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Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Cincias Exatas


Departamento de Qumica

CRISTIANE DE CARVALHO GUIMARES

Desenvolvimento e validao de modelos quimiomtricos


baseados em espectroscopia no infravermelho prximo
para a predio de parmetros do caldo e da biomassa do
sorgo sacarino visando produo de etanol

Belo Horizonte
2014

UFMF/ICEx/DQ 1016
D 554

CRISTIANE DE CARVALHO GUIMARES

Desenvolvimento e validao de modelos quimiomtricos


baseados em espectroscopia no infravermelho prximo
para a predio de parmetros do caldo e da biomassa do
sorgo sacarino visando produo de etanol

Dissertao
Qumica

apresentada

do

Instituto

de

ao

Departamento

Cincias

Exatas

Universidade Federal de Minas Gerais,

de
da

como

requisito parcial para obteno do grau de Mestre


em Qumica Qumica Analtica.

Belo Horizonte
2014

ii

Guimares, Cristiane de Carvalho


Desenvolvimento
e
validao
de
modelos
quimiomtricos
baseados
em
espectroscopia
no
infravermelho prximo para a predio de parmetros do
caldo e da biomassa do sorgo sacarino visando
produo de etanol [manuscrito] / Cristiane de
Carvalho Guimares. 2014.
[xv], 101 f. : il.
Orientador: Marcelo Martins de Sena.
Dissertao (mestrado) Universidade Federal de
Minas Gerais. Departamento de Qumica.
Bibliografia: f. 84-90.
Anexos: f. 91-101.
1. Qumica analtica - Teses 2. Espectroscopia de infravermelho Teses 3.
Calibrao Teses 4. Sorgo sacarino Teses I. Sena, Marcelo Martins de,
Orientador II. Ttulo.
CDU 043

iii

iv

Se as coisas so inatingveis...ora! No motivo para no quer-las...


Que tristes os caminhos, se no fora a presena distante das estrelas!
Mrio Quintana

AGRADECIMENTOS

Esta dissertao de mestrado fruto de um longo esforo coletivo. Em primeiro lugar,


sou muito grata ao Prof. Marcelo Martins de Sena pela pacincia, competncia e amizade
com que orientou o meu trabalho. Da mesma forma, agradeo aos Drs. Rafael Parrela e
Maria Lcia Simeone, pesquisadores da Embrapa Milho e Sorgo, por confiarem a mim este
projeto. Tambm agradeo a colaborao do Carlos Henrique que dividiu comigo a tarefa de
analisar tantas amostras! Aos meus queridos amigos Michelle e Vander Felipe pela ajuda,
carinho e amizade. Ao Bruno, companheiro do grupo de pesquisa, meus sinceros
agradecimentos por compartilhar comigo o seu conhecimento em Matlab. Ao Prof. Clio
Pasquini e sua aluna Lvia Paulia, da UNICAMP, pelo emprstimo do polarmetro. No
poderia deixar de agradecer ao amigo Mrio ngelo por estar sempre ao meu lado nas
dificuldades que encontrei pelo caminho e tambm aos professores, funcionrios e colegas
do Departamento de Qumica da UFMG por tudo que me ensinaram em seus cursos,
seminrios e conversas. Em especial, agradeo o incentivo e o amor dos meus pais, Paulo e
Branca, do meu irmo Filipe e de todos os amigos que me ajudaram a seguir com alegria
quando o cansao teimava em aparecer. Finalmente, dou graas a Deus, meu melhor e fiel
amigo, por me permitir alcanar essa conquista!

vi

RESUMO

O caldo do sorgo sacarino vem ganhando importncia como matria-prima para a


produo de etanol de primeira gerao na entressafra da cana-de-acar. Alm disso, h uma
grande expectativa na utilizao do bagao do sorgo para produo de etanol lignocelulsico,
uma vez que esta cultura apresenta alto rendimento de biomassa por hectare e baixos custos
de produo. Consequentemente, os programas de melhoramento gentico esto buscando
melhorar a qualidade desta matria-prima com o objetivo de aumentar a produtividade. Tal
prtica gera um nmero excessivo de amostras para serem analisadas. Assim, o objetivo desse
trabalho foi desenvolver mtodos rpidos e baratos, baseados em calibrao multivariada e
espectroscopia no infravermelho prximo, para a determinao de parmetros de qualidade da
biomassa (celulose, hemicelulose e lignina) e do caldo (brix, leitura sacarimtrica, acares
redutores, pol e pureza aparente) do sorgo sacarino, alm da estimativa do rendimento terico
de etanol (RTE) baseada nos componentes da parede celular (celulose e hemicelulose). Os
modelos para biomassa foram construdos com 957 amostras, obtidas a partir de mais de 100
gentipos diferentes, nas faixas de 21,4 a 49,1 % m/m, 18,4 a 34,8 % m/m, 221 a 412 L t-1 e
1,8 a 11,5% m/m para celulose, hemicelulose, RTE e lignina, respectivamente. Os modelos
para o caldo foram construdos com 500 amostras, parte delas proveniente de 275 linhagens
contrastantes para qualidade e quantidades de acares no caldo, nas faixas de 5,5 a 18,1 B
para brix, 1,1 a 53,2 Z para leitura sacarimtrica, 1,2 a 5,2 % m/v para acares redutores,
0,3 a 13,0 % m/v para pol e 9,8 a 83,0 % m/v para pureza aparente. Finalmente, os mtodos
foram submetidos a uma completa validao analtica multivariada, de acordo com os guias
nacionais e internacionais, e considerados exatos, lineares, sensveis e sem vis.
Palavras-chave: NIRS, calibrao multivariada, biocombustveis

vii

ABSTRACT

The sweet sorghum juice is gaining importance as a raw material for the first
generation ethanol production in the period between harvests of sugar cane. Furthermore,
there is a great expectation on the use of sorghum bagasse for the lignocellulosic ethanol
production, since this culture has a high yield of biomass per hectare and low production
costs. Consequently, breeding programs are seeking to improve this raw material quality in
order to increase productivity. This practice has generated an excessive number of samples to
be analyzed. Thus, the aim of this study was to develop rapid and low cost methods based on
multivariate calibration and near infrared spectroscopy for the determination of quality
parameters of sweet sorghum biomass (cellulose, hemicellulose and lignin) and juice (brix,
saccharimetric reading, reducing sugars, pol and apparent purity), besides the estimate of the
theoretical ethanol yield (TEY) based on cell wall components (cellulose and hemicellulose).
The biomass models were built using 957 samples, obtained from over 100 different
genotypes, in the ranges of 21.4 to 49.1% w/w, 18.4 to 34.8% w/w, 221 to 412 Lt-1 and 1.8 to
11.5% w/w for cellulose, hemicellulose, lignin and TEY, respectively. The juice models were
built with 500 samples, part of them from 275 contrasting strains for quality and for amount
of sugars in the juice, in the ranges of 5.5 to 18.1 B for brix, 1.1 to 53.2 Z for saccharimetric
reading, 1.2 to 5.2 % w/v for reducing sugars, 0.3 to 13.0 % w/v for pol and 9.8 to 83.0% w/v
for apparent purity. Finally, a complete multivariate analytical validation was carried out in
accordance with the Brazilian and international guidelines, and the methods were considered
accurate, linear, sensitive and unbiased.
Key words: NIRS, multivariate calibration, biofuels

viii

SUMRIO

AGRADECIMENTOS .......................................................................................................... vi
RESUMO ............................................................................................................................ vii
ABSTRACT ....................................................................................................................... viii
SUMRIO............................................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................................... xiv
1 - INTRODUO ................................................................................................................ 1
1.1 Bioenergia e Bioetanol ................................................................................................. 1
1.2 Sorgo sacarino .............................................................................................................. 4
2 - MOTIVAO .................................................................................................................. 7
2.1 Programas de melhoramento gentico do sorgo sacarino .............................................. 7
2.2 Parmetros de qualidade e metodologias convencionais................................................ 8
2.2.1Caracterizao do caldo de sorgo sacarino .............................................................. 8
2.2.1.1 Brix ................................................................................................................ 8
2.2.1.2 Pol e leitura sacarimtrica ............................................................................... 9
2.2.1.3 Acares redutores.......................................................................................... 9
2.2.1.4 Pureza aparente do caldo ............................................................................... 11
2.2.2 Caracterizao da biomassa de sorgo sacarino ..................................................... 11
2.2.2.1 FDN.............................................................................................................. 12
2.2.2.2 FDA.............................................................................................................. 12
2.2.2.3 Lignina ......................................................................................................... 13
2.2.2.4 Celulose ........................................................................................................ 14
2.2.2.5 Hemicelulose ................................................................................................ 15
2.2.2.6 Rendimento Terico de Etanol (RTE) ........................................................... 16
3 - REFERENCIAL TERICO ........................................................................................... 18
3.1 Espectroscopia no infravermelho prximo NIRS ..................................................... 18
3.2 Quimiometria e calibrao multivariada ..................................................................... 25
3.2.1 Definio dos termos ........................................................................................... 25
3.2.2 Mtodos de calibrao multivariada ..................................................................... 27
3.2.3 Regresso por mnimos quadrados parciais .......................................................... 28
3.2.4 Deteco de amostras anmalas Outliers........................................................... 30
3.3 Validao de modelos multivariados e figuras de mrito............................................. 33
3.3.1 Veracidade .......................................................................................................... 34
3.3.2 Preciso ............................................................................................................... 34
3.3.3 Linearidade .......................................................................................................... 35
3.3.4 Sensibilidade ....................................................................................................... 38
ix

3.3.5 Sensibilidade analtica ......................................................................................... 38


3.3.6 Seletividade ......................................................................................................... 39
3.3.7 Faixa de trabalho ................................................................................................. 39
3.3.8 Vis (teste para erro sistemtico Bias) ........................................................... 39
3.3.9 Relao de Desempenho do Desvio, RPD (Residual Prediction Deviation).......... 40
4 - OBJETIVOS................................................................................................................... 42
5 - PARTE EXPERIMENTAL............................................................................................. 43
5.1 Amostras .................................................................................................................... 43
5.2 Reagentes ................................................................................................................... 44
5.3 Equipamentos............................................................................................................. 45
5.4 Softwares ................................................................................................................... 46
5.5 Procedimentos ............................................................................................................ 46
5.6 Mtodos de referncia ................................................................................................ 48
6 - RESULTADOS E DISCUSSO..................................................................................... 51
6.1 Resultados obtidos pelas metodologias de referncia .................................................. 51
6.2 Espectros NIR e desenvolvimento dos modelos PLS .................................................. 54
6.3 Determinao do rendimento terico de etanol ........................................................... 60
6.4 Otimizao dos modelos atravs da deteco de amostras anmalas ........................... 63
6.5 Validao analtica multivariada ................................................................................. 65
6.5.1 Linearidade .......................................................................................................... 65
6.5.2 Veracidade, preciso e faixa de trabalho .............................................................. 69
6.5.3 Seletividade e sensibilidade analtica ................................................................... 77
6.5.4 Vis e RPD .......................................................................................................... 78
6.5.5 Cartas de Controle ............................................................................................... 79
7 - CONCLUSO ................................................................................................................ 82
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................. 84
ANEXOS ............................................................................................................................. 91

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Emisses evitadas pela utilizao de biocombustveis em 2012 Brasil .................. 2


Figura 2 Rotas para produo de bioetanol ............................................................................ 3
Figura 3 Planta de Sorgo sacarino ......................................................................................... 5
Figura 4 Representao esquemtica da produo de etanol a partir da biomassa
lignocelulsica ............................................................................................................... 6
Figura 5 Equao da reao qumica envolvida no mtodo de Lane-Eynon ......................... 10
Figura 6 Representao esquemtica da metodologia de extrao sequencial baseada no
mtodo de van Soest. .................................................................................................... 12
Figura 7 Modelo estrutural da lignina proposto por Nimz e co-autores ................................ 13
Figura 8 Celulose - Polmero linear de molculas de D-glicose. .......................................... 14
Figura 9 Representao de um tipo de molcula de hemicelulose ........................................ 15
Figura 10 Algumas vibraes moleculares .......................................................................... 20
Figura 11 Representao esquemtica dos modelos harmnico (A) e anarmnico (B) para a
energia potencial de molculas diatmicas33. de = distncia de equilbrio ..................... 23
Figura 12 Alguns modos de medida empregados em espectroscopia NIR33: (a) reflectncia
difusa, (b) transflectncia e (c) transmitncia. (Ip e Is = intensidade da radiao incidente
e que emerge do material, respectivamente).................................................................. 24
Figura 13 Decomposio em VL das matrizes X e Y para modelos PLS ............................. 29
Figura 14 Distribuio residual normal. Dados se aproximam do ajuste de uma linha reta ... 36
Figura 15 Grfico de correlao do teste de Durbin-Watson ................................................ 37
Figura 16 Acessrio de transflectncia utilizado nas medidas dos espectros do caldo .......... 48
Figura 17 (a) Determinador de fibras Ankom e (b) bolsas de filtro utilizadas nas anlises de
FDA e FDN .................................................................................................................. 49
Figura 18 Polarmetro utilizado na determinao da leitura sacarimtrica ............................ 49
Figura 19 Determinao do teor de acares redutores em Redutec. (a) antes e (b) depois da
titulao ....................................................................................................................... 50
Figura 20 Refratmetro digital para a determinao de brix ................................................ 50
Figura 21 Teores dos parmetros da biomassa determinados pelas metodologias de referncia
para (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina. ............................................ 52

xi

Figura 22 Teores dos parmetros do caldo determinados pelas metodologias de referncia


para (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, (d) pol e (e) pureza
aparente........................................................................................................................ 53
Figura 23 Espectros NIR de 957 amostras da biomassa do sorgo sacarino ........................... 54
Figura 24 Espectros NIR de 957 amostras da biomassa do sorgo sacarino aps o prprocessamento SNV ..................................................................................................... 55
Figura 25 Coeficientes de regresso dos modelos PLS para (a) celulose, (b) hemicelulose, (c)
RTE e (d) lignina .......................................................................................................... 57
Figura 26 Espectros NIR de 500 amostras do caldo do sorgo sacarino ................................. 58
Figura 27 Espectros NIR de 500 amostras do caldo do sorgo sacarino aps o prprocessamento 1 DSG ................................................................................................. 59
Figura 28 Coeficientes de regresso dos modelos PLS para (a) brix, (b) leitura sacarimtrica,
(c) acares redutores, (d) pol e (e) pureza aparente...................................................... 61
Figura 29 Resduos para as amostras da calibrao () e validao (). Modelos PLS para
determinao de (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina em biomassa de
sorgo ............................................................................................................................ 66
Figura 30 Resduos para as amostras da calibrao () e validao (). Modelos PLS para
determinao de (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, (d) Pol e (e)
pureza aparente em caldo de sorgo ............................................................................... 67
Figura 31 Erros relativos das amostras de validao para os parmetros da biomassa (a)
celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina. Limites em vermelho (-20 a +10%). . 73
Figura 32 Erros relativos das amostras de validao para os parmetros do caldo (a) brix, (b)
leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, (d) pol e (e) pureza aparente. Limites em
vermelho (-20 a +10 %). ............................................................................................... 74
Figura 33 Cartas de controle para o monitoramento da estabilidade dos modelos NIRS da
biomassa. (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) lignina e (d) RTE. .................................... 81

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Resultados para a otimizao dos modelos PLS da biomassa (resultados finais em
negrito) atravs das etapas de deteco de outliers........................................................ 62
Tabela 2 Resultados para a otimizao dos modelos PLS do caldo (resultados finais em
negrito) atravs das etapas de deteco de outliers........................................................ 62
Tabela 3 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos
para a determinao de celulose, hemicelulose, RTE e lignina em biomassa de sorgo
sacarino ........................................................................................................................ 75
Tabela 4 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos
para a determinao de brix, leitura sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza
aparente (Q) nas amostras de caldo de sorgo sacarino ................................................... 76
Tabela 5 Parmetros dos testes estatsticos usados na avaliao das cartas de controle
desenvolvidas para o monitoramento dos modelos NIRS .............................................. 80

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ASTM

American Society for Testing and Materials (Instituio normativa)

BAG

Banco Ativo de Germoplasma

BF

Brown Forsythe (Teste estatstico para avaliao da homocedasticidade dos


resduos)

DP

Desvio Padro

DPR

Desvio Padro Relativo

DSG

Derivada seguida de alisamento Savitzky-Golay

DW

Durbin Watson (Teste estatstico para avaliao da independncia dos


resduos)

FDA

Fibras insolveis em Detergente cido

FDN

Fibras insolveis em Detergente Neutro

FdM

Figuras de Mrito

FT-NIR

Espectrofotometria de Infravermelho Prximo com Transformada de


Fourier (Fourier Transform Near Infrared)

INMETRO

Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial

IUPAC

Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (International Union of


Pure and Applied Chemistry)

MAPA

Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

MLR

Regresso Linear Mltipla (Multiple Linear Regression)

MSC

Correo de
Correction)

NAS

Sinal Analtico Lquido (Net Analyte Signal)

NIRS

Espectroscopia no Infravermelho Prximo (Near Infrared Spectroscopy)

PCR

Regresso por Componentes Principais (Principal Component Regression)

PLS

Mnimos Quadrados Parciais (Partial Least Squares)

PMGS

Programa de Melhoramento Gentico de Sorgo

Pureza aparente do caldo

RIL

Linhagens Endogmicas Recombinantes (Recombinant Inbred Lines)

RJ

Ryan Joiner (Teste estatstico para avaliao da normalidade dos resduos)

RMSEC

Raiz Quadradas dos Erros Quadrticos Mdios de Calibrao (Root Mean


Square Error of Calibration)

Espalhamento

Multiplicativo

(Multiplicative

Scatter

xiv

RMSECV

Raiz Quadrada do Erro Quadrtico Mdio de Validao Cruzada (Root


Mean Square Error of Cross-Validation)

RMSEP

Raiz Quadrada do Erro Quadrtico Mdio de Previso (Root Mean Square


Error of Prediction)

RPD

Relao de Desempenho do Desvio (Residual Prediction Deviation)

RTE

Rendimento Terico de Etanol

Pol (Porcentagem de sacarose no caldo da cana/sorgo)

SDV

Desvio Padro dos Erros de Validao (Standard Deviation of Validation


Errors)

SEL

Seletividade

SEN

Sensibilidade

SNV

Variao Normal Padro (Standard Normal Variate)

VL

Variveis Latentes

xv

1 - INTRODUO
1.1 Bioenergia e Bioetanol
O petrleo, principal fonte de energia do mundo moderno, alcanou posio de
destaque durante dcadas graas ao seu preo relativamente baixo e s facilidades de
exportao e transporte do mesmo. Entretanto, a diminuio das reservas desse material fssil
e a elevao dos custos para sua obteno, aliadas crescente preocupao com a preservao
ambiental, vm exigindo solues tecnolgicas imediatas para a substituio dessa fonte de
energia1. Tais solues se baseiam na utilizao de algumas fontes alternativas que permitam
realizar em longo prazo e, com limitados impactos econmicos, a transio para uma nova era
de energias mais limpas e renovveis2. Nesse sentido, bastante intuitivo pensar em produzilas com base em matria orgnica renovvel a chamada bioenergia.
A bioenergia representa uma das melhores alternativas para captar e armazenar a
energia solar sempre que haja terras livres para cultivo, clima adequado e conhecimento
suficiente para aplic-la. A energia solar na forma de biocombustvel, produzido com
eficincia e sustentabilidade, capaz de atender s urgentes demandas para reduzir as
emisses de gases de efeito estufa, melhorar a qualidade do ar nas metrpoles e competir em
preo com as energias convencionais3. A principal diferena entre os biocombustveis e os
combustveis fsseis, do ponto de vista de emisses, que os combustveis derivados de
petrleo utilizam para a combusto o carbono das molculas que estava estocado h milhes
de anos nas jazidas petrolferas, emitindo dixido de carbono para a atmosfera, em um ciclo
semiaberto, alterando sua composio qumica. No caso dos biocombustveis, o ciclo de
carbono fechado, ou seja, todo o carbono emitido para atmosfera durante a combusto
reabsorvido no ciclo seguinte, para produo da mesma quantidade de biocombustvel4. Alm
disso, o teor de oxignio nos biocombustveis mais elevado, o que possibilita uma
1

combusto mais limpa1,3. Na Fig. 1, observam-se as emisses evitadas no ano de 2012 no


Brasil, medidas em toneladas de CO2 equivalente, decorrentes do uso de biocombustveis
renovveis em detrimento de seus equivalentes fsseis5. Cerca de 35 milhes de toneladas de
dixido de carbono deixaram de ser lanadas na atmosfera com a substituio de gasolina por
etanol anidro e hidratado.

Figura 1 Emisses evitadas pela utilizao de biocombustveis em 2012 Brasil


Dentre os biocombustveis o que mais vem se destacando o bioetanol, devido sua
efetiva insero na matriz energtica mundial e maior maturidade do processo de produo
do mesmo. Esse lcool geralmente classificado em trs tipos, dependendo da matria-prima
atravs da qual obtido. O primeiro derivado de materiais base de acares simples, tais
como cana-de-acar e beterraba sacarina. Por ser obtido a partir de fermentao direta desses
acares, ele denominado etanol de primeira gerao de tecnologias. O segundo
derivado de materiais amilceos como gros de milho e trigo. O terceiro produzido a partir
de materiais lignocelulsicos, incluindo resduos de culturas (por exemplo, palha de arroz,
bagao de cana-de-acar e palha de milho) e materiais lenhosos3. Esses dois ltimos tipos
so tambm chamados de etanol de segunda gerao de tecnologias, pois, a matria-prima

passa por um processo de hidrlise (cida ou enzimtica), antes da fermentao, para que os
polissacardeos sejam quebrados em acares fermentveis. A Fig. 2 mostra as snteses das
rotas tecnolgicas de obteno de cada um deles3.

Materiais
aucarados

Materiais
amilceos

lignocelulsicos

Extrao por
presso

Triturao

Triturao

Hidrlise
enzimtica

Hidrlise
cida ou
enzimtica

Materiais

Soluo aucarada fermentvel


Fermentao
Destilao
Etanol
Figura 2 Rotas para produo de bioetanol
Com relao ao bioetanol, o Brasil se encontra em uma posio privilegiada. O pas
o segundo maior produtor de etanol de primeira gerao (produzido a partir da fermentao
do caldo da cana-de-acar) do mundo6. A produo e o uso de bioetanol como combustvel
veicular so praticados regularmente no Brasil desde 1931, com notvel evoluo durante as
ltimas dcadas3. Embora a produo de etanol a partir do caldo da cana-de-acar seja um
processo bem estabelecido no Brasil, com os menores custos, a maior produtividade e o
melhor balano energtico do mundo, ainda h espao para crescimento 7. Existem diversas
possibilidades de investimento em pesquisa, desenvolvimento e inovao para o
aperfeioamento da produo de etanol, tanto pela busca de matrias-primas alternativas, que
complementem a produo do lcool, quanto pelo desenvolvimento cientfico e tecnolgico
da obteno do etanol lignocelulsico produzido a partir da celulose e hemicelulose.

A produo de bioetanol a partir de materiais celulsicos assumidamente a que


apresenta o maior potencial entre as alternativas possveis para aumentar a produo do lcool
no mundo. O bagao produzido nas usinas de processamento de etanol de primeira gerao, a
partir da cana-de-acar, tem grande potencial para ser utilizado nesse processo. Entretanto,
esta ainda no uma realidade em escala industrial8. No Brasil, o desenvolvimento de
combustveis celulsicos segue com investimentos modestos. Apesar disto, no ano de 2012,
foi anunciada a primeira usina comercial de etanol de segunda gerao, localizada em
Alagoas, cuja inaugurao est prevista para 20149.
Apesar da soberania da cana-de-acar como matria-prima na obteno de etanol
tanto de primeira quanto de segunda gerao, o setor sucroalcooleiro, por ser uma atividade
agroindustrial, sofre a influncia de uma caracterstica intrnseca: a sazonalidade da produo
da matria-prima. O ciclo da cana-de-acar de 12 a 18 meses o que dissocia o perodo de
colheita das necessidades do consumo que se prolongam por todos os meses do ano. Assim,
preciso estocar uma grande proporo da produo de modo a permitir a manuteno da
oferta de etanol no perodo de entressafra, quando as fbricas esto paralisadas 10. Nesse
contexto se insere a busca por matrias-primas capazes de complementar a oferta de bioetanol
durante os perodos de entressafra da cana-de-acar.

1.2 Sorgo sacarino


Uma das matrias-primas que se apresenta com grande potencial para produo de
etanol, ao lado da cana-de-acar, o sorgo sacarino (Fig. 3). O sorgo (Sorghum bicolor L.
Moench) uma planta de origem africana, da mesma famlia botnica do milho, conhecido
por ser utilizado na alimentao animal, principalmente de bovinos11. Agronomicamente, os
sorgos so classificados em cinco grupos: granfero, forrageiro para silagem e/ou sacarino,
forrageiro para pastejo/corte, vassoura e biomassa.

Figura 3 Planta de Sorgo sacarino


O sorgo do tipo sacarino apresenta colmos com caldo semelhante ao da cana-deacar, rico em acares fermentveis, e pode servir para a produo de etanol de primeira
gerao na mesma instalao utilizada para cana12. O sorgo sacarino tem sido identificado
como uma cultura de baixos custos de cultivo, pois, uma planta com alta eficincia
fotossinttica, grande tolerncia seca e que requer o mnimo de fertilizantes para ser
cultivada. Alm disso, apresenta uma vantagem adicional em relao cana-de-acar: seu
perodo de maturao de apenas 4 meses13.
Somado a isso, por ser uma matria-prima que apresenta alto rendimento de biomassa
por hectare e baixos custos de produo, o bagao do sorgo sacarino uma promessa futura
na obteno de etanol de segunda gerao. Assim como outros materiais lignocelulsicos, ele
contm quantidades considerveis de carboidratos polimricos (celulose e hemicelulose) que
podem ser hidrolisados - por cidos ou enzimas - em acares fermentveis que sero
posteriormente fermentados em etanol14 (Fig. 4). Alm dos carboidratos, a biomassa contm
ainda quantidade aprecivel de lignina, um complexo polmero fenlico, que torna o bagao
um excelente combustvel para gerao de eletricidade e vapor. Essa combusto da lignina
contribui para a reduo da energia fssil utilizada nas usinas de produo de etanol15.

Figura 4 Representao esquemtica da produo de etanol a partir da biomassa


lignocelulsica16
O cultivo do sorgo do tipo sacarino pode ser uma alternativa tcnica e
economicamente vivel para fornecimento de matria-prima s usinas alcooleiras, evitando o
corte antecipado de cana-de-acar e a reduo do rendimento industrial. Alm disso, a
insero e expanso do sorgo sacarino em complemento cana-de-acar para a produo de
bioetanol podem estabilizar a oferta de lcool combustvel no Brasil ao longo do ano17.

2 - MOTIVAO
2.1 Programas de melhoramento gentico do sorgo sacarino
A utilizao de sorgo sacarino para a produo de etanol de primeira e de segunda
gerao tem sido amplamente estudada pelo Programa de Melhoramento Gentico de Sorgo
(PMGS) da Embrapa. O desenvolvimento de novas variedades e hbridos dessa matria-prima
vem sendo realizado com o objetivo de aumentar a capacidade de produo do lcool18. Alm
disso, a reduo dos custos de obteno de etanol pode ser alcanada atravs da melhoria da
qualidade da matria-prima19.
Em um programa de melhoramento gentico o ponto de partida o banco de
germoplasma, que rene milhares de gentipos. Depois de serem obtidas por cruzamentos
especficos definidos pelos pesquisadores, as sementes so enviadas s estaes experimentais
onde so plantadas. As plantas passam, ento, por uma fase de seleo para a definio dos
materiais com as caractersticas desejadas, por exemplo, maiores teores de acares no caldo e
composio adequada da biomassa, um trabalho que feito em conjunto com mtodos
biotecnolgicos avanados. nessa etapa do processo que as amostras devem ser
caracterizadas em laboratrio, pois, a matria-prima precisa ser submetida a um controle de
qualidade para garantir uma produo com maior rendimento e, portanto, com maior
eficincia.
Devido similaridade de composio, os mtodos analticos utilizados para avaliar os
parmetros de qualidade do caldo de cana-de-acar podem servir para a avaliao do caldo
de sorgo18. Os parmetros mais utilizados nessa avaliao so: teor de slidos solveis (brix),
sacarose (leitura sacarimtrica, pol e pureza aparente), e acares redutores (glicose e frutose).
Da mesma maneira, as metodologias e os parmetros de qualidade empregados para avaliar a
biomassa da cana-de-acar podem ser estendidos para o bagao do sorgo sacarino utilizado
7

na produo de etanol de segunda gerao 18. Os mtodos analticos para avaliao de


biomassa lignocelulsica devem possibilitar a quantificao dos polissacardeos celulose e
hemicelulose, bem como os teores de lignina. Alm disso, de interesse do PMGS estimar a
quantidade de etanol celulsico que, teoricamente, pode ser obtido a partir de cada material
desenvolvido.
preciso levar em considerao que, para a caracterizao dos materiais selecionados
pelo PMGS, etapa imprescindvel na otimizao da produtividade, uma grande quantidade de
amostras gerada anualmente, tornando o processo impraticvel com a utilizao de
metodologias de anlise convencionais.

2.2 Parmetros de qualidade e metodologias convencionais


A caracterizao da matria-prima realizada de acordo com a finalidade a que se
destina. Para fins energticos, nas rotas de produo de etanol de 1 gerao tecnolgica fazse a caracterizao do caldo, e, para fins diferenciados (etanol de 2 gerao tecnolgica)
procede-se a caracterizao da biomassa.
2.2.1 Caracterizao do caldo de sorgo sacarino
O caldo extrado do sorgo sacarino contm acares simples como glicose, frutose e
sacarose20. Estes acares so diretamente fermentados para produzir o etanol, levando, dessa
forma, ao processo mais barato. A seguir so apresentados os principais parmetros a serem
analisados na avaliao da qualidade do caldo, bem como uma breve descrio das
metodologias de anlises comumente utilizadas nessa avaliao.
2.2.1.1 Brix
O brix o parmetro mais utilizado na indstria do lcool. Por definio, ele expressa
a porcentagem massa/massa dos slidos solveis contidos em uma soluo pura de sacarose,
8

ou seja, mede o teor de sacarose em solues puras21. A sua determinao quantitativa pode
ser realizada atravs de refratmetros nos quais o ndice de refrao do caldo extrado
medido em escala brix (B). Por definio, 1 B corresponde a 1 grama de sacarose em 100 g
de soluo aquosa. No entanto, para o caldo de sorgo, assim como para o caldo de cana, ele
representa a estimativa do teor de sacarose tendo em vista as demais impurezas presentes.
Este parmetro no fornece qualquer informao qualitativa acerca dos acares presentes.
2.2.1.2 Pol e leitura sacarimtrica
Pol (S) a medida da quantidade de sacarose na mistura de acares21,22. O clculo do
pol feito atravs da determinao do grau de polarizao da amostra. Essa medida, chamada
de leitura sacarimtrica (Z), realizada em um polarmetro (sacarmetro) aps a
clarificao do caldo com uma mistura base de alumnio.
A equao completa para o clculo do pol a seguinte22:
S(% do caldo) = (1,00621 x LAl + 0,05117) x (0,2605 - 0,0009882 x B)

(Eq. 1)

na qual LAl a leitura sacarimtrica obtida com a mistura clarificante base de alumnio
(Z) e B o brix do caldo (B).
2.2.1.3 Acares redutores
Os acares redutores (glicose e frutose) podem ser avaliados por uma titulao de
oxirreduo. O mtodo mais comum, o de Lane-Eynon23, baseia-se no fato de que os sais
cpricos, em soluo tartrica alcalina (soluo de Fehling), podem ser reduzidos a quente por
aldoses ou cetoses transformando-se em sais cuprosos, que se precipitam, conforme mostrado
na Fig. 5.

Figura 5 Equao da reao qumica envolvida no mtodo de Lane-Eynon


Para alcanar maior exatido dos resultados, a soluo de Fehling deve ficar sob
ebulio constante durante toda a titulao, pois o Cu2O formado pode ser novamente oxidado
pelo O2 do ar, mudando novamente a cor para azul. Alm disso, a titulao deve levar no
mximo trs minutos, porque pode haver decomposio dos acares com o aquecimento
prolongado. A relao entre o cobre reduzido e o acar redutor no estequiomtrica, e o
resultado, obtido de tabelas ou padronizando-se a mistura de Fehling com uma soluo de
concentrao conhecida de acar, geralmente expresso em porcentagem de glicose.
A desvantagem deste tipo de mtodo baseado na reduo de metais e outros
compostos que os resultados dependem de um tempo de reao preciso, a temperatura da
reao e a concentrao dos reagentes devem ser cuidadosamente controladas e eles so
bastante susceptveis interferncia. A porcentagem de acares redutores presentes no caldo
dada pela equao 2:
AR(%) = CP x Vp/Va x dil

(Eq. 2)

na qual Cp a concentrao da soluo padro de glicose em % m/v, V p o volume do padro


de glicose gasto para a padronizao da soluo de Fehling em mL, V a o volume de amostra
gasto para a titulao da soluo padronizada de Fehling em mL e dil o fator de diluio da
amostra (quando houver).
10

2.2.1.4 Pureza aparente do caldo


A pureza aparente do caldo (Q) definida como a porcentagem de pol em relao ao
brix, e calculada pela equao22:
Q = 100 x S B

(Eq. 3)

Caldos com pureza aparente abaixo de 75% so considerados de baixa pureza.


2.2.2 Caracterizao da biomassa de sorgo sacarino
A biomassa lignocelulsica basicamente composta de trs polmeros: celulose,
hemicelulose e lignina24. Para a produo de etanol de segunda gerao desejvel que os
teores desses compostos sejam determinados e, ainda, que seja feita uma estimativa do
rendimento terico de etanol com base nos teores dos polissacardeos hidrolisveis.
A seguir so apresentadas as principais metodologias para determinao desses
parmetros de qualidade da biomassa, bem como uma breve descrio das anlises de
referncia.
A metodologia mais simples utilizada para as anlises de celulose, hemicelulose e
lignina baseada no mtodo de extrao sequencial de van Soest25. Este mtodo foi proposto
em 1968 e considera que os constituintes das plantas podem ser divididos em contedo celular
(lipdios, compostos nitrogenados, gorduras, amido e outros compostos solveis em gua) e
parede celular (protena insolvel, hemicelulose, celulose e lignina). A metodologia
subdividida em FDA (fibras insolveis em detergente cido) e FDN (fibras insolveis em
detergente neutro)26, como mostrado na Fig. 6:

11

Detergente neutro

Detergente cido

H2SO4 72% v/v + 500 C/4h

Figura 6 Representao esquemtica da metodologia de extrao sequencial baseada no


mtodo de van Soest.
2.2.2.1 FDN
A clula vegetal revestida por uma parede celular rgida composta basicamente por
celulose, mas em clulas adultas esta parede sofre um espessamento que pode formar uma
segunda parede composta por lignina e hemicelulose. O mtodo de van Soest consiste,
inicialmente, em separar o contedo celular da parede celular (Fig. 6). Isto feito aquecendose parte da amostra em soluo de detergente neutro. O contedo celular solubiliza-se no
detergente, enquanto a parede celular no, podendo ser separada por filtrao. As fraes
resultantes so denominadas fibras solveis em detergente neutro, compostas por protena,
nitrognio no proteico, lipdeos, pigmentos, acares, cidos orgnicos e pectina, e FDN,
constituda basicamente por celulose, hemicelulose e lignina.
2.2.2.2 FDA
Quando se utiliza soluo de detergente cido, a hemicelulose solubiliza-se e a lignina
ligada celulose (lignocelulose) separada por filtrao (Fig. 6). As duas fraes so
12

denominadas, respectivamente, fibras solveis em detergente cido e FDA (constituda de


celulose e lignina).
2.2.2.3 Lignina
A lignina um dos principais componentes da biomassa vegetal, possuindo natureza
aromtica e muito complexa. Ela est presente em muitas espcies vegetais e no possui a
mesma estrutura qumica em todas elas. A presena de diferentes unidades precursoras e o
elevado nmero de combinaes possveis entre essas unidades faz com que a estrutura da
macromolcula de lignina seja bem mais complexa que as apresentadas pela celulose e pela
hemicelulose. Na Fig. 7 apresentado o modelo estrutural da lignina proposto por Nimz27:

Figura 7 Modelo estrutural da lignina proposto por Nimz e co-autores


Durante o desenvolvimento das clulas, a lignina incorporada como o ltimo
componente na parede, interpenetrando as fibrilas e assim enrijecendo as paredes celulares.
Ela tem um importante papel no transporte de gua, nutrientes e metablitos, sendo
responsvel pela resistncia mecnica de vegetais, alm de proteger os tecidos contra o ataque
de microorganismos24. Os teores desejados de lignina na biomassa so controversos, pois,
enquanto se espera maior produo de energia com o aumento do contedo de lignina nos
13

processos de cogerao, a eficincia da converso dos polissacardeos (celulose e


hemicelulose) em etanol prejudicada pela presena desse composto aromtico. Dessa
maneira, conhecer a quantidade e composio da lignina no sorgo sacarino importante para
as linhas de melhoramento gentico que precisam adequar essa composio finalidade que
se pretende dar biomassa. A determinao da lignina tambm segue a metodologia de van
Soest e feita sequencialmente extrao das fibras em detergente neutro e cido, atravs da
digesto do resduo de FDN com soluo de cido sulfrico e posterior calcinao (Fig. 6).
2.2.2.4 Celulose
A celulose localiza-se principalmente na parede celular secundria e faz parte da
estrutura fibrosa organizada. A celulose um polmero orgnico, que constitudo
unicamente por unidades de D-glicose, mantidas unidas numa cadeia molecular linear por
ligaes glicosdicas -1,428 (Fig. 8).

Figura 8 Celulose - Polmero linear de molculas de D-glicose.


As cadeias de celulose nas paredes celulares das plantas so arranjadas
compactamente, de modo que suas fibras apresentam regies nitidamente cristalinas, uma
consequncia do grande nmero de ligaes de hidrognio que resulta numa forte interao
entre suas molculas. A metodologia mais comum para a determinao de celulose se baseia
14

no teor de FDA. Esta fibra composta basicamente de lignina, celulose e slica. Uma vez
determinados os teores de FDA e de lignina, efetua-se a incinerao do resduo da lignina. A
celulose corresponde parte do resduo que se perde com a incinerao. O que sobra,
corresponde cinza residual, que contm slica. A celulose ento calculada por diferena de
peso29.
2.2.2.5 Hemicelulose
A hemicelulose um heteropolmero que possui muitas ramificaes contendo
diferentes carboidratos, como xilose, arabinose, manose, galactose, glicose, assim como
cidos urnicos24. Dependendo da predominncia do tipo de acar as hemiceluloses podem
ser chamadas de arabino-xilanas, mananas, glucanas ou galactanas. Esses acares contm
cinco (pentoses) ou seis (hexoses) carbonos em sua estrutura e so unidos por ligaes
glicosdicas quase sempre acetiladas, formando uma estrutura fraca e hidroflica que serve
como uma conexo entre a lignina e as fibras de celulose, alm de conferir rigidez ao
complexo celulose-hemicelulose-lignina. Comparadas com a celulose, as hemiceluloses
apresentam maior susceptibilidade hidrlise cida, pois oferecem uma maior acessibilidade
aos cidos minerais comumente utilizados como catalisadores. Esta reatividade usualmente
atribuda ao carter amorfo destes polissacardeos24. Na Fig. 9 est representada uma
molcula de hemicelulose. A proporo de hemicelulose determinada atravs de clculos
pela diferena entre os teores de FDN e FDA.

Figura 9 Representao de um tipo de molcula de hemicelulose


15

2.2.2.6 Rendimento Terico de Etanol (RTE)


Para o PMGS importante que sejam avaliados diversos cultivares de sorgo sacarino
sob diferentes ciclos de cultivo, com o objetivo de aumentar o perodo de colheita para a
produo de etanol em escala industrial. interesse do Programa identificar a quantidade de
etanol que poderia ser produzida por cada cultivar em diferentes perodos de maturao da
planta (antes da maturao, no pico de maturidade e na maturao tardia) e sob diferentes
tipos de manejo de cultivo e estresse (ataque de pragas, perodos de seca, deficincia de
fertilidade, excesso de gua). Alm disso, esta estimativa tambm importante na
comparao do potencial de produo de etanol entre hbridos e linhagens do sorgo sacarino.
A forma mais usual de estimar o rendimento de etanol em escala laboratorial consiste
na utilizao de metodologias caras e demoradas. Tratam-se de etapas de hidrlise enzimtica
da biomassa e fermentao dos acares, seguidas de anlises cromatogrficas para a
determinao do teor de lcool30. No entanto, alguns artigos tm correlacionado com sucesso
a anlise da composio de biomassa com a produo de etanol prevista para certas matriasprimas, incluindo o sorgo19,31.
Nesse contexto, baseado no trabalho de Zhao et al31, a equao a seguir pode ser usada
para determinao do RTE a partir dos teores de celulose e hemicelulose presentes no bagao
do sorgo:
RTEcel,hem = (CEL + HEM) x (BS) x 1,11 x 0,85 x 0,51 x 0,85 x 1000/0,79

(Eq. 4)

na qual RTEcel,hem o rendimento terico de etanol de celulose e hemicelulose em L ha -1, CEL


+ HEM so os teores de celulose e hemicelulose na matria seca em %, BS a biomassa seca
em t ha-1, 1,11 o fator de converso de acar de celulose e hemicelulose, 0,85 a eficincia
do processo de acar de celulose e hemicelulose, 0,51 o fator de converso de etanol a

16

partir de acar, 0,85 a eficincia do processo de etanol a partir de acar, 1000/0,79 a


densidade do etanol g mL-1.
A maioria das metodologias comumente usadas na caracterizao do caldo e da
biomassa, como foi exposto, demorada, complexa, cara e demanda grande quantidade de
reagentes, muitas vezes txicos, o que por sua vez leva gerao de um grande volume de
resduos qumicos. Alm disso, tendo em vista a quantidade de amostras geradas pelo PMGS,
o uso dessas metodologias pode tornar as anlises inviveis de serem realizadas em tempo
hbil para tomadas de deciso.
Dessa forma, a busca por metodologias mais rpidas e de baixo custo tem se tornado
constante nos laboratrios que atendem a demanda do PMGS. Alm disso, preciso lembrar
que a reduo do uso de reagentes txicos e a diminuio da quantidade de resduos gerados
nas anlises vo de encontro a uma questo bastante atual na pesquisa cientfica: a qumica
verde32. A fim de atingir os objetivos da qumica analtica verde, mtodos no destrutivos, ou
pelo menos que evitem o tratamento qumico das amostras, so desejveis. Assim, cada vez
mais, aumenta o interesse pelos mtodos vibracionais de anlise.

17

3 - REFERENCIAL TERICO
3.1 Espectroscopia no infravermelho prximo NIRS33-37
Uma alternativa analtica para superar as desvantagens das metodologias tradicionais
o uso da espectroscopia no infravermelho prximo, NIRS (Near Infrared Spectroscopy)
combinada com mtodos de calibrao multivariada. Esta tcnica possibilita a determinao
simultnea de vrias propriedades (ou concentraes de vrios analitos) de uma amostra
usando uma nica medida instrumental sem a necessidade de uma separao fsica dos
componentes. Como consequncia, ela apresenta baixo consumo de reagentes, pouca
manipulao de amostras e alta velocidade de anlise, o que pode ser crucial no mundo real,
onde qualquer atraso na obteno de resultados analticos pode resultar em significantes
perdas tanto de qualidade quanto financeiras. Com a utilizao deste tipo de tcnica, reagentes
potencialmente perigosos so evitados e claros benefcios sade dos operadores e ao
ambiente so alcanados. Alm disso, h considervel reduo de custos com tratamento de
resduos qumicos.
A espectroscopia no infravermelho prximo uma tcnica vibracional que durante as
ltimas duas dcadas tem feito progressos evidentes em suas aplicaes em diversas reas da
cincia38-40. A radiao NIR emprega ftons de energia (h) na faixa de 2,65 x 10 -19 a 7,96 x
10-20 J, o que corresponde faixa de comprimento de onda de 750 a 2.500 nm (nmeros de
onda de 13.330 a 4.000 cm-1) do espectro eletromagntico. Esta faixa de energia suficiente
apenas para promover a vibrao molecular. temperatura ambiente a maioria das molculas
est em seus nveis de energia do estado vibracional fundamental. tomos ou grupos de
tomos participantes das ligaes qumicas esto se deslocando uns em relao aos outros em
uma frequncia que definida pela fora das ligaes e pela massa dos tomos individuais ou
grupos de tomos ligados. A amplitude dessas vibraes de poucos nanmetros e aumenta

18

se alguma energia transferida para a molcula. Esta energia (E) pode ser transferida na
forma de um fton de dado comprimento de onda () e pode ser dada por:
E = h = hc/

(Eq. 5)

Na qual h a constante de Planck e c a velocidade da luz no vcuo.


A radiao de uma dada frequncia, capaz de fornecer exatamente a energia entre dois
nveis vibracionais, pode ser absorvida pela molcula e produzir excitao a nveis de energia
vibracionais maiores. Entretanto, apenas essa energia no suficiente para a absoro da
radiao. Para que haja variaes na amplitude dos movimentos das molculas, necessrio
que o campo de oscilao eltrica da onda eletromagntica possa interagir com a molcula.
Isto s pode ocorrer se o deslocamento dos tomos no modo vibracional puder produzir uma
mudana no momento de dipolo da molcula ou do grupo de tomos vibrantes.
O momento dipolar determinado pela magnitude da diferena de carga e a distncia
entre os dois centros de massa. Quando uma molcula que possui essa variao do momento
dipolar vibra, surge um campo que pode interagir com o campo eltrico associado radiao.
Dessa forma, a correspondncia da energia da radiao com a diferena de energia entre dois
nveis vibracionais provoca a resposta seletiva do sistema molecular radiao incidente. Isto
significa que em uma dada faixa de comprimento de onda, muitas frequncias sero
absorvidas, outras no, enquanto outras sero ainda apenas parcialmente absorvidas. Do
mesmo modo, a rotao de molculas assimtricas em torno dos seus centros de massa resulta
em uma variao peridica do dipolo que pode interagir com a radiao.
As vibraes moleculares podem ser de dois tipos: deformaes axiais (ou
estiramentos) e deformaes angulares. Quando a deformao ocorre na direo do eixo da
molcula, a distncia interatmica aumenta e diminui alternadamente e o modo de vibrao
denominado deformao axial. As vibraes de deformao angular correspondem ao
movimento de um grupo de tomos em relao ao resto da molcula, sem que as posies
19

relativas dos tomos do grupo se alterem. Essas deformaes recebem a denominao de


deformao angular simtrica e assimtrica no plano e deformao angular simtrica e
assimtrica fora do plano (Fig. 10).

Figura 10 Algumas vibraes moleculares


O modelo mecnico mais simples, conhecido como oscilador harmnico (Fig. 11a),
pode ser usado, de forma mais didtica, para representar as vibraes que acontecem de forma
isolada em uma molcula. As caractersticas da vibrao de estiramento podem se aproximar
do modelo de duas massas ligadas por uma mola. As frequncias fundamentais de quaisquer
dois tomos ligados podem ser calculadas assumindo que a energia obedece Lei de Hooke.
Assim, as massas representam os tomos e a mola representa a ligao qumica entre eles.
Uma perturbao de uma das massas ao longo do eixo da mola resulta em uma vibrao
denominada de movimento harmnico simples e a fora restauradora proporcional ao
deslocamento, tendendo a restaurar as massas para sua posio original. A frequncia () da
vibrao dada por:

(Eq. 6)
em que k a constante de fora da ligao e a massa reduzida dos dois tomos de massas
m1 e m2, definida como:

20

(Eq. 7)
A vibrao molecular pode ser descrita por um modelo simplificado no qual a energia
potencial (E) dada como funo da separao entre os tomos (y):

(Eq. 8)
Este modelo til para o entendimento de energia vibracional e funciona bem para o
clculo de frequncias fundamentais de molculas diatmicas simples. Contudo, essa
aproximao fornece apenas a mdia ou a frequncia central de transies de estados
vibracionais e rotacionais de ligaes diatmicas. Em molculas poliatmicas os eltrons
sofrem influncia de tomos ou grupos vizinhos e isso influencia o estiramento, o
comprimento da ligao, o ngulo da ligao e, consequentemente, a frequncia da vibrao
das ligaes qumicas. Estas diferenas especficas, que ocorrem devido a essas interaes,
proporcionam que cada substncia apresente um espectro caracterstico.
Para representar as diferenas citadas um modelo harmnico/quntico pode ser
utilizado. Para a mecnica quntica as vibraes moleculares podem ter apenas determinados
nveis de energia discretos definidos como:

(Eq. 9)
em que h a constante de Planck e o nmero quntico vibracional, que pode assumir
valores positivos e inteiros incluindo o zero. Para molculas poliatmicas, os nveis de
energia se tornam numerosos e uma aproximao pode tratar essas molculas como uma srie
de osciladores harmnicos diatmicos e independentes. Nesse caso, a equao para a energia
potencial pode ser generalizada como:

(Eq. 10)
21

em que 3N-6 o nmero de vibraes possveis em uma molcula com N tomos (para
molculas lineares existem 3N-5 vibraes possveis), m a frequncia vibracional do
modelo clssico e 1, 2, ...= 0, 1, 2, ...16.
Uma restrio imposta pelo modelo harmnico que somente transies fundamentais
poderiam existir, sendo esta restrio denominada de regra de seleo (= 1). Uma vez que
os nveis vibracionais so igualmente espaados, apenas um nico pico de absoro deveria
ser observado para uma certa vibrao molecular. Apesar de o modelo harmnico ajudar no
entendimento da espectroscopia vibracional, ele apresenta algumas restries por no permitir
transies nas quais maior que 1. Transies com 2 so proibidas pelo modelo
harmnico e, neste caso, muitos dos fenmenos observados no espectro vibracional - bandas
de sobretons no poderiam existir. Alm disso, as vibraes no modelo harmnico so
independentes e suas combinaes no existiriam sob as restries impostas pelo modelo. No
entanto, tanto bandas de sobretons quanto de combinao existem. Outra limitao
apresentada por esse modelo que medida que dois tomos se aproximam, a repulso
coulombiana entre os dois ncleos produz uma fora que age na mesma direo da fora de
restaurao da ligao. Assim, espera-se que a energia potencial cresa mais rapidamente do
que previsto pelo modelo do oscilador harmnico. Por outro lado, quando a distncia entre
os tomos aumenta, um decrscimo na fora de restaurao e, portanto, na energia potencial,
ocorre quando a distncia interatmica se aproxima daquela em que ocorre a dissociao dos
tomos.
Um modelo mecnico mais realstico para molculas diatmicas pode ser visto na Fig.
11b. A molcula ainda aproximada por duas massas ligadas por uma mola. No entanto, o
modelo considera um comportamento no ideal do oscilador, que leva em conta a repulso
entre as nuvens eletrnicas quando os ncleos dos tomos se aproximam; e um
comportamento varivel da fora da ligao quando os tomos se afastam uns dos outros. De

22

fato, em uma molcula real, o excesso de afastamento dos ncleos atmicos ir causar ruptura
da ligao molecular com consequente dissociao dos tomos. O modelo anarmnico
tambm impe algumas restries aos estados de energias possveis das molculas.
Entretanto, ele prediz a ocorrncia das transies com 2 e a existncia de bandas de
combinao entre as vibraes. Sob as suposies do modelo anarmnico, as vibraes no
so independentes e podem interagir umas com as outras.

Figura 11 Representao esquemtica dos modelos harmnico (A) e anarmnico (B) para a
energia potencial de molculas diatmicas33. de = distncia de equilbrio
O espectro NIR pode ser dividido em regio I (12500 8333 cm-1), regio II (83335555 cm-1) e regio III (5555-4000 cm-1). Os limites dessas trs regies no so muito
rigorosos. A regio I aquela na qual tanto bandas de combinao quanto de sobretons so
observadas. Todas as bandas que aparecem nessa regio so muito fracas, o que significa que
ela mostra alta transparncia. Um grande nmero de aplicaes biomdicas e de produtos
agrcolas realizado nesta regio. Na regio II, podem ser observadas bandas resultantes do
primeiro sobretom de estiramento vibracional de X-H (X=C, O, N) e vrios tipos de modos de
combinao de vibraes X-H. A regio III a dos modos de combinao cuja
permeabilidade mais pobre. Uma ampla gama de aplicaes, tais como: estudos sobre
ligaes de hidrognio e interaes solvente-soluto usa as regio II e regio III.
Por se tratar de uma tcnica vibracional, a maioria das vantagens da espectroscopia
NIR advm da possibilidade de utilizao de amostras intactas apresentadas diretamente ao
23

equipamento, sem a necessidade de pr-tratamentos. Este fato implica na promoo de


interaes no convencionais da radiao com a matria por meio de diferentes modos de
medidas. A Fig. 12 mostra alguns dos modos de medida empregados na obteno do espectro
NIR. A principal forma de obter a informao espectral analisando a informao contida na
poro da radiao difusamente refletida pelas amostras slidas em vez do fraco sinal de
transmitncia. Na reflectncia difusa (Fig. 12a), absorbncia e espalhamento da radiao pelas
amostras contribuem para mudana na intensidade de sinal. Na Fig. 12b est esquematizada
outra possibilidade empregada na obteno da informao, o modo de transflectncia, que
uma forma especial de transmitncia (Fig. 12c). A diferena em relao transmitncia
simples que o caminho ptico dobra, pois o feixe de radiao passa duas vezes atravs da
amostra.

Figura 12 Alguns modos de medida empregados em espectroscopia NIR33: (a) reflectncia


difusa, (b) transflectncia e (c) transmitncia. (I p e Is = intensidade da radiao incidente e que
emerge do material, respectivamente)
Apesar da complexidade e da presena de bandas de absoro amplas e sobrepostas, o
espectro NIR apresenta grande quantidade de informaes, que tm sido intensamente
explorada em anlises qumicas e fsicas. Para fins quantitativos as informaes presentes no
espectro NIR podem ser empregadas na estimativa das concentraes ou propriedades fsicas
de uma dada substncia em uma amostra, desde que elas reflitam mudanas significativas na
intensidade de sinal ou no comprimento de onda do espectro produzido pela amostra. A
aplicao de NIRS em anlises de biomassa iniciou-se na ltima dcada41,42. Desde ento,

24

muitos artigos tm sido publicados usando NIRS para caracterizar matrias-primas usadas
para a produo de biocombustveis, tais como palha de milho41, gramneas43 e gros de
cereais44. Apenas um artigo tratou do uso do NIRS para a determinao de trs propriedades
do bagao de sorgo: poder calorfico, digestibilidade in vitro e protena bruta45. Mais
importante para os objetivos dos programas de melhoramento gentico de plantas, focados em
biocombustveis, alguns artigos tm recentemente usado NIRS para predizer o rendimento de
etanol apartir de gramneas (Panicum virgatum)43, de cereais como trigo, centeio e triticale44,
beterraba46 e milho47. Em todos eles o rendimento de etanol foi medido por HPLC aps as
amostras terem sido submetidas a um processo de fermentao.
Com relao s amostras lquidas, alguns trabalhos utilizando NIRS na predio de
brix48, pH48, acares49,50 e outros parmetros51 de qualidade em sucos de frutas j foram
descritos. A utilizao de NIRS na predio de alguns parmetros de qualidade do caldo de
cana-de-acar como pol52, brix52,53 e acares redutores52, tambm j foi relatada.
preciso destacar que os benefcios dessa tcnica no podem ser considerados como
totalmente explorados sem o uso da quimiometria, que permite a seleo de procedimentos de
medidas timos e a extrao da mxima informao qumica a partir dos dados espectrais.

3.2 Quimiometria e calibrao multivariada


3.2.1 Definio dos termos54-56
A quimiometria pode ser definida como a aplicao de mtodos matemticos,
estatsticos, grficos ou simblicos para maximizar a informao que pode ser extrada a
partir de dados qumicos e para planejar ou selecionar procedimentos e experimentos em
condies timas. Esta disciplina foi introduzida por grupos de pesquisa em qumica, no final
da dcada de 1960 e durante toda a dcada de 1970. Foram duas as razes para sua
emergncia: a necessidade de introduo de instrumentao que fornecesse respostas
25

multivariadas para cada amostra analisada e o aumento da disponibilidade dos computadores.


O surgimento do pensamento quimiomtrico veio da percepo de que a estatstica univariada
no era mais suficiente para descrever e modelar experimentos qumicos. A quimiometria
alcanou maturidade em meados da dcada de 1980, e hoje segue com algumas importantes
linhas de aplicao: 1 uso no planejamento e otimizao experimental; 2 reconhecimento
de padres e classificao de dados; 3 processamento de sinais analticos; 4 calibrao
multivariada e 5 mtodos de inteligncia artificial.
A calibrao multivariada a aplicao de maior sucesso da combinao da
quimiometria com dados espectrais. Ela consiste na construo de uma relao entre certas
propriedades qumicas, fsicas ou biolgicas de uma amostra e seu espectro. Esta uma
extenso da lei de Beer aplicada a relaes univariadas entre absorbncia e concentrao.
Uma frmula matemtica requerida com a finalidade de transformar os dados medidos
(leituras espectromtricas) em informao relevante (concentraes qumicas).
A equao de predio mais simples a linear univariada:
C = b0 + xb1

(Eq. 11)

na qual C a estimativa da concentrao, x a varivel medida e b0 e b1 so os coeficientes


de regresso linear e angular, respectivamente. No entanto, contribuies de constituintes
qumicos interferentes com sinais instrumentais sobrepostos ou outros interferentes
sistemticos nos sinais medidos podem criar erros grosseiros nas concentraes preditas se
esta calibrao convencional univariada utilizada. Dessa forma, muitos esforos tm sido
direcionados para elaborar preparos de amostras prvios s medidas, purificando as amostras
para obter medidas livres de interferncias.
A calibrao multivariada oferece uma soluo alternativa para este problema
especfico: atravs da combinao de muitas medidas diferentes (ex.: absorbncia da luz em

26

uma faixa de comprimentos de onda), interferentes podem ser modelados e eliminados. A


equao de predio multivariada linear pode ser escrita como:
C = b0 + xb

(Eq. 12)

na qual x = (x1, x2,...,xp) representa um vetor linha, de p diferentes variveis medidas, e b =


(b1,b2,...,bp) o correspondente vetor coluna de coeficientes de regresso. Aqui, iremos supor
que a resposta instrumental lida, x, linearizada. A determinao dos coeficientes de
regresso b0, b1,...,bp a chamada calibrao multivariada e pode ser feita de diversas formas.
A principal delas a calibrao indireta para a qual necessrio um conjunto representativo
de amostras de referncia com valores medidos para ambos, espectros e concentraes dos
constituintes a serem preditos. Este conjunto de dados de calibrao usado para a estimativa
estatstica dos parmetros do modelo, que aps a transformao matemtica, rende os
coeficientes de regresso desejados, b0, b1, b2...
A tcnica que mais utiliza a calibrao multivariada indireta a espectroscopia NIR.
Ela era vista como uma tcnica de pouca aplicao antes da introduo da quimiometria, pois
as bandas de absoro no NIR so geralmente muito fracas e sobrepostas, dificultando
anlises qualitativas e tornando quase impossvel a obteno de um comprimento de onda
seletivo que possibilite a calibrao univariada.
3.2.2 Mtodos de calibrao multivariada57
Muitos mtodos de regresso vm sendo utilizados em qumica analtica para a
construo de modelos de calibrao multivariada, dentre esses os mais empregados tm sido
a regresso linear mltipla (MLR), a regresso por componentes principais (PCR) e a
regresso por mnimos quadrados parciais (PLS), que so mtodos para ajuste linear entre as
variveis. A maioria dos mtodos de calibrao multivariada empregados em espectroscopia
utiliza o ajuste linear, uma vez que, este representa o modelo de mais fcil elaborao e
interpretao. Todas as tcnicas multivariadas lineares buscam resolver o mesmo problema
27

genrico. Se n espectros de calibrao so medidos a p comprimentos de onda, ento X, a


matriz de dados espectrais, definida como uma matriz n x p contendo as variveis espectrais
como colunas. Similarmente, y o vetor de dimenso n x 1 contendo os valores de referncia
para as amostras de calibrao (caso se deseje modelar mais de uma propriedade
simultaneamente o vetor y passa a ser uma matriz Y n x k). O objetivo do modelo
multivariado linear calcular um vetor predio p de dimenso n x 1 que resolva a equao:
y = X tp + e

(Eq.13)

onde Xt a transposta da matriz X. O vetor de erros, e, um vetor de dimenso n x1, que


contm as diferenas entre os valores de referncia y e suas estimativas, .
3.2.3 Regresso por mnimos quadrados parciais57-60
A modelagem mais simples de y e X feita usando a MLR, que funciona bem desde
que as variveis em X sejam poucas e no correlacionadas. No entanto, com as modernas
medidas instrumentais, incluindo espectrmetros e cromatgrafos, as variveis em X tendem a
ser numerosas, altamente correlacionadas e ruidosas. Uma forma de contornar esse problema
a utilizao do mtodo PLS, que nos permite avaliar esses sistemas mais complexos de
maneira mais realstica. O PLS envolve a decomposio dos dados espectrais da matriz X em
um produto de matrizes, levando-se em considerao as informaes da matriz Y (ou vetor y),
de forma que haja a mxima covarincia entre os dois conjuntos de dados. Assim, ele faz a
decomposio em variveis que no s modelam os sinais analticos, mas tambm explicam a
varincia relacionada aos valores de referncia. Cada componente do modelo recebe a
denominao de Varivel Latente (VL). A ideia principal aqui que as matrizes de dados
contm informaes redundantes e podem ser substancialmente reduzidas. Os termos
reduzidos so mais fceis de entender, tm mais estabilidade matemtica e os resduos devem
conter somente rudo.

28

PLS um mtodo de calibrao inversa, ou seja, a resposta analtica Y (e.g.


concentrao) uma funo do sinal analtico X (e.g. espectro). Assim, o modelo calculado
pela decomposio simultnea de X e Y em uma soma de A VL. X uma matriz n x p,
composta por n amostras e p variveis, e y uma matriz n x k, composta por n amostras e k
propriedades ou concentraes a serem previstas. No caso mais simples e mais usual, k igual
a 1, sendo o modelo criado para prever apenas uma resposta analtica (PLS-1), mas a
decomposio utilizando mais de uma propriedade simultaneamente tambm utilizada
(PLS-2). No mtodo PLS a decomposio feita segundo as equaes 14 e 15 e a Fig. 13:
X = TPt + E

(Eq. 14)

Y = UQt + F

(Eq. 15)

Figura 13 Decomposio em VL das matrizes X e Y para modelos PLS


Em que T e U so os escores, P e Q so os pesos (loadings) e E e F so os resduos das
matrizes X e Y, respectivamente. O vetor de coeficientes de regresso linear b correlaciona os
blocos X e Y de forma linear, para A VL, de acordo com a equao 16.
uA = bAtA

(Eq. 16)

Os valores de bA so agrupados na matriz diagonal B, que contm os coeficientes de


regresso entre a matriz T, dos escores de X, e a matriz U dos escores Y. A melhor relao
linear possvel entre os escores desses dois blocos obtida por meio de pequenas rotaes das
29

VL dos blocos de X e Y. Os valores previstos para as novas amostras () podem ser ento
calculados de acordo com a equao 17, com base nos novos escores T*.
= T*Bq

(Eq.17)

Como as matrizes de escores e pesos dependem do nmero de VL A, a escolha desse


parmetro de grande importncia, para evitar sub ou sobre ajuste dos modelos. O primeiro
caso implica a modelagem insuficiente dos dados para explicar toda informao sistemtica, e
o segundo, a incluso de excesso de informao no modelo, que pode ser aleatria ou estar
sistematicamente relacionada presena de erros. De um modo geral, o risco de sobreajuste
em calibrao multivariada muito maior do que o de subajustes. Para a escolha do nmero
de VL, usa-se um mtodo de validao cruzada, baseado num procedimento de reamostragem,
e deve ser selecionado o nmero de VL correspondente ao modelo de menor raiz quadrada do
erro quadrtico mdio de validao cruzada (RMSECV). Os principais mtodos de validao
cruzada so: 1) leave-one-out, que remove uma amostra de cada vez, sendo indicado apenas
para modelos com pequeno nmero de amostras (aproximadamente 20); 2) blocos contguos,
que separa amostras em blocos de amostras sequenciais; 3) venezianas (venetian blinds), que
separa amostras sistematicamente espaadas; e 4) subconjuntos aleatrios, que separa,
aleatoriamente, conjuntos de amostras.
3.2.4 Deteco de amostras anmalas Outliers57,61
Desde que os parmetros dos modelos tenham sido estimados, os coeficientes de
regresso resultantes podem ser usados para predio de novas amostras. Entretanto, tais
predies podem fornecer resultados de concentraes errneos se obtidas a partir de
amostras para as quais o modelo no se aplica. Tais amostras podem ser chamadas de
amostras anmalas ou outliers. Testes estatsticos so aplicados para detectar outliers
durante o desenvolvimento dos modelos de calibrao e durante a validao dos modelos
30

construdos. Outliers incluem amostras com alta influncia, amostras cujos valores de
referncia so inconsistentes com o modelo e/ou amostras cujos espectros apresentam alguma
anomalia em relao ao conjunto de dados.
Erros e fenmenos inesperados so inevitveis na construo de um modelo de
calibrao e podem ser causados por diversos motivos como, por exemplo, erros do operador,
rudos nos dados, problemas instrumentais e amostras com caractersticas muito distintas das
demais. A presena de amostras anmalas no conjunto de calibrao pode conduzir a modelos
com baixa capacidade de previso. Quando presentes no conjunto de validao, elas podem
influenciar os resultados levando a estimativas que indicam que o modelo no adequado ou
que a sua capacidade inferior que poderia ser apresentada na ausncia destas amostras
anmalas. Assim, a identificao de anomalias um passo importante para a otimizao dos
conjuntos de calibrao e validao, sendo que, a excluso dos outliers permite a construo
de modelos mais eficientes, precisos e com melhor capacidade de previso.
Os outliers na calibrao so, usualmente, avaliados com base no leverage (h)
extremo, resduos no modelados nos dados espectrais (X) e resduos no modelados nas
variveis dependentes (Y). O leverage representa o quanto uma amostra est distante da
mdia do conjunto de dados, ou seja, o peso relativo de uma amostra em relao s demais
presentes em um mesmo conjunto. De acordo com a ASTM E1655-0557, amostras com h >
(3A + 1)/n, onde n corresponde ao nmero de amostras da calibrao, devem ser removidas
do conjunto de calibrao, e o modelo deve ento ser reconstrudo.
A identificao de anomalias em relao aos resduos no modelados nos dados
espectrais obtida por comparao do desvio padro residual total (s()), definido como:

(Eq. 18)

31

em que J o nmero de variveis espectrais, A o nmero de VL e n o nmero de amostras


da calibrao, com o desvio padro residual de uma amostra i (s(i)), que calculado por:

(Eq. 19)
Se uma amostra apresentar s(i)>2s(), esta removida do conjunto de calibrao.
Com relao aos resduos no modelados na varivel dependente, os outliers so
identificados atravs da comparao da raiz quadrada do erro mdio da calibrao (RMSEC)
com o erro absoluto daquela amostra. Se a amostra apresentar erro absoluto maior do que
(3xRMSEC), esta definida como um outlier. O RMSEC determinado como:

(Eq. 20)
em que, yi o valor de referncia e i o valor estimado.
comum a contnua deteco de outliers aps a reconstruo do modelo. Quando
aplicaes repetidas dos testes continuam a identificar outliers, um fenmeno conhecido
como snowball (do ingls, efeito bola de neve) pode estar acontecendo. Este fenmeno
indica que h algum problema com a estrutura dos dados espectrais. Para evitar este
problema, no mais do que trs rodadas de deteco de outliers (4 modelos) devem ser
realizadas.
No conjunto de validao as amostras anmalas podem ser identificadas atravs do
teste de resduos Jacknife (Jei)62. Atravs desse teste estatstico os outliers so detectados de
acordo com a equao 21:

(Eq. 21)

32

Na qual n o nmero de pontos, p o nmero de parmetros do modelo, r i = ei/sei os resduos


padronizados. Este teste usa uma estimativa do desvio padro independente do ponto. Ento
os resduos so facilmente computados para cada ponto sem ter que ajustar as n regresses
separadas, cada uma excluindo um ponto. Os resduos Jacknife seguem a distribuio t com np-1 graus de liberdade. Valores de Jei maiores que valores de tcrtico so considerados outliers e
eliminados at um total de 2/9 do total de dados62.

3.3 Validao de modelos multivariados e figuras de mrito


O objetivo da validao de um procedimento analtico demonstrar que o mesmo
adequado para a sua finalidade. por meio da validao que os laboratrios comprovam que
os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis, rastreveis,
comparveis e adequados qualidade pretendida63. A validao de um mtodo um processo
contnuo que comea no planejamento da estratgia analtica e continua ao longo de todo o
seu desenvolvimento e transferncia. Ela pode ser atestada atravs da determinao de
parmetros conhecidos como figuras de mrito (FdM), sendo os principais: veracidade,
preciso, linearidade, sensibilidade, seletividade e faixa de trabalho 64,65.
Estudos cientficos que abordam a validao em calibrao multivariada so
recentes61,66-69. A grande maioria dos trabalhos e guias que tratam do tema ainda referente
calibrao univariada. Na rea de alimentos e produtos agrcolas tanto os guias oficiais
brasileiros70 quanto os internacionais65,71-73 ignoram completamente aspectos multivariados
intrnsecos ao desenvolvimento de mtodos NIRS. A necessidade de harmonizao entre a
legislao vigente e a demanda de mtodos multivariados tem sido discutida
recentemente61,67,69,74-76, levando concluso de que alguns conceitos como seletividade,
sensibilidade e curvas de calibrao precisam sofrer adaptaes para se adequarem aos

33

modelos multivariados. A seguir so descritas as principais FdM e suas formas de aplicao


nos modelos quimiomtricos desenvolvidos.
3.3.1 Veracidade
A veracidade (termo que atualmente substitui o antigo significado de exatido) 77
avaliada atravs de um parmetro especfico no contemplado pelos guias tradicionais:
RMSEP (estimado com as amostras de validao externa). O RMSEP, erro mdio de predio
da propriedade de interesse, referido como uma estimativa da veracidade, entretanto, este
um parmetro global que incorpora tanto erros sistemticos quanto aleatrios. O RMSEP
calculado a partir da equao 22:

(Eq. 22)
em que, nv o nmero de amostras do conjunto de validao. importante tambm, na
avaliao da veracidade, que seja conhecida a faixa de erros relativos de predio para as
amostras individuais76.
3.3.2 Preciso
A avaliao da preciso realizada da mesma forma que nos modelos univariados. De
acordo com a norma ASTM E 1655-0557 a preciso dos valores estimados a partir de um
modelo multivariado NIR deve ser calculada pela medida repetida dos espectros. Para a
determinao da preciso em nvel de repetitividade os espectros de, pelo menos, trs
amostras, com seis replicatas de cada, devem ser coletados no mesmo dia em trs nveis de
concentrao, cobrindo a faixa til do modelo. O clculo realizado utilizando-se a equao
2378. Para a determinao da preciso intermediria devem ser avaliadas as circunstncias nas

34

quais o mtodo ser aplicado e assim proceder variao de dia, nmero de analistas e
laboratrios para a anlise das replicatas.

(Eq. 23)
Em que n o nmero de amostras utilizadas no clculo da preciso, m o nmero de
replicatas de n e corresponde aos valores preditos pelo modelo.
3.3.3 Linearidade
De acordo com a definio do INMETRO77, linearidade a habilidade de um mtodo
analtico em produzir resultados que sejam diretamente proporcionais concentrao do
analito em amostras, em uma dada faixa de concentrao. Normalmente, a linearidade pode
ser inferida pela observao de parmetros como o coeficiente de regresso b, o intercepto
a e o coeficiente de correlao r de uma reta. No entanto, considera-se que um valor de r
prximo de 1 no suficiente para demonstrar a linearidade, pois deve-se tambm assegurar a
aleatoriedade dos resduos. Em calibrao multivariada, deve-se analisar a curva dos valores
de referncia versus valores previstos (Anexos A e B) e/ou o grfico dos resduos para as
amostras de calibrao e validao, que podem indicar se a distribuio residual tem um
comportamento aleatrio78. No entanto, a observao da aleatoriedade dos resduos atravs
dos grficos subjetiva e deve ser confirmada atravs de testes estatsticos apropriados 62.
A normalidade dos resduos deve ser avaliada atravs do teste de Ryan-Joiner (RJ), no
qual os resduos (ei) so ordenados de forma crescente e plotados contra a porcentagem de
pontos correspondentes (qi) a partir da distribuio normal padro (grfico quantil-quantil),
conforme mostrado na Fig. 14. Caso os resduos tenham comportamento normal, os dados
devem se aproximar do ajuste de uma linha reta. Caso eles sigam uma distribuio alternativa,
35

o grfico exibe algum grau de curvatura. O coeficiente de correlao (Req) para os dados
normalmente distribudos , ento, comparado com os valores de R crtico calculados, para a
rejeio ou aceitao da hiptese nula de normalidade. Os resduos podem ser considerados
normalmente distribudos se Req Rcrtico.

Figura 14 Distribuio residual normal. Dados se aproximam do ajuste de uma linha reta
O teste Brown-Forsythe (BF), ou Levene modificado, deve ser usado na avaliao da
homocedastidade dos resduos, ou seja, a variao absoluta constante de todos os pontos da
faixa de trabalho. Para este teste, os resduos devem ser divididos em dois grupos de tamanho
n1 e n2, respectivamente, com relao aos valores da faixa de trabalho, ou seja, os resduos
correspondentes aos valores da metade inferior da faixa ficam no grupo 1 e os resduos
correspondentes metade superior da faixa ficam no grupo 2. As medianas (1 e 2) de cada
grupo so, ento, calculadas. Em seguida, os valores absolutos das diferenas entre os
resduos e as medianas de cada grupo di1=|ei 1| e di2=|ei 2| devem ser calculados. Por
fim, a soma dos desvios quadrados de dj (SSD1 e SSD2) de cada grupo devem ser estimadas.
A estatstica de t L (t de Levene) avaliada pela equao 24:

Eq. 24
36

na qual

a mdia de dij de cada grupo, nj o nmero de amostras de cada grupo e s2p= SSD1

+ SSD2/(n1 + n2 - 2). Os resduos so considerados homocedsticos se t L tcritico.


Finalmente, a independncia dos resduos avaliada com o teste de Durbin-Watson
(DW). Este teste definido pela equao 25:

Eq. 25
A ausncia de autocorrelao verificada atravs da comparao entre os desvios
padro dos resduos ordenados (denominador da Eq. 25) e das diferenas sucessivas desses
mesmos resduos (numerador dessa equao), conforme mostrado na Fig. 15. Para cada
conjunto de dados, existem dois limites para d (dL o limite inferior e dU o limite superior).
Se o valor de d estimado para um conjunto de dados estiver fora destes limites, o teste
inconclusivo ou existe autocorrelao (pode-se tambm calcular limites para estas duas
situaes). Os valores de DW variam de 0 a 4 com mdia 2. Se o valor calculado convergir
para 2 significa que no h autocorrelao.

Figura 15 Grfico de correlao do teste de Durbin-Watson

37

3.3.4 Sensibilidade
A sensibilidade (SEN) um parmetro que demonstra a variao da resposta em
funo da concentrao do analito 77. A SEN pode ser considerada como a mudana na
resposta lquida do instrumento dividida pela correspondente mudana no estmulo (a
concentrao do analito de interesse). Ela ainda definida como a inclinao (coeficiente
angular) em uma curva de calibrao 78. Suas dimenses so unidade de sinal x concentrao -1.
Para modelos de calibrao multivariada inversa, como PLS, a SEN pode ser estimada por:

(Eq. 26)
em que b o vetor dos coeficientes de regresso estimados pelo modelo PLS e "|| ||" indica a
norma euclidiana de um vetor.
3.3.5 Sensibilidade analtica
Como a SEN depende da tcnica analtica empregada, uma FdM mais til a
sensibilidade analtica (). Este parmetro, definido na equao 26, a razo entre a SEN e o
rudo instrumental (x), o qual em NIRS estimado como o desvio padro de vrias medidas
do acessrio de medida vazio.

(Eq. 27)
O inverso desse parmetro (-1) permite estabelecer a menor diferena de concentrao entre
amostras, a qual pode ser distinguida pelo mtodo, considerando o rudo instrumental como
nica fonte significativa de erro. Este parmetro tambm define o nmero de casas decimais e
algarismos significativos que devem ser usados para expressar os resultados de predio.

38

3.3.6 Seletividade
A seletividade (SEL) a capacidade de determinar uma espcie de interesse em
amostras na presena de interferentes78, ou seja, a medida do grau de sobreposio entre o
sinal da espcie de interesse e os interferentes presentes na amostra. Logo, a SEL indica a
parte do sinal que perdida por essa sobreposio 67. Para modelos de calibrao multivariada
esse parmetro definido como:

(Eq. 28)
Em que nsi o escalar NAS (Sinal Analtico Lquido - Net Analyte Signal)79 estimado
para a amostra i e xi o vetor de dados original.
Para mtodos univariados o requisito de 100 % de SEL usual, mas para mtodos
multivariados no existe interesse prtico em estabelecer um valor mnimo. Diferentemente
de mtodos univariados, baixos valores de SEL podem ser obtidos mesmo para mtodos
multivariados exatos.
3.3.7 Faixa de trabalho
A faixa de trabalho corresponde ao intervalo de massas ou concentraes para o qual
se pode afirmar que o mtodo fornece um grau aceitvel de exatido e linearidade.
3.3.8 Vis (teste para erro sistemtico Bias)57,67
De acordo com a IUPAC, o vis definido como a diferena entre a mdia
populacional e o seu valor verdadeiro. Erros sistemticos, ou seja, todos os componentes do
erro que no so aleatrios correspondem parcela fixa do vis em uma medida qumica. A
existncia desse tipo de erro afeta a preciso, a veracidade e a determinao dos intervalos de
confiana. A norma E1655-05 da ASTM57 sugere um teste t para avaliar se o vis incluso no
39

modelo significante, usando somente as amostras de validao. O vis mdio pode ser
calculado como:

(Eq. 29)
Em seguida, o desvio padro dos erros de validao (SDV, standard deviation of validation)
determinado por:

(Eq. 30)
O valor de t ento obtido:

(Eq. 31)
Caso o valor de t calculado seja menor que o seu valor crtico para graus de liberdade e 95%
de confiana, o vis includo no modelo pode ser considerado insignificante e desprezado.
3.3.9 Relao de Desempenho do Desvio, RPD (Residual Prediction Deviation)80
O RPD uma FdM mais recente, utilizada para estimar a capacidade preditiva dos
mtodos e mais adequada para comparaes em termos absolutos. A RPD estimada para os
conjuntos de calibrao e validao de acordo com as equaes 31 e 32, nas quais DPCal e
DPVal so os desvios padres dos valores de referncia dos conjuntos de calibrao e
validao, respectivamente.

(Eq. 32)
(Eq. 33)
40

Bons modelos de calibrao devem possuir um valor de RPD acima de 2,4, enquanto valores
entre 2,4 e 1,5 so considerados satisfatrios. Modelos com RPD menor que 1,5 no devem
ser utilizados.

41

4 - OBJETIVOS
O objetivo principal desse trabalho o desenvolvimento de metodologias rpidas,
limpas, confiveis e de baixo custo para a caracterizao da biomassa e do caldo do sorgo
sacarino com o intuito de otimizar a pesquisa do PMGS da Embrapa Milho e Sorgo (Sete
Lagoas-MG). Para alcanar tal objetivo foram seguidos os seguintes passos:
- A construo de modelos de calibrao multivariada empregando o mtodo de regresso por
PLS para a determinao da composio (celulose, hemicelulose, lignina) da biomassa do
sorgo sacarino utilizando espectroscopia no infravermelho prximo.
- A construo de modelos de calibrao multivariada empregando o mtodo de regresso por
PLS para a determinao do RTE obtido a partir de cada cultivar de sorgo sacarino
desenvolvido pelo PMGS da Embrapa utilizando espectroscopia no infravermelho prximo.
- A construo de modelos de calibrao multivariada empregando o mtodo de regresso por
PLS para a determinao de parmetros de qualidade (brix, leitura sacarimtrica, acares
redutores, pol e pureza aparente) no caldo do sorgo sacarino utilizando espectroscopia no
infravermelho prximo.
- A validao dos modelos de calibrao multivariada pela determinao das FdM.

42

5 - PARTE EXPERIMENTAL
5.1 Amostras
Tanto as amostras de biomassa quanto as amostras de caldo analisadas neste estudo
foram de diferentes gentipos de sorgo sacarino, dentre as quais algumas foram obtidas do
PMGS e outras foram provenientes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG), ambos
pertencentes ao Centro Nacional de Pesquisas de Milho e Sorgo da Embrapa em Sete Lagoas,
MG, Brasil.
Biomassa
Para a caracterizao da biomassa foram conduzidos trs ensaios nos campos
experimentais da Embrapa em Sete Lagoas, entre 2010 e 2013, a partir dos quais trs painis
de diversidade gentica foram montados. Alm disso, com o intuito de aumentar a
variabilidade incorporada nos modelos de calibrao, amostras oriundas de testes de
maturao foram includas. Estas amostras foram coletadas desde o incio do
desenvolvimento da planta at o ltimo estgio de maturao que ocorreu cerca de dez
semanas depois.
Para todas as anlises laboratoriais, amostras representativas dos colmos das plantas de
sorgo, aps a extrao do caldo, foram pesadas frescas e secas em estufa de circulao forada
de ar por 72 h a 65 C. As amostras secas foram modas em moinho tipo Wiley at
granulometria adequada (2 mm) e acondicionadas em potes de polietileno. Um total de 957
amostras, obtidas de mais de uma centena de hbridos e linhagens puras, foram usadas para
construir os modelos.

43

Caldo
Para a caracterizao do caldo foi utilizado um total de 500 amostras. Parte delas so
provenientes de 275 linhagens endogmicas recombinantes (RIL) de sorgo sacarino, oriundas
de duas linhagens contrastantes quanto quantidade e qualidade de acares no caldo. Alm
disso, para assegurar uma alta variabilidade nos modelos de calibrao, amostras derivadas de
ensaios de maturao foram includas. Estas amostras foram coletadas desde o incio do
desenvolvimento da planta at o ltimo estgio de maturao, que ocorreu cerca de dez
semanas depois, garantindo teores de acares nos trs nveis baixo, moderado e alto.
Para todas as anlises laboratoriais amostras representativas dos colmos das plantas
foram desintegradas em desfibrador/homogeneizador. Em seguida, elas foram submetidas
prensa hidrulica, 250 kgf cm- durante 1 minuto, para extrao do caldo, segundo mtodo
descrito por Tanimoto 81. O caldo extrado das amostras foi acondicionado em frascos de
polietileno e enviado ao laboratrio para anlise. Uma vez que as amostras de caldo sofrem
rpida fermentao e que no foi realizado qualquer teste de estabilidade, as mesmas foram
analisadas no mesmo dia em que foram coletadas.

5.2 Reagentes
Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analtico e usados sem
nenhuma purificao adicional.
Biomassa
Para as anlises da biomassa foram utilizados os seguintes reagentes: cido sulfrico
(95-97% m/v), brometo de cetiltrimetilamnio CTAB (99% m/m), dodecil sulfato de sdio
(99% m/m), cido etilenodiaminotetractico sal dissdico di-hidratado EDTA (99-101%

44

m/m), tetraborato de sdio (borax) deca-hidratado (99-105% m/m), fosfato de sdio dibsico
anidro (99% m/m), trietileno glicol e acetona (99,5% v/v).
Caldo
Para as anlises do caldo foram utilizados os seguintes reagentes: sacarose (99,9 %
m/m), D-glicose anidra (99,7 % m/m), reagente clarificante base de alumnio - Octapol,
soluo de Fehling A (sulfato de cobre) e soluo de Fehling B (tartarato de sdio e potssio e
hidrxido de sdio).

5.3 Equipamentos
Os espectros foram coletados em um espectrmetro Bchi NIRFlex N-500 FT-NIR
(Flawil, Switzerland), equipado com acessrio de reflectncia difusa (biomassa) e de
transflectncia (caldo).
Biomassa
Os equipamentos usados para a avaliao da biomassa atravs das metodologias
convencionais incluram: um determinador de fibras Tecnal (Piracicaba, Brasil), modelo TE149, com capacidade para 30 testes; um forno mufla Quimis (Diadema, Brasil), modelo
Q318S, com rampas e patamares; uma balana analtica Mars Scales (North York, Canad),
modelo AUW220, com sensibilidade de 0,1 mg; uma estufa American Lab (San Francisco,
EUA), modelo AL 100/150, com circulao e renovao de ar e um moinho tipo Wiley
(Thomas Scientific, Swedesboro, EUA). Bolsas de filtro Ankom F57 (Ankom Technology,
Macedon, EUA) e uma seladora de embalagem manual 40 cm modelo PCS400C tambm
foram empregados para a determinao das fibras.

45

Caldo
Os equipamentos usados para a avaliao da qualidade do caldo atravs das
metodologias convencionais incluram: refratmetro digital porttil Atago (Tkio, Japo) com
correo automtica de temperatura modelo PAL-1 3810; polarmetro VIS/NIR com fonte de
radiao tipo laser de diodo 82; determinador de acares redutores (Redutec) Tecnal modelo
TE-088 (Piracicaba, Brasil); prensa hidrulica para extrao e esmagamento de cana
Hidraseme modelo PHS 250 (Ribeiro Preto, SP); desfibrador/homogeneizador tipo betoneira
IRBI (Araatuba, SP).

5.4 Softwares
O espectrmetro foi controlado e os dados foram adquiridos utilizando o software
Bchi NIRWare Operator (Flawil, Switzerland). Os dados foram tratados utilizando-se o
software MATLAB verso 7.13 (The MathWorks, Natick, MA, EUA). A rotina PLS utilizada
oriunda do PLS Toolbox verso 6.5 (Eigenvector Technologies, Manson, WA, EUA). Uma
rotina prpria, desenvolvida pelo grupo de pesquisa do professor Jez W. B. Braga, foi
aplicada para a deteco de amostras anmalas75. Para a determinao da leitura sacarimtrica
do caldo foi utilizado o software POL_SAC82.

5.5 Procedimentos
Aquisio dos espectros NIR
Biomassa
As amostras de biomassa de sorgo, secas e modas, foram transferidas para placas de
petri de vidro, de 100 mm de dimetro interno, as quais foram utilizadas como clula de
medida para a obteno dos espectros NIR. Os espectros das amostras foram registrados em

46

triplicata na faixa de nmeros de onda de 10.000 a 4.000 cm-1 em passos de 4 cm-1, como a
mdia de 32 varreduras, e temperatura de 25 2 C. Seis replicatas de amostras com trs
diferentes nveis de rendimento terico de etanol - baixo, mdio e alto - foram obtidas para a
avaliao da repetibilidade. Estas replicatas tambm foram analisadas em trs diferentes dias
por um analista diferente para a estimativa da preciso intermediria. Dez replicatas espectrais
da placa de petri vazia foram registradas, nas mesmas condies, com o objetivo de estimar o
rudo instrumental.
Caldo
As amostras de caldo de sorgo foram filtradas em algodo hidrfilo e transferidas para
placas de petri de vidro de 100 mm de dimetro interno, as quais foram utilizadas como clula
de medida para a obteno do espectro NIR. Um acessrio metlico de transflectncia foi
ento posicionado sobre a amostra para que o espectro fosse obtido (Fig. 16). Os espectros de
transflectncia das amostras foram registrados em triplicata na mesma faixa de nmero de
onda e nas mesmas condies em que foram obtidos os espectros das amostras de biomassa.
Seis replicatas das amostras com trs diferentes nveis de acares, baixo, mdio e alto, foram
obtidas para a avaliao da repetibilidade. A preciso intermediria no foi avaliada neste
caso, pois como as amostras no so estveis, elas foram analisadas e descartadas no mesmo
dia da coleta. Dez espectros de replicatas da placa de petri contendo apenas a placa de
transflectncia tambm foram obtidos para a estimativa do rudo experimental.

47

Figura 16 Acessrio de transflectncia utilizado nas medidas dos espectros do caldo

5.6 Mtodos de referncia


Biomassa
FDA, FDN e lignina em detergente cido foram determinadas pelo mtodo de extrao
sequencial desenvolvido por van Soest 83 e automatizado e simplificado pela Ankom
Technology84 (Fig. 17). Aproximadamente 500 mg de cada amostra foram colocados em
bolsas de filtro, as quais foram seladas por aquecimento. Os filtros com amostras foram
aquecidos em soluo de detergente neutro. Nesse processo, o contedo celular foi
solubilizado enquanto a parede celular (constituda de celulose, hemicelulose e lignina),
insolvel, foi separada por filtrao. Os filtros com resduos de FDN foram secos a 105C e
pesados para a determinao da porcentagem de FDN. Em seguida, eles foram submetidos a
aquecimento com soluo de detergente cido. Nesse processo a hemicelulose foi solubilizada
e o novo resduo (consistindo quase que inteiramente de lignina e celulose) foi seco a 105C e
pesado para a determinao do teor de FDA. Para a estimativa da lignina, o resduo de FDA
foi submetido a uma soluo de cido sulfrico 72% m/v durante 3h. Os filtros com os
resduos resultantes desse procedimento foram secos a 105 C e pesados para a determinao
da lignina. Em seguida, os resduos foram submetidos a ignio 500 C por 4 h para a
determinao das cinzas residuais. A quantidade de celulose foi determinada pela diferena
entre FDA e lignina e o teor de hemicelulose foi encontrado como a diferena entre FDN e
FDA. O rendimento terico de etanol foi determinado atravs da equao 4.
48

(a)

(b)

Figura 17 (a) Determinador de fibras Ankom e (b) bolsas de filtro utilizadas nas anlises de
FDA e FDN
Caldo
Para a determinao da leitura sacarimtrica (Z) o caldo obtido a partir de cada
amostra foi diludo com gua deionizada na proporo de 1:1 (50 mL de caldo para 50 mL de
gua). Em seguida, essa soluo foi misturada a aproximadamente 7,0 g de uma mistura
clarificante base de alumnio e filtrada em papel de filtro qualitativo. O filtrado foi ento
colocado em cubeta de caminho ptico conhecido e levado ao polarmetro (previamente
calibrado com soluo de sacarose a 15% m/v), para a determinao do grau de polarizao
em comprimento de onda de 589 nm (Fig. 18).

Figura 18 Polarmetro utilizado na determinao da leitura sacarimtrica

Para a determinao dos teores de acares redutores (glicose e frutose) as amostras


foram filtradas em algodo hidrfilo para a eliminao das partculas em suspenso. Em
49

seguida, elas foram diludas com gua deionizada na proporo de 5 mL do caldo para 50 mL
total. Essa soluo foi transferida para uma bureta e utilizada para titular um volume
conhecido de reagente de Fehlling, previamente padronizado com soluo de D-Glicose
0,25% m/v, mantido em ebulio constante no equipamento Redutec. O final da titulao foi
acompanhado por diferena de potencial (Fig. 19) e o teor de acares redutores foi calculado
atravs da equao 2.
(a)

(b)

Figura 19 Determinao do teor de acares redutores em Redutec. (a) antes e (b) depois da
titulao
O brix foi determinado automaticamente adicionando-se cerca de 0,5 mL de amostra
na superfcie do prisma do refratmetro digital (Fig. 20).

Figura 20 Refratmetro digital para a determinao de brix


A determinao do pol e da pureza aparente do caldo foi feita com a utilizao das
equaes 1 e 3, respectivamente.

50

6 - RESULTADOS E DISCUSSO
6.1 Resultados obtidos pelas metodologias de referncia
De acordo com a norma ASTM E165557 o conjunto de amostras utilizado para a
construo dos modelos deve representar toda a variabilidade qumica e fsica normalmente
encontrada na rotina de anlises. Alm disso, esta variabilidade deve estar distribuda
uniformemente ao longo de ampla faixa de concentrao, permitindo a construo de modelos
com considervel faixa de trabalho.
Nos histogramas das Fig. 21 e 22 esto representadas as faixas de concentrao de
cada parmetro, obtidas pelas metodologias de referncia, para as amostras utilizadas nos
modelos bem como a distribuio dessas concentraes entre as amostras. Os resultados
foram agrupados em dois conjuntos: calibrao (cal) e validao (val). Pode-se inferir, a partir
dos histogramas que os valores de todos os parmetros esto distribudos, homogeneamente,
em ampla faixa de concentrao e que o conjunto selecionado para validao tem faixa de
concentrao similar ao conjunto de calibrao.
preciso lembrar que nem todas essas amostras esto presentes nos modelos, uma vez
que os mesmo passaram por etapas de eliminao de outliers.
As dimenses dos valores de referncia tambm podem ser observadas pela avaliao
das tabelas contidas nos anexos C a K.

51

160

(a)

(b)

Frequncias

140
120
100
80

cal

60

val

40
20
0
20

22

24

26

28

30

32

34

36

Teores de hemicelulose (%)

70

60

(c)

60

40
30

cal

20

val

10

Frequncias

Frequncias

50

(d)

50
40
30

cal

20

val

10

1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
11,5

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
Rendimento terico de etanol (Lt -1 )

Teores de lignina (%)

Figura 21 Teores dos parmetros da biomassa determinados pelas metodologias de referncia para (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d)
lignina
52

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Figura 22 Teores dos parmetros do caldo determinados pelas metodologias de referncia para (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares
redutores, (d) pol e (e) pureza aparente

53

6.2 Espectros NIR e desenvolvimento dos modelos PLS


Biomassa
Os parmetros avaliados para a qualidade da biomassa foram celulose, hemicelulose,
RTE e lignina. Celulose, polmero cristalino de glicose, hemicelulose, polmero amorfo de
xilose e arabinose, e lignina, complexo polmero de alcois aromticos, so os principais
componentes da biomassa celulsica. Bandas de vibrao associadas com estes componentes
qumicos42,85 podem ser observadas na Fig. 23, que mostra o espectro das 957 amostras de
biomassa de sorgo sacarino analisadas. Tais bandas sero especificamente atribudas em
seguida, na discusso sobre os coeficientes de regresso dos modelos PLS.
0.7
0.6

log(1/R)

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000

Numeros de onda (cm-1)

Figura 23 Espectros NIR de 957 amostras da biomassa do sorgo sacarino


As regies espectrais entre 7.200-6.600 cm-1, 6.000-5500 cm-1, 5.400-4.600 cm-1 e
4.600-4.000 cm-1 podem ser atribudas ao primeiro sobretom de estiramento de O-H, primeiro
sobretom de estiramento de C-H, bandas de combinao de O-H e bandas de combinao de
C-H, respectivamente86.
As amostras foram divididas em 638 para o conjunto de calibrao e 319 para o
conjunto de validao usando o algoritmo Kennard-Stone87 que garante, sistematicamente, a
presena das amostras mais representativas no conjunto de calibrao atravs da varredura
54

uniforme dos dados espectrais. Como a obteno da informao espectral foi feita por
reflectncia difusa, foi necessria a utilizao de um pr-processamento dos espectros para
correo dos desvios de linha de base causados pelo espalhamento da radiao. Os desvios
no lineares da linha de base foram corrigidos atravs do pr-processamento SNV (standard
normal variate)88, como pode ser observado na Fig. 24. O mtodo de pr-processamento
alternativo, MSC (multiple scatter correction), tambm foi testado, mas forneceu resultados
um pouco piores (valores de RMSEC e RMSEP mais elevados). Todos os modelos foram
centrados na mdia e o nmero de VL foi escolhido por validao cruzada em blocos
contnuos, considerando o menor RMSECV. Como as regies espectrais entre 10.000 e 9.000
cm-1 no apresentaram absorbncias significantes, elas foram removidas dos modelos.
5
4

log(1/R)

3
2
1
0
-1
-2
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000

Numeros de onda (cm-1)

Figura 24 Espectros NIR de 957 amostras da biomassa do sorgo sacarino aps o prprocessamento SNV
Os coeficientes de regresso dos modelos PLS desenvolvidos para celulose,
hemicelulose, lignina e RTE so mostrados na Fig. 25. Pela observao destas figuras
possvel identificar os nmeros de onda que apresentam os coeficientes mais positivos e,
assim, mais contribuem para cada modelo.
Os coeficientes de regresso mais positivos e mais negativos para todos os quatro
parmetros so bastantes similares indicando que as regies espectrais mais importantes para
todos eles so praticamente as mesmas. Esse resultado era esperado, uma vez que tanto os
55

polissacardeos (celulose e hemicelulose) quanto a lignina so molculas orgnicas


constitudas basicamente por ligaes C-H e O-H, e o RTE um parmetro estimado a partir
de celulose e hemicelulose.
Para a celulose (Fig. 25a) as variveis espectrais mais importantes so uma banda
larga entre 6.800-6.400 cm-1 (relacionada ao primeiro sobretom do estiramento de O-H) e
picos nas regies de 5.970 cm-1 (primeiro sobretom do estiramento de C-H), 5.210 cm-1
(bandas de combinao do estiramento O-H e deformao de O-H), 4.415 cm-1 (banda de
combinao dos estiramentos de O-H e C-O), 4.290 cm-1 (combinao do estiramento de C-H
e deformao de CH2) e 4.230 cm-1 (combinao de deformao de C-H e estiramento de CH).
Para a hemicelulose (Fig.25b), os picos esto em cerca de 7.000 cm-1 (primeiro
sobretom do estiramento de O-H), 5.820 cm-1 (primeiro sobretom do estiramento de C-H),
4.880cm-1, 4.280cm-1 (combinao de estiramento de C-H e deformao de CH2) e 4.060cm-1.
Para o RTE (Fig. 25c), os picos esto em cerca de 7.060 cm-1, 5.230 cm-1 e 4.330 cm-1.
Para a lignina (Fig 25d), os picos esto em cerca de 7.040 cm-1 (primeiro sobretom do
estiramento de O-H), 5.940 cm-1 (primeiro sobretom do estiramento de C-H de aromticos),
5.230 cm-1 (primeiro sobretom do estiramento de O-H de aromticos), 4.415 cm-1 (bandas de
combinao de O-H e estiramento de C-O), 4290 cm-1 e 4.210 cm-1 42,85,86.

56

0.6

Coeficientes de Regresso (Hemicelulose)

Coeficientes de Regresso (Celulose)

1.5

(a)

0.5

-0.5

-1

8800

8400

8000

7600

7200

6800

6400

6000

5600

5200

4800

4400

0.2

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

4000

Nmeros de onda (cm-1)

8400

8000

7600

7200

6800

6400

6000

5600

5200

4800

4400

4000

5600

5200

4800

4400

4000

0.5

0.4

(c)

Coeficientes de Regresso (Lignina)

Coeficientes de Regresso (RTE)

8800

Nmero de onda (cm-1)

2
1
0
-1
-2
-3
-4

(b)

0.4

8800

8400

8000

7600

7200

6800

6400

6000

Nmeros de onda (cm-1)

5600

5200

4800

4400

4000

(d)

0.3
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
-0.3

8800

8400

8000

7600

7200

6800

6400

6000

Nmeros de onda (cm-1)

Figura 25 Coeficientes de regresso dos modelos PLS para (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina

57

Caldo
Os parmetros avaliados para a qualidade do caldo foram brix, leitura sacarimtrica,
pol, pureza aparente e acares redutores. Os primeiros quatro parmetros citados esto
relacionados com os teores de sacarose, enquanto que o ltimo se relaciona aos teores dos
monossacardeos glicose e frutose. Bandas de vibrao associadas com estes componentes
qumicos do caldo podem ser observadas na Fig. 26, que mostra o espectro das 500 amostras
de caldo de sorgo sacarino analisadas. Tais bandas sero especificamente atribudas em
seguida, na discusso sobre coeficientes de regresso dos modelos PLS.
3.5

log (1/R)

2.5

1.5

0.5

0
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000

Numero de onda (cm-1)

Figura 26 Espectros NIR de 500 amostras do caldo do sorgo sacarino


Trs regies espectrais importantes (7.400-6.400 cm-1, 5.800-4.600 cm-1 e 4.600-4.000
cm-1) podem ser observadas nos espectros da Fig. 26. A regio entre 10.000 e 7.800 cm-1
associada aos segundos e terceiros sobretons e caracterizada por baixas intensidades de
absoro e baixas razes sinal/rudo sendo, portanto, removida dos modelos.
As amostras foram divididas em 333 para o conjunto de calibrao e 167 para o
conjunto de validao usando o algoritmo Kennard-Stone87. A obteno dos espectros foi feita
por transflectncia e, neste caso, a presena de desvios no lineares da linha de base foi
corrigida atravs da aplicao de primeira derivada seguida de alisamento Savitzky-Golay (1
DSG), com janela de 15 pontos89 e polinmio de segunda ordem, como pode ser observado na
58

Fig. 27. O uso de derivadas reduz a sensibilidade das determinaes analticas, porm, elimina
problemas relacionados absoro de fundo devido presena de pequenas partculas slidas
em amostras lquidas, que podem dispersar a luz provocando o deslocamento da linha de base.
Como o uso de derivadas tambm aumenta o rudo, usa-se o alisamento simultaneamente.
0.04
0.02

Primeira Derivada SG

0
-0.02
-0.04
-0.06
-0.08
-0.1
-0.12
-0.14
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000

Numeros de onda (cm-1)

Figura 27 Espectros NIR de 500 amostras do caldo do sorgo sacarino aps o prprocessamento 1 DSG
Todos os modelos foram centrados na mdia e o nmero de VL foi escolhido por
validao cruzada em blocos contnuos, considerando o menor RMSECV.
Os coeficientes de regresso dos modelos PLS desenvolvidos para brix, leitura
sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza aparente so mostrados na Fig. 28. Pela
observao desta figura possvel notar que os nmeros de onda que apresentam os
coeficientes mais positivos e, assim, mais contribuem para cada modelo esto na regio
compreendida entre 5.400 cm-1 e 4.000 cm-1.
Para brix (Fig. 28a), leitura sacarimtrica (Fig. 28b), pol (Fig. 28c) e pureza aparente
(Fig, 28e), os coeficientes de regresso so bastante similares. Essa similaridade era esperada,
uma vez que todos esses parmetros esto relacionados aos teores de sacarose. Os nmeros de
onda mais positivos relacionados a esses parmetros esto nas regies prximas a 4.350 cm -1
e entre 4.500-4.700 cm-1, que so o primeiro conjunto de bandas de combinao caracterstico
dos acares; a banda de absoro em 4.405 cm-1 associada combinao de estiramento e
59

deformao de C-H. A regio entre 6.0245.682 cm-1 associada ao primeiro sobretom de


modos de vibrao de estiramento em grupos CH3 e CH2. Bandas negativas podem ser
observadas nas regies de 7.140 cm-1, 5.300-4.890 cm-1 e 4.450 cm-1. Estas bandas so
associadas gua presente no caldo, mais especificamente a sobretons de estiramento de OH50. Tais coeficientes negativos implicam em uma contribuio negativa para os modelos, ou
seja, quanto maior a quantidade de gua nas amostras, menor ser a quantidade de acares.
A Fig. 28c mostra os coeficientes de regresso para os acares redutores. Os nmeros
de onda que contribuem positivamente para este modelo diferem um pouco dos demais.
Destaca-se a regio entre 4.300-4.700 cm-1, associada s bandas de combinaes de acares.

6.3 Determinao do rendimento terico de etanol


Tendo em vista a necessidade de substituir a complexa metodologia de anlise
utilizada na determinao do RTE, baseada em hidrlise enzimtica, fermentao e tcnicas
cromatogrficas, nesse trabalho o modelo quimiomtrico construdo para a determinao
desse parmetro foi baseado na equao 4 desenvolvida por Zhao et al31 com ligeira
adaptao. Como no foram obtidas informaes a respeito do rendimento de biomassa por
hectare de cada cultivar utilizado no modelo, o termo BS (biomassa seca em t h -1) foi
eliminado da equao 4 e os valores de RTE passaram, assim, a serem expressos em L t -1.
A utilizao dessa equao para a construo do modelo permitiu a determinao do
RTE com base apenas nos teores dos polissacardeos celulose e hemicelulose, reduzindo o
tempo e o custo das anlises.

60

40

150

Coeficientes de Regresso

Coeficientes de Regresso

100

(a)

20

-20

-40

(b)

50
0
-50
-100
-150
-200

-60

-250
-80
7800 7600

7200

6800

6400

6000

5600

5200

4800

4400

-300
7800 7600

4000

Numeros de onda (cm-1)

7200

6800

6400

6000

5600

5200

4800

4400

4000

5200

4800

4400

4000

Numeros de onda (cm-1)

300

Coeficientes de Regresso

250
200

(c)

150
100
50
0
-50
-100
-150
7800 7600

7200

6800

6400

6000

5600

5200

4800

4400

4000

Nmeros de onda (cm-1)


40

150
100

(d)

Coefeicientes de Regresso

Coeficientes de Regresso

20

-20

-40

50

(e)

0
-50
-100
-150
-200

-60
-250
-80
7800 7600

7200

6800

6400

6000

5600

Nmeros de onda (cm-1)

5200

4800

4400

4000

-300
7800 7600

7200

6800

6400

6000

5600

Nmeros de onda (cm-1)

Figura 28 Coeficientes de regresso dos modelos PLS para (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, (d) pol e (e)
pureza aparente

61

Tabela 1 Resultados para a otimizao dos modelos PLS da biomassa (resultados finais em negrito) atravs das etapas de deteco de outliers

Ncala
Nvalb
NVLc
RMSECd
RMSEPd

Celulose
2
3

638
319
6
2,7
2,7

600
319
6
1,7
2,8

542
248
6
1,0
1,5

638
319
6
3,5
3,5

568
319
6
1,6
2,9

Hemicelulose
2
3
4
605
319
6
2,0
3,6

570
319
6
1,8
3,6

550
249
6
1,4
1,7

RTE
2
3

Lignina
2
3

638
319
4
18
14

599
319
4
14
14

534
250
4
9
12

638
319
6
1,4
1,3

598
319
6
1,0
1,3

532
256
6
0,8
0,8

562
319
4
12
14

560
319
6
0,9
1,3

Nmero de amostras da calibrao, b Nmero de amostras da validao, c Nmero de variveis latentes, dcelulose, hemicelulose e
lignina em %m/m. RTE em Lt-1

Tabela 2 Resultados para a otimizao dos modelos PLS do caldo (resultados finais em negrito) atravs das etapas de deteco de outliers

Ncala
Nvalb
NVLc
RMSECd
RMSEPd

Brix
2
3

Leitura Sacarimtrica
1
2
3
4

Acares redutores
1
2
3
4

333
167
6
0,7
0,7

305
167
6
0,6
0,8

284
135
6
0,5
0,4

333
167
6
4,7
3,9

333
167
14
0,6
0,7

333
167
6
1,2
1,1

297
167
6
0,9
1,2

279
167
6
0,8
1,2

264
136
6
0,7
0,8

333
167
6
8,8
7,8

311
167
6
7,1
7,6

296
167
6
6,6
8,1

288
142
6
6,3
5,8

284
167
6
0,5
0,8

294
167
6
3,6
4,0

275
167
6
3,3
4,2

275
137
6
3,3
3,2

309
167
13
0,4
0,7

291
167
12
0,4
0,7

276
130
12
0,4
0,4

Pol

Nmero de amostras da calibrao, b Nmero de amostras da validao, c Nmero de variveis latentes, dbrix em B, leitura sacarimtrica em Z, acares
redutores em %m/v, pol em %m/v e Q em %m/v

62

6.4 Otimizao dos modelos atravs da deteco de amostras anmalas


Aps os modelos PLS terem sido construdos, eles foram otimizados atravs da
aplicao de procedimentos estatsticos para a deteco de outliers, baseados na literatura
relevante57,61,62,75,76. Os outliers foram detectados com 95% de nvel de confiana e os
resultados para a biomassa e para o caldo esto sumarizados nas Tabelas 1 e 2,
respectivamente. Amostras anmalas foram removidas at um limite de 2/9 (22%) do total do
nmero de amostras, como estabelecido pelos guias brasileiros 70 e internacionais62,90. A
otimizao do conjunto de validao foi realizada aps o final da otimizao da calibrao.
Finalmente, no mais que trs rodadas de deteco de outliers (quatro modelos) foram
realizadas para que o efeito snowball fosse evitado.
Como pode ser visto nas Tabelas 1 e 2, o nmero de VL para os modelos da biomassa
variaram de 4 a 6, enquanto quase todos os modelos do caldo usaram 6 VL, com exceo do
modelo dos acares redutores para o qual foram usadas 12 VL. Esses nmeros de VL podem
ser considerados adequados tendo em vista a complexidade das duas matrizes (caldo e
biomassa) e das metodologias utilizadas para a obteno dos valores de referncia. O nmero
de VL mais alto utilizado para o modelo dos acares redutores pode ser atribudo baixa
concentrao desses acares no caldo e sobreposio das principais variveis espectrais da
sacarose quelas relacionadas a esses acares. Alm disso, a grande quantidade de gua
presentes nas amostras interfere consideravelmente nas medidas.
Biomassa
Para a biomassa (Tabela 1), no modelo construdo para a predio da celulose, 96
outliers foram detectados no conjunto de calibrao (15%), dos quais 7, 26 e 63 foram
baseados em alto leverage, altos resduos espectrais (X) e altos resduos na propriedade de
interesse (Y), respectivamente; no conjunto de validao, 71 outliers (22%) foram removidos.
63

Para o modelo da hemicelulose, 88 outliers foram detectados no conjunto de calibrao


(14%), dos quais 6, 25 e 57 para alto leverage, altos resduos em X e Y, respectivamente; no
conjunto de validao 70 outliers (22%) foram removidos. Para o modelo do RTE, 104
outliers (16%) foram detectados no conjunto de calibrao: 3, 28 e 73; e 69 (22%) no
conjunto de validao. Para o modelo da lignina, 106 amostras anmalas (17%) foram
detectadas no conjunto de calibrao: 7, 23 e 76; e 63 (20%) no conjunto de validao.
Caldo
Para o caldo (Tabela 2), no modelo construdo para a predio do brix 49 outliers
foram detectados no conjunto de calibrao (15%), dos quais 8 por alto leverage, 12 por altos
resduos em X e 29 por altos resduos em Y. No conjunto de validao, 32 (19%) amostras
anmalas foram removidas. No modelo da leitura sacarimtrica 58 outliers foram eliminados
do conjunto de calibrao (17%), sendo 5, 15 e 38 por alto leverage, altos resduos em X e
altos resduos em Y, respectivamente. No conjunto de validao foram detectados 30 outliers
(18%). Para o modelo dos acares redutores 57 outliers foram identificados no conjunto de
calibrao (17%): 4, 5, 48; e 30 (22%) no conjunto de validao. Para o modelo do pol 69
amostras anmalas foram eliminadas do conjunto de calibrao (21%), das quais 9 por alto
leverage, 16 por altos resduos em X e 44 por altos resduos em Y; no conjunto de validao
foram removidos 31 outliers (19%). Finalmente, para o modelo de pureza aparente 45 outliers
foram detectados no conjunto de calibrao (14%), entre eles 5 por alto leverage, 5 por altos
resduos em X e 35 por altos resduos em Y. No conjunto de validao foram removidas 25
amostras anmalas (15%).

64

6.5 Validao analtica multivariada


As Tabelas 3 e 4 resumem os parmetros estimados na avaliao das FdM para os
mtodos propostos para a biomassa e para o caldo de sorgo sacarino, respectivamente. Nas
subsees seguintes elas sero discutidas mais especificamente.
6.5.1 Linearidade
A linearidade dos mtodos desenvolvidos foi estimada atravs do ajuste dos valores
preditos versus valores de referncia (Anexos A e B). Qualitativamente, o grfico dos
resduos deste ajuste para as amostras da calibrao e da validao indica um comportamento
linear se eles forem aleatoriamente distribudos. Os resduos para os modelos construdos para
a biomassa e para o caldo de sorgo foram plotados em funo dos valores preditos e so
mostrados nas Fig. 29 e 30, respectivamente.
Como pode ser visto, nenhuma tendncia sistemtica foi observada nas distribuies
residuais. Ainda assim, o comportamento aleatrio desses resduos foi confirmado atravs de
testes estatsticos (Tabelas 3 e 4).

65

4
3

(a)

Hemicelulose resduos (%)

Celulose resduos (%)

2
1
0
-1
-2
-3

(b)

2
1
0
-1
-2
-3

-4
20

25

30

35

40

45

-4
18

50

20

22

Celulose valores preditos (%)

24

26

28

30

32

34

Hemicelulose valores preditos (%)

30

(c)

1.5

20

(d)

Lignina resduos (%)

-1

RTE resduos (L t )

10

-10

0.5
0
-0.5
-1

-20
-1.5

-30
220

240

260

280

300

320

340

360
-1

RTE valores preditos (L t )

380

400

420

-2
2

10

11

Lignina valores preditos (%)

Figura 29 Resduos para as amostras da calibrao () e validao (). Modelos PLS para determinao de (a) celulose, (b) hemicelulose, (c)
RTE e (d) lignina em biomassa de sorgo

66

1.5

(a)

Leitura Sacarimtrica resduos (Z)

Brix resduos (B)

0.5

-0.5

-1

(b)

2
0
-2
-4
-6

-1.5
4

10

12

14

16

-8
0

18

10

20

Brix valores preditos (B)

30

40

50

60

Leitura Sacarimtrica valores preditos (Z)

0.8

Acares reduores resduos (%)

0.6
0.4

(c)

0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1
0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

Acares redutores valores preditos (%)


2

15

1.5
10

(d)

Pureza aparente resduos (%)

Pol resduos (%)

1
0.5
0
-0.5
-1

-5

-10

-1.5
-2
0

(e)

Pol valores preditos (%)

10

12

14

-15
10

20

30

40

50

60

70

80

90

Pureza aparente valores preditos (%)

Figura 30 Resduos para as amostras da calibrao () e validao (). Modelos PLS para determinao de (a) brix, (b) leitura sacarimtrica,
(c) acares redutores, (d) Pol e (e) pureza aparente em caldo de sorgo

67

Biomassa
Para a estimativa dos valores crticos dos testes estatsticos nos modelos da biomassa,
foi considerado N=550, o maior nmero de amostras usado entre os mtodos desenvolvidos,
aps a deteco de outliers (hemicelulose, Tabela 1).
Para o teste de RJ, as estimativas dos valores de Req estiveram todas abaixo do valor
crtico de 0,9997 calculado a 95% de nvel de confiana, mas elas estiveram todas acima de
0,9928, o valor crtico a 99%. A grande quantidade de amostras usadas (muito acima do
normalmente utilizado em modelos univariados, para os quais este mtodo foi inicialmente
proposto) levou a elevados valores de Rcritico e fez com que o teste de RJ se tornasse muito
rigoroso. Assim, os resduos para todos os modelos tiveram uma distribuio normal a 99%
de nvel de confiana.
No teste de BF os valores de t L estimados estavam todos abaixo do t crtico de 1,96
(95% e infinitos graus de liberdade), confirmando ento a homocedasticidade.
A independncia dos resduos (teste de DW) foi confirmada para todos os modelos,
pois todos os valores estimados de d estavam dentro da faixa de aceitabilidade, entre dL =
1,81 e dU = 2,19 a 95% de nvel de confiana.
Caldo
Para a estimativa dos valores crticos para estes testes nos modelos do caldo, foi
considerado N=288, o maior nmero de amostras usado entre os mtodos desenvolvidos
(pureza aparente, Tabela 2) aps a etapa de deteco de outliers.
Para a normalidade dos resduos, as estimativas dos valores de Req estavam todas
abaixo do valor crtico de 0,9966, a 95% de nvel de confiana, exceto para o modelo do brix
que apresentou Req de 0,9988. No entanto, para todos os outros 4 modelos os valores de R eq
estavam acima de 0,9902, o valor crtico a 99%. Dessa forma, os resduos para todos estes

68

modelos apresentaram uma distribuio normal, sendo que o brix a 95% de nvel de confiana
e os demais parmetros a 99% de nvel de confiana.
Na avaliao da homocedasticidade dos resduos atravs do teste de BF os valores de
tL estimados estavam todos abaixo do t crtico de 1,96 (95% e infinitos graus de liberdade),
exceto para o modelo dos acares redutores, que apresentou valor de t L de 2,03. Assim, os
modelos de brix, leitura sacarimtrica, pol e pureza aparente foram considerados
homocedsticos a 95% de confiana, e o modelo dos acares redutores a 98% (t crtico = 2,33 e
infinitos graus de liberdade).
Por fim, a independncia dos resduos (teste de DW) foi confirmada, j que todos os
valores de d estavam dentro da faixa de aceitabilidade, entre dL = 1,81 e dU = 2,19 a 95% de
nvel de confiana.
Uma discusso mais aprofundada sobre estes testes (clculo dos valores crticos, por
exemplo) pode ser encontrada no artigo de Souza & Junqueira 62 e nas referncias nele citadas.
Sendo que as premissas para a linearidade dos modelos foram verificadas, os parmetros para
os ajustes dos valores de referncia versus valores preditos mostrados nas Tabelas 3 e 4
podem ser considerados vlidos.
6.5.2 Veracidade, preciso e faixa de trabalho
Os resultados de veracidade e preciso permitem atestar a exatido dos mtodos77.
A preciso expressa o grau de concordncia entre os resultados de uma srie de
medidas realizadas para uma mesma amostra homognea em condies determinadas 78 e
avaliada atravs dos desvios padro relativos (DPR).
A veracidade pode ser avaliada atravs dos parmetros absolutos RMSEC e RMSEP,
mostrados nas Tabelas 1 e 2, para biomassa e caldo, respectivamente, e tambm pela
observao dos erros relativos individuais (Tabelas 3 e 4 e Anexos C a K).

69

A avaliao dos erros relativos individuais foi realizada pela comparao dos mesmos
com os limites estabelecidos pela normatizao do MAPA91. De acordo com esta norma,
prevista para calibrao univariada, a veracidade a concordncia entre a mdia de um
nmero suficientemente grande de resultados de um ensaio e o valor de referncia aceito
convencionalmente como verdadeiro atravs de ensaios de recuperao. No entanto, em
calibrao multivariada esta FdM pode ser avaliada pela comparao dos valores preditos
pelo modelo com os valores obtidos pelos mtodos de referncia calculando-se os erros
relativos individuais. Os limites de erros relativos utilizados para avaliao da veracidade
foram de -20 a +10%.
Biomassa
Os valores de RMSEP de 1,5%, 1,7%, 0,8% e 12 Lt-1; para celulose, hemicelulose,
lignina e RTE, respectivamente (Tabela 1), indicam que os mtodos fornecem resultados em
bom acordo com os valores de referncia.
Para celulose e RTE todos os valores de erros relativos estiveram dentro da faixa de
10%. Para hemicelulose, apenas 8 das 249 (3%) amostras da validao apresentaram erros
fora da faixa de 10%, mas para lignina 69 das 256 (27%) das amostras apresentaram erros
maiores do que os limites. A veracidade mais baixa desse ltimo mtodo atribuda faixa
analtica menor para lignina. Os histogramas dos erros relativos das previses dos parmetros
avaliados para a biomassa (amostras da validao) so mostrados na Fig. 31.
Para os parmetros da biomassa, a preciso foi calculada nos nveis de repetibilidade e
de preciso intermediria. Para todos os mtodos, os valores de DPR variaram entre 0,5 e 1,5
% para repetibilidade e entre 0,5 e 1,6 % para preciso intermediria (Tabela 3). Todos esses
resultados esto de acordo com os guias brasileiros que prescrevem aceitabilidade mxima
para o DPR de 4% para repetibilidade e 10% para preciso intermediria91.

70

Considerando os estudos de linearidade e exatido, as faixas de trabalho dos mtodos


desenvolvidos para anlise da biomassa foram estabelecidas (Tabela 3): 21,4 a 49,1 % para
celulose, 18,4 a 34,8 % para hemicelulose, 1,8 a 11,5 % para lignina e 221 a 412 L t-1 para
RTE.
Caldo
Os valores de RMSEP de 0,4 B, 3,2 Z, 0,4 %, 0,8 % e 5,8% para brix, leitura
sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza aparente, respectivamente (Tabela 2), indicam
que os mtodos fornecem resultados em bom acordo com os valores de referncia. Com
exceo do modelo do brix, cujos erros relativos (entre -8,3 e 11,0 %) esto mais prximos
dos limites de aceitabilidade dos guias brasileiros (entre -20 e +10%), todos os demais
parmetros apresentaram faixas de erros prximas de 30%. Para leitura sacarimtrica, 49
das 137 (36%) amostras de validao apresentaram erros acima dos limites. Para acares
redutores, 34 das 130 (26%) amostras de validao ultrapassaram a faixa de aceitabilidade.
Para o modelo do pol 48 das 136 amostras (32%) apresentaram erros superiores aos limites.
Finalmente, para pureza aparente 26 % (37 das 142) das amostras ficaram fora dos limites
aceitveis. A veracidade mais baixa para os mtodos desenvolvidos para o caldo pode ser
atribuda maior complexidade das anlises de referncia e baixa estabilidade das amostras.
Os histogramas dos erros relativos das previses dos parmetros avaliados para o caldo
(amostras da validao) so mostrados na Fig. 32.
Para os parmetros do caldo, a preciso foi calculada apenas no nvel de
repetibilidade. Os valores de DPR foram de 2,8 % para brix, 4,1 % para pureza aparente,
4,3% para leitura sacarimtrica, 4,7 % para pol e 14,3 % para acares redutores (Tabela 4).
Apenas o resultado para o brix est de acordo com o limite estabelecido pelos guias
brasileiros, que prescrevem aceitabilidade mxima para o DPR de repetibilidade de 4% 91, no
entanto os resultados para pureza aparente, leitura sacarimtrica e pol esto prximos a este
71

limite. O DPR mais elevado dos parmetros avaliados para o caldo, possivelmente, se deve,
em parte, ao uso alternativo do acessrio de transflectncia, em vez de cubetas, para avaliao
das amostras. Esse acessrio faz com que a sensibilidade da anlise seja reduzida, o que se
reflete tambm na preciso. Alm disso, o caldo apresenta certa quantidade de amido que
decanta rapidamente no fundo da placa, o que no permite grande reprodutibilidade na
aquisio dos espectros. O valor ainda mais alto de DPR para os acares redutores pode ser
atribudo faixa analtica mais baixa deste parmetro (1,2 a 5,2% - Tabela 4).
Considerando os estudos de linearidade e exatido, as faixas de trabalho dos mtodos
desenvolvidos para anlise do caldo foram estabelecidas (Tabela 4): 5,5 a 18,1 B para brix,
1,1 a 53,2 Z para leitura sacarimtrica, 1,2 a 5,2 % para acares redutores, 0,3 a 13,0 % para
pol e 9,8 a 83,0 % para pureza aparente do caldo.

72

(a)

(c)

(b)

(d)

Figura 31 Erros relativos das amostras de validao para os parmetros da biomassa (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina.
Limites em vermelho (-20 a +10%)

73

(b)

(a)

(c)

(d)

(e)

Figura 32 Erros relativos das amostras de validao para os parmetros do caldo (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, 74
(d) pol e (e) pureza aparente. Limites em vermelho (-20 a +10 %)

Tabela 3 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos para a determinao
de celulose, hemicelulose, RTE e lignina em biomassa de sorgo sacarino
FdM
Veracidade
Preciso

Linearidade

Faixa de
trabalho
Seletividade
Sensibilidade
Sensibilidade
Analtica ()
-1
Vis

Parmetro
Erros relativos(min/max)
DPR repetibilidadea
DPR preciso
intermediriaa
Req (teste RJ)
tL (teste BF)
d (teste DW)
Inclinaob
Interceptob
Coef, de correlao (r)b

Celulose
Valor
-5,3/6,5 %
1,5%
1,5%

Hemicelulose

RTE

Lignina

-9,8/12,2%
0,5%
0,7%

-5,6/6,1 %
0,5 %
0,5 %

-28,8/37,6%
1,5%
1,6%

0,9964
0,2400
1,95
0,930,01
2,690,43
0,9631
21,4 a 49,1 %

0,9952
1,9489
1,93
0,700,02
7,670,61
0,8390
18,4 a 34,8 %

0,9980
0,4736
1,96
0,910,01
28,374,19
0,9553
221 a 412 L t-1

0,9956
1,1487
1,87
0,790,02
1,290,13
0,8920
1,8 a 11,5%

0,13
0,07
1,7 %-1

0,11
0,15
3,4 %-1

0,26
0,02
0,5 t L-1

0,14
0,27
6,1 %-1

0,6 %
0,3 %
2 L t-1
0,2 %
-1
Vis SDV
-0,0311,079 % 0,1061,354 % 0,0498,182 Lt
0,3620,778 %
t estimado
0,46
1,23
0,09
0,36
RPD
RPD calibrao
3,7
1,8
3,3
2,2
RPD validao
2,7
1,7
2,7
2,0
a
b
Resultados para trs amostras em trs nveis diferentes, Valores para o ajuste linear das amostras de calibrao, c Desvio
Padro dos erros de validao (Standard Deviation of Validation Errors)
c

75

Tabela 4 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos para a determinao de brix, leitura
sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza aparente (Q) nas amostras de caldo de sorgo sacarino
FdM

Veracidade
Preciso
Linearidade

Faixa de
trabalho
Seletividade
Sensibilidade
Sensibilidade
Analtica ()
-1
Vis
RPD

Parmetro

Brix

Erros relativos(min/max)
DPR repetibilidadea
Req (teste RJ)
tL (teste BF)
d (teste DW)
Inclinaob
Interceptob
Coef, de correlao (r)b

Vis SDV
t estimado
RPD calibrao
RPD validao

Leitura
sacarimtrica

Acares
redutores

Pol

Valor
-8,3/11,0 %
2,8 %
0,9988
1,2691
2,14
0,970,01
0,320,12
0,9861
5,5 a 18,1 B

-24,6/28,5 %
4,3 %
0,9944
1,2976
2,11
0,930,02
1,830,46
0,9631
1,1 a 53,2 Z

-26,6/37,0 %
14,3 %
0,9952
2,0346
1,94
0,820,03
0,520,08
0,9044
1,2 a 5,2 %

-32,9/32,8 %
4,7 %
0,9916
1,0385
2,16
0,940,02
0,360,11
0,9683
0,3 a 13,0 %

-19,7/34,3 %
4,1 %
0,9905
1,7111
2,11
0,840,02
8,541,30
0,9145
9,8 a 83,0 %

0,08
0,02
2,7 B-1

0,08
0,01
1,2 Z-1

0,01
0,01
1,2%-1

0,08
0,02
2,7 %-1

0,08
0,01
1,2%-1

0,4 B
0,0800,371 B
2,50
5,7
6,2

0,8 Z
0,4183,170 Z
1,54
3,5
3,1

0,8 %
-0,0510,371 %
1,58
2,3
2,3

0,4 %
0,1080,797 %
1,58
3,8
3,0

0,8 %
-0,0865,811 %
0,18
2,4
2,1

Resultados para trs amostras em trs nveis diferentes, b Valores para o ajuste linear das amostras de calibrao,c Desvio Padro dos
erros de validao (Standard Deviation of Validation Errors)

76

6.5.3 Seletividade e sensibilidade analtica


A SEL e a SEN foram estimadas com base no NAS. Em relao SEN, os valores
deste parmetro no so apropriados para comparao com outros mtodos. Dessa maneira, a
sensibilidade analtica () tambm foi calculada a partir do rudo instrumental estimado. O
inverso de fornece uma estimativa da diferena de concentrao mnima que pode ser
distinguida pelo mtodo, independente da tcnica analtica utilizada e considerando o rudo
instrumental aleatrio como a nica fonte de erro.
Biomassa
No desenvolvimento dos modelos para biomassa, os valores estimados de SEL
indicam que 13, 11, 14 e 26 % do sinal analtico foram usados para predio de celulose,
hemicelulose, lignina e RTE, respectivamente.
O rudo instrumental de 0,042 foi estimado a partir dos desvios padro dos espectros
de dez replicatas da placa vazia e foi usado para o clculo das sensibilidades analticas ()
(Tabela 3).
Caldo
No desenvolvimento dos modelos para o caldo, os valores estimados de SEL indicam
que 8 % do sinal analtico foi usado para predio de brix, leitura sacarimtrica, pol e pureza
aparente, enquanto que apenas 1 % do sinal foi usado para a predio de acares redutores.
O rudo instrumental de 0,0083 foi estimado a partir dos desvios padro dos espectros
de dez replicatas da placa contendo apenas o acessrio de transflectncia e foi usado para o
clculo das sensibilidades analticas () (Tabela 4).

77

6.5.4 Vis e RPD


O vis foi calculado apenas com as amostras da validao 57 e as estimativas esto
mostradas nas Tabelas 3 e 4.
De acordo com a literatura80, bons modelos de calibrao devem ter valores de RPD
maiores que 2,4, enquanto que valores entre 2,4 e 1,5 so considerados aceitveis. Modelos
com valores de RPD inferiores a 1,5 no so considerados adequados.

Biomassa
Para a biomassa, todos os valores de t calculados para a estimativa do vis foram
menores que o valor de tcrtico (1,96, com infinitos graus de liberdade e 95% de nvel de
confiana), confirmando a ausncia de erros sistemticos nos modelos de predio.
Como pode ser observado na Tabela 3, os valores de RPD para celulose e RTE foram
considerados bons, enquanto que para hemicelulose e lignina foram considerados
satisfatrios.
Caldo
Para o caldo, o valor de t calculado (2,50) para o parmetro brix (Tabela 4) foi menor
que o valor de tcrtico apenas a 99 % de nvel de confiana (2,58 com infinitos graus de
liberdade), enquanto que os valores de t calculados para os demais parmetros foram
inferiores ao valor de tcrtico a 95% de nvel de confiana (1,96 com infinitos graus de
liberdade). Assim, a confirmao da ausncia de erros sistemticos para o modelo de brix se
deu com 99% de nvel de confiana, enquanto que para pol, leitura sacarimtrica, acares
redutores e pureza aparente observa-se a ausncia de erros sistemticos com 95% de
confiana.

78

Como mostrado na Tabela 4, os valores de RPD para brix, leitura sacarimtrica e pol
foram considerados bons, enquanto que para acares redutores e pureza aparente foram
considerados satisfatrios.
6.5.5 Cartas de Controle
Aps os mtodos NIRS terem sido validados e implementados para a anlise de
biomassa, suas estabilidades foram monitoradas atravs de cartas de controle.
Biomassa
De abril a setembro de 2013, 50 amostras de biomassa de sorgo sacarino foram
aleatoriamente selecionadas, duas por semana, e analisadas por NIRS e pelos mtodos de
referncia. As cartas de controle construdas com estes resultados so mostradas na Fig. 33.
Os limites indicados nessas cartas so baseados na normatizao brasileira70, a qual estabelece
que, no monitoramento de mtodos quantitativos para anlises agrcolas e de alimentos, dois
teros das amostras devem ter erros relativos entre 15 % (limites de alerta adotados nas
cartas de controle), enquanto um tero pode apresentar erros mximos permissveis de 33 %
(limites de ao). Como pode ser visto nesta figura, apenas duas amostras mostraram erros
relativos entre os limites de alerta e de ao para os modelos da celulose e da hemicelulose
(Fig. 33a-b), enquanto nenhuma amostra apresentou erro acima do limite de alerta para RTE
(Fig. 33d). Os piores resultados observados foram para o modelo da lignina (Fig. 33c), no
qual 15 das 50 amostras (30%) mostraram erros entre os limites de alerta e de ao. Apesar
disso, este ltimo resultado ainda est dentro dos limites de aceitao e todos os modelos
foram considerados satisfatoriamente estveis.
Para complementar a anlise das cartas de controle desenvolvidas, a distribuio
aleatria dos erros foi checada com os mesmo testes estatsticos previamente usados para a
avaliao da linearidade. Uma vez que um comportamento aleatrio dos resduos das
79

previses destas cartas indica a estabilidade dos modelos, justifica-se o emprego dos mesmos
testes usados anteriormente para verificar a linearidade. Os parmetros estimados so
mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 Parmetros dos testes estatsticos usados na avaliao das cartas de controle
desenvolvidas para o monitoramento dos modelos NIRS
Teste/Parmetro
RJ / Req
BF / tL
DW / d

Celulose
0,9763
1,53
1,21

Hemicelulose
0,9835
2,36
1,59

Lignina
0,9861
0,23
1,16

RTE
0,9843
0,30
1,64

Para o teste de RJ, as cartas de controle para hemicelulose, lignina e RTE


apresentaram valores de Req acima do Rcrtico (0,9764, N=50) a 95% e a carta controle para
celulose apresentou valores muito prximos deste limite. Assim, a 96% de nvel de confiana,
todos os erros foram considerados normalmente distribudos. Para o teste de BF, celulose,
lignina e RTE mostraram valores de t L abaixo do valor crtico (2,01) a 95%, enquanto o t L
estimado para a hemicelulose foi aceitvel apenas a 98% (t crtico = 2,40), garantindo a
homocedasticidade dos erros neste nvel. Finalmente, o teste de DW indicou que apenas a
hemicelulose e o RTE apresentaram valores de d dentro da faixa de aceitabilidade (1,58-2,42,
a 95%), enquanto celulose e lignina apresentaram erros com certo grau de dependncia.
Caldo
Como as amostras do caldo so instveis e devem ser analisadas imediatamente aps a
coleta, no foi possvel monitorar os modelos construdos para esta matriz. Alm disso, no
havia nmero de amostras suficiente para a construo das cartas de controle durante um
longo perodo.

As cartas de controle so ferramentas de controle bastante teis e devem ser utilizadas


rotineiramente para a avaliao dos modelos construdos.
80

(a)

(c)

(b)

(d)

Figura 33 Cartas de controle para o monitoramento da estabilidade dos modelos NIRS da biomassa. (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) lignina e
(d) RTE

81

7 - CONCLUSO
Considerando a necessidade de um grande nmero de experimentos para melhorar a
qualidade do sorgo sacarino destinado produo de etanol e a necessidade do PMGS da
Embrapa de diferenciar hbridos de acordo com seu potencial de produo de lcool, mtodos
analticos rpidos e de baixo custo so necessrios para caracterizao das amostras e para a
estimativa do rendimento de etanol. Assim, este trabalho desenvolveu e validou mtodos de
calibrao multivariada baseados em NIRS para determinao de parmetros de qualidade em
caldo e biomassa de sorgo sacarino visando produo de etanol de primeira e de segunda
gerao, respectivamente.
Alm disso, o rendimento terico de etanol lignocelulsico foi determinado a partir dos
componentes estruturais da parede celular, o que permitiu a eliminao das complexas
metodologias de referncia baseadas em hidrlise, fermentao e mtodos cromatogrficos. A
estimativa do rendimento terico de etanol a partir dos componentes estruturais considerada
mais confivel que a abordagem alternativa de quantificar os teores de monossacardeos, uma
vez que as caractersticas estruturais da planta, como a lignificao, afetam a disponibilidade
dos monossacardeos para a converso em etanol92.
As metodologias desenvolvidas propiciaram uma economia significativa tanto em custo
quanto em tempo de anlises para o PMGS, uma vez que necessrio apenas um minuto para
a obteno dos espectros e predio simultnea de todos os parmetros em cada amostra
(biomassa ou caldo) e a utilizao de reagentes feita apenas nas etapas de calibrao e
manuteno dos modelos.
Todos os mtodos desenvolvidos foram submetidos a uma validao analtica
completa, de acordo com os guias nacionais e internacionais, e considerados exatos, lineares,
sensveis e sem vis. Finalmente, a estabilidade dos modelos da biomassa foi monitorada
durante aproximadamente seis meses atravs do desenvolvimento de cartas de controle
82

apropriadas. Esta mesma estratgia no pde ser aplicada s amostras de caldo, em virtude de
sua indisponibilidade em quantidade suficiente.
Finalmente, o desenvolvimento deste trabalho numa parceria entre a universidade e
uma empresa pblica promoveu transferncia de conhecimento e tecnologia no sentido de que
as metodologias propostas sero efetivamente exploradas e utilizadas nas rotinas de anlise da
Embrapa, contribuindo para a agilidade e economia de recursos financeiros na pesquisa.

83

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90

ANEXOS
ANEXO A: Valores referncia versus valores preditos para os modelos da biomassa. () amostras de calibrao () amostras da validao.
50

34
32

45

Valores preditos (%)

Valores preditos (%)

30
40

35

30

28
26
24
22

25
20
20
20

25

30

35

40

45

18
18

50

20

22

420

11

400

10

380

360
340
320
300
280

26

28

30

32

34

36

8
7
6
5
4

260

240
220
220

24

Valores de referncia - hemicelulose (%)

Valores preditos (%)

-1

Valores Preditos (L t )

Valores de referncia - celulose (%)

240

260

280

300

320

340

360
-1

Valores de referncia - RTE (L t )

380

400

420

2
0

10

12

Valores de referncia - lignina (%)

91

ANEXO B: Valores referncia versus valores preditos para os modelos do caldo. () amostras de calibrao () amostras da validao.
18

55
50

16
40

14

Valores preditos (Z)

Valores preditos (B)

45

12

10

35
30
25
20
15
10

6
5
4
4

10

12

14

16

0
0

18

10

15

Valores de referncia - brix (B)

20

25

30

35

40

45

50

55

Valores de referncia - leitura sacarimtrica (Z)

14

Valores preditos (%)

12

10

0
0

10

12

14

Valores de referncia - pol (%)


90

5.5
5

80

4.5

Valores preditos (%)

Valores preditos (%)

70
60
50
40

4
3.5
3
2.5
2

30
1.5
20
10
0

1
10

20

30

40

50

60

Valores de referncia - pureza aparente (%)

70

80

90

0.5
1

1.5

2.5

3.5

Valores de referncia - acares redutores (%)

4.5

5.5

92

ANEXO C: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro celulose.
VR
(%)
35,0
33,8
40,9
34,1
39,9
33,5
40,7
37,5
34,0
34,6
37,3
45,0
37,6
35,2
37,7
36,8
37,7
35,3
40,9
35,8
39,3
40,6
41,1
33,1
35,9
31,9
37,4
37,2
43,1
44,4
39,5
31,3
43,7
38,6
35,8
42,6
29,2
36,1
37,2
28,7
34,8
40,2
35,1
38,6
39,8
42,8
34,2
37,3
30,9
32,5
39,8
34,6
27,9

VP
(%)
36,9
35,3
39,6
34,4
41,3
34,8
41,2
37,7
35,4
33,6
37,8
44,4
38,6
37,0
37,9
35,8
39,2
37,5
41,6
37,9
40,0
41,3
41,8
34,1
38,0
32,4
38,1
36,7
44,1
44,2
39,4
32,3
42,9
39,3
34,5
42,2
29,5
36,2
37,4
30,6
34,6
38,8
33,3
38,6
41,9
44,1
35,3
37,2
32,0
34,1
39,8
34,2
28,2

ER
(%)
5,3
4,4
-3,1
1,0
3,4
4,1
1,1
0,7
4,1
-2,9
1,5
-1,3
2,5
5,0
0,5
-2,6
3,9
6,2
1,7
5,6
1,8
1,9
1,8
3,2
5,9
1,7
1,9
-1,5
2,2
-0,5
-0,3
3,4
-2,0
1,8
-3,4
-1,1
1,1
0,3
0,5
6,5
-0,7
-3,4
-5,0
0,1
5,1
3,2
3,1
-0,3
3,7
4,8
0,0
-1,3
1,4

VR
(%)
33,5
33,8
37,8
40,7
32,3
37,5
35,7
35,4
34,2
36,0
44,7
33,8
36,2
35,7
33,8
36,3
38,2
32,1
35,4
39,5
36,7
41,1
35,4
37,3
42,7
34,0
33,3
32,6
36,9
39,0
41,3
42,8
46,5
47,1
40,7
38,3
40,4
34,1
33,0
34,9
37,3
36,0
42,6
34,7
33,2
37,4
37,4
34,5
39,4
39,2
37,3
36,5
43,2

VP
(%)
32,6
35,1
36,7
39,9
31,6
35,8
36,0
35,7
34,2
36,5
44,7
32,2
36,9
34,0
34,5
36,0
36,7
33,9
34,8
39,2
35,4
39,0
35,1
36,4
41,7
34,6
33,2
33,5
35,2
40,8
41,3
42,1
45,5
46,0
41,1
37,5
42,3
35,0
35,0
36,4
38,2
36,8
42,2
36,5
34,7
38,1
36,7
35,6
38,3
37,5
38,2
37,1
42,0

ER
(%)
-2,8
4,0
-3,1
-2,0
-2,2
-4,3
0,9
0,9
0,0
1,3
-0,1
-4,6
1,9
-4,9
1,9
-1,0
-4,1
5,7
-1,6
-0,8
-3,6
-5,3
-0,7
-2,3
-2,4
1,8
-0,4
2,9
-4,5
4,6
0,0
-1,6
-2,1
-2,3
1,0
-2,1
4,8
2,8
6,0
4,3
2,5
2,4
-0,9
5,0
4,5
1,9
-2,0
3,4
-2,7
-4,5
2,4
1,5
-2,8

VR
(%)
42,6
39,4
41,1
47,9
40,7
40,6
43,1
35,0
41,3
42,0
40,3
41,5
43,4
44,6
46,9
44,4
40,1
36,4
40,5
40,3
40,5
41,2
44,6
45,8
42,4
42,4
34,2
34,9
35,4
43,3
39,8
43,3
40,5
40,4
44,2
45,4
40,5
44,1
41,0
42,5
41,7
41,8
45,7
37,2
43,7
40,7
45,6
34,7
40,1
43,5
42,2
42,4
40,5

VP
(%)
41,0
39,2
40,4
46,5
41,0
40,0
42,5
35,7
39,3
40,6
38,8
41,1
44,2
45,3
46,4
42,5
39,7
36,8
39,6
38,5
39,1
42,2
45,3
44,8
41,7
41,9
33,8
35,4
35,8
43,2
40,2
43,7
40,6
40,2
44,3
44,7
38,5
42,3
40,4
40,9
40,5
40,9
44,2
38,0
44,0
40,7
45,4
36,3
41,6
43,3
40,5
40,6
40,1

ER
(%)
-3,8
-0,4
-1,6
-3,1
0,8
-1,5
-1,5
2,0
-4,7
-3,2
-3,8
-0,7
1,7
1,6
-0,9
-4,2
-0,9
1,3
-2,2
-4,4
-3,6
2,4
1,7
-2,2
-1,7
-1,2
-1,2
1,5
0,9
-0,4
1,0
1,0
0,3
-0,5
0,4
-1,6
-5,0
-4,0
-1,5
-3,8
-2,8
-2,1
-3,1
2,2
0,8
0,1
-0,6
4,7
3,6
-0,4
-3,9
-4,1
-0,9

VR
(%)
36,3
34,0
37,6
42,3
40,0
38,2
39,3
40,9
44,2
34,1
47,0
45,1
35,7
34,9
41,6
45,1
41,5
42,1
42,8
39,4
45,3
40,0
44,7
40,7
39,3
42,3
45,2
44,5
43,1
37,6
42,7
38,6
41,0
41,5
45,4
43,6
39,2
44,1
41,2
38,5
38,3
35,6
41,9
36,4
37,8
39,7
42,1
44,7
46,8
27,4
31,8
45,8
45,6

VP
(%)
37,2
34,8
36,7
41,6
38,3
38,8
40,7
39,4
44,9
34,8
46,7
44,4
34,8
36,0
41,0
43,7
42,1
42,3
42,9
38,8
44,3
39,2
45,0
41,4
39,7
43,8
45,0
44,4
42,7
37,8
40,5
39,0
42,0
40,5
43,2
43,4
38,7
43,2
40,6
38,8
37,7
37,0
40,5
35,6
38,8
40,1
43,4
43,7
47,3
26,6
30,4
43,8
47,2

ER
(%)
2,7
2,5
-2,4
-1,8
-4,2
1,6
3,3
-3,8
1,6
2,2
-0,5
-1,4
-2,6
3,2
-1,5
-3,3
1,6
0,3
0,3
-1,5
-2,2
-2,0
0,8
1,6
0,9
3,5
-0,5
-0,4
-1,0
0,4
-5,1
1,0
2,4
-2,4
-4,7
-0,7
-1,4
-2,1
-1,5
0,7
-1,5
3,9
-3,4
-2,2
2,6
1,1
3,2
-2,4
1,1
-2,7
-4,5
-4,4
3,4

93

ANEXO D: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro hemicelulose.
VR
(%)
27,2
26,8
22,9
28,4
29,0
29,7
24,2
29,4
23,7
23,3
26,3
26,6
24,9
27,2
27,6
26,1
24,6
29,6
25,5
24,9
28,6
27,1
25,7
27,8
27,4
23,2
24,4
22,8
26,1
23,8
26,0
28,3
26,5
30,4
28,3
22,8
25,8
24,0
26,4
27,2
23,7
25,3
26,5
24,8
21,3
24,5
25,7
23,6
22,9
23,2
25,8
24,5
20,0

VP
(%)
26,8
26,0
23,3
26,3
28,4
27,8
26,3
29,8
23,3
23,9
25,8
27,7
25,6
27,7
28,2
26,7
24,8
28,0
26,5
25,4
27,4
24,6
28,1
27,8
26,7
24,2
25,7
23,0
27,8
25,5
27,4
27,5
24,6
29,2
26,9
23,8
26,9
22,8
24,6
26,3
22,9
23,5
28,7
25,8
22,9
24,0
27,4
25,7
22,6
23,7
26,3
25,0
21,7

ER
(%)
-1,6
-3,2
1,6
-7,3
-1,9
-6,5
8,7
1,2
-1,7
2,9
-1,9
4,3
3,1
1,6
2,2
2,1
0,9
-5,4
3,9
2,2
-4,4
-9,4
9,1
0,0
-2,5
4,3
5,6
0,7
6,8
7,3
5,4
-2,9
-7,1
-3,9
-4,9
4,5
4,2
-4,8
-6,9
-3,3
-3,4
-7,0
8,2
4,2
7,4
-1,7
6,6
8,7
-1,2
2,6
2,1
2,1
8,6

VR
(%)
25,7
28,0
23,7
22,7
22,7
25,8
28,0
24,6
24,7
23,2
26,0
29,2
22,5
26,1
21,7
24,9
22,9
23,6
22,2
25,0
24,3
25,6
26,3
25,5
21,7
22,5
25,1
24,6
26,4
27,7
26,3
26,9
25,0
22,7
24,9
21,2
25,5
26,4
23,2
24,9
27,1
26,4
25,5
24,6
24,2
25,1
25,9
25,3
22,7
26,4
26,8
30,2
26,6

VP
(%)
26,1
25,2
23,9
24,5
25,3
25,6
25,8
24,1
24,3
23,7
27,8
28,2
24,1
25,0
23,7
22,9
24,7
23,9
23,9
25,9
25,9
26,6
26,3
27,8
23,9
22,8
25,2
24,7
28,5
29,1
28,6
28,8
25,0
23,9
24,7
20,9
25,8
26,1
25,1
25,0
25,3
25,3
27,2
24,4
25,1
25,8
26,7
26,0
22,9
26,8
25,4
27,8
28,3

ER
(%)
1,4
-9,8
0,7
7,7
11,4
-0,8
-8,1
-2,0
-1,8
1,9
7,0
-3,4
7,4
-4,0
9,3
-8,1
7,8
1,0
7,8
3,5
6,6
4,0
0,1
8,9
10,4
1,5
0,4
0,3
8,0
4,9
8,6
7,0
0,2
5,4
-1,0
-1,4
1,0
-1,4
8,0
0,3
-6,7
-4,1
6,8
-0,5
3,5
3,1
3,0
2,4
0,9
1,6
-5,2
-7,7
6,5

VR
(%)
27,9
27,1
26,1
30,2
25,4
28,3
22,0
25,5
24,5
22,9
23,5
27,1
26,8
27,3
26,1
27,4
23,2
26,0
24,2
26,9
25,8
26,2
26,9
28,1
28,8
24,4
24,4
27,0
30,9
27,4
28,6
28,6
26,5
28,6
26,1
27,0
25,6
25,9
24,6
25,2
28,0
26,8
31,0
29,9
28,2
30,4
30,1
28,3
29,2
28,1
30,3
26,2
26,9

VP
(%)
28,3
25,0
27,0
28,7
26,5
25,8
24,7
25,9
25,4
25,5
25,9
27,4
27,9
28,2
26,5
25,9
25,5
24,9
25,1
25,3
26,3
27,9
29,1
27,6
28,5
27,0
26,1
25,9
28,8
26,6
27,4
27,3
27,5
28,7
27,3
26,7
25,9
26,7
25,8
27,5
27,9
28,2
30,2
27,4
29,6
27,9
28,9
29,4
29,3
29,0
28,2
27,3
28,1

ER
(%)
1,6
-7,6
3,3
-4,8
4,4
-8,7
12,2
1,7
3,5
11,2
10,1
1,0
4,0
3,2
1,3
-5,7
9,8
-4,1
4,0
-5,8
2,0
6,4
8,1
-1,8
-1,1
10,7
7,1
-3,9
-6,7
-2,8
-4,0
-4,5
3,8
0,4
4,7
-1,2
1,3
3,3
4,7
9,2
-0,5
5,4
-2,7
-8,2
5,1
-8,0
-4,1
4,0
0,4
3,0
-6,9
3,9
4,5

VR
(%)
24,5
26,5
24,6
27,9
28,8
26,4
27,4
27,7
28,4
30,0
31,5
30,9
27,7
26,2
28,4
30,1
28,8
29,5
26,7
30,0
25,7
26,6
26,9
28,8
28,7
28,4
26,6
28,1
28,2
25,3
27,2
26,3
22,2
32,1
32,6
34,1
33,2
30,9
31,7
20,5
23,3
23,8
22,7
20,9
32,6
32,6
31,7
32,0
30,1
23,4
31,4
30,7
31,0

VP
(%)
25,2
25,7
26,0
27,4
27,1
25,4
25,7
27,3
27,2
27,8
29,0
28,6
27,1
28,2
28,3
28,3
28,7
27,9
28,9
28,3
26,7
28,0
27,3
28,8
28,1
28,7
28,3
27,8
26,3
25,5
26,8
25,9
24,0
30,3
30,7
31,7
30,6
32,3
32,7
22,0
23,1
25,6
24,9
22,8
30,7
31,5
30,6
33,8
30,2
22,3
30,6
30,5
29,3

ER
(%)
3,0
-3,1
5,3
-2,0
-6,0
-3,8
-6,4
-1,4
-4,1
-7,5
-7,8
-7,6
-2,2
7,6
-0,5
-6,0
-0,5
-5,1
8,3
-5,6
4,0
5,1
1,5
0,0
-2,1
1,0
6,5
-1,2
-6,6
0,7
-1,3
-1,7
8,0
-5,8
-5,7
-7,0
-7,8
4,5
3,1
7,2
-1,0
7,3
9,5
8,9
-6,0
-3,2
-3,5
5,5
0,5
-4,8
-2,6
-0,6
-5,4

94

ANEXO E: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro RTE.
VR
(Lt-1)
327
317
290
341
358
357
284
284
309
327
305
331
372
327
307
345
324
309
357
323
334
351
351
289
309
281
325
313
346
361
348
296
380
343
300
351
273
321
331
317
284
330
327
358
269
308
372
333
290
323
356
352
348

VP
(Lt-1)
328
327
292
338
359
356
289
296
311
343
306
335
364
330
309
337
327
314
344
311
350
346
345
295
326
284
342
317
357
368
341
298
365
337
296
343
271
309
324
323
274
330
334
343
275
300
357
334
284
318
361
352
335

ER
(%)
0,2
3
0,2
-1
0,2
-0,3
1,8
4,2
0,6
5
0,4
1,3
-2,3
0,8
0,7
-2,3
0,8
1,7
-3,5
-3,8
5
-1,3
-1,8
2,3
5,3
1,2
5
1,3
3,1
1,8
-2,1
0,6
-3,9
-1,7
-1,6
-2,3
-0,7
-3,8
-1,8
1,8
-3,6
-0,1
2
-4,3
2,5
-2,8
-3,8
0,4
-2
-1,8
1,5
0
-3,9

VR
(Lt-1)
313
262
319
256
300
297
314
308
302
338
298
288
309
309
316
326
302
312
363
363
289
320
317
295
304
286
295
343
344
313
343
326
350
297
286
316
360
378
374
367
370
364
366
303
297
256
327
304
314
304
349
304
294

VP
(Lt-1)
327
279
331
264
297
297
312
291
297
322
311
289
310
313
307
319
297
310
364
352
294
321
317
299
314
299
304
350
339
316
329
322
348
289
287
322
355
370
365
361
375
357
364
315
309
268
331
316
328
320
352
311
307

ER
(%)
4,6
6,1
3,8
3,2
-1,1
0,1
-0,6
-5,6
-1,6
-4,5
4,4
0,5
0,3
1,6
-2,7
-2
-1,6
-0,6
0,3
-3,1
1,9
0,5
0,1
1,4
3,2
4,5
2,8
2
-1,4
1,1
-4,1
-1,4
-0,5
-2,7
0,1
1,9
-1,3
-2,1
-2,3
-1,5
1,1
-2,1
-0,6
3,8
3,8
4,7
1,4
4
4,5
5,3
0,8
2,2
4,3

VR
(Lt-1)
357
330
328
318
359
392
341
345
339
353
314
338
324
333
362
366
381
349
340
327
327
329
331
341
346
373
362
365
320
381
345
369
354
344
374
372
339
359
344
335
364
335
362
362
351
379
334
361
368
366
362
367
354

VP
(Lt-1)
356
322
331
323
352
375
331
347
341
340
324
341
331
344
363
371
370
349
344
325
332
317
325
337
362
374
361
362
323
365
349
364
349
358
370
363
338
351
344
348
361
350
362
351
352
376
342
364
374
368
360
354
350

ER
(%)
-0,3
-2,6
1,1
1,5
-2,1
-4,3
-3
0,7
0,5
-3,8
2,9
0,9
1,9
3,1
0,4
1,3
-2,8
0,2
1,1
-0,8
1,5
-3,5
-1,7
-1,1
4,6
0,3
-0,3
-0,9
0,9
-4,1
1,3
-1,2
-1,4
4,3
-1
-2,3
-0,2
-2,1
-0,2
3,9
-0,8
4,5
0,2
-3,1
0,2
-0,7
2,5
1
1,5
0,6
-0,4
-3,6
-1,2

VR
(Lt-1)
310
348
331
332
324
370
328
331
315
354
374
359
374
364
347
364
355
377
356
365
380
358
347
351
348
369
336
359
361
371
347
363
356
342
326
322
322
284
359
371
391
388
403
232
260
286
272
259
399
352
261
390
382

VP
(Lt-1)
324
355
329
341
334
370
322
314
322
342
359
358
356
352
350
366
358
369
348
368
368
365
347
349
350
367
347
366
364
370
352
364
354
339
327
332
322
281
353
359
379
387
402
235
261
289
277
258
411
343
259
374
378

ER
(%)
4,7
2,1
-0,7
2,6
3,1
-0,2
-2,1
-5
2,2
-3,5
-3,9
-0,1
-4,6
-3,2
0,9
0,5
1
-2,3
-2,3
0,8
-3,1
2
-0,1
-0,7
0,6
-0,5
3,2
2
0,6
-0,4
1,4
0,5
-0,6
-0,9
0,3
3
0,2
-0,8
-1,7
-3,1
-2,9
-0,3
-0,2
1,1
0,5
1,3
1,9
-0,6
3
-2,6
-0,9
-3,9
-0,9

95

ANEXO F: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro lignina.
VR
(%)
8,0
5,0
5,6
7,5
7,0
6,6
7,2
6,7
7,7
5,8
7,3
6,5
7,0
6,0
6,2
8,9
6,2
6,6
5,4
7,2
6,1
6,2
5,8
8,3
7,6
7,4
6,7
7,5
4,8
7,0
6,5
9,8
7,1
5,5
6,7
6,5
9,2
3,8
7,0
7,0
4,8
6,1
7,0
3,8
5,4
6,4
6,2
3,4
5,1
8,7
8,8
7,7
5,3

VP
(%)
7,8
6,5
5,3
7,4
6,8
6,2
7,6
6,3
7,6
5,6
5,9
6,6
7,9
5,8
7,0
8,5
6,1
6,7
6,1
7,1
6,7
7,5
6,2
7,9
8,1
7,5
5,8
6,8
5,4
6,9
6,3
8,7
7,3
5,4
7,8
7,4
7,9
4,2
5,9
6,7
6,2
7,0
6,8
4,6
5,4
6,8
6,6
4,7
6,5
8,0
8,2
6,5
6,6

ER
(%)
-2,1
29,0
-4,4
-1,0
-2,7
-6,9
5,2
-6,2
-1,9
-3,0
-19,0
1,9
13,9
-2,0
13,3
-4,4
-1,5
1,6
13,9
-0,4
9,7
21,1
7,5
-4,6
5,5
1,4
-13,3
-9,1
11,8
-1,6
-3,4
-10,9
2,6
-2,9
15,7
13,8
-13,5
10,6
-15,6
-3,6
27,8
13,8
-3,5
21,1
-1,0
6,4
6,2
37,6
28,2
-7,6
-7,1
-15,3
26,2

VR
(%)
6,3
3,9
6,1
5,7
4,6
4,8
5,6
5,6
5,4
4,8
6,2
7,4
6,7
4,8
5,9
7,0
4,8
6,0
5,8
3,7
7,9
5,8
4,1
5,6
6,9
5,1
4,5
5,8
6,7
4,5
5,8
6,3
3,9
5,5
5,6
5,5
6,5
6,3
4,7
4,5
4,8
7,5
8,8
10,8
8,9
7,2
8,0
4,3
4,4
5,5
4,6
4,8
5,2

VP
(%)
6,1
4,1
6,1
5,4
3,7
5,5
4,7
5,6
4,6
4,2
6,2
7,1
6,3
4,5
5,5
6,1
6,0
5,4
6,1
4,8
8,0
4,8
4,5
5,8
5,5
4,9
5,0
5,8
5,7
5,4
5,2
6,3
5,2
6,4
5,5
5,9
5,6
4,8
5,3
5,8
5,7
7,6
8,8
9,3
7,9
6,8
7,7
5,5
5,0
5,4
4,2
5,5
6,1

ER
(%)
-2,3
4,5
-0,1
-5,5
-18,7
13,6
-17,0
-0,3
-15,0
-11,1
-0,8
-3,8
-5,4
-5,7
-7,7
-12,2
25,2
-10,7
4,9
31,1
2,0
-16,8
8,0
3,9
-19,6
-4,8
10,3
0,1
-15,1
19,5
-10,3
0,7
32,5
15,9
-2,3
7,6
-13,0
-23,8
13,7
27,6
18,1
1,5
-0,1
-13,5
-11,6
-5,7
-3,4
28,4
14,7
-1,7
-9,0
13,6
18,6

VR
(%)
5,1
7,5
6,6
5,8
8,9
7,5
7,9
6,4
7,4
4,5
7,9
5,9
6,9
8,4
8,4
5,6
7,9
8,0
6,7
7,1
7,3
6,2
9,4
9,3
9,1
5,7
7,4
8,3
6,4
7,3
7,0
8,8
7,9
8,8
7,3
7,7
6,5
6,4
6,1
7,1
6,6
6,5
8,4
8,1
7,6
7,1
5,9
7,3
7,5
8,6
8,6
7,1
8,3

VP
(%)
6,2
6,1
6,4
6,9
9,0
7,7
8,1
6,8
7,4
6,0
7,2
6,3
6,8
7,8
9,2
6,7
7,2
8,9
7,1
8,4
6,2
5,9
8,6
8,6
9,1
7,0
6,5
7,1
5,8
7,0
7,1
8,2
8,8
8,8
7,9
8,1
5,7
5,6
6,0
7,3
8,0
7,4
7,2
8,9
9,0
8,6
6,7
7,6
7,4
7,6
8,4
6,6
8,3

ER
(%)
22,9
-18,2
-3,7
20,1
0,5
3,8
1,6
5,1
-0,6
32,4
-8,7
7,6
-2,1
-6,7
9,6
20,3
-8,5
10,6
5,8
18,4
-14,8
-4,5
-8,7
-7,4
-0,2
22,7
-11,8
-14,7
-10,2
-3,4
2,2
-6,8
11,8
-0,2
8,6
5,6
-11,4
-13,0
-1,5
2,2
21,5
13,6
-15,1
10,0
18,2
20,8
13,2
4,4
-1,2
-11,3
-2,7
-7,2
-0,2

VR
(%)
9,7
8,4
9,4
7,3
6,0
8,1
6,4
4,8
5,9
6,3
7,8
6,8
6,7
7,8
4,6
7,8
5,4
7,9
8,4
8,5
7,4
8,5
8,7
9,0
7,8
7,9
9,0
9,2
7,4
8,1
8,5
9,3
8,5
9,3
7,7
8,1
8,0
6,8
5,1
5,4
6,9
6,6
7,3
8,6
4,2
5,8
5,1
4,1
9,1
8,2
8,4
3,9
7,3

VP
(%)
8,4
7,9
8,2
8,5
7,5
6,8
6,0
5,9
6,4
5,9
7,6
6,5
6,8
8,6
5,6
9,0
6,1
7,8
8,6
8,1
8,3
7,0
8,0
8,7
7,1
8,8
8,5
8,2
6,8
7,3
7,3
8,1
7,4
8,4
7,3
8,3
7,7
6,9
5,9
4,7
7,4
7,6
6,6
8,8
3,7
5,3
3,7
3,7
8,6
7,2
9,5
4,1
8,3

ER
(%)
-13,2
-5,9
-12,6
17,1
25,4
-15,5
-5,2
22,9
7,7
-6,7
-1,8
-4,9
0,9
10,5
22,0
15,3
11,9
-0,8
1,6
-4,8
13,3
-17,6
-8,5
-3,5
-9,7
10,2
-6,3
-10,3
-8,3
-10,5
-13,8
-12,5
-13,0
-9,7
-6,1
2,5
-4,2
0,7
15,7
-13,0
6,1
15,2
-9,7
2,1
-13,5
-8,0
-28,7
-8,9
-5,3
-11,8
13,4
5,2
14,7

96

ANEXO G: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro brix.
VR
(B)
14,3
15,3
13,0
13,3
12,0
13,2
12,5
14,7
11,6
16,7
13,7
14,2
10,2
14,5
14,3
13,9
15,7
15,6
14,6
13,0
12,3
14,1
12,8
10,9
12,9
15,5
15,0
14,4
12,0
16,2
11,1
13,1
11,8
12,3

VP
(B)
14,4
14,8
13,5
13,4
11,7
12,9
12,6
14,5
11,9
16,1
13,2
13,8
10,8
14,5
14,6
14,5
16,0
16,1
15,1
13,1
12,2
14,3
12,3
11,3
13,1
15,2
15,5
14,6
11,7
16,1
11,7
12,8
11,3
12,0

ER
(%)
0,7
-3,5
4,1
0,5
-2,2
-2,5
1,0
-1,5
2,2
-3,8
-3,5
-2,7
5,8
0,3
2,3
4,6
1,8
3,0
3,7
0,5
-0,6
1,1
-3,7
3,9
1,8
-2,2
3,6
1,3
-2,1
-0,5
5,3
-1,9
-3,9
-2,4

VR
(B)
13,9
12,4
12,1
12,7
13,1
11,8
12,9
15,3
14,5
13,6
12,9
14,9
13,4
12,3
14,9
13,4
14,9
12,1
13,0
11,4
12,8
12,7
13,1
10,3
13,6
14,9
11,8
10,9
8,5
12,2
8,1
8,0
9,5
11,2

VP
(B)
14,0
12,5
12,5
12,9
13,0
12,3
13,2
15,4
14,5
13,9
13,3
15,3
14,1
12,4
15,2
13,7
15,2
12,4
13,3
12,0
13,0
13,0
13,4
9,9
14,3
14,6
11,1
10,8
8,3
11,5
8,7
8,5
9,4
11,1

ER
(%)
0,4
1,1
3,2
1,4
-0,5
4,3
2,6
0,6
0,0
2,0
3,4
2,9
4,9
1,0
2,2
2,3
1,9
2,7
2,4
4,9
1,4
2,4
2,1
-3,7
4,9
-1,8
-5,6
-1,2
-2,8
-5,5
7,8
6,5
-0,9
-0,9

VR
(B)
8,3
11,3
10,3
9,6
11,0
9,6
8,6
7,7
8,7
11,9
13,4
9,8
7,7
10,1
9,2
10,8
10,0
9,5
11,1
10,6
10,2
12,8
11,9
13,9
6,1
9,7
13,1
4,7
10,0
11,5
9,7
7,5
13,1
8,1

VP
(B)
8,8
11,4
10,8
10,1
11,4
9,9
9,1
8,2
8,6
11,5
13,0
10,5
7,5
10,4
9,2
10,8
9,8
9,5
11,8
10,5
10,2
12,7
12,0
13,5
5,9
9,9
12,8
5,2
10,2
11,3
10,4
7,7
13,7
8,7

ER
(%)
6,3
1,3
5,2
5,2
4,0
2,8
6,2
6,4
-0,7
-3,5
-2,7
6,7
-3,2
3,4
0,1
-0,1
-2,2
0,1
6,4
-1,1
0,0
-0,6
0,5
-3,2
-3,1
1,9
-2,2
11,0
2,4
-1,6
7,3
3,1
4,5
7,2

VR
(B)
13,9
10,4
14,0
7,5
14,3
6,9
11,5
10,7
11,0
11,8
11,5
9,2
11,0
8,0
9,9
8,3
11,3
9,2
8,6
9,4
12,0
12,6
11,9
8,0
9,1
9,0
14,2
12,3
10,0
10,2
12,6
11,0
13,2

VP
(B)
14,2
10,0
14,0
7,3
14,3
7,6
11,5
11,3
10,6
11,3
10,9
9,3
11,2
8,2
10,1
8,6
11,3
9,6
7,9
9,1
11,5
12,2
11,5
8,4
8,9
9,0
14,5
12,2
9,6
10,8
11,9
10,9
13,3

ER
(%)
2,0
-3,7
-0,3
-3,0
-0,3
9,8
-0,4
6,0
-4,0
-3,9
-4,8
0,8
2,1
2,5
1,6
3,8
0,2
3,9
-8,3
-3,0
-3,9
-2,9
-3,3
4,4
-2,6
-0,3
1,8
-1,0
-4,0
5,6
-5,7
-0,7
0,6

97

ANEXO H: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro leitura sacarimtrica.
VR
(Z)
35,3
39,8
22,0
29,9
23,6
36,5
46,0
35,2
30,9
23,0
41,3
38,5
38,2
39,8
33,8
42,4
31,7
30,9
32,6
26,1
32,7
20,2
27,9
44,6
40,0
27,4
45,6
30,6
29,9
27,4
31,6
39,6
28,2
25,0

VP
(Z)
35,9
37,7
24,6
29,1
29,0
35,6
42,5
31,9
33,5
23,6
37,9
38,9
37,7
43,1
36,6
43,0
32,9
28,1
37,5
28,9
28,9
25,3
32,3
42,2
38,0
26,4
44,5
31,7
24,9
27,8
30,4
33,8
27,6
29,7

ER
(%)
1,7
-5,2
11,9
-2,7
23,0
-2,4
-7,5
-9,2
8,2
2,3
-8,3
1,0
-1,3
8,4
8,3
1,3
3,8
-9,0
15,0
10,6
-11,9
24,8
16,0
-5,5
-5,0
-3,7
-2,5
3,5
-16,7
1,6
-3,7
-14,7
-2,1
19,0

VR
(Z)
34,1
29,1
29,8
35,5
32,3
36,8
28,2
45,1
43,0
34,2
30,8
40,9
33,4
26,0
38,3
30,2
39,6
25,2
28,7
25,1
10,5
28,2
12,7
29,9
23,0
33,7
19,3
14,4
26,3
23,7
13,4
8,6
18,1
22,2

VP
(Z)
40,2
35,0
30,4
37,7
38,2
31,1
33,8
43,1
38,6
35,3
33,8
41,3
36,3
29,0
40,4
33,5
37,9
26,3
32,4
28,4
12,9
28,7
16,3
34,0
21,3
27,5
18,2
11,3
22,3
22,0
12,6
10,7
15,9
21,6

ER
(%)
18,0
20,6
2,0
6,3
18,2
-15,4
19,5
-4,6
-10,2
3,3
9,7
1,2
8,7
11,3
5,5
11,1
-4,2
4,3
12,7
13,4
23,5
1,8
28,6
13,6
-7,3
-18,3
-5,6
-21,4
-15,5
-7,2
-5,7
23,4
-11,9
-2,7

VR
(Z)
20,7
20,3
10,7
23,5
18,4
20,6
11,7
15,7
12,6
11,2
8,7
10,1
26,4
28,1
14,4
10,9
9,9
17,0
9,2
15,9
20,1
21,9
19,5
16,7
24,2
21,6
6,8
11,3
18,1
28,7
22,2
24,7
23,1
6,6

VP
(Z)
22,6
24,1
13,4
23,4
21,4
22,4
13,9
18,7
14,6
13,1
8,3
10,7
25,5
30,3
16,7
13,9
7,6
20,7
11,6
18,7
18,0
25,7
16,3
17,4
27,2
26,3
5,8
12,4
17,2
30,0
21,1
23,8
21,0
8,3

ER
(%)
9,1
18,8
24,8
-0,1
16,6
8,6
19,6
19,3
16,7
17,6
-4,6
5,9
-3,3
7,9
16,4
26,9
-23,6
21,8
26,9
17,6
-10,3
16,9
-16,7
4,4
12,2
22,0
-15,4
10,0
-5,0
4,6
-5,0
-3,8
-9,2
25,3

VR
(Z)
29,6
10,5
34,0
19,5
35,1
7,1
31,5
4,5
19,3
25,1
26,9
20,4
24,7
10,9
13,7
14,4
8,3
22,8
30,2
18,7
14,3
18,4
28,5
28,4
27,2
9,9
13,5
14,8
35,9
33,8
15,0
22,3
30,4
19,2

VP
(Z)
31,6
13,4
34,3
17,8
33,2
7,5
34,5
5,8
21,3
23,6
23,5
15,4
23,6
9,2
10,4
18,0
10,1
19,9
25,4
16,9
11,7
14,9
23,9
26,0
25,3
12,2
12,8
14,7
35,6
29,5
17,8
21,3
25,1
21,6

ER
(%)
7,0
27,7
1,0
-8,7
-5,5
7,0
9,5
28,1
10,7
-6,2
-12,3
-24,6
-4,4
-15,7
-24,3
24,7
21,7
-12,5
-16,0
-9,4
-18,3
-18,7
-16,3
-8,5
-7,0
23,0
-5,1
-0,1
-0,9
-12,6
18,6
-4,6
-17,3
12,4

98

ANEXO I: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro pol.
VR
(%)
8,8
9,8
5,5
7,5
5,9
9,0
11,3
8,8
7,7
5,8
10,2
9,6
9,5
9,8
8,4
10,5
7,9
7,7
8,1
6,5
8,2
5,1
7,0
11,1
9,9
6,9
11,2
7,6
7,5
6,9
8,0
9,9
7,1
6,3

VP
(%)
9,0
9,5
6,2
7,2
7,3
8,9
10,6
8,0
8,3
5,9
9,4
9,7
9,4
10,7
9,1
10,7
8,2
7,0
9,4
7,2
7,1
6,3
8,1
10,5
9,5
6,5
11,1
7,9
6,1
6,9
7,5
8,3
6,8
7,3

ER
(%)
2,4
-3,7
11,6
-3,3
23,2
-1,9
-6,5
-8,2
8,3
1,3
-8,2
1,9
-1,1
9,3
8,0
1,8
3,3
-10,0
15,4
9,6
-13,3
23,8
15,7
-4,7
-4,2
-4,9
-1,1
3,6
-18,3
0,2
-5,3
-15,3
-3,7
17,6

VR
(%)
7,3
7,4
8,8
8,1
9,2
7,1
11,2
10,7
8,5
7,7
10,1
8,3
6,5
9,5
7,5
9,8
6,3
7,2
6,3
2,7
7,1
3,2
7,4
5,8
8,3
4,9
3,7
6,6
5,9
3,4
2,2
4,6
5,6
5,2

VP
(%)
8,7
7,5
9,5
9,6
7,8
8,5
10,8
9,7
8,8
8,4
10,3
9,2
7,3
10,2
8,4
9,5
6,6
8,2
7,2
3,0
7,2
4,1
8,6
5,4
6,9
4,6
2,8
5,6
5,6
3,2
2,8
4,0
5,5
5,7

ER
(%)
19,4
0,9
7,2
18,7
-14,6
19,8
-3,2
-9,4
3,2
9,8
1,9
10,4
11,9
7,5
11,9
-3,0
4,3
13,7
14,8
14,1
2,6
27,8
16,6
-6,9
-17,5
-5,9
-24,0
-15,1
-5,7
-6,2
26,4
-11,8
-1,7
8,0

VR
(%)
5,1
2,7
5,9
4,6
5,2
3,0
4,0
3,2
2,8
2,2
2,6
6,6
7,0
3,6
2,8
2,5
4,3
2,3
4,0
5,1
5,5
4,9
4,2
6,1
5,4
1,8
2,9
4,6
7,2
5,6
6,2
5,8
1,7
7,4

VP
(%)
6,2
3,4
5,9
5,5
5,7
3,6
5,1
4,1
3,2
2,0
2,6
6,4
7,6
4,6
3,6
1,9
5,2
3,0
4,7
4,5
6,5
4,0
4,4
6,8
6,7
1,2
3,2
4,3
7,5
5,3
5,9
5,2
2,2
7,9

ER
(%)
20,1
23,4
-0,7
18,0
9,6
19,6
29,3
28,5
11,2
-8,5
3,3
-2,5
8,3
26,0
28,6
-25,7
20,8
30,2
16,1
-11,5
18,4
-18,4
4,8
12,4
23,6
-30,9
9,9
-5,8
4,8
-6,0
-4,5
-10,8
29,5
7,5

VR
(%)
2,7
8,5
4,9
8,7
1,8
7,8
1,2
4,8
6,3
6,7
5,2
6,2
2,8
3,5
3,7
2,1
5,7
7,6
4,7
3,7
4,7
7,2
7,1
6,8
2,5
3,4
3,8
8,9
8,5
3,8
5,6
7,6
4,8
8,1

VP
(%)
3,4
8,6
4,5
8,3
1,9
8,6
1,5
5,4
6,0
5,9
3,9
6,0
2,3
2,4
4,5
2,8
5,0
6,4
4,3
2,6
3,8
6,1
6,5
6,4
3,1
3,3
3,8
9,0
7,5
4,5
5,3
6,2
5,5
8,0

ER
(%)
25,7
1,5
-9,7
-4,8
4,6
10,6
30,8
10,7
-5,8
-12,0
-23,6
-3,9
-15,4
-30,0
24,5
30,9
-12,9
-16,1
-9,9
-29,0
-19,3
-15,3
-8,4
-6,3
23,7
-5,2
1,5
0,5
-11,7
19,4
-5,0
-17,9
13,5
-1,0

99

ANEXO J: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro pureza aparente.
VR
(%)
76,8
70,6
75,8
45,7
63,1
61,2
64,3
45,9
56,5
47,2
61,5
67,7
63,9
54,1
57,1
70,6
66,9
68,3
62,5
62,4
67,1
60,3
60,8
62,9
57,5
51,0
60,9
46,8
54,0
75,1
73,7
68,9
57,3
69,4

VP
(%)
81,1
81,3
84,9
51,4
64,0
61,1
65,2
52,5
56,9
56,1
61,7
67,9
60,5
60,0
52,6
65,6
66,1
65,4
69,7
63,5
71,0
70,0
60,3
55,7
62,1
55,0
54,5
52,8
57,4
65,2
68,4
64,8
54,9
72,5

ER
(%)
5,6
15,1
12,0
12,4
1,5
-0,3
1,5
14,3
0,7
19,0
0,3
0,4
-5,4
11,0
-7,8
-7,1
-1,2
-4,2
11,5
1,8
5,8
16,1
-0,9
-11,4
8,1
7,7
-10,4
12,8
6,3
-13,2
-7,2
-6,0
-4,2
4,6

VR
(%)
63,6
55,7
70,9
56,9
51,7
60,5
55,4
58,6
65,0
59,2
70,0
52,4
56,5
72,9
73,5
62,6
59,6
67,9
62,0
53,0
63,7
56,1
62,1
65,8
52,1
55,2
48,9
55,5
46,3
46,6
50,5
49,7
48,9
56,7

VP
(%)
53,1
55,1
60,8
55,4
58,0
68,0
62,0
56,9
65,4
65,0
60,0
60,1
62,1
70,8
65,1
62,6
61,2
67,5
62,6
54,5
67,9
61,0
54,9
64,6
52,0
60,7
54,9
54,4
55,3
56,6
61,1
58,7
46,3
54,0

ER
(%)
-16,5
-1,0
-14,2
-2,6
12,2
12,4
12,0
-3,0
0,6
9,7
-14,3
14,7
9,9
-2,9
-11,5
0,0
2,6
-0,6
0,9
2,8
6,7
8,8
-11,6
-1,8
-0,2
10,0
12,2
-2,0
19,5
21,6
21,0
18,2
-5,5
-4,8

VR
(%)
54,1
49,4
42,2
27,6
48,1
49,8
54,0
49,3
32,9
52,2
45,1
54,4
39,2
35,9
37,2
33,0
29,0
29,5
55,6
52,2
37,2
32,8
33,0
42,4
37,2
50,8
49,7
46,5
41,4
47,3
45,5
28,8
40,1
47,2

VP
(%)
48,8
46,5
37,1
35,1
42,7
48,0
46,0
46,9
36,3
46,7
47,2
49,9
40,6
43,8
39,1
40,5
30,0
33,0
49,1
53,7
42,8
38,8
31,4
47,3
40,1
43,0
50,1
40,8
41,6
51,7
51,0
27,8
35,2
39,1

ER
(%)
-9,7
-6,0
-12,1
27,1
-11,2
-3,7
-14,8
-4,9
10,4
-10,5
4,8
-8,2
3,4
22,2
5,2
22,7
3,5
12,2
-11,7
2,9
15,1
18,2
-4,7
11,5
7,8
-15,4
0,8
-12,1
0,5
9,3
12,1
-3,4
-12,2
-17,2

VR
(%)
56,1
54,0
51,4
33,8
22,7
56,3
33,2
60,8
47,4
62,3
24,1
54,6
42,1
59,2
57,1
56,4
34,7
38,7
36,9
51,6
42,4
49,5
59,6
56,4
57,4
31,6
37,8
41,6
62,8
37,9
55,2
44,0
61,1
62,4

VP
(%)
45,1
47,5
44,4
43,9
29,3
53,7
38,0
58,5
41,6
57,6
32,2
58,1
43,0
48,2
48,9
47,9
31,5
35,7
43,1
46,1
34,5
40,0
49,0
48,7
50,0
35,3
38,0
38,5
59,9
41,7
45,1
44,6
55,9
54,5

ER
(%)
-19,7
-12,1
-13,6
30,1
29,4
-4,7
14,4
-3,8
-12,3
-7,6
33,5
6,4
2,1
-18,6
-14,4
-15,1
-9,0
-7,8
17,0
-10,6
-18,6
-19,1
-17,8
-13,6
-12,8
11,6
0,5
-7,5
-4,6
10,1
-18,4
1,3
-8,6
-12,6

100

ANEXO K: Valores de referncia, valores preditos e erros relativos de amostras de validao


para o parmetro acares redutores.
VR
(%)
1,5
1,5
1,5
1,3
1,5
1,7
4,7
3,7
3,4
3,1
4,4
5,3
4,0
4,6
3,6
3,3
4,9
2,4
2,4
3,2
3,0
3,6
4,4
2,6
3,3
1,8
2,4
2,1
3,6
3,6
2,4
2,3
3,5

VP
(%)
1,3
1,7
1,6
1,3
1,2
1,8
4,2
3,0
3,9
3,0
4,4
4,7
3,8
4,2
3,4
3,3
5,3
2,3
2,9
3,6
3,2
3,3
4,0
2,6
3,6
2,5
2,5
2,6
3,5
2,8
2,2
1,7
3,0

ER
(%)
-17,7
15,1
2,3
-2,0
-23,6
6,8
-10,4
-18,4
15,0
-0,7
-0,7
-10,1
-4,6
-9,0
-6,2
0,8
8,8
-3,3
23,6
11,0
7,4
-6,7
-9,6
-1,9
10,2
37,0
4,9
24,4
-3,2
-20,7
-7,0
-26,6
-14,2

VR
(%)
3,5
4,3
3,7
3,1
3,4
3,7
5,3
3,6
3,8
1,5
1,7
2,0
2,4
4,0
3,9
3,7
2,5
3,4
2,9
4,1
2,9
3,3
4,1
4,3
3,3
3,6
2,4
3,1
2,2
3,2
2,4
3,0
3,9

VP
(%)
3,0
4,1
4,2
2,9
3,4
3,4
4,5
3,3
3,5
1,8
2,3
2,2
2,2
3,6
3,6
3,2
3,2
3,2
3,2
3,5
3,1
3,0
3,8
4,0
3,1
3,3
2,8
2,4
2,9
3,0
2,7
2,4
3,3

ER
(%)
-13,0
-3,1
12,1
-9,4
0,6
-8,9
-14,4
-8,3
-9,1
20,9
40,5
13,5
-7,2
-11,8
-6,2
-12,8
28,0
-5,3
9,9
-14,6
5,6
-11,3
-7,1
-7,8
-8,3
-6,1
18,1
-24,2
31,2
-6,5
12,1
-19,0
-14,0

VR
(%)
3,3
2,0
3,1
2,6
3,8
3,7
3,3
3,8
3,1
3,6
3,7
4,7
2,4
1,8
3,0
3,0
1,5
1,6
1,9
2,2
3,1
1,6
1,7
2,1
2,0
3,3
2,4
3,2
2,0
3,5
2,9
3,2
3,2

VP
(%)
2,7
2,4
3,1
2,8
3,6
3,0
3,6
3,1
3,5
3,8
3,5
4,2
2,6
1,8
3,1
3,7
2,0
2,1
2,1
2,4
2,7
1,7
2,0
2,5
2,0
3,5
2,3
2,7
2,2
3,2
3,0
2,6
3,3

ER
(%)
-19,7
20,7
-1,0
8,3
-5,6
-19,0
6,6
-16,8
10,0
5,8
-5,2
-8,9
10,5
2,4
3,2
24,3
29,8
27,7
7,7
7,4
-14,0
4,9
17,8
18,3
-2,6
7,6
-3,3
-15,4
7,5
-7,4
2,7
-18,1
1,9

VR
(%)
2,5
4,2
2,3
2,2
2,6
2,1
2,4
2,8
3,2
3,3
4,1
4,1
3,7
2,9
3,6
3,3
3,3
3,3
3,4
3,6
3,2
3,0
2,8
3,2
2,5
3,6
3,0
2,5
4,0
3,7
3,0

VP
(%)
2,8
3,9
2,3
2,6
2,8
2,2
2,7
2,9
3,4
3,6
3,8
3,9
4,0
3,4
3,2
3,1
3,3
2,7
3,6
3,3
3,4
3,4
2,6
2,5
2,5
3,1
2,8
2,5
3,5
3,3
3,3

ER
(%)
11,9
-7,4
2,4
19,2
8,5
6,6
10,3
5,1
4,8
10,0
-5,5
-6,5
6,3
14,6
-9,4
-7,4
1,6
-17,5
4,9
-8,2
5,3
14,7
-6,7
-23,2
-1,3
-14,1
-6,6
-0,2
-12,6
-8,7
10,9

101