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10/09/2015 AformaodeoligmerossolveiseamilidefibrilascompropriedadesfsicasdotremorepizoticoisoformadaprotenaprinicadodomnioCt

Journal of Biological Chemistry


www.jbc.org

Publicado pela primeira vez em 13 de julho de 2006, doi: 10,1074 /


jbc.M605367200
08 de setembro de 2006 do Journal of Biological Chemistry, 281, 26121-26128.

Aformaodeoligmerossolveise
amilidefibrilascompropriedadesfsicas
dotremorepizoticoisoformadaprotena
prinicadodomnioCterminalda
protenamurinarecombinantePrion
mPrP(121231)*
Samantha M. Martins

, 1,

Fernanda G. De Felice
+

Dris J. Frosoni

, 2

Ana M. Blanco Martinez

, 3

e Srgio T. Ferreira

Autor Filiaes

3 A Howard Hughes Medical Institute Internacional Scholar. Para quem a


correspondncia deve ser endereada. Tel .: 5521-2562-6790; E-mail:
ferreira@bioqmed.ufrj.br.

Resumo
Doenas de pries, so desordens neurodegenerativas fatais associadas com a
converso conformacional da protena prio celular, a PrP C, em um mal dobrada,
forma resistente protease, PrP Sc. Aqui demonstramos pela primeira vez, a
oligomerizao e fibrillization do domnio C-terminal da PrP murino, mPrP- (121231), ao qual falta a totalidade do domnio N-terminal da protena noestruturados. Em particular, a construo foi utilizado no tem os resduos de
aminocidos 106-120 do chamado ncleo amiloidogica da PrP (resduos 106126). Formao de amilide foi acompanhada pela aquisio da resistncia
digesto com proteinase K. Agregao de mPrP- (121-231) foi investigada usando
uma combinao de tcnicas biofsicas e bioqumicas a pH 4.0, 5.5, e 7.0 e a 37 e
65 C. Sob condies parcialmente desnaturante (65 C), os agregados de
diferentes morfologias que vo desde oligmeros solveis para amadurecer
fibrilas amilides de mPrP- (121-231) foram formados. A anlise por microscopia
electrnica de transmisso revelou que aproximadamente esfrica agregados
foram prontamente formado quando a protena foi incubada a pH 5,5 e 65 C
durante 1 h, enquanto que a incubao prolongada levou formao de fibrilas
amilides maduros. As amostras foram incubadas a 65 C a um pH 4.0 ou 7.0
apresenta uma mistura inicial de oligmeros e protofibrilas ou fibrilas. A anlise
eletrofortica das amostras incubadas a 65 C revelou a formao de oligmeros
de dodecilsulfato de sdio-resistente (dmeros, trmeros, tetrmeros e superiores)
e agregados de peso molecular de mPrP- (121-231). Estes resultados demonstram
que a formao de uma forma de amilide com propriedades fsicas de PrP Sc pode
ser alcanada na ausncia do domnio do terminal N e flexvel, em particular, dos
resduos 106-120 de PrP e no requer outros factores celulares ou uma PrP Sc
modelo.
A converso conformacional da isoforma celular normal da protena do prio, PrP
C, 4 para uma isoforma patolgico anormal, a PrP Sc, subjacente a um grupo de
doenas neurodegenerativas fatais conhecidas como encefalopatias espongiformes
transmissveis ou doenas provocadas por pries, o que inclui a doena de
Creutzfeldt-Jakob no homem , scrapie em ovinos e caprinos, e encefalopatia
espongiforme bovina em bovinos (1). Neuropatologicamente, doenas provocadas
por pries so caracterizadas por perda neuronal e astrogliose e muitas vezes por
espongiforme degenerao do crebro e a deposio de placas amilides (1). A
nica caracterstica destas doenas que, alm das formas espordicos e
hereditrios, que pode ser adquirida atravs da transmisso de um agente
infeccioso. A hiptese "proteinonly" de propagao prio postula que a isoforma
anormal, a PrP Sc, actua como um agente transmissvel da doena e auto-propaga a sua
conformao patolgica usando PrP C como um substrato (1).
PrP Sc definido como uma forma agregada da PrP que em larga medida
resistente proteinase K (PK) a digesto sob condies nas quais a PrP C e a
maioria das outras protenas so facilmente degradados (2). Em adio s suas
estabilidades diferentes degradao proteoltica, as estruturas secundrias,
tercirias, e quaternrias de PrP C e PrP Sc tambm diferem (3 - 7). PrP C
monomrico e altamente -helicoidal (5), ao passo que a PrP Sc adopta um arranjo
multimrica e contm uma grande quantidade de -estrutura e menor estrutura
helicoidal. A transio entre a PrP C e a PrP Sc ocorre por um mecanismo pstranslacional e parece ter lugar sem qualquer modificao covalente da protena
detectvel (8). At data, no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a
transio conformacional entre as confrmeros normais e patognicos da PrP
permanecem pouco conhecidos. De acordo com os modelos actuais, a
conformao da protena prio oscila entre um estado dominante nativa, a PrP C, e
uma srie de confrmeros menores que a auto-associar-se de uma maneira
ordenada para produzir uma estrutura supramolecular estvel, a PrP Sc, composto

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ordenada para produzir uma estrutura supramolecular estvel, a PrP Sc, composto
de monmeros PrP misfolded (2, 9, 10). Uma vez que uma estrutura estvel
"semente" formada, as molculas de PrP adicionais podem ento ser recrutados,
conduzindo a uma formao autocataltica, rpido de PrP Sc (2, 10, 11).
Agregao amilide desempenha um papel importante em vrias outras patologias
humanas,
incluindo
Alzheimer,
Parkinson,
Huntington
e
doenas.
Independentemente das diferentes sequncias de aminocidos das protenas ou
pptidos a partir dos quais so formados, de protenas amilides mostram muitas
propriedades fsicas e tintoriais comuns (12). Vrios estudos recentes tm
demonstrado que as condies parcialmente desnaturantes so necessrios para o
in vitro de formao de amiloide, que podem ser atribudos necessidade de
desestabilizar a dobra nativa de uma protena, sob condies em que as
interaces no covalentes que envolvem a cadeia polipeptdica mantm favorveis
(por comentrios, ver Ref. 12). Neste contexto, a utilizao de desnaturantes

parcialmente in vitro as condies devem ser vistos como uma ferramenta para
preencher conformaes agregao propensas e para acelerar um processo que
normalmente pode levar muito mais tempo in vivo. Tais estudos podem conduzir a
uma melhor compreenso dos mecanismos da formao de amilide e para o
desenvolvimento de estratgias teraputicas destinadas a prevenir a formao de
amiloide e luta contra as doenas amiloides.
Evidncia considervel indica agora que os principais espcies neurotxicos
envolvidos em danos neuronais na doena de Alzheimer, Parkinson e doenas de
pries, so oligmeros de amilide solvel em vez de as fibrilas maduras que so
encontrados em depsitos amilides in vivo (para revises, ver, Refs. 13 - 15). Isto
provavelmente explica a falta de correlao directa entre a carga da placa amilide
e a neurodegenerao observada em doenas de pries (para uma reviso, ver ref.
16) e sugere que oligmeros solveis neurotxicos podem desempenhar um papel
na disfuno neuronal induzida por prio.
As estruturas tridimensionais de protenas recombinantes a partir de um prio
nmero de organismos diferentes, incluindo ratinho, hamster, e prp de seres
humanos, revelaram que o segmento N-terminal compreendendo os resduos de
aminocidos 23-120 inteiras flexvel e desordenada que apenas o segmento
contendo O C-terminal de 111 resduos, PrP- (121-231), possui uma estrutura
tridimensional definido (17 de - 20). A regio N-terminal flexvel parece
desempenhar um papel importante na transmisso da encefalopatia espongiforme
transmissvel e influencia a formao de conformaes de proteinase-resistente de
PRP (por exemplo, Ref. 21). O domnio do terminal N tambm contm sequncias
de aminocidos que so geralmente considerados importantes para o controlo de
agregao (por exemplo, os resduos 94-113; Ref. 21) e o chamado ncleo
amiloidognico que consiste na sequncia peptdica 106-126 neurotxico. A
regio C-terminal , um domnio de auto-estruturado e dobrar bem contm trs
hlices a e uma folha -antiparalela cadeia de dois (19, 20).
No presente trabalho, ns descrevemos a oligomerizao e fibrillization do
domnio C-terminal da protena prio de murino, mPrP- (121-231). Esta
construo no tem toda a regio flexvel N-terminal e a maior parte dos resduos
de aminocidos 106-126 do ncleo amiloidognica de PrP. Mostra-se que vrios
tipos de agregados, incluindo oligmeros de SDS-resistentes e fibrilas amilides
maduros, so formadas por incubao das mPrP- (121-231) sob condies
desnaturantes parcialmente diferentes. A formao de oligmeros foi ptima a pH
5,5, e algumas das espcies formadas morfologia exibiu anelar. Curiosamente, a
agregao de mPrP- (121-231) a um pH de 7.0 deu origem formao de um
agregado de amilide que era resistente digesto com proteinase K, o que
sugere que exibe propriedades semelhantes a PrP Sc. So discutidas possveis
implicaes da formao de oligmeros PrP para a patognese de doenas de
pron.

PROCEDIMENTOSEXPERIMENTAIS
Materiais -Thioflavin T (ThT) e proteinase K foram de Sigma. Acetato de uranilo foi
de Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA). Todos os outros reagentes
foram do mais elevado grau analtico disponvel comercialmente.
Expresso e purificao de protenas -O plasmdeo para a expresso bacteriana da
variante F175W de murino PrP- (121-231) foi uma oferta generosa do Dr. R.
Glockshuber (Eidgenssische Technische Hochschule, Sua). A protena
recombinante foi expressa em Escherichia coli estirpe BL21 (DE3) e foi purificado
como descrito anteriormente (25). Aps o passo final de purificao, mPrP- (121231) foi dialisada contra gua MilliQ e concentrou-se utilizando uma clula de
ultraf iltrao agitada Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA), e a sua concentrao foi
determinada usando 280 = 28.800 M - 1 cm -1 (22). Alquotas de protenas (1,02,0 mg / ml) foram armazenadas a -20 C at sua utilizao.
PrP Agregao concentrao de mPrP- -O (121-231) em todas as amostras foi de
0,8 mg / ml (60 M), E 0,02% DE NAN 3 foi adicionada para prevenir o crescimento
bacteriano durante longos perodos de incubao. As amostras foram incubadas
durante intervalos de tempo crescentes a diferentes temperaturas e valores de pH,
tal como descrito em "Resultados". Quando foram utilizadas as solues
tamponadas, o pH das amostras foi ajustado com 80 m M cido actico NaOH
(pH 4,0), a 80 m M Mes NaOH (pH 5,5), ou 80 m M de Tris-HCl (pH 7,0). Em
experincias nas quais a agregao foi investigada em condies de fora inica

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experincias nas quais a agregao foi investigada em condies de fora inica
baixa (solues no tamponadas), as amostras foram preparadas por adio de
uma parte alquota da soluo de estoque mprp a gua MilliQ, cujo pH tinha sido
previamente ajustado para o valor desejado com HCl. Aps 1 semana de
incubao, o pH de tais solues no tamponadas passou de 5,5 e 7,0 para 6,2 e
7,4, respectivamente.
Turvao e medies de disperso de luz -Protein agregao foi monitorizada a 25
C por turbidimetria (densidade ptica a 330 nm) num espectrofotmetro
Ultrospec 2000 Pharmacia (GE Healthcare) e em ngulo recto por medies de
disperso de luz a 500 nm sobre um espectrofluormetro ISS (PC1 ISS Inc.,
Champaign, IL). Amostras pr-agregados foram diludas 10 antes das medies.
Medies de fluorescncia ThT amostras -PrP foram incubadas com uma
concentrao equimolar de ThT durante 30 min temperatura ambiente antes das
medies. ThT espectros de emisso de fluorescncia (excitao a 440 nm,
emisso a partir de 460 e 600 nm, 5 nm para ambos bandpasses excitao e de
emisso) foram medidos a 25 C num espectros luormetro Hitachi F4500 (Hitachi
Instruments Co., Tquio, Japo). ThT apresenta muito pouca fluorescncia em
tampo aquoso, e a sua fluorescncia grandemente aumentada aps ligao a
fibrilas amilides (23). O aumento da fluorescncia aps a ligao podem assim
ser utilizados para seguir a cintica da formao de fibrilas amiloides.
Intensidades de fluorescncia relativas THT em diferentes tampes de pH so
normalizados por os valores de medio para controlo mPrP- (121-231) amostras
que foram mantidas a 4 C durante 1 semana para os valores de pH
correspondentes.
Medies de fluorescncia intrnseca -Fluorescence espectros de emisso foram
medidos a 25 C num espectrofluormetro ISS PC1 com excitao a 280 nm,
emisso a partir de 300 para 420 nm, usando um filtro de 320 Schott GT sobre o
canal de emisso e 4 bandpasses nm para excitao e de emisso.
Electroforese em Gel -Samples retiradas a diferentes pontos de tempo durante a
agregao de mPrP- (121-231) foram analisadas por PAGE em ambos nativa (12%
acrilamida) e desnaturante (18% de acrilamida) condies. Para PAGE nativa, as
amostras foram diludas em tampo de carga no desnaturante. Antes da SDSPAGE, as amostras foram fervidas durante 2 min em tampo de carga contendo 2%
de SDS e 140 m M ditiotreitol. Anidrase carbnica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa),
albumina (66 kDa), e Na, K-ATPase (-subunidade, 100 kDa) ou um molecular
conjunto de marcadores de peso pr-corados (Pierce) foram utilizadas como
padres para determinar a massas moleculares dos oligmeros de PrP e agregados
de ordem superior.
Microscopia Eletrnica de Transmisso -Samples foram absorvidas por 2 min para
redes formwar-revestido de carbono que tinha sido pr-tratadas com 0,01% poliaquosa L-LISINA. As amostras foram coradas com 5 mL de acetato de uranilo a 2%,
e observadas num microscpio electrnico Zeiss 902 com uma voltagem de
acelerao de 80 kV seco ao ar.
Proteinase K Digesto -Samples de qualquer monomrica ou agregada mPrP(121-231) (formado aps agregao de 0,8 mg / ml mPrP- (121-231) a pH 7,0 e
65 C durante 1 semana) foram 4 vezes e diluda incubou-se durante 1 h a 37 C
em 100 m M de tampo Tris-HCl, pH 7,2, com a proteinase K em que a protease:
PrP propores indicadas na digesto foi parada pela adio de 5 -concentrated
amostra de SDS-PAGE de carga "Resultados". tampo contendo 2% de SDS e 140 m
M ditiotreitol. As amostras foram aquecidas a 95 C durante 5 minutos e
resolvidas em gis de 18% SDS-PAGE.

RESULTADOS
Temperatura e pH Efeitos sobre a agregao de mPrP- (121-231) -Para identificar
condies experimentais que levam oligomerizao ou fibrillization de mPrP(121-231), inicialmente acompanhou a agregao da protena, tanto pH 5,5 e 7,0
e a 37 e 65 C. As experincias a pH 5,5 foram realizados para aproximar o pH
nas vesculas endocticas, que tm sido implicados como um possvel
compartimento intracelular em que a transio conformacional de PrP c para PrP Sc
pode ter lugar (4, 24). Por outro lado, a comparao entre a agregao a 37 e 65
C foi motivada pelo facto de o T m para a desnaturao trmica de mPrP- (121231) ~ 65 C (25-27), que deve preencher uma parcialmente estado desnaturado
da protena que pode ser mais propensos a agregao.
As experincias iniciais com amostras incubadas a 37 C em meio sem buffer
enquanto 1 semana em qualquer pH mostrou nenhuma agregao significativa. Em
contraste, a agregao foi marcadamente aumentada a 65 C (Fig suplementar.
S1). Curiosamente, enquanto que as medies da turvao indicou que a formao
de agregados mprp estava essencialmente completa dentro de algumas horas a 65
C (suplementar Fig. S1, A e B), ensaios de ligao de THT mostrou que
quantidades substanciais de material amilide s foram formados aps muito
tempo de incubao vezes (isto , vrios dias;. suplementar Fig S1, C e D). Isto
indica que os agregados formados inicialmente lentamente convertidos em
estruturas amilides com tempos de incubao mais longos.
mPrP- (121-231) tem sido relatado para adoptar uma conformao de folha-
alternativa abaixo de pH 5, na presena de ureia (28). Isto levou-nos a investigar a

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alternativa abaixo de pH 5, na presena de ureia (28). Isto levou-nos a investigar a
agregao a um pH de 4 na ausncia de desnaturantes qumicos utilizando
solues tamponadas. A investigao inicial da dependncia da temperatura de
agregao em meios tamponados a um pH de 5,5 e 7 mostram que a agregao
aumentou ligeiramente de 37 para 59 C, seguido por um aumento acentuado a
65 C (Fig suplementar. S2). Com base nestes resultados, o prximo realizou uma
investigao detalhada da agregao de mPrP- (121-231), tanto a 37 e 65 C.
Figo. 1 (A-C) mostra a agregao de mPrP- (121-231) monitorizada por
turbidimetria. Agregao em ambos pH 5,5 e 7,0 foi aumentada a 65 C, com a
agregao mxima obtida em menos de 2 min. Notamos que a incubao a 65 C
no estimular a agregao de mPrP- (121-231) a pH 4,0 (A). Isto est em
contradio aparente com trabalhos anteriores que mostraram que o baixo pH
mais eficaz quando utilizado em conjunto com a desnaturao parcial por ureia
(por exemplo, Ref. 28). bem conhecido, no entanto, que diferentes produtos
qumicos (por exemplo, agentes desnaturantes (ureia fsicas, guanidina) ou por
exemplo, temperatura, presso) pode levar a diferentes conjuntos desnaturado ou
parcialmente desnaturado. provvel, portanto, que os estados parcialmente
desnaturada de mprp estabilizadas por ureia ou por temperaturas elevadas so
diferentes nas suas estruturas residuais e nas suas propenses para formar
agregados amilides. tambm possvel que a conformao parcialmente
desnaturada de mprp estabilizado a um pH de 4 e 65 C exibe uma cintica de
agregao mais lenta (como confirmado por resultados de ligao THT descrito
abaixo).
A 37 C, a incubao de mPrP- (121-231) durante at 1 semana a qualquer pH 4,0
(Fig. 1 D) ou pH 7,0 (Fig. 1 F) no resultou em fibrillization como medido pela
ligao ThT. Por outro lado, as amostras foram incubadas durante 1 semana, a pH
5,5 a 37 C (E) apresentaram um aumento de ~ 4 vezes na ligao de TT,
indicando a formao de uma estrutura de amilide sob estas condies. A 65 C,
as amostras incubadas a pH 4,0 (D) exibiram aumento ThT ligao como uma
funo do tempo. A pH 7,0 e 65 C, as medies de fluorescncia THT sugerido
que os agregados amilides de mPrP- (121-231) foram prontamente formada na
primeira hora de incubao (Fig. 1 F).
Medies de disperso de luz indicou que a incubao de mPrP- (121-231) a pH
4,0 e 65 C durante 1 semana (Fig. 1 L) resultou em agregao visvel (compatvel
com resultados THT). As amostras incubadas a pH 5,5, a 65 C (H) apresentaram
aumento de agregao como uma funo do tempo, tal como monitorizado por
disperso da luz. De acordo com as medies de turvao, a um pH de 7 medies
de disperso de luz mostraram que a incubao a 65 C levou a agregao muito
rpida de mprp (I).
Agregao de mprp tambm foi monitorizada pela sua emisso de fluorescncia
intrnseca. A construo mprp ns utilizamos exibe um aumento de 2,5 vezes na
fluorescncia intrnseca mediante desdobramento (29). A 37 C, a incubao de
mPrP- (121-231) durante at 1 semana a todos os valores de pH investigados no
revelou alteraes significativas na fluorescncia intrnseca, indicando preservao
da dobra nativa da protena. Em contraste, as amostras foram incubadas a 65 C
apresentaram
um
aumento
significativo
de
fluorescncia,
indicando
desdobramento da protena dentro das primeiras horas de incubao (Fig. 1, J-L).
As intensidades de fluorescncia intrnseca de mPrP- (121-231) foram mais
elevadas nas primeiras horas de incubao a 65 C e diminuiu progressivamente
ao longo do tempo para valores prximos aos das amostras de controlo. Isto
sugere que a incubao de mprp a 65 C conduz ao inicial (parcial)
desdobramento da protena e que, aps a formao de agregados amilides, mprp
assume uma conformao mais compacta novamente e / ou torna-se parte de
uma estrutura organizada em que Trp-175 torna-se protegido contra o solvente.
FIGURA 1.
Influncia do pH e da
temperatura na agregao de
mPrP- (121-231), em solues
tamponadas. O pH das
amostras foi ajustado com os
seguintes tampes: 80 m M
cido actico NaOH, pH 4,0;
80 m M Mes NaOH, pH 5,5;
80 m M de Tris-HCl, pH 7,0. As
amostras foram incubadas a pH
Ver verso maior:
4,0 (A, D, G, e J), pH 5,5 (B, E,
Nesta pgina Em uma nova janela
H, e K) ou pH 7,0 (C, F, I, e L), a
Download como Slide do PowerPoint
37 ou 65 C durante os
perodos de tempo indicados
(em horas). A concentrao de mPrP- (121-231) foi de 0,8 mg / ml. A
agregao foi monitorizada por densidade ptica, disperso de luz,
tioflavina T, ou medies de fluorescncia intrnseca. As inseres em B
e C mostram a cintica iniciais de agregao mprp (horas mostradas em
minutos na abscissa) medida por turbidimetria. Bares nas inseres
correspondem a mdias SD de trs determinaes. Para ThT
medies de fluorescncia (D-F), de Student t teste de anlise (singletailed) revelou que os valores medidos em todos os pontos de tempo a
65 C foi significativamente diferente (0,003 <P <0,04) a partir do valor

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65 C foi significativamente diferente (0,003 <P <0,04) a partir do valor
de controlo, no- amostras de agregados. Diferenas individuais entre
os valores medidos adicionais em diferentes pontos de tempo so
indicados por * (p = 0,03) e ** (p = 0,01). As barras representam as
mdias DP de trs a quatro experincias independentes.

Oligmeros e ordem superior mprp Agregados revelado pelo Native e


desnaturao Eletroforese em Gel NATIVO PAGE mostraram que as amostras
incubadas a 65 C foram totalmente convertido dentro das primeiras horas em
agregados de alto peso molecular que no entram no gel em execuo
(suplementar Fig. S3) , ao passo que as amostras incubadas a 37 C manteve-se
monomrica durante at 1 semana de incubao.
A formao de agregados de mPrP- (121-231), foi investigada por SDS-PAGE (Fig.
2). As amostras foram incubadas a 65 C mostrou a acumulao progressiva de
oligmeros-resistentes SDS (dmeros, trmeros, tetrmeros e) e agregados de peso
molecular mais elevado em todos os valores de pH investigados. Incubao
prolongada a 65 C tambm conduziu ao aparecimento de bandas de baixo peso
molecular (<13 kDa), o que provavelmente correspondem a produtos de protelise
de mPrP- (121-231). interessante notar que mesmo estes fragmentos de menor
massa molecular de mprp apareceu a sofrer agregao a 65 C, dando origem a
bandas de desmaiar entre o monmero / dmero e bandas dmero / trmero.
Ultrastructural Anlise de mprp Agregados morfologias -As de agregados
formados em diferentes condies experimentais foram examinadas por
microscopia eletrnica de transmisso (Fig. 3). Inspeco de um grande nmero de
amostras de controlo coradas negativamente (ou seja, amostras mantidas a 4 C
durante at 1 semana a diferentes valores de pH) mostrou ausncia de oligomrico
ou estruturas polimricas (dados no mostrados). As amostras foram incubadas
durante at 1 semana a 37 C tambm mostrou a ausncia de material agregado
(dados no mostrados).

As amostras foram incubadas durante to pouco quanto 1 hora a pH 5,5 e 65 C


em soluo no tamponada exibiu um grande nmero de agregados
aproximadamente esfrica com um dimetro mdio de -12 nm (com partculas de
maiores dimenses com dimetros atingindo at ~ 30 nm; A Fig. 3 A) . tambm
interessante notar que alguns dos agregados exibiu estruturas anulares distintos
(Fig. 3 A, inserir), reminiscente das morfologias exibidas pelos agregados de sinuclena, amilina, e soro amilide A (30). Tempos de incubao mais longos a pH
5,5 provocou o desaparecimento dos agregados esfricos e ao aparecimento de
fibrilas amilides maduros com dimetros de ~15-30 nm (Fig. 3 B).
mPrP- (121-231) amostras incubadas durante 1 h a 65 C e pH 7,0 em soluo
no tamponada mostrou oligmeros abundantes e algumas estruturas
protofibrillar curtas (Fig. 3 C). Tempos de incubao mais longos, nestas
condies levou a uma diminuio do nmero de oligmeros e ao aparecimento de
fibrilas amilides maduros com dimetros de ~10-20 nm (Fig. 3 D).
FIGURA 2.
A anlise de SDS-PAGE de
oligmeros e agregados de
peso molecular mais elevados
de mPrP- (121-231). As
amostras foram incubadas a 37
ou 65 C a diferentes valores
de pH como indicado. As
alquotas foram retiradas a
Ver verso maior:
diferentes tempos, diluiu-se em
Nesta pgina Em uma nova janela
tampo de carga contendo 2%
Download como Slide do PowerPoint
de SDS e 140 m M ditiotreitol,
fervida durante 2 min, e
resolvido em 18% SDS-PAGE como descrito em "Procedimentos
Experimentais." Peso molecular (MW) marcadores so indicados por
pontas de seta. 7 ug de mPrP- (121-231) foram aplicadas em cada
pista, e o gel foi corado com Azul de Coomassie. A banda principal
mais prxima do fundo do gel corresponde ao monomrica mPrP(121-231) (13,3 kDa). A e B correspondem s amostras incubadas a pH
5,5 ou 7,0, respectivamente, em soluo no tamponada. C-E
correspondem s amostras incubado a pH 4.0, 5.5, ou 7.0 em meios
tamponados, respectivamente. Em todos os painis, pistas marcadas de
controlo correspondem a amostras mprp incubada durante 1 semana a
4 C com os valores de pH correspondentes. Note-se a acumulao de
dmero de SDS-resistentes, trmero, tetrmero e bandas de agregados
de ordem superior e visto como uma mancha, no topo dos gis de
funcionamento.

A incubao durante 1 h a 65 C e pH 4,0 em meio tamponado produzido


relativamente poucos oligmeros e pequenas estruturas protofibrillar raras (Fig. 3
E), embora em alguns imagens adquiridas sob esta condio tambm foi possvel
ver ocasionais protofibrilas maiores (dados no mostrando). Curiosamente, mais

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ver ocasionais protofibrilas maiores (dados no mostrando). Curiosamente, mais
tempo de incubao (1 semana) a 65 C e pH 4,0 no conduzir formao de
fibrilas amilides maduros, mas sim para a acumulao de agregados
aglomerados que assemelham-se os grnulos sobre uma cadeia (Fig. 3 F). Embora
estes agregados so morfologicamente diferentes das fibrilas amilides maduros,
que pareceu ligar-se alguns TT, bem como (Fig. 1 D). As amostras foram
incubadas durante 1 h a 65 C e pH 5,5 em meio tamponado exibiram uma
mistura de agregados abundantes aproximadamente esfrica (com dimetros de ~
25 nM) e as estruturas protofibrillar (3 Fig. G). Tempos de incubao mais longos
provocou o desaparecimento dos agregados globulares e o aparecimento de
grande nmero de fibrilas amilides que engrenadas em conjunto (Fig. 3 H).
Finalmente, a incubao para to pouco quanto 1 hora a 65 C e pH 7,0 em feixes
produzida mdias tamponadas de fibrilas amilides torcidos (fig. 3 I). Tempos de
incubao mais longos conduziu acumulao de fibrilas amilides maduras, com
um dimetro mdio de 10-20 nm, juntamente com as estruturas esfricas
aproximadamente ~ 30 nm de dimetro (fig. 3 J).
Protease Resistncia de agregado mprp proteinase K de digesto tem sido
amplamente utilizado para distinguir entre resistente s proteases PrP Sc e PrP
protease-lbil C conformaes da protena prio, bem como para testar diferenas
entre a PrP Sc estirpes (31, 32). Tratamento de mPrP- nativa (121-231) com
proteinase K resultou em degradao completa da protena mesmo em muito
baixo de protease: rcios PrP (Fig. 4, painel superior). Em contraste, a agregao
durante 1 semana a 65 C e pH 7,0 foi acompanhado por um aumento
significativo na resistncia proteinase K de digesto (Fig. 4, painel inferior).

DISCUSSO
A construo utilizada no presente trabalho corresponde ao domnio C-terminal
de 111 resduos estruturado de murino da protena do prio celular e no tem
toda a regio N-terminal flexvel, que tem sido implicada na transmisso de
encefalopatia espongiforme transmissvel e na formao de protease- agregados
resistentes (21). Alm disso, o segmento que compreende os resduos de
aminocidos 106-126 de comprimento completo em PrP representa a regio mais
conservada e hidrfobo, conhecido para formar agregados neurotxicos in vitro,
e geralmente considerado para formar o ncleo da protena amiloidognica (33).
Embora mPrP- recombinante (121-231) contm somente seis resduos da regio
hidrfoba que, mostra-se que ele tem a capacidade de montar em agregados
solveis, aproximadamente esfrica anelar e protofibrilas lineares, e fibrilas
amilides em condies experimentais apropriadas, na ausncia de qualquer
outros factores celulares. mPrP- (121-231) tem sido demonstrado para formar
agregados amilides na presena de ADN (25), mas os presentes resultados
mostram que o cido nucleico no necessrio para a agregao de amilide
desta construo PrP. Tomados em conjunto, os presentes resultados suportam a
noo de que o domnio C-terminal estruturada de PrP podem desempenhar
papis importantes na agregao amilide e a formao de espcies de
proteinase-resistente.
Agregao de mPrP- (121-231) foi marcadamente aumentada a 65 C
(correspondendo ao T m para a desnaturao trmica deste construto) com a
aparncia da linha de agregados dentro dos primeiros minutos de incubao a pH
5,5 e ambos 7.0. A localizao subcelular da transio conformacional da PrP C em
PrP Sc ainda motivo de controvrsia. Existe evidncia indicando que ocorre tanto
na superfcie celular (a um pH aproximado de 7,3 que corresponde ao meio
intersticial do crebro; refs. 34 e 35) e, aps internalizao de PrP em endossomas
(4, 24), em que o pH Os valores variam entre 4,7 e 5,8 (36). In vitro, a converso
da PrP humana C a uma PrP Sc -like forma aumentada a pH cido (37). Estudos
biofsicos tm mostrado que a energia livre de desdobramento de PrP- humana
(90-231) menor do que a pH cido com um pH neutro (26) e que, em soluo de
cloridrato de guanidina PrP- cida humana (90-231) adopta uma parcialmente
dobrado conformao que contm uma grande quantidade de estruturas
secundrias de folha-. Um -rico folha de dobragem intermdia, tambm tem
sido observada para mPrP- rato (121-231) em solues de ureia a um pH baixo,
mas no a pH neutro (28). Alm disso, demonstrou-se que um pH baixo induz um
aumento na exposio de manchas hidrofbicas na superfcie das mPrP- (121231) (38). No entanto, a pH baixo sozinho no suficiente para provocar a
transio conformacional de PrP. Por exemplo, a incubao de hamster PrP- (90231) a pH 4,0 a 4 C durante 50 h, conduz formao de agregados amorfos e
no de estruturas amilides (39). Factores destabilizadores adicionais, tais como
subdenaturing concentraes de cloridrato de guanidina ou ureia, na presena de
cloreto de sdio, demonstraram ser necessria para promover a transio
conformacional da protena prio. Os nossos resultados mostram que a incubao
de mPrP- (121-231) a pH 4,0 e 65 C durante 1 semana no conduzir formao
de fibrilas amilides proeminente. Em vez disso, sob estas condies e estruturas
globulares agregados protofibrillar, bem como alguns agregados amorfos, foram
formadas (Fig. 3 F). Assim, estes resultados sugerem que a pH <5 e parcialmente
desnaturante temperatura favorece a formao de oligmeros e protofibrilas PrP.
FIGURA 3.
A anlise por microscopia electrnica de transmisso de agregado
mPrP- (121-231). Os

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mPrP- (121-231). Os
diferentes painis mostram a
formao de agregados
globulares, protofibrilas, e
fibrilas amilides maduros de
mPrP- (121-231) aps
incubao a 65 C a diferentes
valores de pH. Esquerda e
painis da direita representam
as imagens obtidas a partir de
amostras incubadas durante 1 h
ou 7 dias, respectivamente, os
Ver verso maior:
seguintes valores de pH: A e B,
Nesta pgina Em uma nova janela
pH 5,5 (solues no
Download como Slide do PowerPoint
tamponadas). Um nmero de
agregados PrP anulares pode
ser visto em cima de uma inspeo da imagem em A, e um exemplo
representativo mostrado em maior ampliao como uma insero, C e
D, pH 7.0 (solues sem buffer); E e F, pH 4.0 (tamponada mdio); G e
H, pH 5,5 (meio tamponado). A insero em H ilustra um campo de
ampliao elevada mostrando um conjunto de fibrilas amilides
engrenadas em conjunto; I e J., PH 7,0 (meio tamponado) Barras de
escala correspondem a 0,2 um.

FIGURA 4.
Proteinase K de digesto
limitada com a forma de
amilide mPrP- (121-231).
MPrP- monomrica nativa (121231) (painel superior) ou
fibrilas amilides formadas por
incubao de mPrP- (121-231)
durante 1 semana a 65 C e pH
7 (painel inferior) foram
tratados com proteinase K
Ver verso maior:
durante 1 hora a 37 C no PK:
Nesta pgina Em uma nova janela
mprp propores indicadas na
Download como Slide do PowerPoint
figura. As amostras foram
analisadas por SDS-PAGE
seguida por colorao com prata. 3 g de mPrP- (121-231) foram
aplicados em cada pista. MW, massa molecular.

Curiosamente, as amostras foram incubadas durante 1 h a nica pH 5,5 e 65 C


em meio no tamponado, exibiu um grande nmero de oligmeros de
aglomerados morfologia formando aproximadamente esfrico que se
assemelhavam contas num fio (Fig. 3 A). Alm disso, agregados anulares
assemelhando-se aqueles que so formados por incubao de hamster PrP- (90232) a pH 4,2 e 1 M DE cloridrato de guanidina durante 25 dias (40) tambm foram
observadas (Fig. 3 A, insero). Tais estruturas anulares tm sido propostos para
consistem de um anel de oito monmeros de PRP (40).
Considerando o aumento da evidncia de que os oligmeros no fibrilares solveis
podem desempenhar papis importantes na neurotoxicidade em vrias outras
doenas neurodegenerativas (41), um procedimento experimental eficiente para
produzir oligmeros da protena prio pode ajudar a identificar o papel
desempenhado por essas espcies de encefalopatias espongiformes transmissveis
. A este respeito, vrios grupos estudaram a transio conformacional de
diferentes construes de protena prio recombinantes em agregados rico-p (40,
42 - 48). Alguns estudos apontam para a formao de oligmeros rica em beta
durante a transio conformacional de PrP (40, 48). Tem sido sugerido que a poligmeros no esto na via para a formao de amiloide (42, 46) e que a
preferncia para formar quer uma -oligmero ou de um agregado de amilide
pode ser ditada pelas condies experimentais com pH <5 e parcialmente
desnaturante As concentraes de ureia (4-5 M) favorecendo a -oligmero e pH>
5 e baixas concentraes de ureia (1-2 M) a favor da amilide (42). Os nossos
resultados actuais indicam que a combinao de temperatura elevada e pH 5,5 em
meio no tamponado, mais eficaz na promoo da formao de mPrP- (121231) Os oligmeros. Alm disso, sob estas condies experimentais, verifica-se
que os oligmeros sejam progressivamente consumido enquanto protofibrilas
surgir, com tempos de incubao mais longos que conduz ao desaparecimento de
oligmeros e o aparecimento de fibrilas amilides maduras (Fig. 3, A e B).
A acumulao de oligmeros de SDS-resistentes mPrP- (121-231) uma
reminiscncia da formao de oligmeros de SDS-resistentes do pptido amilide (49) e indica a elevada estabilidade das referidas espcies. Tem sido
sugerido que a oligomerizao de PrP pode ocorrer atravs da formao de
ligaes dissulfureto intermoleculares (50, 51). No entanto, os oligmeros de
mPrP- (121-231) no foram ainda desmontado por ebulio na presena de 140 m
M ditiotreitol e SDS (Fig. 2). Isto sugere que a oligomerizao de mPrP- (121-231)
no envolve a formao de ligaes dissulfureto intermoleculares.

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no envolve a formao de ligaes dissulfureto intermoleculares.
Tratamento da PrP Sc com PK gera um ncleo PK-resistente que engloba os
resduos 90-231, referidos como PrP27-30. O construto temos utilizado no
contm o domnio N-terminal da protena prio que clivada por PK, e, portanto,
qualquer alterao no peso molecular da protena seria esperado por digesto PK.
No entanto, a incubao de mPrP- (121-231) a pH 7,0 a 65 C durante 1 semana,
levou formao de um agregado anormal caracterizada por uma maior
resistncia digesto PK comparao com PrP nativo (Fig. 4). Estes resultados
sugerem que, sob estas condies experimentais, mPrP- (121-231) agrega em
uma amilide que tem propriedades fsicas de PrP Sc.
Em um estudo recente, Norstrom e Mastrianni (52) investigaram a agregao de
uma PrP construo em que uma sequncia palindrome correspondente aos
resduos de aminocidos 112-119 no ncleo hidrofbico da protena prio foi
suprimido. O facto de que este mutante de deleco formou agregados quando
expressa em levedura est de acordo com os nossos resultados actuais e apoia a
noo de que a regio C-terminal da PrP pode ser suficiente para a agregao.
Pries sintticos gerados in vitro tm sido mostrados para ser semelhante a uma
subpopulao recentemente identificado da PrP Sc de doena de Creutzfeldt-Jakob
espordica (53). De interesse significativo, a forma amilide desta subpopulao
contm um ncleo K-resistente proteinase composto apenas de resduos 152 /
153-230 e 162-230. Alm disso, um importante estudo recente mostrou que a
converso da PrP C a PrP Sc e amplificao do ltimo pode ser conseguida in vitro
(54). Inoculao do tipo selvagem com hamsters, tais in vitro -produced PrP Sc
levou a uma doena scrapie bastante semelhante ao da doena produzida por
inoculao de material infeccioso derivado do crebro (54).
Em concluso, o presente trabalho demonstra que uma forma de amilide com
propriedades fsicas de PrP Sc pode ser obtida in vitro utilizando o domnio Cterminal da PrP, que no possui a totalidade do domnio N-terminal flexvel da PrP
e a maior parte do chamado amiloidogica (hidrofbico) do ncleo da protena.
Compreendendo a converso da PrP para, uma conformao resistente protease
especfica-amilide podem fornecer discernimento sobre os mecanismos de
neurodegenerao e pode levar ao desenvolvimento de novas estratgias para
combater doenas provocadas por pries.

Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. R. Glockshuber (Eidgenssische Technische Hochschule,
Sua) para o dom do plasmdeo contendo a variante de gene que codifica F175W
mPrP- (121-231).

NotasdeRodap
4 As abreviaturas utilizadas so: a PrP C, isoforma celular da protena prio; PrP
Sc, isoforma patognica ou tremor epizotico da protena prio; PK, proteinase K; mPrP(121-231), a PrP murino recombinante compreendendo os resduos 121-231;
ThT, tioflavina T; Mes, cido 4-morpholineethanesulfonic.
* Este trabalho foi parcialmente financiado por doaes do Instituto Mdico
Howard Hughes (para STF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico
e Tecnolgico (CNPq) e pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Rio
de Janeiro (FAPERJ) (ao STF e FGF ). As despesas de publicao deste artigo
foram custeados em parte pelo pagamento de encargos de pgina. Este artigo
deve ser marcada por este meio "anncio" de acordo com 18 USC Seo 1734
exclusivamente para indicar este fato.
A verso on-line deste artigo (disponvel em http://www.jbc.org) contm
figuras suplementares. S1-S3.
1 O beneficirio de bolsas do CNPq / FAPERJ.
2 Um companheiro da Organizao Human Frontier Science Program.
Recebido 05 de junho de 2006.
Reviso recebeu 12 de julho de 2006.
A Sociedade Americana de Bioqumica e Biologia Molecular, Inc.

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