltantes. El rbol ms parsimonioso
se obtuvo usando la opcin Tree-Bisection-Regrafting, con bsqueda de nivel 1, donde
el rbol inicial se obtuvo de la adicin aleatoria de secuencias (100 rplicas).
4.8. Anlisis estadstico
La frecuencia de ocurrencia de cada especie de hongo aislada del cuerpo y la galera
del insecto fue calculada usando la siguiente frmula:
; donde F
representa la frecuencia de ocurrencia (%) de los hongos de cada uno de los mtodos
de donde se obtuvo el aislamiento; NS representa el nmero de siembras donde se
observ cada hongo particular que fue aislado y NTs representa el nmero total de
siembras (Massoumi et al., 2006; Yamaoka, 2004).
33
5.
RESULTADOS Y DISCUSIN
5.1. Identificacin del descortezador
El descortezador fue identificado como Dendroctonus mexicanus; las caractersticas

que llevaron a dicha identificacin fueron: el tamao de las setas en el declive elitral, y
la longitud y el color del insecto adulto (Figura 15).
Figura 15.
Dendroctonus mexicanus, A) perfil del cuerpo. B) acercamiento al declive elitral.

C) antena.
El tamao promedio registrado fue de 4 mm para el insecto adulto; todos los

ejemplares se encontraron en el rango de 2.3 a 4.5 mm que sealan Cibrin et al.
(1995) para D. mexicanus. El cuerpo del insecto fue de coloracin oscura casi negra, el
declive elitral present setas de ms de dos tamaos. Por otra parte las galeras en la
34
corteza interna de los rboles colonizados fueron sinuosas, y el sitio de colecta se

encontr dentro de la distribucin natural del descortezador, adems de ubicarse en el
rango altitudinal de 1600-2800 msnm que seala Ziga et al. (2006), para D.
mexicanus.
5.2. Identificacin del hospedante
El hospedante se identific como Pinus leiophylla var. leiophylla por poseer fascculos
de cinco acculas, vaina caediza, umbo dorsal en las escamas del cono, semillas con
ala, conos persistentes, ovoides, de 5-7 cm de longitud. La identificacin de la especie
fue confirmada por el Dr. Enrique Guzar Nolasco, encargado del Herbario de la
Divisin de Ciencias Forestales.
5.3. Aislamiento de los hongos
Se obtuvieron un total de 19 aislamientos, 10 de galeras, 7 del cuerpo del insecto, y 2
de la solucin Tween 20. Para la identificacin morfolgica, se seleccionaron 10 de los
19 aislamientos con caractersticas en cultivo tpicas de anamorfos de Ophiostomatales
para la identificacin morfolgica. Los peritecios slo se produjeron en dos de los 10
aislamientos que se utilizaron para inocular los cubos de madera.
5.4. Identificacin morfolgica
En las galeras de la corteza se encontraron tres especies de Ophiostoma.
Ophiostoma nigrocarpum
Los peritecios no se desarrollaron en medio de cultivo, pero si se desarrollaron en los
cubos de madera. La base del peritecio es globosa y oscura, con un dimetro promedio
de 158 m [rango 125-214 m, descrito en el presente trabajo como (125-)158(-214)].
El cuello ostiolar present una longitud de (36.6-)103(-163) m, y ancho de (20.4)26.8(-36.2) m, sin hifa ostiolar. Las ascosporas son de forma reniforme a elipsoide
con una longitud de (4.8-)5.1(-5.3) m y ancho de (1.8-)2.1(-2.4) m (Figura 16). La
colonia fue hialina. El anamorfo no se pudo observar en el microscopio de luz, y no se
tom como especie representativa para su estudio en el microscopio electrnico.
35
Las caractersticas morfolgicas de esta especie fueron similares a las caractersticas

reportadas por Upadhyay (1981) para O. nigrocarpum, pero difiere en el dimetro de la
base del peritecio, siendo ms grande en la especie descrita en el presente estudio.
Figura 16.
Ophiostoma nigrocarpum. A, B, C) Peritecios. D) Ascosporas. E) Colonia.
36
Ophiostoma conicola
Los peritecios no se desarrollaron en medio de cultivo. La base del peritecio es globosa
y oscura con ornamentos, con un dimetro de la base de (62.6-)124(-165) m; el cuello
ostiolar tiene una longitud bimodal de (233-)491-744(-1065) m y ancho de (11.5)16.8(-19.3) m, y es estriado, haciendo un torsal; hay hifas ostiolares presentes, con
longitud de (15.4-)22.6(-50.2) m; las ascosporas presentaron una forma reniforme a
alantoide con una longitud de (2.76-)3.43(-3.84) m y ancho de (1.23-)1.34(-1.51)
(Figura 17). Esta especie no se encontr en las claves. Pero es similar a Ophiostoma
conicolum (conicola) reportada por Marmolejo y Butin (1993) en conos de P.
cembroides Zucc. atacados por Conophthorus cembroides Wood en el estado de
Nuevo Len, Mxico.
Figura 17.
Ophiostoma conicola. A) Peritecio. B) Cuello ostiolar con ascosporas. C) pice

del cuello con hifas ostiolares. D) Ascosporas.
37
Ophiostoma ips
Los peritecios no se desarrollaron en medio de cultivo. La base del peritecio es globosa
y oscura, con un dimetro de (66.4-)127(-207) m. El cuello ostiolar tiene una longitud
de (520-)855(-1324) m y ancho de (12.8-)17.5(-23.9) m (Figura 18). No se pudieron
observar las ascosporas. La colonia presento un dimetro de 65 mm en 6 das a 25C.
Present el anamorfo Hyalorhinocladiella (sp.1).
Las caractersticas morfolgicas de esta especie son similares a O. ips, descrita por
Upadhyay (1981) y Marmolejo y Butin (1993).
Figura 18.
Ophiostoma ips. A) Peritecio. B) Cuello ostiolar. C) pice del cuello sin hifas
ostiolares.
38
Por otro lado, los estudios morfolgicos de los aislamientos indicaron la presencia de
los anamorfos Leptographium, Hyalorhinocladiella, y Sporothrix (Cuadro 1).
Cuadro 1.
Caractersticas morfolgicas de especies Ophiostomatales aisladas.
Especie de hongo
Longitud del
Tipo de ramiconidiforo m
ficacin
Forma del
conidio
Tamao del
conidio m
Tasa de
crecimiento
(mm/da)
Leptographium terebrantis 1 (87.4-)142(-179)
oval a elipsoide
8.33x4.00
7.91
Leptographium terebrantis 2 (28.8-)90.5(-152)
subgloboso a oval
6.21x5.10
3.51
Leptographium elegans
(30.6-)42.5(-50.1)
oblongo a elipsoide
2.63x1.16
5.70
Leptographium sibiricum
(53.3-)71.9(-98.7)
oblongo
3.10x1.06
4.80
Leptographium sp.1
(64.8-)115(-216)
subgloboso
2.60x2.15
4.86
Hyalorhinocladiella sp.1
(51.0-)76.0(-116)
NA
oblongo a oval
4.60x1.67
11.0
(11.6-)13.4(-15.8)
NA
oblongo a oval
2.90x1.22
2.61
(13.7-)57.2(-143)
NA
oblongo a elipsoide
9.63x4.12
3.67
Sporothrix sp.1
NA
NA
oval a elipsoide
2.20x1.32
0.43
NA= no aplica
Leptographium terebrantis 1
Las colonias presentaron un crecimiento radial con una tasa de crecimiento de 7.91
mm da-1, el micelio creci de forma area y tambin inmerso en el medio de cultivo; las
hifas son septadas. La coloracin de la colonia en los primeros dos das fue blanca
tornndose color oliva con la edad. Los conidiforos presentaron un tamao de (87.4)142(-179) m, con una longitud del aparato conidiognico de (49.8-)93.4(-127) m y
ramificacin tipo B (2-3 ramas), rizoides ausentes. La forma del conidio fue oval a
elipsoide con una longitud de (5.8-)8.33(-11.3) m y ancho de (2.47-)4(-4.07) m
(Figura 19). De los cultivos en MA no se produjeron peritecios.
Las caractersticas morfolgicas obtenidas del aislamiento de L. terebrantis fueron
similares con las descritas previamente en la literatura (Jacobs y Wingfield, 2001;
Cibrin et al., 2007).
39
Figura 19.
Leptographium terebrantis 1. A, B) Conidiforo. C) Conidiognesis. D) Conidios.

E) Colonia.
40
El crecimiento de las colonias fue irregular, con una tasa de crecimiento de 3.51 mm
da-1, el micelio creci sumergido y areo, hifas septadas, la coloracin de la colonia
durante los primeros dos das fue blanca y se torno caf olivo oscuro con la edad. Los
conidiforos presentaron una longitud de (28.8-)90.5(-152) m, con un aparato
conidiognico de (16-)48.5(-81.5) m, con ramificacin tipo B (3 ramificaciones); la
forma del conidio fue subglogoso a oval con una longitud de (5.02-)6.21(-7.84) m y
ancho (4.02-)5.1(-6.51) m (Figura 20). No se desarrollaron peritecios en el medio de
cultivo ni en los cubos de madera. Esta especie fue similar a la descrita en la literatura
como L. terebrantis (Jacobs y Wingfield, 2001), a pesar de que la longitud del
conidiforo en este estudio fue menor.
Figura 20.
Leptographium terebrantis 2. A, B, C) Conidiforos. D) Conidios. E) Colonia.
41
Similar a Leptographium elegans

Las colonias presentaron un crecimiento radial con una tasa de crecimiento de 5.7 mm
da-1, el micelio creci sumergido en el medio de cultivo y areo, hifas septadas. La
coloracin en los primeros das fue en unas partes blanca y en otras olivo claro,
tornndose oscura con la edad. El tamao del conidiforo fue de (30.6-)42.5(-50.1) m,
con ramificacin tipo B (3 ramificaciones), ausencia de rizoides. La forma de conidio fue
oblongo a elipsoide con una longitud de (2.10-)2.63(-3.15) m ancho de (1.02-)1.16(1.49) m (Figura 21). No se produjeron peritecios en el medio de cultivo ni en los cubos
de madera. Esta especie present caractersticas morfolgicas similares a L. elegans
Wingf., Crous & Tzean descrita por Jacobs y Wingfield (2001).
Figura 21.
Similar a Leptographium elegans. A) Conidiforo. B) Conidiognesis. C)

Conidios. D) Colonia.
42
Similar a Leptographium sibiricum

El crecimiento de la colonia fue radial, con una tasa de crecimiento de 4.8 mm da-1. El
micelio creci inmerso y areo con hifas septadas. Color de la colonia fue blanca en los
primeros dos das, tornndose caf olivo con la edad. El tamao del conidiforo fue de
(53.3-)71.9(-98.7) m, con ramificacin tipo B (2-3 ramificaciones). Los rizoides fueron
auscentes. La forma del conidio fue oblongo con una longitud de (2.80-)3.10(-3.31) m
y ancho de (1.01-)1.06(-1.13) m (Figura 22). Sin peritecios en el medio de cultivo y
tampoco en los cubos de madera. Esta especie fue similar a la descrita por Jacobs y
Wingfield (2001) como L. sibiricum Jacobs & Wingf., aunque la longitud del conidiforo
es menor en la especie encontrada en el presente estudio.
Figura 22.
Similar a Leptographium sibiricum. A) Conidiforo. B) Conidiognesis. C)

Conidios. D) Colonia.
43
Leptographium sp. 1
La colonia present un crecimiento radial, y una tasa de crecimiento de 4.86 mm da-1.
El micelio creci inmerso en el medio de cultivo y areo, hifas septadas, la coloracin
en los primeros dos das fue hialino, cambiando a caf olivo con la edad. Longitud del
conidiforo (64.8-)115.5(-216.2) m, con ramificacin tipo A (2 ramificaciones),
ausencia de rizoides. Los conidios de forma subglobosa, con una longitud de (2.26-)
2.66(-3.36) m y ancho de (1.83-)2.15(-2.57) m (Figura 23). No crecieron peritecios en
el medio de cultivo ni en los cubos de madera.
Esta especie no se pudo identificar con la clave de Jacobs y Wingfield (2001).
Figura 23.
Leptographium sp.1. A, B) Conidiforos. C) Conidios. D) Colonia.
44
Hyalorhinocladiella sp.1.
El crecimiento de la colonia fue radial, con una tasa de crecimiento de 11 mm da-1, el
micelio creci sumergido en medio de cultivo y areo, hifas septadas, colonia de color
caf claro durante los primeros dos das, tornndose negro con la edad (Figura 24). Los
conidiforos fueron de (51-)76(-116) m de longitud. La forma del conidio fue oblongo a
oval de (3.86-)4.66(-5.22) m de largo, y de (1.17-)1.67(-2.11) m de ancho. Sin
peritecios en el medio de cultivo ni en los cubos de madera.
Figura 24.
Hyalorhinocladiella sp.1. A) Conidiforo. B) Conidios. C) Colonia.
45
El crecimiento de la colonia fue irregular, con una tasa de crecimiento de 2.61 mm da-1,
el micelio creci sumergido en medio de cultivo y areo, hifas septadas, de color blanco
durante los primeros cuatro das tornndose amarillo plido con la edad (Figura 25).
Los conidiforos de longitud (11.6-)13.4(-15.8) m. Los conidios tenan la forma
oblongo a oval, elipsoide largo (2.18-)2.9(-5.56) m y ancho (1-)1.22(-2.19) m. Sin
peritecios en el medio de cultivo ni en los cubos de madera.
Figura 25.
Hyalorhinocladiella sp.2. A, B) Conidiforo. C) Conidios. D) Colonia.
46
El crecimiento de la colonia fue radial, con una tasa de crecimiento de 3.67 mm da-1, el
micelio creci sumergido en el medio de cultivo y areo, hifas septadas, colonias
hialinas los primeros cuatro das, tornndose caf olivo claro en los cultivos de ms
edad (Figura 26). Los conidiforos presentaron una longitud de (13.7-)34.9-73.5(-143)
m. La forma del conidio fue oblongo a elipsoide longitud (7.24-)9.63(-12) m y ancho
(3.23)4.12(4.89) m. Sin peritecios en el medio de cultivo ni en cubos de madera.
Figura 26.
Hyalorhinocladiella sp.3. A, B, C) Conidiforos. D) Conidios. E) Colonia.
47
Sporothrix sp.1
La colonia present crecimiento radial, con una tasa de crecimiento de 0.43 mm da-1,
el micelio se desarroll de sumergido y areo, colonia de color blanco. No se pudieron
observar los conidiforos. La forma del conidio fue oval a elipsoide, de (1.7-)2.22(-2.85)
m de largo, y ancho (1.03-)1.32(-1.6) m (Figura 27). No se presentaron peritecios en
el medio de cultivo.
La caracterstica que llev a identificar esta especie como Sporothrix sp. fue la
presencia de dentculos de donde se desprenden los conidios.
Figura 27.
Sporothrix sp.1. A) Conidiforo. B) Agrupacin de conidios en microscopio
electrnico de barrido. C, D) Agrupaciones de conidiforos en microscopio de luz.
48
Los alineamientos en BLAST (seccin 5.5) de las secuencias de los anamorfos

descritos en las pginas precedentes, arrojaron la mayor similitud con Leptographium
terebrantis, Ophiostoma nigrocarpum, O. ips y O. montium (Cuadro 2). Ophiostoma ips
y O. montium son similares morfolgicamente (Kim et al., 2003), por lo que parece
justificarse un estudio de crecimiento a 5C y 35C, como lo sugieren Kim et al. (2003),
para corroborar si se tratan de las dos especies de Ophiostoma, o de una sola.
Cuadro 2.
Especies identificadas morfolgicamente, con la alineacin de mayor
similitud de su amplicn de la -tubulina.

Aislamiento
Especie alineada en BLAST
Nmero de
Similitud (%)
acceso
Leptographium terebrantis 1 Leptographium terebrantis
AY544622.1
98
Leptographium terebrantis 2 Leptographium terebrantis
AY544622.1
97
Leptographium elegans *
Ninguna
Leptographium sibiricum *
Ninguna
Leptographium sp.1
Leptographium terebrantis
AY544622.1
98
Ophiostoma ips
AY194949.1
95
AY789149.1
97
Ophiostoma montium
AY194963.1
96
Sporothrix sp.1
AY789149.1
99
* La secuenciacin fue de mala calidad
Finalmente, los resultados de la identificacin morfolgica concuerdan en lo general

con el reporte de Zhou et al. (2004), quienes identificaron morfolgicamente seis
especies ophiostomatoides asociados a D. mexicanus en P. pseudostrobus en el
estado de Chiapas, a saber, Ceratocystiopsis minuta, una especie similar a
Ophiostoma galeiformis, O. pluriannulatum, una especie de Hyalorhinocladiella, y dos
especies Sporothrix.
En lo que se refiere a la asociacin de los hongos con el descortezador, O.
nigrocarpum (Hyalorhinocladiella sp.2) y L. terebrantis (L. terebrantis 1, L. terebrantis 2,
y Leptographium sp.1) tuvieron la ms alta frecuencia de ocurrencia (F) (Cuadro 3). Por
lo cual se puede decir que son las especies que presentan una asociacin ms
estrecha con D. mexicanus en P. leiophylla.
49
Cuadro 3.
Frecuencia de ocurrencia (%) de anamorfos de especies Ophiostomatales
aisladas de Dendroctonus mexicanus y sus galeras.

Especie
Frecuencia de ocurrencia (%)

D. mexicanus Galeras Tween
10
Leptographium elegans
Leptographium sibiricum
29
Leptographium sp.1
16
10
43
Sporothrix sp.1
38
5.5. Identificacin molecular

Los amplicones purificados resultantes de la PCR fueron aproximadamente de 600 a
700 pb de largo para el ITS, y de 700 a 900 pb para el gen de la -tubulina, con una
concentracin tpica de alrededor de 75 ng l-1 (Figura 28), de acuerdo a lo observado
en el gel de la electroforesis.
50
Figura 28.
Electroforesis de productos de PCR de especies Ophiostomatales. M) escalera
molecular. 1ITS y 1-t) Ophiostoma sp. 2ITS y 2-t) Hyalorhinocladiella sp. 2. 3ITS y 3-t)
Hyalorhinocladiella sp. 1. CN) Control negativo.
Por otro lado, la concentracin obtenida en el espectrmetro Sinergy 2 fue de (51.5)96.3(-162) ng l-1 para el amplicn del ITS, y de (57.4-)84(-152) ng l-1 para el
amplicn de la -tubulina. Cumpliendo con el requerimiento mnimo de 50 ng l-1
solicitado por la empresa Macrogen para realizar la secuenciacin.
Las secuencias obtenidas fueron en promedio de 570 pb para el ITS (Anexo 4) y de
767 pb para la -tubulina (Anexo 5). Estas secuencias se utilizaron para la
identificacin de las especies mediante el uso del BLAST (Figura 29).
51
Figura 29.
Resultado que se muestra en BLAST.
Dos de los tres amplicones de la -tubulina de la PCR de los peritecios (PCR directa)
(Anexo 6), se alinearon en BLAST con O. nigrocarpum, con 95% y 97% de similitud,
descritas en el cuadro 4.
Cuadro 4.
Alineacin de las secuencias de la PCR directa de peritecios.
PCR directa Especie alineada en BLAST

-t
Nmero de Similitud
acceso
(%)
Hospedero
Origen
Fuente del
aislamiento
Peritecio 1
AY789149.1
95
Pinus radiata Nueva Zelanda
Trozas
Peritecio 2
AY789149.1
97
Pinus radiata Nueva Zelanda
Trozas
Por otro lado, de la secuencia de la -tubulina de los 19 aislamientos (anamorfos)

(Anexo 6), slo se identificaron en BLAST cuatro especies de Ophiostomatales: O.
nigrocarpum, O. ips, O. montium y L. terebrantis (Cuadro 5). L. terebrantis ha sido
reportado asociado a varias especies de descortezadores, como Dendroctonus
frontalis, D. terebrans, D. brevicomis, D. valens, Ips pini, Tomicus piniperda, Hylurgops
porosus, Hylastes tenuis e Hylobius spp. (Eckhardt, 2003; Jacobs y Wingfield, 2001; Six
52
et al., 2003; Hausner et al., 2005; Cibrin et al., 2007), y se ha considerado como un
hongo altamente patognico (Paine et al., 1997), que induce significativamente el
desarrollo de lesiones despus de la inoculacin en varias especies de pinos (Matusick
y Eckhardt, 2010).
Similarmente, de la secuencia del ITS de los 19 aislamientos (anamorfos) (Anexo 7),
slo se identificaron en BLAST tres especies de Ophiostomatales: Ophiostoma
pulvinisporum,
O.
rectangulosporium
(ahora
Graphilbum
rectangulosporium)
Sporothrix sp. (Cuadro 5). Estos resultados coinciden con el estudio de Zhou et al.
(2004), quienes encontraron a O. pulvinisporum asociada a D. mexicanus en P.
pseudostrobus, as como el anamorfo Sporothrix, pero difiere en la presencia de la
especie Graphilbum rectangulosporium. Esta ltima especie no ha sido reportada en
Mxico, pero existen reportes de su existencia en Pityogenes chalcographus, y en
galeras de Pityogenes bidentatusen en P. sylvestris en Polonia (Jankowiak y Kot,
2011), y tambin en las galeras y el cuerpo de Polygrapus proximus infestando Abies
mariesii en Japn (Ohtaka et al., 2006).
La especie Hyalorhinocladiella sp.1 se aline con O. pulvinisporum en el caso del ITS y
con O. ips con el amplicn de la -tubulina. Sin embargo, tuvo mayor porcentaje de
similitud con O. ips, y aunque las dos especies estn asociadas a D. mexicanus (Zhou
et al., 2004), las caractersticas morfolgicas del teleomorfo de Hyalorhinocladiella sp.1
son ms parecidas a O. ips.
53
Cuadro 5.
Especies alineadas en BLAST.
Aislamiento
ITS
-t
Fuente del aislamiento
Especie alineada en BLAST
Nmero de
acceso
Similitud
(%)
Hospedero
Origen
Fuente del aislamiento
Hyalorhinocladiella sp1.
Galeras
Ophiostoma pulvinisporum
AY546713.1
89
Pinus pseudostrobus
Mxico
Dendroctonus mexicanus
Hyalorhinocladiella sp2.
Galeras
Sporothrix sp.
AY546722.1
95
P. maximinoi
Mxico
Ips calligraphus
Aislamiento 2
Galeras
O. cf. rectangulosporium
GU393357.1
97
P. brutia, P. halepensis y P. pinea
EUA
Orthotomicus erosus
Aislamiento 3
Galeras
O. cf. rectangulosporium
GU393357.1
98
P. brutia, P. halepensis y P. pinea
EUA
O. erosus
Aislamiento 4
Galeras
Sporothrix sp.
AY546722.1
97
P. maximinoi
Mxico
I. calligraphus
Aislamiento 5
Galeras
Sporothrix sp.
AY546722.1
97
P. maximinoi
Mxico
I. calligraphus
Galeras
L. terebrantis
AY544622.1
98
P. contorta
Canad
Albura
D. mexicanus
L. terebrantis
AY267826.1
98
N.R.
Canad
D. ponderosae y D. jeffreyi
Leptographium sp.1
D. mexicanus
L. terebrantis
AY544622.1
98
P. contorta
Canad
Albura
Galeras
O. ips
AY194949.1
95
P. contorta
Canad
N.R.
Galeras
O. nigrocarpum
AY789149.1
97
P. radiata
Nueva Zelanda
Trozas
D. mexicanus
O. montium
AY194963.1
96
P. ponderosa
EUA
D. ponderosae
Sporothrix sp.1
Tween
O. nigrocarpum
AY789149.1
99
P. radiata
Nueva Zelanda
Trozas
Aislamiento 1
D. mexicanus
L. terebrantis
DQ118421.1
99
P. contorta
Canad
D. ponderosae
Aislamiento 3
Galeras
O. nigrocarpum
AY789149.1
97
P. radiata
Nueva Zelanda
Trozas
Aislamiento 4
Galeras
O. nigrocarpum
AY789149.1
93
P. radiata
Nueva Zelanda
Trozas
Aislamiento 5
Galeras
O. nigrocarpum
AY789149.1
98
P. radiata
Nueva Zelanda
Trozas
Aislamiento 6
Tween
O. nigrocarpum
AY789149.1
92
P. radiata
Nueva Zelanda
Trozas
N.R.=No reportado
Nota: los aislamientos 1 al 6 slo se les realiz caracterizacin molecular.
54
5.6. Anlisis filogentico

El alineamiento mltiple del ADNr result en 956 caracteres (Figura 30). Para los
rboles de las especies con el ITS (Figuras 31 y 32), se muestra que hay una relacin
estrecha entre el aislamiento 5 y Hyalorhinocladiella sp.2 con Sporothrix sp., y que las
especies Hyalorhinocladiella sp.1, aislamiento 2, aislamiento 3 y aislamiento 4 se
encuentran fuertemente ligados a Ophiostoma rectangulosporium (Graphilbum
rectangulosporium).
Figura 30.
Secuencias de ITS alineadas en Clustal Omega.
Figura 31.
Uno de los rboles ms parsimoniosos obtenido del anlisis de ADNr de 16
especies Ophiostomatales. Para la raz del rbol se us la secuencia de O. fusiforme. Los
valores de soporte (bootstrap, 1000 rplicas) se muestran en los nodos.
55
Figura 32.
rbol filogentico de 16 especies Ophiostomatales (ADNr) con el mtodo de
Neighbor-Joining y modelo de la distancia P. Para la raz del rbol se us la secuencia de O.
fusiforme. Los valores de soporte (boostrap, 1000 rplicas) se muestran en los nodos.
56
6.
CONCLUSIONES
En el presente estudio se encontraron once especies Ophiostomatales en las

galeras y el cuerpo de D. mexicanus: Ophiostoma nigrocarpum, una especie
similar a Ophiostoma ips, una especie similar a Ophiostoma conicola,
Graphilbum rectangulosporium, Leptographium terebrantis, tres especies de
Hyalohinocladiella, una especie de Sporothrix, dos especies de Leptographium
sin identificar.
Las especies con ms frecuencia de ocurrencia fueron O. nigrocarpum y L.

terebrantis, lo que indica una relacin especfica entre el descortezador y estas
dos especies de hongos.
La identificacin morfolgica de algunas especies fue impedida por el nmero

insuficiente de caracteres de diagnstico, incluyendo la ausencia de teleomorfo.
Se reporta por primera vez L. terebrantis, O. nigrocarpum y Graphilbum

rectangulosporium asociados a D. mexicanus.
La identificacin molecular, utilizando una concentracin de ADN entre 30-40 ng

l-1 para la PCR, result en una concentracin de la PCR purificada entre (51.5)96.3(-162) ng l-1 para el ITS, y de (57.4-)84(-152) ng l-1 para la -tubulina, por
lo que dicha concentracin del ADN fue la adecuada para tener una PCR con la
concentracin necesaria para obtener las secuencias.
El gen -tubulina fue mejor recurso que el ADNr, porque fue del que se
obtuvieron las mejores secuencias para alinear en el BLAST, y donde se
encontraron ms especies Ophiostomatales.
57
7.
RECOMENDACIONES
Para futuras investigaciones se requiere aumentar el nmero de rboles de pino

utilizados en la colecta, y ubicarlos en diferentes sitios para tener un estudio ms
representativo del descortezador, y del hospedero u hospederos.
Realizar pruebas de patogenicidad de estos hongos para evaluar su potencial

para causar la mancha azul en la madera de P. leiophylla y de ser posible en
otras especies.
Hacer la extraccin de ADN usando -mercaptoetanol, para que el ADN extrado

sea de mejor calidad para realizar la PCR.
58
8.
LITERATURA CITADA
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63
9.
ANEXOS
Anexo 1.
Localizacin del rea infestada por Dendroctonus mexicanus.
64
Anexo 2.
Certificado de esterilizacin de los cubos de madera del Instituto Nacional
de Investigaciones Nucleares.
65
Anexo 3.
Ejemplo de grfica de calidad de la secuenciacin en Macrogen.
66
Anexo 4.
Ejemplo del resultado de la secuenciacin del ITS.
67
Anexo 5.
Ejemplo del resultado de la secuenciacin del gen de la -tubulina.
68
Anexo 6.
Secuencias del gen -tubulina.
>Leptographium terebrantis 1
CCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAACTTGTCGATTCTCCACCAGCTGGTGCACCGATAG
AGTCCCGGCCCTCCGTACCGGGCTCCACAACCGTGTCCGACACCTTGGGGCGACGGCATCACCGA
GAACGTAGCCATCATCCGGTCGGGGAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATTAGCAGGGTGCCCATACC
GGCACCCGTGCCACCGCCCAGGGAGTGCGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCACAGCCCTCAG
CCTCGCGGCGGACGACGTCGAGCACCTGGTCCACAAGCTCGGCACCCTCCGTGTAGTGACCCTTG
GCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGGCCGAAAACGAAGTTGTCAGGCCGGAAGAGCTGTCCGAA
AGGACCGGCGCGCACAGCATCCATTGTGCCGGGCTCGAGATCGACCAGGACGGCGCGGGGCACAT
ACTTGTTGCCCGAGGCCTCGTTGAAGTACACGCTCATACGCTCCAGCTGGAGCTCAGACGTGCCGT
TGTACCTGATAGAACATATTAGATGATATACACCACAATAGACACTCTTCCGAAACCGGAAACCTACA
CTCCATTGCTGTCGAGACCGTGCTCGCTGGAGATCTGCTGCCTGTGAAGTAGGTTAGAATTTGTCAC
TTCAAGCAGATTGCCCAGATGCGTTATTTATAGCTCAGATAAAACTTACCAGAAAGCGGCACCGATCT
GGTTACCCTGTTATGCCATAGCCCGTGTCAGTTTAAAGGTTTGTTTCGTCGGAGCCTGGGGGCCCTG
TAGGGGTCGATTGATTCGGGGTAGGGCGAAACGTACGCTTGGCATCGAAAGACACCCTATTATTTAA
AAAAAAAAAAAAAAAACGGGTTCCGAAA
>Leptographium terebrantis 2
CGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAACTTGTCGAGTTCTCCACCAAGCTGGTGCACCGA
TAGGAAGTTTCGGCCGTTCGTACTGGTCTCCAACAACCGGTGCTCCGACACCTTGGGCGACGGCAT
CACCGGAGAACGTAGCCATCATCCGGTCGGGGAACTCCTCGGCGGATCTTGGAGATTAGCAGGGT
GCCCATACCGGGCACCCGTGCCACCGCCCAGGGAGTGCGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCA
CAGCCCTTCAGCCTCGCGGCGGACGACGTCGAGCACCTGGTCCACAAGCTCGGCACCCTCCGTGT
AGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGGCCGAAAACGAAGTTGTCAGGCCGGAAGA
GCTGTCCGAAAGGACCGGCGCGCACAGCATCCATTGTGCCGGGCTCGAGATCGACCAGGACGGCG
CGGGGCACATACTTGTTGCCCGAGGCCTCGTTGAAGTACACGCTCATACGCTCCAGCTGGAGCTCA
GACGTGCCGTTGTACCTGATAGAACATATTAGATGATATACACCACAATAGACACTCTTCCGAAACCG
GAAACCTACACTCCATTGCTGTCGAGACCGTGCTCGCTGGGAGATCTGCTGCCTGTGAAGTAGGTTT
AGAATTTGTCACTTCAAGCAGATTGCCCAGATGCGTTATTTATAGCTCAGATAAAACTTACCAGAAAG
CGGCACCGATCTGGTTACCCTGTTATGCCATAGCCCGTGTCAGTTTAAAGGTTTGTTTCGTCGGAGC
CTGGGGGTCCTGTTAGGGGGTATCGATTGATTCCGGGGTAGGGCGAAACGTACGCTTGGCATTGA
>Leptographium sp.1
TCCCGCTTCTCTTTTTTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAACTTCGAGTTTCCAC
CAGCTGGTGCACCGATAGAGTCGCCCGGTTTGTACCGGCTCCACAACCGTGTCCGACACCTTTGGG
CGACGGCATCACCGAGAACGTAGCCATCATCCGGTCGGGGAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATTAG
CAGGGTGCCCATACCGGCACCCGTGCCACCGCCCAGGGAGTGCGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGC
TGTCACAGCCCTCAGCCTCGCGGCGGACGACGTCGAGCACCTGGTCCACAAGCTCGGCACCCTCC
GTGTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGGCCGAAAACGAAGTTGTCAGGCCGG
AAGAGCTGTCCGAAAGGACCGGCGCGCACAGCATCCATTGTGCCGGGCTCGAGATCGACCAGGAC
GGCGCGGGGCACATACTTGTTGCCCGAGGCCTCGTTGAAGTACACGCTCATACGCTCCAGCTGGAG
CTCAGACGTGCCGTTGTACCTGATAGAACATATTAGATGATATACACCACAATAGACACTCTTCCGAA
ACCGGAAACCTACACTCCATTGCTGTCGAGACCGTGCTCGCTGGAGATCTGCTGCCTGTGAAGTAG
GTTAGAATTTGTCACTTCAAGCAGATTGCCCAGATGCGTTATTTATAGCTCAGATAAAACTTACCAGA
AAGCGGCACCGATCTGGTTACCCTGTTATGCCATAGCCCGTGTCAGTTTAAGGTTTGTTTCGTCGGA
GCCTGGGGGCCTGTAGGGGTCGAATTGATTTACGGGGGTAGGGCGAACGTACCTTGCA
>Hyalorhinocladiella sp.1
TGGGGGGGGGGGGTTGGGGAGGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAGTTGTCGA
GTTCTCGACCAGCTGGTGCACCGACAGACGTCGGCGTTGTAGGGCTCAACGACCGTGTCGGACAC
CTTGGGCGACGGCACAACGGAGAACGTGGCCATCATGCGGTCGGGGAACTCCTCGCGGATCTTGG
AGATCAGCAGAGTACCCATACCGGCACCGGTACCACCACCCAGGGAGTGGGTGATCTGGAAGCCCT
GAAGGCAGTCGCATGACTCGGCCTCGCGGCGCACGACGTCGAGGACCTGGTCGACCAGCTCGGCA
CCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCGCCGGACTGGCCGAAGACAAAGTTGTCG
69
GGGCGGAACAGCTGACCGAAAGGACCGGCACGGACGGCGTCCATGGTGCCGGGCTCGAGATCGA
CAAGGACGGCACGGGGGACGTACTTGTTGCCAGAGGCCTCGTTGAAGTAGACGCTCAGGCGCTCC
AGCTGCAGGTCGGAGGAGCCATTGTACCTGGGGGTGTTAGATGCGTTACACGGTTGTCGTGCCAGG
CAGGATTGAGGAATACATACACGCCACTGCTGTCAAGACCGTGCTCGCCGGAAATCTGCTGCCAGA
AAGCGGCACCGATTTGGTTACCCTAGGGCAGTGTTAGCAACAAAATACGCATGGACGAGGAACGAG
ATGTCAAAATATCCGGCCAGCACGGGTGTTCCGTTCATGAGGTTAAGCACATGGTAAAAGGGGAGG
TAATACGTACGCACTGACCGCTGAAAAAAAATCTCTTTTTTTTTAATAAAAAAATCAGGCAAAAGTCAA
ATCACA
CAATCCTTTTGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAATCAAGTCTCGTCCGAGTTCTCGAC
CAGCTGGTGGAAGGAGAGAGTGGGCGTTGTAGGGCTCGACGACGGTGTCAGAGACCTTGGGCGAG
GGGACAACGGAGAAGGTGGCCATCATGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATCAGGAG
GGTACCCATACCGGCACCGGTACCACCACCCCAGGGAGTGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTG
TCGCAGGACTCGGCCTCGCGACGGACAACGTCGAGGACCTGGTCGACGAGCTCGGCACCCTCAGT
GTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTTGTCGGGGCGGA
ACAGCTGGCCGAAAGGACCAGCGCGGACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACG
GCACGGGGGACGTACTTGTTGCCGGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCATTTTCACA
CTGGGTGGGCTGGACTGACCTCGTTGAAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGAGGTCCGAGGTG
CCGTTGTAGACACCATTGTTGTCGAGGCCGTGCTCGCCGGAAATCTGCTGCCAGAAAAGCGGCACC
GATTTGGTTACCCTGTTCTATCGCGTTAGTTTTTGTCCATTGTTTACCGTTGTCAATGGTCGCCGTAA
AGAACTCAGAAAGTCGGCTGTCTTTGGGGAGGAAAGGGAGGCTCGGAAGCAGAAGGCAAACGTAC
GCATTGGCGTCTGGGGAACCTTTAA
GGGGAGTGCGGGGTTCCGGGGGGGGCCCTTTTTTTTTTTTTGAAAAAATTAACGGTCTCGTCCGAGT
TCTCAACCAGCTGGTGGATCCGAACAGGCGTTCGCGTTGTACGGCTCAACAACCGTGTCCGACACC
TTGGGCGACGGCACGACCGAGAACGTCGCCATCATGCGGTCGGGGAACTCCTCGCGGATCTTGGA
GATCAGCAGAGTGCCCATACCGGCACCGGTACCACCACCCAGCGAGTGCGTGATCTGGAAGCCCT
GCAGACTGTCGCAGGACTCGGCCTCGCGGCGCACAACGTCCAGCACCTGGTCGACCAGCTCGGCA
CCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCGGACTGACCGAAAACAAAGTTGTCG
GGGCGGAACAGCTGGCCAAAGGGACCAGCACGCACGGCGTCCATGGTGCCGGGCTCCAGATCGA
CCAGCACGGCGCGGGGGACGTACTTGTTGCCCGACGCCTCGTTGAAGTAGACACTCAGGCGCTCC
AGCTGCAGGTCAGACGAGCCATTGTAGACACCGCTGCTGTCCAGGCCGTGCTCGCCTGGAAAATTC
TTGCATTGCCAGAAAGCGGCACCGATCTGGTTACCGCACTGACCGGCTGGAAACCCCCCCCCTTTT
TT
>Sporothrix sp.1
GGTGTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAAAAATTTGTCCGAGTTCTCGACCAGCTGGTTGGA
TGGAGTAGAGTGGGCGTTGTAAGGCTCGACGACGGTGTCAGAGACCTTGGGCGAGGGGACAACGG
AGAAGGTGGCCATCATGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATCAGGAGGGTACCCATAC
CGGCACCGGTACCACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCGCAGGACTCG
GCCTCGCGACGGACAACGTCGAGGACCTGGTCGACGAGCTCGGCACCCTCAGTGTAGTGACCCTT
GGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTTGTCGGGGCGGAACAGCTGGCCGA
AAGGACCAGCGCGGACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACGGCACGGGGGAC
GTACTTGTTGCCGGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCGTTTTCACACTGGGTGGGCT
GGACTGACCTCGTTGAAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGAGGTCCGAGGTGCCGTTGTAGACA
CCATTGTTGTCGAGGCCGTGCTCGCCGGAAATCTGCTGCCAGAAAGCGGCACCGATTTGGTTACCC
TGTTATAACGCGTTAGTTTTTGTCCGTTGTTTACCGTTGTCAATTGTCGCCGTGAAGACTCAGAAGTC
AGCTGTCTTCGGGAGAAAAGGAGGCTCGGAAGCAGAAGCAAACGTACGCATTGGCGTCAAGGAAAA
CCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAAGGGGGGAAGCCGGTTG
>Aislamiento 1
CCGCTTCCCCCCCCTACCCTTTTTTTGTGTTCACAAACTCAAGGTCTCGTCCGAGTTCTCCACCAGCT
GGTGCACCGATAGAGTCGCCGGTTTGGTACGGGCTCCACAACCGTGTCCGACACCTTGGGGCGAC
GGCATCACCGAGAACGTAGCCATCATCCGGTCGGGGAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATTAGCAGG
70
GTGCCCATACCGGCACCCGTGCCACCGCCCAGGGAGTGCGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTC
ACAGCCCTCAGCCTCGCGGCGGACGACGTCGAGCACCTGGTCCACAAGCTCGGCACCCTCCGTGT
AGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGGCCGAAAACGAAGTTGTCAGGCCGGAAGA
GCTGTCCGAAAGGACCGGCGCGCACAGCATCCATTGTGCCGGGCTCGAGATCGACCAGGACGGCG
CGGGGCACATACTTGTTGCCCGAGGCCTCGTTGAAGTACACGCTCATACGCTCCAGCTGGAGCTCA
GACGTGCCGTTGTACCTGATAGAACATATTAGATGATATACACCACAATAGACACTCTTCCGAAACCG
GAAACCTACACTCCATTGCTGTCGAGACCGTGCTCGCTGGAGATCTGCTGCCTGTGAAGTAGGTTAG
AATTTGTCACTTCAAGCAGATTGCCCAGATGCGTTATTTATAGCTCAGATAAAACTTACCAGAAAGCG
GCACCGATCTGGTTACCCTGTTATGCCATAGCCCGTGTCAGTTTAAGGTTTGTTTCGTCGGAGCTTA
CCATCCTTCGAACAGTGCCCGTACGGGCTTCGATTCATTCGCGGATAGGCCTGAAACGTACGCTTG
GCAGCGGGAGACACCTTCATAAAA
>Aislamiento 3
TGGGAACGTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAACCAGCTCGTCCGAGTTCTCGACCAGCTTGGGTAGG
CATGGAGAGAGTGGAGTTGTAAGGCTCGACGACAGTGTCAGAGACCTTGGGCGAGGGGACAACGG
AGAAGGTGGCCATCATGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATCAGGAGGGTACCCATAC
CGGCACCGGTACCACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCGCAGGACTCG
GCCTCGCGACGGACAACGTCGAGGACCTGGTCGACGAGCTCGGCACCCTCAGTGTAGTGACCCTT
GGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTTGTCGGGGCGGAACAGCTGGCCGA
AAGGACCAGCGCGGACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACGGCACGGGGGAC
GTACTTGTTGCCGGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCGTTTTCACACTGGGTGGGCT
GGACTGACCTCGTTGAAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGAGGTCCGAGGTGCCGTTGTAGACA
CCATTGTTGTCGAGGCCGTGCTCGCCGGAAATCTGCTGCCAGAAAGCGGCACCGATTTGGTTACCC
TGTTATAACGCGTTAGTTTTTGTCCGTTGTTTACCGTTGTCAATAGTCGCCGTGAAGACTCAGAAGTC
CAGCAGTCTACTGGGAGCACAAGGGTGAGGGCTCGGAAAGCAGAAGCAAACGTACGCATTGGCCG
GCTGGAACACTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAACCC
>Aislamiento 4
CCAACCCCCCCCCCGGGGTTTTTTTTTTTGGTTTTTTAAACAAACGAGTCTCGTCCGAGTTCTCGACC
AGCTGGTGGATGGAGCAGAGTCGTGCGGTTCTGTAAGGCCTCGACGAGACGGTATACAGACACCTT
GGGCGAGGGGACAACGGACAAGGTGGCCATCACGCGGTCGGGAACACTCCACGCGGATCTGGGA
GATCACGAGGGTACGCACATACCGGCACCGGTACCACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCC
CTGGAGGCTGTCCCAAGACTCGGCCTCGCGACGGACAACGTCGAGGGACCTGGTCGACGAGCTCG
GCACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTTG
TCGGGGCGGAACAGCTGGCCGAAAGGACCAGCGCGGACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATC
GACAAGGACGGCACGGGGGACGTACTTGTTGCCGGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACA
TCGTTTTCACACTGGGTGGGCTGGACTGACCTCGATGACAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGA
GGTCCGAGGTGCCGTTGTAGACACCATTGTCGTCGAGGCCGTGCTAGCCGGAAATCTGCTGCCAGA
AAGCGGCACCGATTGTGGTTACCCTGTGATAACGCGATAGTGTTGGTCGCGTGGTTTACCGTCGGC
TAATCGTCGCACGTGAAGATCGCGAGATAGTCCACCAGTCGTTCTGGGTAGAAAGGGAGGCTCCAG
GAAGCAGAAGCAAACGTACGCATTGGCCGGTCGAGATTCTTCTCTATCTTTATAAAAAAAAA
>Aislamiento 5
GGGGCGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAAAAACAGTTCGTCCGAGTTCTCGACCAGCTGGTGG
ATGGAGAGAGTTGGGCTGTTTGTAAGGCTCGACGACGGTGTCAGAGACCTTGGGCGAGGGGACAA
CGGAGAAGGTGGCCATCATGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATCAGGAGGGTACCC
ATACCGGCACCGGTACCACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCGCAGGA
CTCGGCCTCGCGACGGACAACGTCGAGGACCTGGTCGACGAGCTCGGCACCCTCAGTGTAGTGAC
CCTTGGCCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTTGTCGGGGCGGAACAGCTGG
CCGAAAGGACCAGCGCGGACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACGGCACGGG
GGACGTACTTGTTGCCGGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCGTTTTCACACTGGGTG
GGCTGGACTGACCTCGTTGAAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGAGGTCCGAGGTGCCGTTGTA
GACACCATTGTTGTCGAGGCCGTGCTCGCCGGAAATCTGCTGCCAGAAAGCGGCACCGATTTGGTT
ACCCTGTTATAACGCGTTAGTTTTTGTCCCGTTGTTTACCGTTGTCAATTGTCGCCGTGAAGACTCAG
AAGTCAGCCTGTCTTCGGGGAGAAAAGGGAAGGGCTTCGGGAAGCAGAAGCAAACGTACGCATTGG
CCGGCTGGAAAAAACCAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG
71
>Aislamiento 6
GACTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAACTTTTCGAGTTCTCGCCAGCTTGGCTGCTATGGACAGAGTGGC
GTTTATATGGCCCGACGAACGTGTTCAGACACCTTGGGCGAGGGGACAACGGAGAAGGTGGCCATC
ACGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTAGGAGATCACGAGGGAGCCCATACCGGCACCGGTACC
ACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCGCAGGACTCGGCCTCGCGACGGA
CAAACGTCGAGGACCTGGTCGACAAGCTCGGCACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTTG
CCGGCACCCGACTGACCGAAGACAAAGTTGTCGGGGCGGAACAGCTGGCCGAAAGGACCAGCGCG
GACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACGGCACGGGGGACGTACTTGTTGCCGG
AGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCGCTTTCACACTGGGTGGGCTGGACTGACCGTCGT
TGACAATAGACGCTCAGACGCTCCAGCCGGAGGTCCGAGGTGCCGTTGTAGACACCATTGTTGTCG
AGGACGTGCTCGCCGGAAATATGCTGCCAGAAAGCGGCACCGATCTGGTTACCCTGTTATAACGCG
TCAGTTTTTGTCCGTGGTTGACCGGTGTCAATAGTCGCCGTGAAGAAAAAAACAAAGTCAGCTGTCG
TTCGTGAGACAAATGGAAGGGCGCCGGAAGCAGAAGCAAACGTACGCATTGGCCGGTCTGGAAACC
CCCCCTCTTTTATAATAAAAAAAAAAGGAAAAA
>Peritecio 1
TTTTTTTTGGTCACAAACAGAAGGTCTCGTCCGAGTTCTTCGACCAGCTGGGTGCGATGGAGAGAGT
TGGCGTTCAAAAGATCGACGACGGTGTCAGAGACCTTGGGCGAGGGGACAACGGAGAAGGTGGCC
ATCATGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATCAGGAGGGTACCCATACCGGCACCGGTA
CCACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCGCAGGAATCGGCCTCGCGACG
GACAACGTCGAGGACCTGGTAGACGAGCTCGCCACCCTCAGCGTAGTGACCCTTGGCCCAGTTGTT
GCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTCGTCGGGGCGGAACAGCTGGCAGAAAGGACCAGCG
CGGACGGCGTCCAAGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACGGCACGGGGGACGTACTGGTTGCC
GGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCGTTTTCACACTGGGTGGGCTGGACTGACCTC
GTTGAAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGAGGTCCGAGGTGCCGTAGTAGACACCATGGTTGTC
AAGGCCGTGCTCGCCGAAAATATGCTGCCAAAAAGCGGCACCGATTCGGTTACCCGGTTATAACGC
GTTAGTTTTTGTCCGTTGTTGACCGTAGTCAAATGTCGCCGTGAAGACTCAGAACTCAGACTGTCGG
CGGGAAAAAAAAGAGGAAAGGCTTCGAAACCCAAAAACCAAACCGGTACCGCCATTTGGGCCGGCT
TGGGAAAACCCCCCCTCCTATAAAAAAAAAAGGGGAAAAAA
>Peritecio 2
GTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAACAGTTCGTCCGAGTTCTCGACCAGTCTGCGTAGTATGGAAA
GAGAGTGGTCTGTTGTAAGGCTCGACGACGAGTCTCACAGACCTTGGGCGAGGGGACAACGGAGA
AGGTGGCCATCATGCGGTCGGGAAACTCCTCGCGGATCTTGGAGATCAGGAGGGTACCCATACCG
GCACCGGTACCACCACCCAGGGAATGGGTGATCTGGAAGCCCTGGAGGCTGTCGCAGGACTCGGC
CTCGCGACGGACAACGTCGAGGACCTGGTCGACGAGCTCGGCACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGG
CCCAGTTGTTGCCGGCACCCGACTGACCGAAGACGAAGTTGTCGGGGCGGAACAGCTGGCCGAAA
GGACCAGCGCGGACGGCGTCCATGGTACCGGGCTCAAGATCGACAAGGACGGCACGGGGGACGT
ACTTGTTGCCGGAGGCCTACACAATGTTAGGAAGCTGTTCACATCGTTTTCACACTGGGTGGGCTGG
ACTGACCTCGTTGAAGTAGACGCTCAGACGCTCCAGCTGGAGGTCCGAGGTGCCGTTGTAGACACC
ATTGTTGTCGAGGCCGTGCTCGCCGGAAATCTGCTGCCAGAAAGCGGCACCGATTTGGTTACCCTG
TTATAACGCGTTAGTTTTTGTCCGTTGTTTACCGTTGTCAATTGTCGCCGTGAAGACTTCAGTCAAGT
CCAGATGTCTTCGGGAGACAAGCGAGCCTCGGAAGCAGAAGCAGAACGTACGCCCCATTGGCCGG
TCTGGAGTGAACCCCTTTTGTAAAAATT
72
Anexo 7.
Secuencias consenso del ADNr.
TTTCCTCCTGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCCTACCCTGGATCCGAGGTCAACCTT
GGTACAAAGTGCGGGGCGGCAGCGAAGAGACGCTGGCCGCCCGTCGCGCGCGTTGATTCATATGC
CGAACGCTCAGCCGGAGCTGCCGAGTCGAGAGGAGATACAAGGTCGTTCCTTGGAAAGCTGCGCT
CGGAGCCGCCAGCAGGGCCTCGCCACTGGTTTTGAGGGCCAAGCCGCCCGCGGGCGGAGGAGCC
CCAACGCCATCGGCGCGAGAGAGCGCTAAGGGGGGAAATGACGCTTCGGACAGGCATGCCCGATC
CAGAATGCTGGCGCCCTAGGCGCAATGTTGCGTTCAAAGATTCGATGACTCGACAGAATTCTGCCAA
TTAGCATTACGGATCGCACTTCGCTGCGTTCATTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGATGTTCA
AAGTTTATGCTCATTTTTGTTTGTTGCTCAGACGGGACGGCAGCCGATAATAAAAAAGTTCAGGCGG
CTCGATGGCCGCTGAAGGGCGCCCCGGGGGGGACCTAGAGGGGGGAGGAGGGGCGCGCGCCCC
CGAAGGAGCGATGCGTCCCCCCTCCCGCCTCCCGCTCAGAACCAACGAGAACGGAACGGGGTACG
ACTTTGACATACGGTCTAGGAGTTGACCAAGAACCCCGGTAAAGTGATAACACCTTCCACCCACCCA
GCAAACTGACCAGGACCCCCCCCGGAGGTACCTCTAGAAACACCGTTACGACATTTTTTCTCCCTAA
AGTGCTCGAGATT
CCAATGGCCGGGTAGGGTGATCCATTTACAAGAAGTTTTTCCAAACTTCCCCAACCCCTTTGGCGAA
CCATAACTCATAACAGTTTCTCGTTAGCTTTCCGGCGGGGGACGGGAGGGGGGCTGCCCTCGGGCT
GCCCCTCCCCTCCCGCGCCGGGGGCGGCGGGCCCTATGAACCTTTACATCTCAACCACAAGAAAAC
CGTCTGAGCTAAAAAAACAAATAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGCGAACCATCGAATCTTTGAACGC
ACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCCCCCCTCACGCGCCC
CGTTGCGCGCTGGGTGTTGGGGCTCCTCCGCCTGGCGGAGGGCCCCCAAAGCGAGTGGCGGGCC
CGTCTGGCGGCTCCGAGCGCAGTACCGAACGCAAGTTCTCCCCTCGCCCGGACGCCCCGTCGGCG
CCTTGCCAGCCCAAAATCGCGCCATGACGTGCAAACTTCTTTTTTACAAAGGTTGACCTCGGATCAG
GTAGGACTACCGCTGACTTAACCTACAAAAACGCAAAAAAAAAATGAGGTAAGAATCT
>Aislamiento 2
CGTTCCGCCCGGCATTTTTTTTTTTTCTCCCCCCTTTTTTTTTTTGTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACC
TGATCCGATTGGTTCAACCCTAAAAAAAATATAAGAGGTTTCACGGCAGGGCGCAAGCCGGGGCGT
CCAGAGCGGAGAGTGTTTTACTGCGCTCGGAGCCGACCAGCCAGCCCGCCACTTGCTTTCGGGGC
CTGCGGCCAGGCCGCAGGAGAGCCCCAACAGCAGGCGCGCGAGGGCGCCTGAGGGTGGAAATGA
CGCTCGGACAGGCATGCCTGCCAGAATACTGGCAGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTTGATGATTC
ACTAAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCGTTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAG
ATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTTTGTCTTTTCTTTTTTTGCTCAGACGAGCCACAAAATCAGGCA
AGCGTTTCTAAAGAGGCCGTGCCTGCCACCTCCGGCCGGTGCCCCTGGCGCGCGCGCCAGGCGCC
TTGCGGGCCACCCCTCTGACAGGGCGGCCGCCGGCCGGAAGCAACAGAGACAGCAGAACGTCGGT
AAGGTTCACATGGGTTGGGGAGTTGAAAACTCGGGTAAATGAATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGG
AGACCTTGTTACGACTTTCTCATTAAAAAAAGACCCAAAAAAAAAAAA
>Aislamiento 3
TTCGCGGTCCGGACCCGCTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCTTTAAGTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCT
ACCTGATCCGAGGTCAACCTTGATAAAACAATATACGATGGTTTCACCGGCAGGGCGCAAGCCGGG
GCGTCCAGAGCGGAGAGTGTTTTACTGCGCTCGGAGCCGACCAGCCAGCCCGCCACTTGCTTTCG
GGGCCTGCGGCCAGGCCGCAGGAGAGCCCCAACAGCAGGCGCGCGAGGGCGCCTGAGGGTGGA
AATGACGCTCGGACAGGCATGCCTGCCAGAATACTGGCAGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTTGAT
GATTCACTAAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCGTTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCA
AGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTTTGTCTTTTCTTTTTTTGCTCAGACGAGCCACAAAATCA
GGCAAGCGTTTCTAAAGAGGCCGTGCCTGCCACCTCCGGCCGGTGCCCCTGGCGCGCCGCGCCAG
GCGCCTTGCGGGCCACCCCTCTGACAGGGCGGCCGCCGGCCGGAAGCAACAGAGACAGCAGAAC
GTCGGTAAGGTTCACATGGGTTGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTTCCCCGCGTGGGTTCA
CCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTCCAAAAT
73
>Aislamiento 4
CTTTCCTTCGCCTAATTGAATTGCTTAAGGTTCACGGGTGATCCTACCGATTTGGTTCCCTCGCACGG
TGTATATTATGATCTTACTCTACAGCGAGTTTCCTCAGTTTCCCCTTTCTTCCTGATATGCTAGTTCAG
CGGGTAGTCCTACCTGATCCGGAGGTTCAACGCTGGGTAAAAAGAGTTGCACGTCATGCGCGATTT
GGGCTGGCAAGGCGCCGACGGGGCGTCCGGGCGAGGGGAGAACTTGCGTTCGGTACTGCGCTCG
GAGCCGCCAGACGGGCCCGCCACTCGCTTTAGGGGCCCTCCGCCAGGCGGAGGAGCCCCAACAC
CAGCGCGCAACGGGGCGCGTGAGGGGGGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACT
GGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCGCTGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGC
ATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTATTTGTTTT
TTTAACTCAGACGGTTTTCTTGTGGTTGAGATGTAAAGGTTCATAGGGCCCGCCGCCCCCGGCGCG
GGAGGGGGAGGGGCAGCCCGAGGGCAGCCCCCCACCCGTCCCCCGCCGGAAGCAACAAGAACAG
TATGGGTATGGTTCGCAAGGGATATGGGAGTTTGAGAAAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCG
CCAACGGACACCTTGTTACTACTTTACACTTCCTCTAAATGAACAGAAACC
>Aislamiento 5
GGGTTTCTCCGTTTGGGTGACCAGCGGGAGGGATCATTACAGAAGTTTTCTAAACTTCCAACCCTTT
GCGAACATACCCATACTGTTCTCGTTGCTTCCGGCGGGGGACGGGTGGGGGGCTGCCCTCGGGCT
GCCCCTCCCCTCCCGCGCCGGGGGCGGCGGGCCCTATGAACCTTTACATCTCAACCACAAGAAAAC
CGTCTGAGTTAAAAAAACAAATAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGGAATCAGCGAACCATCGAATCTTTGAACGC
ACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCCCCCCTCACGCGCCC
CGTTGCGCGCTGGTGTTGGGGCTCCTCCGCCTGGCGGAGGGCCCCTAAAGCGAGTGGCGGGCCC
GTCTGGCGGCTCCGAGCGCAGTACCGAACGCAAGTTCTCCCCTCGCCCGGACGCCCCGTCGGCGC
CTTGCCAGCCCAAATCGCGCATGACGTGCAACTCTTTTTACCCAAAGGGTTGACCTCGGATCAGGTA
GGACTACCCGCTGAACTTAAGCTATAAAAAAGGGGAAAAAAAAAACAC
74

Revilla Gonzalez Ursula Salome 2013

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UNIVERSIDAD AUTNOMA CHAPINGO

DIVISIN DE CIENCIAS FOR ESTALES

Hongos Ophiostomatales asociados a Dendroctonus

INGENIERO EN RESTAURACIN FORESTAL

URSULA SALOME REVILLA GONZLEZ

Chapingo, Texcoco, Estado de Mxico, septiembre de 2013

Texcoco,Estadode Mxico,septiembrede 2013

A mi familia que me ha apoyado en todo momento.

Objetivo general ............................................................................................ 3

Objetivos especficos .................................................................................... 3

Pinus leiophylla ............................................................................................. 4

Dendroctonus mexicanus Hopkins ................................................................ 6

Manchado de la madera ................................................................................ 8

Asociacin descortezador-hongo .................................................................. 9

Hongos ophiostomatoides ........................................................................... 11

3.6.10. Raffaelea .............................................................................................. 18

Identificacin de hongos microscpicos ...................................................... 18

MATERIALES Y MTODOS ............................................................................... 20

Colecta de insectos y galeras ..................................................................... 21

Identificacin del descortezador .................................................................. 22

Identificacin del hospedante ...................................................................... 23

Aislamiento de los hongos........................................................................... 23

Identificacin morfolgica de los hongos ..................................................... 26

Microscopa de luz ............................................................................... 26

Microscopa electrnica de barrido ...................................................... 27

Identificacin de hongos por mtodos moleculares ..................................... 28

Extraccin de ADN ............................................................................... 28

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 31

Anlisis filogentico ..................................................................................... 32

Anlisis estadstico ...................................................................................... 33

RESULTADOS Y DISCUSIN ........................................................................... 34

Identificacin del descortezador .................................................................. 34

Identificacin del hospedante ...................................................................... 35

Aislamiento de los hongos........................................................................... 35

Identificacin morfolgica ............................................................................ 35

Identificacin molecular ............................................................................... 50

Anlisis filogentico ..................................................................................... 55

LITERATURA CITADA ....................................................................................... 59

Figura 22. Similar a Leptographium sibiricum ............................................................... 43

Hyalorhinocladiella, una especie de Sporothrix, y dos especies de Leptographium sin

Ophiostomatales. In this study Ophiostomatales fungi were isolated from Dendroctonus

Las gimnospermas comprenden alrededor de 900 especies, la mayora localizadas en

hongos Ophiostomatales asociados al descortezador

Corroborar que la especie del descortezador colectada sea Dendroctonus

Aislar los hongos asociados a D. mexicanus, causantes del manchado azul de la

Identificar los hongos Ophiostomatales asociados a D. mexicanus morfolgica y

El gnero Pinus es el gnero ms abundante de la familia Pinaceae. En Mxico, los

Esta especie crece en un rango de 15 a 30 m de alto (Lpez-Upton, 2002; Muslem y

La madera de P. leiophylla es usada para construcciones, traviesas de ferrocarril, lea,

Los rboles de P. leiophylla presentan conos muy susceptibles al hongo Caeoma

descortezadores primarios y secundarios que se alimentan del tejido subcortical de las

El uso de feromonas de agregacin, que asegura la colonizacin masiva del

Sus interacciones con los hongos asociados (Paine et al., 1997).

Se han investigado tres estrategias generales en la vida de los escoltidos en relacin a

tiene como hospedantes a Pinus ayacahuite Ehren, P. lawsoni Roezl, P. leiophylla, P.

Distribucin geogrfica de Dendroctonus mexicanus (Ziga et al., 2006).

Los adultos de D. mexicanus presentan un tamao promedio 3.2 mm (Wood, 1982). La

3.4. Manchado de la madera

Rodaja de Pinus leiophylla con mancha azul.

Las hifas penetran en la madera a travs de secciones transversales o radiales de

ophiostomatoides, particularmente del genero Ophiostoma y Ceratocystis, estos

Los marchitamientos vasculares causados por hongos se caracterizan por el bloqueo

Los hongos ophiostomatoides son agrupados colectivamente como ascomicetos con

Ascomata representativos del orden Ophiostomatales (Seifert et al., 2013).