Efecto Fuente Carbono

Instituto Politcnico Nacional
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS
POSGRADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA

ADICIN DE SALES DE CALCIO Y/O MAGNESIO
EN LA PRODUCCIN DE NARINGINASA POR MEDIO DE
Aspergillus niger
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestra en Ciencias de los Alimentos

PRESENTA
Q. A. RAQUEL GONZLEZ VZQUEZ

MXICO, D.F. 2009
El trabajo experimental se realiz en el laboratorio de Tecnologa de

alimentos y en el laboratorio de enzimologa del departamento de
Graduados en alimentos de la Escuela. Nacional de Ciencias
Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional.
Fue dirigido por la Dra. Yadira Rivera Espinoza y por la M. en C.

Teresa Cruz y Victoria, con el financiamiento de los proyectos SIP
20070396 y 20080285 ambos titulados: Produccin de naringinasa
mediante la fermentacin de diferentes fuentes de carbono por medio
de hongos filamentosos.
Agradezco a CONACyT, institucin que me apoy econmicamente.

Siendo becaria de enero 2006 a diciembre 2008, con nmero de
registro 217266/206844.
Agradezco al programa de formacin de investigadores PIFI del IPN

ya que me apoy econmicamente. Siendo becaria en los periodos
correspondientes a partir de enero 2006 y hasta diciembre 2008.
INDICE GENERAL
Resumen
Abstrac... 2
Introduccin.. 3-5
II Antecedentes....
6 27
II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos................ 6
II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos..............
6-7
II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.............................. 8
II. 2.Mtodos fisicoqumicos del sabor amargo en los jugos de frutas

ctricas.......................................................................................................... 8-9
II. 3. Mtodo enzimtico para la eliminacin del amargor............................ 10-11
II. 4. Produccin de naringinasa..................................................................
12
II. 4.1. Caractersticas del gnero Aspergillus.............................................
12-13
II. 5. Factores que influyen en la produccin de naringinasa......................
13-14
II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa...................................................
14-15
II. 7. Actividad enzimtica y constantes de Km y Vmx reportadas para la

naringinasa..................................................................................................
15-16
II. 8. Mtodos para determinar la actividad enzimtica de la naringinasa...
17-18
II. 8.1 Modelos grficos para la determinacin de la actividad enzimtica.. 18-19
II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten..........................................................
19-20
II 8.1.1.1 Determinacin de las contantes de MichaelisMenten................
20-22
II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk...........................................................
23
II 8.1.2.1Determinacin de las contantes de Lineweaber-Burk...................
23-24
II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen.............................................................
24-25
II 8.1.3.1. Determinacin de contantes de Eadie-Hofsteen.........................
25-26
II 8.1.4. Modelo de Agustinson....................................................................
26-27
II 8.1.5 Modelo de Wilkinson........................................................................ 27-28
Justificacin...............................................................................................
29
Objetivos..................................................................................................... 30
III. Materiales y mtodos...........................................................................
31-45
III.1 Desarrollo experimental........................................................................
31
III.2 Materias primas....................................................................................
32
III.3 Material de laboratorio y reactivos........................................................
32
III.4 Equipo.................................................................................................
32
III.5 Mtodos................................................................................................
33-39
III.5.1 Evaluacin preliminar de la capacidad productora de naringinasa

de la cepa Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografa en
capa fina......................................................................................................
33-34
III.5.1.1 Determinacin del mejor disolvente que permite la ascendencia

por capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de
naranja en cromatografa en capa fina........................................................
34-36
III.5.2 Recuperacin de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo

inclinado....................................................................................................... 36
III.5.3 Preparacin del inculo de A. niger por medio de turbidimetria........
36-37
III.5.4 Fermentaciones para la produccin de naringinasa por medio de

A. niger utilizando como base un caldo nutritivo.........................................
37-39
III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de

carbono........................................................................................................
39
III.6 Mtodos analticos................................................................................
40-45
III.6.1 Determinacin de protena en el medio de cultivo............................. 40
III.6.1.1 Preparacin del reactivo de Bradford............................................
40
III.6.1.2 Patrn de albmina srica bobina (ASB)........................................ 40-41
III.6.2 Determinacin de la actividad enzimtica de la naringinasa

comercial de Penicillium decumbens........................................................... 41
III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentracin de naringinasa de

Penicillium decumbens en la hidrlisis de naringina...................................
42
III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la

naringina por la naringinasa de Penicillium decumbens.............................. 42-43
III.6.2.3 Curva tipo de naringina................................................................... 43
III.6.2.4 Determinacin de las constantes de Vmx y Km para la

naringinasa de P. decumbens por los mtodos grficos de MichaelisMenten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson..........
43-44
III.6.3 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa producida por

A. niger en muestras de la fermentacin de cada formulacin.................... 44
III.6.4 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa producida por

A. niger del caldo nutritivo que present mayor actividad enzimtica en el
estudio anterior............................................................................................
44-45
III.6.5 Anlisis estadstico para determinar la confiabilidad de los

resultados obtenidos por medio del programa estadstico MINITAB13....... 45
IV. Resultados y discusin.......................................................................
46-84
IV.1 Evaluacin de la capacidad productora de naringinasa de la cepa

Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografa en capa fina..... 46-57
IV.1.1 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de una muestra
de naringina pura en cromatografa en capa fina........................................
46-49
IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la

naringina presente en el jugo de naranja en cromatografa en capa fina.... 49-51
IV.1.3 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de la naringina
pura y la naringina presente en las naranjas en cromatografa en capa
fina...............................................................................................................
51-52
IV.1.4 Evaluacin de la degradacin de la naringina por la naringinasa

producida por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en
naranjas.......................................................................................................
52-57
IV.2 Recuperacin de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo

inclinado....................................................................................................... 58
IV.3 Fermentaciones.................................................................................... 60-61
IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de

carbono........................................................................................................
60
IV.4 Determinacin de protena en el medio de cultivo por el mtodo de

Bradford.......................................................................................................
62-68
IV.5 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa de A. niger en

muestras de cada fermentacin................................................................... 69
IV.6 Estudio de la actividad enzimtica del caldo nutritivo seleccionado....
76-84
V. Conclusiones.........................................................................................
85-86
VI. Bibliografa............................................................................................ 87-97
Anexos........................................................................................................
98-111
Anexo 1. Curva tipo de protena obtenida por el mtodo de Bradford........ 98
Anexo 2. Estudio y determinacin de la actividad enzimtica de la

naringinasa comercial de Penicillium decumbens.......................................
99-102
Anexo 3. Curva tipo de naringina................................................................ 103-104
Anexo 4. Curva tipo de glucosa..................................................................
105
Anexo 5. Determinacin de las constantes de Vmx y Km para la

naringinasa de P. decumbens por los mtodos grficos de MichaelisMenten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson..........
106-111
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elucin de

una muestra de naringina pura en cromatografa en capa fina...................
35
Cuadro 2. Disolventes y proporcin utilizados para determinar el factor

de elucin de la naringina presente en el jugo de naranja..........................
35
Cuadro 3. Disolventes y proporcin utilizados para determinar el factor

de elucin de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de
naranja en una misma placa cromatogrfica...............................................
36
Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo

empleado en cada fermentacin.................................................................. 37
Cuadro 5. Composicin del caldo nutritivo empleado en cada

fermentacin y al cual se le adicion la fuente de carbono y/o las sales
de calcio y magnesio...................................................................................
Cuadro
6.
Caldos
nutritivos
evaluados
en
el
crecimiento
38
del
microorganismo y produccin de naringinasa por A. niger.......................... 39

Cuadro 7. Curva tipo de albumina srica bovina, para la determinacin
de protena en el medio de cultivo por el mtodo de Bradford....................
41
Cuadro 8. Disolventes para eluir la naringina pura (50 mg/1000ml) en

cromatografa en capa fina..........................................................................
46
Cuadro 9. Mximos de produccin de protena en la produccin de

naringinasa por medio de A. niger...............................................................
65
Cuadro 10. Comparativo de los mximos de produccin de protena

significativos (p0.05) en la produccin de naringinasa mediante
diferentes fuentes de carbono por medio de A. niger..................................
67
Cuadro 11. Mximos encontrados de actividad enzimtica en la

produccin de naringinasa por medio de A. niger (No diferencia
significativa).................................................................................................
73
Cuadro 12. Comparativo de los mximos de actividad enzimtica

significativos (p0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes
fuentes de carbono por medio de A. niger................................................... 74
Cuadro 13. Actividad enzimtica de la naringinasa producida por
diferentes
microorganismos
determinada
mediantes
diferentes
sustratos......................................................................................................
78
Cuadro 14. Parmetros calculados para las curvas de MichaelisMenten, lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson para la naringinasa
de A.niger ATCC1015.................................................................................. 81
Cuadro 15. Parmetros de Vmax y Km para las curvas de MichaelisMenten, Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la
naringinasa de A. niger ATCC1015.............................................................
81
Cuadro 16. Constantes de Vmx y Km para la naringinasa producida por

diferentes microorganismos......................................................................... 82
Cuadro 1A. Efecto de la concentracin en la velocidad de hidrlisis de la
naringinasa de P. decumbens.....................................................................
99
Cuadro 2A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la naringina

por la naringinasa e P. decumbens..............................................................
101
Cuadro 3A. Curva tipo de naringina............................................................ 103
Cuadro 4A. Parmetros Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, EadieHofsteen y Agustinson para la naringinasa de P. decumbens....................
106
Cuadro 5A. Parmetros de Vmax y Km para las curvas de MichaelisMenten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson para
la naringinasa de P. decumbens.................................................................. 107
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Hidrlisis de la naringina en prunina, ramnosa y naringenina

por la enzima naringinasa conteniendo actividad de .-L-ramnosidasa y
-D-glucosidasa........................................................................................... 11
Figura 2. Aspergillus niger. Conidiforo......................................................
13
Figura 3. Aspergillus terreus. Conidiforo................................................... 13

Figura 4. Reduccin del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), (color amarillo)
por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico
(color rojo ladrillo)........................................................................................
18
Figura 5. Representacin grfica de la velocidad de reaccin y

constantes de Vmx y Km de Michaelis-Menten............................................
21
Figura 6. Representacin grfica de la doble recproca de la velocidad

de reaccin y constantes de Vmx y Km para Lineweaberburk.................. 24
constantes de Vmx y Km de Eadie-Hofsteen............................................
25

constantes de Vmx y Km de Agustinson....................................................... 27
Figura 9. Diagrama de proceso para la produccin de naringinasa,
protena y determinacin de la actividad enzimtica de naringinasa
producida por A. niger ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de
carbono........................................................................................................
31
Figura 10. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en

capa fina utilizando como disolvente acetona 100%.(Rf=0)........................
47

capa fina utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.62)...................
47

capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54).....
47

capa fina utilizando como disolvente metanol:acetona 90:10 (Rf=0.66).....
48

capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65)....
49
Figura15. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por

capilaridad en cromatografa en capa fina utilizando como disolvente
metanol 100% (Rf=0.645)............................................................................ 50
Figura 16. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por
metanol: acetona 95:5 (Rf=1.67).................................................................
50
Figura17. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por

metanol: acetona 90:10 (Rf=0)....................................................................
50
Figura 18. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por

metanol: acetona 80:20 (Rf=0.8).................................................................
51
Figura 19. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol: acetona

80:20 (Rf=1)................................................................................................. 52
Figura 20. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol 100%
(Rf=0.86)......................................................................................................
52
Figura 21. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona

80:20 (triplicado)..........................................................................................
53
Figura 22. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger, metanol:

acetona 80:20 (triplicado)............................................................................
53

80:20 (triplicado)..........................................................................................
54

54

80:20 (triplicado)..........................................................................................
55

55

80:20 (triplicado)..........................................................................................
56

56

80:20 (triplicado)..........................................................................................
57

57
Figura 31. Cepa Aspergillus niger ATCC 1015 obtenida del cepario del
CINVESTAV................................................................................................. 58
Figura 32. Agar Saboraud........................................................................... 59
Figura 33. Resiembra del microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015.. 59

Figura 34. Crecimiento optimo de la cepa de Aspergillus niger ATCC
1015............................................................................................................. 59
Figura 35. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con
adicin de CacO3 () y melaza con adicin de MgCO3 ()......................... 61
Figura 36. Curvas de comportamiento de la protena en relacin a la
fuente de carbono (A) y sales de Ca2+ y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger
ATCC1015. Tiempo de la fermentacin en das(C)..................................... 63
Figura 37. Curvas de produccin de protena mostrando las relaciones:
fuente de carbono-sales (A) y fuente de carbono-das (B), para
naringina, melaza y ramnosa y (C) la relacin sales-das para
naringina......................................................................................................
64
Figura 38. Curvas de Actividad enzimtica expresada en microgramos

de glucosa producida despus de 24hrs de hidrolisis, en relacin a las
diferentes fuentes de carbono 0.5%, sales de Ca2+ y/o Mg2+ 0.01mM y
das..............................................................................................................
Figura 39. Curvas de actividad enzimtica
mostrando las relaciones
fuente
carbono-das
de
carbono-sales,
fuente
de
69
sales-
das..............................................................................................................
72
Figura 40. (A)Curva de Michaelis Menten para Naringinasa donde Y=

6.683x+0.068;
R2=0.908;
(B)
Curva
de
Lineweaber-Burk
para
Naringinasa; (C) Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de

Eadie-Hofsteen para la naringinasa de A. niger ATCC1015.......................
80
Figura 1A. Curva tipo de protena............................................................... 98
Figura 2A. Efecto de la concentracin de la naringinasa de P.

decumbens en la hidrlisis de la naringina..................................................
100
Figura 3A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la naringina

por la naringinasa de P. decumbens...........................................................
102
Figura 4A. Curva tipo de naringina, Y= 129.22+ 80.535, R2= 0.921..........
104
Figura 5A. Curva tipo de Azcares reductores obtenida por el mtodo

del cido 3,5-dinitro saliclico (DNS)............................................................
105
Figura 6A. Curva de MichaelisMenten para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................
108
Figura 7A. Curva de Lineweaber-Burk para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................
109
Figura 8A. Curva de Eadie-Hofsteen para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................
110
Figura 9A. Curva de Agustinson para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................
111
________________________________________________________ RESUMEN
RESUMEN
El presente trabajo aporta informacin del efecto de la naringina, melaza o
ramnosa, como fuentes de carbono, y las sales de Ca 2+ y/o Mg2+ en la produccin
de naringinasa por medio de Aspegillus niger ATCC1015, el cual es un
microorganismo productor de cido ctrico y no produce toxinas.
Primero se evalu por cromatografa en capa fina la capacidad productora de

naringinasa por la cepa empleada, lo cual permiti conocer que el microorganismo
empleado tuviera presuntivamente la capacidad de producir naringinasa. Para
conocer el efecto de las diferentes fuentes de carbono de inters, se emple un
caldo nutritivo base, adicionado con naringina, ramnosa o melaza, y/o sales de
calcio y magnesio. Las fermentaciones se llevaron a cabo bajo las mismas
condiciones de temperatura y agitacin. Cada 24 horas durante los siete das de la
fermentacin se cuantific el peso del micelio, la produccin de protena y la
actividad enzimtica de la naringinasa producida, adems se determin mediante
diferentes modelos grficos las contantes de Vmx y Km para la naringinasa que
mostr mayor actividad enzimtica. Las constates de Vmx y Km de la naringinasa
obtenida fueron comparadas contra las de la naringinasa comercial de Penicillium
decumbens, la cual tambin se determin en este trabajo. A partir de las
investigaciones realizadas en la presente investigacin se encontr que la melaza
y la adicin de carbonato de calcio favorecieron significativamente el crecimiento
del microorganismo, pero no la produccin de protena y la actividad enzimtica.
Tambin se encontr que para favorecer la produccin proteica se debe emplear
como fuente de carbono a la naringina y se debe adicionar la mezcla de las sales
de calcio y magnesio. Por otra parte, la fuente de carbono que permiti obtener
una mayor actividad enzimtica fue la ramnosa sin adicin de sales. Finalmente,
se encontr que la naringinasa producida bajo las condiciones de este trabajo
presenta la misma actividad especfica que la naringinasa comercial, lo cual la
convierte en una enzima que puede competir con la enzima que se encuentra en
el mercado.
________________________________________________________________ ABSTRAC
ABSTRAC
The current document provides information to the effect of Naringin, Melase or

Rhamnose, as carbon sources, and salts as Ca2+ and Mg2+ in the production of
Naringinase through Aspegillus niger ATCC1015, which is a microorganism
producer of citric acid and produces no toxins.
First was assessed by thin layer chromatography, production capacity of

Naringinase by the strain used, this allowed knowing that the microorganism used
was allegedly capable of producing Naringinase. To study the effect of different
carbon sources of interest, was used a nutrient broth base, added whit
Naringinase, Rhamnose or Melase and/or calcium and magenisium salts.
Fermentations were carried out under the same conditions of temperature and
agitation. Every 24 hours during the seven days of fermentation the mycelium
weight was quantified, protein production and enzyme activity of produced
Naringinase, also was determined by different graphic models the constants of
Vmax and Km for Naringinase that showed higher enzyme activity. Constants
Vmax and Km from Naringinase obtained were compared against the commercial
Naringinase of Penicillium decumbens, wich is also found in this document. Based
on research conducted in this document found that Melase and the addition of
calcium carbonate, significantly favored the growth of microorganism, but not the
production of protein and enzyme activity. Was also found that to promote the
production of protein must be used as a carbon source the Naringin and addition of
Calcium and Magnesium salts mixture. Furthermore, the carbon source that
yielded a higher enzyme activity was the Rhamnose no added salts. Finally we
found that the Naringinase produced under the terms of this study, shows the
same specific activity that commercial Naringinase, which makes an enzyme that
can compete whit the commercial enzyme.
___________________________________________________________ INTRODUCCIN
I. INTRODUCCIN
La implementacin de enzimas, con aplicacin en la industria de los alimentos, ha

aumentado en aos recientes. Un ejemplo de esto son las glucanasas, utilizadas
en la panificacin, la extraccin y clarificacin de jugos (Villena y Gutirrez, 2003)
o las enzimas quimosina y pepsina, que forman el cuajo para la fabricacin de
quesos, solo por mencionar algunas (Montes y Magaa, 2002; Manzanares y col,
1997).
La aplicacin de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas de

ndole econmica o tecnolgica. La gran especificidad de accin que tienen las
enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Adems, las
enzimas pueden inactivarse fcilmente cuando se considere que ya han realizado
su misin, quedando entonces asimiladas el resto de las protenas presentes en el
alimento (Montes y Magaa, 2002).
La naringinasa es una enzima que est siendo utilizada en la industria de los

alimentos con una aplicacin importante en el proceso de desamargor en los jugos
de uva y otras frutas ctricas. La naringinasa es un complejo enzimtico que
presenta
actividad
-L-ramnosidasa
(EC.3.2.1.40)
-D-
glucosidasa
(EC.3.2.1.21) capaz de hidrolizar a la naringina, el cual es el mayor y principal

componente del amargor en jugos de uva y varias frutas ctricas (Thomas y col,
1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col, 1978). La naringina es
abundante en frutas inmaduras y su concentracin decrece en frutas maduras. Su
presencia ha sido la mayor limitacin en la aceptacin comercial de los jugos de
frutas. La hidrlisis de la naringina produce naringenina la cual es inspida, lo cual
ayuda a la mejor aceptacin de los jugos por la disminucin de su amargor (Yusof
y col, 1990).
___________________________________________________________ INTRODUCCIN
La informacin sobre la -L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y su
produccin ha sido asociada con plantas (Hall, 1938; Thomas y col, 1958, Ting,
1958; Kaji y Ichimi, 1973), gastrpodos marinos (Kurosawa y col, 1973), y
microorganismos (Manzanares y col, 199, Young y col, 1989; Shanmugam y
Yadav, 1995). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en
naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de
Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa
extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un
hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de inters para la industria de
alimentos (Gallego y col, 1996).
Existe poca informacin disponible en cuanto a la produccin de la naringinasa y

mucha informacin est guardada como secreto industrial o est patentada (Ito y
Takiguchi, 1970; Fukumoto y Okada, 1973; Wulbrandt y col, 1995). Algunos
reportes cientficos ofrecen una informacin muy ambigua acerca de las
condiciones de produccin de la naringinasa. Se ha reportado que la produccin
de naringinasa mediante hongos filamentosos esta favorecida por los iones
metlicos como Ca2+ y Mg2+. Sin embargo, se ha encontrado que dichos iones no
son indispensables (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001). Tambin se ha
reportado que la enzima es reprimida por la presencia de glucosa (Bram y
Salomons, 1965) lactato, citrato, sacarosa, fructosa y almidn (Munish y Uttam,
2000). Por otra parte se ha encontrado que la produccin de la enzima disminuye
abajo de pH 4 y es estimulada en presencia de los sustratos naringina, ramnosa,
melaza (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001) y licor de maz (Munish y Uttam,
2000).
La naringinasa de origen microbiano que existen actualmente en el mercado

presenta una eficacia muy deficiente de la hidrlisis de la naringina, por lo que es
necesario llevar a cabo estudios para conocer las condiciones de produccin y
encontrar una enzima naringinasa que presente una mejor capacidad de hidrlisis.
___________________________________________________________ INTRODUCCIN
Por ello en este estudio se utilizarn diferentes fuentes de carbono y iones
metlicos para conocer su efecto en la produccin de la enzima naringinasa y en
su capacidad de hidrlisis. Asimismo, se llevar a cabo una comparacin de la
actividad de la naringinasa producida por Aspergillus niger (ATCC 1015), la cual
es una cepa principalmente productora de cido ctrico, y la naringinasa comercial
pura (producida por Penicillum decumbens) para conocer si la enzima producida
por A. niger presenta mayor capacidad de hidrlisis que la enzima comercial.
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
II. ANTECEDENTES
II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos.
La aplicacin de enzimas provenientes de especies de hongos filamentosos es

una constante en el desarrollo de alimentos. Muchos de ellos degradan polmeros
vegetales, que son los constituyentes de la pared celular (celulosa y hemicelulosa)
y tienen mltiples aplicaciones industriales como la mejora del filtrado de zumos, el
aumento de caractersticas organolpticas de ciertas bebidas alcohlicas o la
extraccin de compuestos de inters nutricional desde residuos agroalimentarios
como es el caso de residuos de pescados para la obtencin de proteasas,
coagulasas y peptonas de uso microbiolgico (Fernandez, 2004). En condiciones
naturales la sntesis de estas enzimas se produce como respuesta a la presencia
de pequeas cantidades de sustancias inductoras que generalmente son
monosacridos producidos por la degradacin de los polmeros asimilables. Estos
azcares entran dentro de la clula fngica a travs de transportadores, pero si en
el medio hay otros azcares monomricos con alto valor nutricional (por ejemplo
glucosa) el microorganismo consume antes esta fuente de carbono que ejerce una
represin de la sntesis de las enzimas extracelulares (Lehninger, 1990).
II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos.
Algunas enzimas pueden necesitarse en la misma cantidad durante todas las

condiciones de crecimiento y se denominan constitutivas. Las enzimas
constitutivas son generalmente enzimas celulares clave requeridas para el
crecimiento bajo todas las condiciones nutricionales y, por tanto, se sintetizan
continuamente en la clula en crecimiento. Por otra parte, las enzimas inducibles
son aquellas que se sintetizan solo cuando el sustrato que requiere se encuentra
6
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
presente en el medio de cultivo como nica fuente de carbono y dicha sustancia
se conoce como inductor (Madigan y col, 2004).
Para movilizar los recursos de las fuentes complejas y que los microorganismos
puedan tener acceso a energa y nutrientes, estos producen enzimas que son
inducidas de acuerdo con los sustratos que estn presentes. Por ejemplo, la
adicin de celulosa estimula la actividad de celulasa en suelos hmedos. (Shackle
y col, 2000) Lo que significa que la produccin enzimtica puede ser una
respuesta inducible a la presencia de sustratos complejos. Las enzimas
producidas bajo estas condiciones actan catalizando la descomposicin de los
sustratos
complejos
en
compuestos
asimilables.
Sin
embargo,
los
microorganismos solo pueden producir estas enzimas a expensas del crecimiento

y metabolismo si la disponibilidad de nutrientes fcilmente asimilables es escasa
(Asmar y col., 1994; Sinsabaugh y Moorhead, 1994; Chrst, 1991; Pelletier y
Sygush, 1990; Koch, 1985; Harder y Dijkhuizen, 1983).
Sin embargo, aunque existen teoras razonables para explicar la produccin

enzimtica, la relacin entre la produccin enzimtica y la adquisicin de
nutrientes no han sido resueltas (Steven y Vitousek, 2005). Basada en la teora
econmica de los microorganismos (Koch, 1985), la produccin enzimtica puede
ser inducida slo cuando esta permita aumentar el grado de adquisicin de
recursos disponibles en el medio de crecimiento. Pero este efecto puede ser dbil,
si: los sustratos nos estn disponibles, los microorganismos no regularan
fuertemente la produccin enzimtica, o los costos enzimticos son muy bajos
para permitir una continua produccin. Es importante remarcar que la relacin
entre la concentracin enzimtica y la degradacin del sustrato es pobremente
comprendida para muchos compuestos de carbono. (Steven y Vitousek, 2005).
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.
Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales
slo se sintetizan en pequeas cantidades y estn implicadas en procesos
celulares. No obstante, algunas enzimas se producen en cantidades mucho ms
grandes por algunos organismos y, en vez de quedarse en el interior de la clula,
se excretan al medio de cultivo. Las enzimas extracelulares son capaces de digerir
polmeros insolubles como la celulosa, las protenas y el almidn; posteriormente,
los productos de digestin son transportados al interior de las clulas donde se
utilizan como nutrientes para el crecimiento (Madigan y col, 2004). De acuerdo con
Steven y Vitousek, (2005), las enzimas extracelulares son el principal medio por el
cual microorganismos como los del suelo pueden tener acceso a energa y
nutrientes, a travs de degradar compuestos orgnicos complejos en molculas
pequeas que pueden ser asimilables (Asmar y col, 1994; Sinsabaugh y
Moorhead, 1994).
II. 2.Mtodos fisicoqumicos del sabor amargo en los jugos de frutas ctricas.
La naringina (4,5,7-trihidroxi-flavonona 7-ramnoglucosido), flavonoide de los
ctricos, es el mayor y principal componente del amargor en jugos de uva y varias
frutas ctricas (Thomas y col, 1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col,
1978). Es abundante en frutas inmaduras y su concentracin decrece en frutas
maduras. Su presencia ha sido la mayor limitacin en la aceptacin comercial de
los jugos de frutas. La concentracin de naringina puede ser reducido por el
proceso tecnolgico conocido como adsorcin del amargor (Griffith, 1969; Jonson
y Chandler, 1988) ya sea por tratamientos qumicos o fsicos
(Kimball, 1987;
Pritchet, 1957; Kimball, 1991; Puri, 1984; Shaw y Wilson, 1983; Wagner y col,
1991). Sin embargo, estas tecnologas tienen las siguientes limitaciones (Munish y
Uttam, 2000):
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
(1) EL jugo debe ser previamente desgrasado, desencerado, despulpado y luego
remezclado con el jugo al que se le elimin el amargor y clarificado.
(2) Las columnas de adsorcin empleadas son regeneradas usualmente con

solucin alcalina diluida y esto puede afectar las propiedades organolpticas y
finalmente la calidad del jugo.
(3) Los tratamientos empleados pueden alterar la composicin del jugo a travs de
reacciones qumicas o remocin de nutrientes, sabor, color, etc.
(4) Los tratamientos no son especficos, son intrnsecamente ineficientes, y ellos

introducen en cada etapa variaciones por no monitorizar los cambios.
(5) Los mtodos de extraccin y terminado afectan el rendimiento, calidad, y

caractersticas de los jugos de ctricos producidos.
Otro mtodo aplicado en la eliminacin del sabor amargo en los jugos es la

hidrlisis acida de la naringina. Sin embargo, este mtodo produce no solo
ramnosa, glucosa y naringenina sino tambin aglicones (terpenol, terpeno-diol, 2fenil etanol o bencilalcohol) los cuales tambin confieren un sabor amargo (Gunata
y col, 1985), por lo tanto, no es un proceso comercialmente viable. Similarmente
bajo condiciones selectas de pH y temperatura, el carbn activado puede remover
completamente la naringina de una solucin; sin embargo, de manera simultnea
se remueven algunos de los componentes deseables del sabor (Munish y Uttam,
2000).
Coghlan, en el 1997, describi un proceso cromatogrfico de flujo radial para la

eliminacin del amargor de los jugos de frutas. En comparacin con la
cromatografa convencional, el sistema de flujo radial es ms rpido y operable a
baja presin (Chisti, 1999). No obstante, el uso de una resina cromatogrfica es un
proceso patentado (Coghlan, 1997).
9
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
II. 3. Mtodo enzimtico para la eliminacin del amargor.
La reduccin del amargor como resultado de un proceso enzimtico, controla la

calidad y mejora el valor comercial del jugo de uva y el de toronja como resultado
del mantenimiento de las propiedades saludables e incrementa la aceptacin por
el consumidor (Gallego y col, 2001) y precisamente el uso de enzimas para este
proceso est incrementndose rpidamente ya que disminuye la contaminacin
durante el proceso (Magindag, 1989).
El componente amargo en los jugos puede ser eliminado por la naringinasa

[obteniendo ambas actividades -L-ramnosidasa (EC.3.2.1.40) y -D-glucosidasa
(EC.3.2.1.21)] que hidroliza a la naringina (Yusof y col, 1990) en la inspida
naringenina (C15H12O5), (4,5,7'-trihidrxiflavonona) (Vila Real y col, 2006).
La naringinasa puede hidrolizar a la naringina por su actividad de -L-ramnosidasa
y -glucosidasa en dos pasos. En primer lugar, el sustrato naringina es hidrolizado
por la ramnosidasa para producir prunina. En segundo lugar la prunina es
convertida al flavonoide naringenina por medio de la -glucosidasa (Figura 1)
(Chandler y Nicol, 1975; Habelt y Pittner, 1983).
10
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
Figura 1. Hidrlisis de la naringina en prunina, ramnosa y naringenina por la

enzima naringinasa conteniendo actividad de -L-ramnosidasa y -D-glucosidasa.
(Vila Real y col, 2006)
El proceso de eliminacin del amargor va enzimtica de los jugos de frutas es

limitado debido a los siguientes factores
(1) El uso de enzimas es caro para los procesos en que se emplea un alto
volumen de jugo.
(2) La limonina acta sinergistamente con la naringina incrementando el amargor,

y el contenido de limonina no es eliminado por la naringinasa.
(3) La disponibilidad de la tecnologa de resinas de intercambio inico neutral para

el proceso de eliminacin del amargor y desacidificacin en jugos de uva; y
(4) La poca eficiencia de las preparaciones de naringinasa para llevar a cabo la

hidrlisis completa de la naringina (Munishy Uttam, 2000).
11
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
II. 4. Produccin de naringinasa.
La informacin sobre la -L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y est
relacionada con las semillas de Fagopyrum esculentum (Bourbouze y col, 1976),
las semillas de apio (Hall, 1938), las hojas de las uvas (Hall, 1938, Thomas y col,
1958, Ting, 1958), el hgado del gastrpodo marino Turbo cornutus (Kurosawa y
col, 1973), la planta patgena Corticium rolfssi (Kaji y Ichimi, 1973), el hongo
Aspergillus niger ( Manzanares y col, 1997) y Penicillium decubens ( Young y col,
1989), Cochiobolus miyabeanus (Ito y Takiguchi, 1970), Rhizotonia solana (Ito y
Takiguchi, 1970), Phanopsis citri (Ito y Takiguchi, 1970), Rhizopus nigricans
(Shanmugam y Yadav, 1995) y la preparacin comercial de Naringinasa (Roitner
y col, 1984b). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en
naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de
Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa
extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un
hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de inters para la industria de
alimentos (Gallego y col, 1996). Por lo que se ha propuesto que el proceso de
eliminacin del amargor puede ser ms rentable si la produccin industrial de la
naringinasa es a travs del uso de microorganismos (Munish y Uttam, 2000). De
tal manera que
II. 4.1. Caractersticas del gnero Aspergillus.
El gnero Aspergillus fue descrito por primera vez por P. A. Micheli (1729)
(Madigan y col, 2004), que lo denomin con este nombre por su parecido con un
"aspergillum" (instrumento religioso utilizado para dispersar el agua bendita).
Las especies del gnero Aspergillus se encuentran ampliamente distribuidas en la

naturaleza pudindose aislar de una gran variedad de substratos. Gracias a la
facilidad de dispersin de sus conidios y a su pequeo tamao, stos pueden
12
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
permanecer en suspensin en el ambiente durante un largo periodo, por lo que el
hombre se encuentra expuesto constantemente a su inhalacin.
El Aspergillus es un hongo filamentoso del grupo Deuteromycetes u Hongos

imperfectos, su aspecto microscpico es tpico y se caracteriza por unas
estructuras esporferas o reproductoras llamadas cabezas conidiales (Fig.2 y 3).
Estas cabezas estn compuestas por una vescula rodeada por una corona de
filides en forma de botella, en cuyo extremo se forman cadenetas de esporas.
Se conocen unas 900 especies del gnero Aspergillus. Rapper y Fennell los
clasifican en 18 grupos, basndose en su aspecto macroscpico y en las
caractersticas morfolgicas de los conidiforos y filides.
Figura 2. Aspergillus niger.

Conidiforo. (Abarca, 2000)
Figura 3. Aspergillus terreus.

Conidiforo. (Abarca 2000)
II. 5. Factores que influyen en la produccin de naringinasa.
En cuanto a la produccin de la naringinasa tanto para A. niger, A. terreus y otras

especies de este gnero los iones metlicos como Ca2+, Mg2+ favorecen la
13
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
produccin de dicha enzima, sin embargo, no son indispensables, (Munish y col,
2005; Gallego y col, 2001) tambin dicha enzima es reprimida por la presencia de
glucosa (Bram y Salomons, 1965), lactato, citrato, sacarosa , fructosa y almidn
(Munish y Uttam, 2000) as como tambin por Cd2+, Cu2+, Co2+, Fe2+,Hg2+, Mn2+,
Ni2+ tomando en cuenta que adems Mn2+ y Fe2 inhiben el crecimiento del hongo.
Por otra parte la produccin de la enzima disminuye abajo de pH 4 y es estimulada
en presencia de los sustratos naringina, ramnosa, melaza (Munish y col, 2005;
Gallego y col, 2001) y licor de maz (Munish y Uttam, 2000). Es importante resaltar
que la produccin de la naringinasa es dependiente del inductor. Tambin se ha
reportado que la adicin continua de pequeas cantidades de naringina en un
cultivo por lote alimentado en un fermentador podra estimular una mayor
produccin de la naringinasa que cuando se adiciona una alta cantidad de sustrato
al inicio de la fermentacin (cultivo por lotes) (Bram y Salomons, 1965; Gallego y
col, 2001).
II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa.
La naringinasa ha sido empleada para la eliminacin de cristales de hesperidn de

los jugos de naranja (Tereda y col, 1995), es utilizada en los procesos de jugo de
uva y naranja para el mejoramiento de lavado de la pulpa, incremento de la
recuperacin y el rendimiento de aceites esenciales, para el proceso de
clarificacin (Grassin y Fauquembergue, 1996), el mejoramiento del aroma del
vino (Caldini y col, 1994) y para preparaciones enzimticas de productos
hidrolizados de glucsidos naturales (Roitnel y col, 1984b; Ellenrieder y col, 1998)
de
importancia
biotecnolgica
como:
preparacin
de
prunita
(4-5,7
trihidroxiflavonona-7-glucosido) flavonoide utilizado como agente endulzante para

diabticos (Roitner y col, 1984), y preparacin de naringenina (Vila Real y col,
2006). Recientemente, el inters en la enzima -L-ramnosidasa ha sido enfocado
principalmente en su accin dirigida hacia los terpenilglicosidos para el desarrollo
del aroma en los jugos de uva y bebidas derivadas (Williams y col, 1982).
14
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
Por otra parte, la naringinasa tambin tiene aplicaciones en la industria
farmacutica como son: la preparacin del antibitico Cloropolysporin C (Sankyo,
1988), aplicacin en transformaciones esteroidales (Munish y Uttam, 2000), en el
estudio de la estructura de plantas y polisacridos de bacterias (Michon, 1987),
preparacin de ramnosa como intermediario en sntesis orgnicas, utilizado como
farmacutico y agente protector de plantas (Daniela y col, 1990) y preparacin de
prunina, flavonoide con actividad antiinflamatoria (Roitner y col, 1984b).
II. 7. Actividad enzimtica y constantes de Km y Vmx reportadas para la

naringinasa.
Es importante tomar en cuenta que el grado de actividad de -L-ramnosidasa y D-glucosidasa varia con la concentracin de protena y el pH (Munish y Uttam,
2000). Adems, cada microorganismo puede producir diferentes formas activas de
una enzima y estas se producen en diferente cantidad dependiendo de la fuente
de carbono.
La actividad que presenta la -ramnosidasa de la naringinasa de A. niger
producida utilizando naringina como fuente de carbono, encontrada por
Manzanares y col, (1997) es de 0.059 mol de ramnosa/min y presenta una Vmx=
20.6 U/mg y una Km= 2.9 mM. Esta actividad es dependiente del pH en el intervalo
de 3 a 5 y presenta su mximo de actividad a un pH=4.5 a 30C en regulador
MacIIvaine, utilizando como sustrato p-nitrofenol. Mutter y col, (1994) determinaron
una Vmx= 13.0 U/mg para la -L-ramnosidasa de A. aculeatus; Por otro lado
cuando Munish y col en el 2005, utilizaron ramnosa como fuente de carbono y
reportaron una actividad de 0.399 IU/ml (IU=cantidad de enzima necesaria para
liberar 1mol naringina/min, utilizando regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4,
T=30C) para la naringinasa de A. niger MTCC 1344. Cuando se utiliz licor de
maz y extracto de malta Bram y Solomons, (1965) encontraron una actividad de
94 U/ml y de 90U/ml para las naringinasas de de la cepa NRRL 72-4 (U=cantidad
de enzima necesaria para hidrolizar 1mol naringina/min, utilizando regulador de
15
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
citratos sin molaridad especifica, pH=4, T=45C). Por su parte, Caldini y col,
(1994) determinaron una Km= 2.32 mM y Kurosawa y col, (1973) determinaron una
Km= 2.65 mM para la -L- ramnosidasa de A. niger utilizando p-nitrofenol, el cual
es un sustrato inespecfico.
Elinbaum y col, (2002) reportaron una actividad de 1.7 U/ml de solucin nutritiva
(U=cantidad de enzima necesaria para liberar 1mol p-nitrofenol/min, en regulador
de cido. succnico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, T= 30C, para la -Lramnosidasa de A. terreus, producida utilizando bagazo de caa de azcar como
fuente de carbono. Por otro lado Gallego y col, (2001) encontraron una actividad
de 91U/mg protena para la misma enzima producida por A. terreus (U= cantidad
de enzima necesaria para liberar 1mol p-nitrofenol/min), determinada en
regulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, T=50C, utilizando ramnosa como fuente
de carbono y una Vmx= 84 mol/mgmin y una Km= 0.17 mM (Michaelis)
En otras especies como Penicillium. decumbens se ha informado una actividad
para la naringinasa de 0.465U/g slido determinada utilizando regulador de
acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, T=40C; dicha naringinasa fue obtenida por
fermentacin solida y presenta una Km= 1.22 mM y Vmx= 0.45 mol/min
(Lineweaberburk) (Glten y col, 2006). Por su parte, Romero y col, (1985)
determinaron una Km= 1.52 mM y una Vmx= 10.7 U /mg para la -L-ramnosidasa
de Penicillium sp. Ting (1979) inform que la naringina presente en jugo de toronja
puede ser hidrolizada a partir de una preparacin comercial de pectinasas,
mediante la cual se hidroliza la naringina en naringenina in vitro, cuando esta se
emplea en una concentracin del 0.02% en regulador de citratos 0.005 mM a pH 4
y se somete a un tiempo de hidrlisis de 2hrs a 50C, utilizando como patrn una
solucin de naringina (Eastman Kodak ) en concentracin de 50 mg/ 100ml y
obteniendo un 68% de hidrlisis; la hidrlisis fue determinada por el mtodo de
Davis (1947).
16
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
II. 8. Mtodos para determinar la actividad enzimtica de la naringinasa.
Para la determinacin de la actividad enzimtica de la naringinasa hay pocos

procedimientos
disponibles.
Estos
procedimientos
estn
basados
en
la
determinacin de flavonoides por medio de espectrofotometra de acuerdo al

mtodo de Davis (1947) mediante el uso de dietilen glicol (Munish y Uttam, 2000).
La naringina reacciona con el reactivo para producir un color amarillo el cual es
medido a una longitud de onda de 420 nm. Tambin se puede realizar esta
determinacin mediante HPLC (Horuichi y col, 1985). El mtodo de HPLC
determina la actividad de la enzima mediante la medida de los cambios en la
concentracin de -ramnosa. Romero y col, (1985) usaron p-nitrofenil-Lramnopiranosido para medir la actividad de la L-ramnosidasa de la naringinasa,
siguiendo colorimtricamente la aparicin de p-nitrofenol (Munish y Uttam, 2000).
El ensayo de Davis es un mtodo colorimtrico en el que se emplea dietilen glicol

alcalino para la determinacin de ramnoglicosidos de
naringina y otros
flavonoides que pueden estar presentes particularmente en la toronja y otras frutas

ctricas. A pesar de que el mtodo de Davis no es especifico para la naringina, es
un mtodo practico y rpido que es particularmente aplicado para la determinacin
de naringina en jugo y en el flavedo de la toronja, para determinar la distribucin
de falvononas en varios tejidos de frutas ctricas, para determinar la recuperacin
de naringina pura adicionada a varias mezclas, para el seguimiento de la hidrlisis
de la naringina y para la determinacin de la hesperidina en otras frutas ctricas.
La desventaja del mtodo de Davis consiste en que si se encuentran compuestos
como el citral, furfural, geraniol y cido ascrbico producen color cuando se
combinan con el dietilen glicol alcalino y muchas de las sustancias provenientes
de plantas dan colores amarillos cuando se mezclan con un lcali, lo cual ocasiona
interferencias (Davis, 1947).
Chaplin y Kennedy, (1968) informaron que, se puede utilizar un ensayo indirecto

para la determinacin de la actividad de cualquier enzima que como producto de la
17
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
hidrolisis de su sustrato genere algn azcar reductor como por ejemplo la glucosa
o
la
fructosa.
Dicho
ensayo
indirecto
consiste
en
una
determinacin
espectrofotomtrica, tras la conversin del azcar reductor producido en un

derivado coloreado, mediante el mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), el
cual se basa en la reduccin del DNS (color amarillo) por la glucosa u otro azcar
reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (color rojo ladrillo) (Figura 4), cuya
presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570
nm. La velocidad de la reaccin se determina analizando la cantidad de azcares
reductores formados por unidad de tiempo y la actividad enzimtica se expresa
como actividad especfica.
HO
HO
CHO
OH
OH
OH
O
cido 3-5-dinitrosaliclico
(amarillo)
OH
OH
OH
OH
CH2OH
D-glucosa
COOH
OH
+
N
OH
OH
NH2
O
cido 3-amino-5-nitrosaliclico
CH2OH
cido D-glucnico
(rojo)
Figura 4. Reduccin del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), (color amarillo) por la

glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (color rojo ladrillo)
(Chaplin y Kennedy, 1968).
II. 8.1 Modelos grficos para la determinacin de la actividad enzimtica.
Existen diferentes modelos grficos para determinar la actividad enzimtica como

son el modelo de Michael-Menten, el modelo de la doble reciproca de LineweaberBurk, el modelo de Eadie-Hofsteen, el modelo de Agustinson y el modelo
estadstico de Wilkinson; estos modelos permiten seguir el curso de los
mecanismos catalticos de las enzimas a travs de determinaciones cinticas de
18
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
las reacciones catalizadas enzimticamente, que se expresan mediante dichos
modelos grficos (Madigan y col, 2004).
II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten.

Leonor Michaelis y Maude Menten desarrollaron en 1913 una teora general
acerca de la accin y cintica de las enzimas. Esta teora, que es fundamental
para el anlisis cuantitativo de todos los aspectos de la cintica de las enzimas y
de la inhibicin, se ha desarrollado plenamente para el caso de una reaccin en la
que slo hay un sustrato. Dicha teora es aplicable cuando la concentracin del
sustrato es mayor que la concentracin de la enzima, y cuando las condiciones
son de estado estacionario, o sea que la concentracin del complejo enzimasustrato es constante (Voet y Voet, 2006; Madigan y col, 2004; Lehninger, 1990).
La teora de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer

lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES (Reaccin 1); a
continuacin este ltimo se escinde en una segunda etapa para formar una
enzima libre y un producto P (Reaccin 2) (Madigan y col, 2004):
K+1
E+S
ES
(1)
E+P
(2)
K-1
K+2
ES
K-2
19
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
Las Reacciones 1 y 2 son reversibles; las constantes de velocidad para las
reacciones directa e inversa poseen un subndice positivo y otro negativo,
respectivamente (Lehninger, 1990).
II 8.1.1.1 Determinacin de las contantes de MichaelisMenten.
Michaelis-Menten dedujeron la ecuacin de la velocidad para una reaccin de un

solo sustrato catalizada enzimticamente (Ecuacin 1); esta ecuacin expresa la
relacin matemtica entre la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una
enzima (V0), la concentracin del sustrato [S] y ciertas caractersticas de la
enzima. A dems esta ecuacin relaciona la velocidad inicial, la velocidad mxima
(Vmx) y la concentracin inicial del sustrato a travs de la constante de MichaelisMenten (Km) que expresa la afinidad de la enzima por el sustrato. En el trmino
Vmx se encuentra contenida la concentracin de la enzima (Lehninger, 1990).
V0= Vmx [S]

Km + [S]
Ecuacin 1.Ecuacin de Michaelis-Menten de la velocidad de reaccin

(Lehninger, 1990).
De la ecuacin de Michaelis-Menten se deriva una relacin numrica importante

en el caso especial en que la velocidad inicial de la reaccin sea exactamente la
mitad de la velocidad mxima y a partir de la cual se puede calcular la velocidad
mxima de la reaccin (Ecuacin 2) (Figura 5).
20
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
V0 = Vmx
Ecuacin 2. Relacin numrica entre la velocidad de reaccin y la velocidad

mxima, derivada de la ecuacin de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).
Figura 5. Representacin grfica de la velocidad de reaccin y constantes de Vmx

y Km de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).
A concentraciones de sustrato muy bajas la velocidad inicial (V 0) es casi

proporcional a la concentracin del sustrato [S]. A concentraciones de sustrato
muy elevadas la velocidad de la reaccin se aproxima asintticamente a la V mx
(Lehninger, 1990).
Al sustituir la ecuacin 2 en la ecuacin 1 y dividir por Vmx se obtiene la Ecuacin

3, mediante la cual se puede calcular la constante de Michaelis-Menten Km. Por
tanto, la contante de Michnaelis-Menten Km es igual a la concentracin de sustrato
en la que la velocidad inicial de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima
(Figura 2).
21
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
Km= [S]
Ecuacin 3.Ecuacin de la constante de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).
Las dimensiones de Km para una reaccin de un solo sustrato son moles por litro y
la constante es independiente de la concentracin de la enzima. Puede obtenerse
con facilidad una aproximacin al valor de Km a partir de una serie de
experimentos en los que la velocidad inicial de la reaccin se mide a diferentes
concentraciones iniciales de sustrato con una concentracin de enzima constante.
El valor aproximado de Km se obtiene grficamente al representar la velocidad
inicial frente a la concentracin inicial del sustrato (Figura 5); se obtiene una
hiprbola rectangular. La Km expresa la afinidad del complejo enzima-sustrato
(ES). Valores bajos indican que el complejo ES est unido muy fuertemente y
raramente se disocia. Por tanto se obtendr una Km segn el sustrato especfico
en que acte cada enzima y las condiciones de reaccin en que se realice las
mediciones (Lehninger, 1990).
La grfica de velocidad de Michaelis-Menten mostrada anteriormente (Figura 5) no

es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va
curvando a medida que aumenta la concentracin de sustrato. Antes de la llegada
de los mtodos, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla,
poda llegar a ser realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmx en las
grficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus
esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten,
dando como resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de EadieHofstee.
22
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk.
La
ecuacin
de
Michaelis-Menten
(Ecuacin
1)
puede
transformarse
algebraicamente en otras formas que son ms tiles para la expresin de los

datos experimentales. Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles
recprocos de ambos miembros de la ecuacin de Michaelis- Menten (Ecuacin 4)
1 = Km + [S]
V0
Vmx [S]
Ecuacin 4.Ecuacin de la doble reciproca de la ecuacin de Michaelis-Menten

de la velocidad de reaccin (Lehninger, 1990).
Redondeando y reduciendo la Ecuacin 4 se obtiene la ecuacin de LineweaverBurk (Ecuacin 5).
1 =
V0
Km
1_
Vmx
[S]
1 _
Vmx
Ecuacin 5.Ecuacin de Lineweaver-Burk de la velocidad de reaccin

(Lehninger, 1990).
II 8.1.2.1Determinacin de las contantes de Lineweaber-Burk.
La representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar la Km y Vmx; el

punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmx, y el
de abscisas es el valor de -1/Km (Figura 6). Tal representacin doble-recproca
tiene la ventaja de que permite una determinacin mucho ms exacta del valor de
Vmx ya que la representacin sencilla de V0 frente a [S] en la curva de Michaelis-
23
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
Menten slo se obtiene su valor aproximado puesto que es un valor lmite a una
concentracin del sustrato infinita.
Figura 6. Representacin grfica de la doble recproca de la velocidad de reaccin

y constantes de Vmx y Km para Lineweaberburk (Lehninger, 1990).
El diagrama de Lineweaver-Burk (Figura 6) se emplea como herramienta grfica

para calcular los parmetros cinticos de una enzima, a dems puede
proporcionar tambin informacin valiosa acerca de la inhibicin enzimtica.
II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen.
Otra transformacin til de la ecuacin de Michaelis-Menten se obtiene

multiplicando ambos miembros de la ecuacin de lineweaber-Burk (Ecuacin 5)
por Vmx y reordenndola se obtiene la ecuacin de Eadie-Hofsteen.
24
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
V0 = -Km V0 + Vmx
[S]
Ecuacin 6.Ecuacin de Eadie-Hofsteen de la velocidad de reaccin

(Lehninger, 1990).
II 8.1.3.1. Determinacin de contantes de Eadie-Hofsteen.
La representacin de V0 frente a V0/ [S] se conoce como la representacin de

Eadie-Hofsteen (Figura 7). Donde V0 representa la velocidad de la reaccin, Km es
la constante de Michaelis-Menten, [S] es la concentracin del sustrato y Vmx, es el
mximo de la velocidad de la reaccin.
Figura 7. Representacin grfica de la velocidad de reaccin y constantes de

Vmx y Km de Eadie-Hofsteen (Lehninger, 1990).
El diagrama Eadie-Hofstee permite visualizar rpidamente los parmetros

cinticos importantes como Km y Vmx a la vez que est menos afectada por el
margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el
mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentracin del sustrato
25
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
o de la velocidad de reaccin. Una de las consecuencias de la aproximacin de
Eadie-Hofstee es que tanto la variable en la ordenada como en la abscisa no son
independientes, sino que dependen de la velocidad de la reaccin. De ste modo,
cualquier error experimental se encuentra presente en ambos ejes (Lehninger,
1990).
II 8.1.4. Modelo de Agustinson.
La representacin de [S]/V0 frente a [S] (Figura 8) se conoce como la

representacin de Agustinson (Figura 6). Donde V0 representa la velocidad de la
reaccin, Km es la constante de Michaelis-Menten, [S] es la concentracin del
sustrato y Vmx, es el mximo de la velocidad de la reaccin. La ecuacin 7
muestra la expresin matemtica empleada en este modelo para la determinacin
de las constantes cinticas de Vmx y Km.
[S] = 1 [S] + Km
V
Vmx
Vmx
Ecuacin 7.Ecuacin de Agustinson de la velocidad de reaccin

(Lehninger, 1990).
26
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
Figura 8. Representacin grfica de la velocidad de reaccin y constantes de Vmx

y Km de Agustinson (Lehninger, 1990).
II 8.1.5 Modelo de Wilkinson.
La estimacin de los parmetros cinticos Vmx y Km por el mtodo de MichaelisMenten y por otros mtodos como el de la doble reciproca de Lineweaver-Burk no
emplean clculos estadsticos. Los mtodos grficos frecuentemente no proveen
ninguna medida de precisin de la determinacin, lo que es necesario para una
evaluacin adecuada de los resultados en relacin a consideraciones terica o
para la comparacin de los resultados obtenidos bajo diferentes condiciones
experimentales.
El modelo de Wilkinson, a diferencia de los otros modelos, emplea herramientas

estadsticas para la estimacin de los parmetros cinticos de Vmx y Km. El
principal propsito de este modelo es suministrar estimaciones ms exactas y
precisas de la Vmx y la Km mediante clculos matemticos y haciendo uso de las
27
_________________________________________________________ ANTECEDENTES
herramientas estadsticas como la desviacin estndar y del error estndar
(Wilkinson, 1960).
28
____________________________________________________________ JUSTIFICACIN
JUSTIFICACIN
El uso de naringinasa para la disminucin del amargor de los jugos de frutas

ctricas es un proceso que ofrece numerosas ventajas, comparado con los
mtodos fisicoqumicos que antiguamente se empleaban; y este proceso es ms
rentable si se utiliza naringinasa de origen microbiano, especialmente de hongos
filamentosos del genero Aspergillus. Es un nicho que necesita ser explorado ya
que no existe suficiente informacin sobre los detalles en el proceso de obtencin
de esta enzima. Mucha de la informacin est patentada o existe como secreto
industrial.
Adems, es menester decir que las enzimas de origen microbiano que existen
actualmente en el mercado presentan una eficacia muy deficiente de la hidrlisis
de la naringina, por lo que es necesario hacer ms estudios con hongos del
gnero Aspergillus con la finalidad de evaluar la capacidad de produccin de
naringinasa por la cepa empleada, comparar la produccin de naringinasa
utilizando diferentes fuentes de carbono y factores que se ha informado que en
ciertas cepas favorecen su produccin, comparar la actividad de la naringinasa
producida contra la actividad de una naringinasa comercial y contribuir en la
generacin del conocimiento que conlleve al mejoramiento del desarrollo
tecnolgico.
29
________________________________________________________________ OJETIVOS
OBJETIVOS
Objetivo general
Estudiar el efecto de diferentes fuentes de carbono y las sales de calcio y

magnesio en la produccin de naringinasa por medio de Aspergillus niger ATCC
1015.
Objetivos particulares:
Evaluar mediante una prueba presuntiva si la cepa de Aspergillus niger
empleada tiene la capacidad de producir naringinasa.
Estudiar el efecto de la fuente de carbono (ramnosa, naringina y melaza en
la produccin de naringinasa por Aspergillus niger
Determinar el efecto de sales de CaCO3 y MgCO3 en el crecimiento del
microorganismo, la produccin de naringinasa y la produccin de protena
durante la fermentacin.
Cuantificar la actividad enzimtica de la naringinasa sobre la hidrlisis de la
narigina in vitro mediante la determinacin de los productos de la hidrlisis
de esta por el mtodo del DNS.
30
___________________________________________________ MATERIALES Y MTODOS

III. MATERIALES Y MTODOS
III.1 Desarrollo experimental.
Aspergillus niger ATCC 1015
Prueba preliminar de la capacidad productora

de naringinasa por la cepa
Preparacin del inculo
Fermentacin
Crecimiento del microorganismo en diferentes sustratos
CaCO3 y/o
MgCO3
Naringina
Melaza
Ramnosa
Identificacin de
la enzima
Protena
Actividad
enzimtica
Mtodo Bradford
Determinacin de la
Vmx, Km
id 9. Diagrama de proceso para la produccin de naringinasa,

Figura
id protena y
id
determinacin de la actividad
enzimtica
de
naringinasa
producida
por A. niger
id
id
ATCC1015
utilizando diferentes fuentes de carbono.
31

III.2 Materias primas.
1. Naringinasa de Penicillium decumbens (Sigma)
2. Naringina (Sigma)
3. Ramnosa (BDDIFCO)
4. Melaza (Ingenio San Miguelito, Crdoba, Ver.)
5. Glucosa (Sigma)
6. Medio de cultivo Agar Saboraud (BDDIFCO)
7. Extracto de malta (BDDIFCO)
Microorganismo
Aspergillus niger ATCC 1015 obtenido de Coleccin Nacional de Cepas
Microbianas y Cultivos Celulares del Centro de Investigacin y de Estudios
Avanzados (CINVESTAV) y mantenidas a 5C en agar papa dextrosa. Este
microorganismo esta reportado como productor de cido ctrico y antgenos
(CDBB: 177).
III.3 Material de laboratorio y reactivos.

cido ortofosfrico (Baker), acido 3,5-dns (Baker), agujas de jeringa (plastipack),
agua destilada-desionizada, agar maltosa de sabouraud (BDDIFCO), albmina
srica bobina (bsa), azul de comassie-g (Baker), cajas petri, cloroformo.
III.4 Equipo.
Balanza analtica (Ohaus, Explorer Po), bao metablico (Shaker, G25), bao
mara
(BM),
centrifuga
ALC4239R,
espectrofotmetro
visible-UV
(Termo
Spectronic, Genesys 20), fotocolormetro (Klett- Summerson), horno (American),

autoclave, parrilla de calentamiento (Termolyne, HP-A1915B), vortex (Daigger,
Vortex Genie 2).
32

III.5 Mtodos.
III.5.1 Evaluacin preliminar de la capacidad productora de naringinasa de la cepa

Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografa en capa fina.
Para conocer si la cepa empleada tena la capacidad de producir naringinasa, se

utilizaron muestras de jugo de dos lotes de naranjas verdes, un lote sin inocular y
otro inoculado por picadura con Aspergillus niger ATCC 1015, con la finalidad de
evaluar la presencia de naringina en el jugo y la hidrolisis de esta por medio de la
enzima producida por el microorganismo inoculado.
Las muestras de jugo de cada lote fueron tomadas cada 24h y en el caso del lote
de naranjas inoculadas las muestras fueron tomadas del punto de inoculacin
debido a que el microorganismo no alcanza a colonizar toda la naranja en 24h. El
lote sin inocular sirvi como control para determinar que, la hidrlisis de la
naringina no fuera efecto de la maduracin de la naranja.
Para dar seguimiento a la presencia o ausencia de naringina se utiliz la tcnica
de cromatografa en capa fina, para lo cual se cortaron placas cromatogrficas de
5 x 2 cm de largo y ancho respectivamente, a las que, se les aplic una gota de la
muestra problema (naringina pura o jugo de naranja) a una distancia de 0.5 cm del
inicio de la placa cromatogrfica (punto de aplicacin). Cada placa cromatogrfica
con la muestra previamente aplicada, se introdujo en una cmara de vidrio que
contena 2 mL de disolvente aproximadamente. La muestra aplicada en la placa
ascendi por capilaridad utilizando diferentes disolventes.
Despus de que la muestra ascendi por capilaridad y el disolvente recorri una
distancia de hasta 0.5 cm antes del final de la placa cromatogrfica, se sac la
placa de la cmara de vidrio y se dej evaporar al ambiente el disolvente que sta
haba absorbido.
33

Para observar la distancia recorrida por las muestras a lo largo de la placa, se
utiliz una lmpara de luz ultravioleta de longitud corta (253 nm) y una de longitud
larga (350 nm), las manchas observadas fueron marcadas con lpiz.
Posteriormente se le aplic con ayuda de un algodn y unas pinzas sulfato srico
amoniacal que sirvi como revelador cuando se someti la placa con el sulfato
srico amoniacal a calentamiento mediante de una parrilla por 1 min
aproximadamente. El experimento se realiz por triplicado.
III.5.1.1 Determinacin del mejor disolvente que permite la ascendencia por

capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de naranja en
cromatografa en capa fina.
En primer lugar se emple una muestra de naringina pura (N) que se emple
como patrn de comparacin en una concentracin de 50 mg/1000ml, para poder
hacer los experimentos que permitieran conocer si la cepa empleada tena
capacidad de producir naringinasa. Por ello se evaluaron las mezclas de
disolventes presentes el Cuadro 1.
La eleccin del disolvente que permiti la mejor elucin de la naringina en

cromatografa en capa fina se realiz en base a los Rf (factor de elucin de un
compuesto
en
una
placa
cromatogrfica)
calculados
para
cada
placa
cromatogrfica, es decir para cada muestra de naringina eluda utilizando

diferentes disolventes.
El Rf expresa la posicin de un compuesto sobre la placa cromatogrfica como

una fraccin decimal; el mximo Rf es 1 y a mayor Rf mejor factor de elucin. El Rf
fue calculado dividiendo la distancia que recorri la muestra en la placa
cromatogrfica entre la distancia que recorri el disolvente.
34

Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elucin de una
muestra de naringina pura en cromatografa en capa fina.
Disolvente / Concentracin %
hexano / 100
acetato / 100
hexano: acetato de etilo / 80:20
acetato de etilo: hexano / 80:20
metanol: acetato de etilo / 80:20
metanol / 100.
acetona / 100
metanol: acetona / 95:5
Adems se utilizaron diferentes disolvente o mezcla de disolventes para conocer

la elucin de la naringina presente en el jugo de naranja (n) en una placa
cromatogrfica las cuales se muestran en el Cuadro 2.
Cuadro 2. Disolventes y proporcin utilizados para determinar el factor de elucin

de la naringina presente en el jugo de naranja.
metanol / 100
acetona / 100
35

Se busc el mejor sistema de elucin tanto para la naringina pura (N) como para la
naringina presente en el jugo de naranja (n). Para ello se evaluaron las mezclas de
disolventes presentes en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Disolventes y proporcin utilizados para determinar el factor de elucin

de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de naranja en una misma
placa cromatogrfica.
metanol / 100
III.5.2 Recuperacin de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.
La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del Cinvestav) se
adquiri en tubos de ensaye en agar papa dextrosa, por lo que fue resembrada
para obtener una cantidad suficiente para que pudiera emplearse en las
fermentaciones a realizar (Daz y col, 1998).
III.5.3 Preparacin del inculo de A. niger por medio de turbidimetria.
Para la obtencin del inculo a emplear en cada fermentacin se prepar para

cada ensayo y en el momento del inicio de la fermentacin una solucin que
contena 900 x 106 esporas/ mL por medio de turbidimetria utilizando una escala
36

de MacFarland previamente preparada como se muestra en el Cuadro 4 (Daz y
col, 1998).
Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo empleado en cada

fermentacin.
Clave del tubo
BaCl 1%
H2SO4 1%
No. aproximado de
mL
mL
microorganismos x
106/mL
0.1
9.9
300
0.2
9.8
600
0.3
9.7
900
0.4
9.6
1200
0.5
9.5
1500
0.6
9.4
1800
0.7
9.3
2100
0.8
9.2
2400
0.9
9.1
2700
10
1.0
9.0
3000
El rengln sombreado indica la cantidad de inculo empleado.
III.5.4 Fermentaciones para la produccin de naringinasa por medio de A. niger

utilizando como base un caldo nutritivo.
Se utiliz Aspergillus niger ATCC 1015 en una concentracin 900 x 106
esporas/mL. Se prepar un caldo nutritivo con la composicin que se observa en
el Cuadro 5 (Munish y col, 2005; Bram y Solomons, 1965).
37

Cuadro 5. Composicin del caldo nutritivo empleado en cada fermentacin y al
cual se le adicion la fuente de carbono y/o las sales de calcio y magnesio.
Caldo nutritivo
sustancia
proporcin
NaNO3
2.0 g/l
KH2PO4
1.0 g/l
KCl
0.5 g/l
MgSO47H2O
0.5 g/l
FeCl3
0.1 g/l
Extracto de malta
1% p/v
Las muestras que se prepararon con caldo nutritivo para conocer el efecto de la
fuente de carbono y de las sales CaCO3 y MgCO3 se muestran en el Cuadro 6.
Cada fermentacin se realiz por duplicado en matraces de 1L los cuales fueron
incubados por un periodo de 8 das a 30C, con agitacin de 54 ciclos por min.
38

Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento del microorganismo y
produccin de naringinasa por A. niger.
Fuente de
Proporcin
carbono
fuente de
CaCO3
MgCO3
proporcin proporcin
carbono %
0.01 mM
0.01mM
naringina
0.5
---
---
naringina
0.5
0.01
---
naringina
0.5
---
0.01
naringina
0.5
0.01
0.01
melaza
0.5
---
---
melaza
0.5
0.01
---
melaza
0.5
---
0.01
melaza
0.5
0.01
0.01
ramnosa
0.5
---
---
ramnosa
0.5
0.01
---
ramnosa
0.5
---
0.01
ramnosa
0.5
0.01
0.01
III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.
Se tom una alcuota de 20 mL cada da que dur la fermentacin, esta fue filtrada
en papel filtro de poro de 1mm y se sec a 80C por 10 min aproximadamente, as
se cuantific el peso del micelio por diferencia (Bucio Villalobos y col, 2007).
39

III.6 MTODOS ANALTICOS.
III.6.1 Determinacin de protena en el medio de cultivo.

Para la determinacin de la protena en el medio de cultivo se utiliz el mtodo de
Bradford, el cual es un mtodo rpido y sensible para la cuantificacin de micro
cantidades de protena utilizando el principio de formacin de color por unin a la
protena (Bradford, 1976; Kirk y col, 2004).
El mtodo de Bradford involucra la unin no covalente de la protena al reactivo

Azul brillante de Coomasie G-250 ya que este interacciona con los grupos bsicos
y aromticos de las protenas. Este colorante absorbe a una longitud de onda de
365 sin embargo la unin de la protena al colorante causa un cambio en el
mximo de absorcin del colorante de 365 a 595nm absorbancia a la que se
realiza la determinacin (Bradford, 1976).
III.6.1.1 Preparacin del reactivo de Bradford.
Se disuelven 100 mg de azul de Comassie en 50 mL de etanol al 96 %, despus

se aaden 100 mL de cido fosfrico 85 %.Se diluye con 1000 mL de H2O
destilada y se deja reposar 24 h en oscuridad, se filtra dos veces con papel filtro y
se conserva en una botella oscura.
III.6.1.2 Patrn de albmina srica bobina (ASB).
Se realiza una curva de ASB de acuerdo con el Cuadro 7. Agitando perfectamente

y despus de incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Cada ensayo se lee
a 595 nm usando como blanco el tubo 6 de la serie y se determinan por triplicado.
Esta curva solo es estable por 30 min y se deber agitar perfectamente antes de
leer. Para determinar el contenido de la protena en cuestin se realiza el mismo
40

procedimiento sustituyendo la ASB por la protena problema e interpolando los
resultados obtenidos para la protena problema en la curva estndar. Durante la
determinacin se desarrolla una coloracin azulada que se incrementa conforme
se incrementa la concentracin de protenas.
Cuadro 7. Curva tipo de albumina srica bovina, para la determinacin de

protena en el medio de cultivo por el mtodo de Bradford.
Tubo
Solucin Protena (ASB,

250 g/mL)
Agua destilada
(mL)
Reactivo de Bradford
(mL)
1
2
3
4
5
6
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.0
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
3
3
3
3
3
3
3
La curva tipo de albumina srica bovina, para la determinacin de protena en el

medio de cultivo por el mtodo de Bradford.se reporta en el Anexo nmero 1 del
presente trabajo y present una ecuacin de la recta de Y=5.78x + 0.1408;
R2=0.9579.
III.6.2 Determinacin de la actividad enzimtica de la naringinasa comercial de

Penicillium decumbens.
Para llevar a cabo la determinacin de la naringinasa producida por el

microorganismo empleado fue importante conocer el comportamiento de esta in
vitro por tanto se realizaron las siguientes determinaciones utilizando naringinasa
de Penicillium decumbens (Sigma).
41

III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentracin de naringinasa de Penicillium
decumbens en la hidrlisis de naringina.
Se prepar una solucin de naringina 0.005 mM en regulador de citratos 0.05 M

pH 4.5 de la cual siempre se adicion 1.9 mL a cada tubo de ensayo, adems de
diferentes soluciones de naringinasa de concentracin final de 10, 30, 50, 75, 100,
125 y 150 g/mL; las cuales fueron elaboradas a partir de una solucin
concentrada de 1500 g/ mL, siendo siempre la alcuota que se adicion al
sustrato de 0.1 mL. As el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2 mL.
Cada ensayo se incubo durante 15 minutos, tiempo en el cual se llevara a cabo la
hidrlisis de naringina por la naringinasa y se obtendra glucosa como producto
final y esta es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producida
por dicha hidrlisis. Terminado el tiempo de reaccin, la reaccin se detiene con la
adicin de 4 mL de DNS y se calienta durante 5 minutos a ebullicin para revelar
cada tubo, los cuales una vez fros fueron ledos a 540nm con filtro verde. (Ting,
1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los
resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2 apartado 2a.1 del presente
trabajo.
III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la naringina

por la naringinasa de Penicillium decumbens.
Del estudio anterior se seleccion una concentracin de naringinasa a la cual se

observara claramente la hidrlisis de la naringina la cual fue 50 g/ mL, dicha
concentracin se mantuvo constante durante todo el experimento donde se
evaluaron diferentes tiempos de hidrolisis los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60
minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9 mL de naringina 0.005M y 0.1 mL
de naringinasa. Terminado el tiempo de reaccin, la reaccin se detuvo con la
adicin de 4 mL de DNS y se calent durante 5 minutos para revelar cada tubo,
los cuales una vez fros fueron ledos en el fotocolormetro con filtro verde. (Ting,
42

resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2, apartado 2a.2 del presente
trabajo.
III.6.2.3 Curva tipo de naringina.
Para el montaje de la curva tipo de naringina una vez conocidos tanto la

concentracin de naringinasa a emplear (50 g/ mL) y el tiempo de hidrlisis ms
adecuado para observar tal efecto (10 min), se prepar una solucin de
naringinasa en concentracin de 50 g/ mL en regulador de citratos 0.005 mM pH
4.5 de la cual se adicin 0.5mL, la concentracin de naringina empleada fue de
0.005M y se emplearon los siguientes volmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1,
1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 mL para alcanzar un volumen final de cada ensayo de 2.5 mL. El
tiempo de incubacin fue de 10 minutos, posteriormente la reaccin fue detenida
agregando 4 mL de DNS y los tubos fueron puestos a ebullicin durante 5
minutos, una vez fros se llevo a cabo la lectura a 450nm con filtro verde. (Ting,
resultados de este estudio se reporta en el Anexo 3, Figura 4A del presente
trabajo.
III.6.2.4 Determinacin de las constantes de Vmx y Km para la naringinasa de

P. decumbens por los mtodos grficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,
Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.
En base a los resultados de obtenidos de la curva de naringinasa y haciendo una

curva patrn de glucosa (Anexo 4, Figura 5A) se calcularon las concentraciones
reales en g/ ml que representa cada volumen empleado en la curva tipo de
naringina 0.005M. Dichos resultados fueron empleados para trazar las curvas de
Michaelis- Mentes (Anexo 5, Figura 6A), Lineweaber-Burk (Anexo 5, Figura 7A),
43

Eadie-Hofsteen (Anexo 5, Figura 8A) y Agustinson (Anexo 5, Figura 9A), y se
determino la Vmx y Km para cada uno, a dems se determinaron dichas
constantes por el mtodo estadstico de Wilkinson (1960) (Anexo 5, Cuadro 5A).
La Vmx esta expresada en U/mg protena donde una U = cantidad de enzima
para liberar 1mol de glucosa/ min.
III.6.3 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa producida por A. niger

en muestras de la fermentacin de cada formulacin.
Para llevar a cabo la determinacin de la actividad enzimtica de la naringinasa

producida por el microorganismo empleado. Se tom 0.5 mL de cada muestra de
la fermentacin de cada formulacin, se le adicion 1.5 mL de una solucin de
naringina (Sigma) 5.26 mM en regulador de citratos 0.05M pH 6, como sustrato, y
se incub a 35C por 24 h, la reaccin fue detenida adicionando 4 mL de cido
3,5-dinitrosalicilico y con ebullicin en bao Mara durante 5 minutos,
posteriormente se ley a 450 nm en un fotocolormetro con filtro verde. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado. Como blanco se utiliz 1.5 mL de una
solucin de naringina 5.26mM. Para el tratamiento de los resultados se utiliz una
curva tipo de glucosa con una ecuacin de la curva de Y=0.6456x -2.2889;
R2=0.987, reportada en el Anexo 4, Figura 5A del presente trabajo.
III.6.4 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa producida por A. niger

del caldo nutritivo que present mayor actividad enzimtica en el estudio anterior.
A partir de los resultados obtenidos en el estudio anterior se seleccion el caldo

nutritivo seleccionado que present mayor actividad enzimtica.
El caldo nutritivo elegido, fue tratado para concentrar la protena y separarla del
medio de cultivo por lo que se le adicion 65 g de sulfato de amonio por cada 100
44

mL de medio de cultivo para precipitar la protena en bao de hielo logrando una
saturacin de 99% de acuerdo con Dawson (1968). La solucin fue centrifugada a
17100 rpm (107442.46875277 radianes /min) 4C por 30 min; el pellet fue resuspendido en 15 mL de regulador de citratos 0.05M pH 6 y se le determin el
contenido proteico por medio del mtodo de Bradford.
Para la determinacin de la actividad enzimtica del concentrado proteico obtenido

se emplearon 1.5 mL de una solucin de naringina de diferente molaridad (0.02,
0.008, 0.00526, 0.0026, 0.0013, 0.001, 0.0006 M) en regulador de citratos 0.05 M
pH 6 a la que se le adicionaron 0.5 mL del concentrado proteico y se incubaron a
35C por 24 h en bao Mara, una vez transcurrido el tiempo de incubacin la
reaccin fue detenida adicionando 4 mL de cido 3,5-dinitrosalicilico y con
ebullicin en bao Mara durante 5 minutos, posteriormente la lectura se realiz en
un fotocolormetro con filtro verde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Para el tratamiento de los resultados se utiliz una curva tipo de glucosa con una
ecuacin de la curva de Y=0.6456x -2.2889; R2=0.987, reportada en el Anexo 4,
Figura 5A del presente trabajo. Los resultados obtenidos permitieron calcular los
grficos de Michaelis-Menten, Lineweaer-Burk, Eadie-Hoffsten y Agustinson. A
dems se determin la Vmx y Km para cada uno. El valor de Vmx y Km para
Wilkinson se calcul de acuerdo al modelo estadstico de Wilkinson (1960).
III.6.5 Anlisis estadstico para determinar la confiabilidad de los resultados

obtenidos por medio del programa estadstico MINITAB13.
Los resultados de peso del micelio, protena y actividad enzimtica fueron

analizados estadsticamente por medio del programa MINITAB13, a travs de un
anlisis de varianza (ANOVA) con un p 0.05 utilizando un diseo factorial
general completo de 3x4x5 (fuente de carbono, sales y das) con tres repeticiones.
45
_________________________________________________ RESULTADOS Y DISCUCIN

IV. RESULTADOS Y DISCUCIN
IV.1 Evaluacin de la capacidad productora de naringinasa de la cepa Aspergillus
niger ATCC 1015 por medio de cromatografa en capa fina.
IV.1.1 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de una muestra de

naringina pura en cromatografa en capa fina.
En la Figura 10 se observa que la acetona 100% no permiti la muestra de

naringina pura ascendiera por capilaridad en cromatografa en capa fina por lo que
este disolvente fue descartado para ser empleado en los siguientes experimentos.
El disolvente metanol 100% (Rf=0.62) (Figura 11) y las mezclas de disolventes
metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54) (Figura 9), metanol: acetona 90:10 (Rf=0.66)
(Figura 12) y metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65) (Figura 13) permitieron que la
muestra de naringina pura ascendiera por capilaridad en cromatografa en capa
fina. La mezclas de disolventes hexano 100% (Rf=0), hexano: acetato de etilo
80:20 (Rf=0), acetato de etilo: hexano 80:20 (Rf=0), metanol: acetato de etilo
80:20 (Rf=0) y acetona 100% (Rf=0) no permitieron la ascendencia por capilaridad
de la muestra de naringina. Los resultados se muestran en la Cuadro 8.
Cuadro 8. Disolventes para eluir la naringina pura (50 mg/1000ml) en

cromatografa en capa fina.
Disolvente / proporcin
%
metanol 100
hexano / 100
hexano: acetato de etilo / 80:20
acetato de etilo: hexano / 80:20
metanol: acetato de etilo / 80:20
acetona / 100
Ascendencia por
capilaridad
s
s
s
s
no
no
no
no
no
Rf
0.62
0.54
0.66
0.65
0
0
0
0
0
46
Figura 10. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina
utilizando como disolvente acetona 100%.(Rf=0).
utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.62).
utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54).
47
utilizando como disolvente metanol:acetona 90:10 (Rf=0.66).
utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65).
El valor de Rf nos permiti inferir que el mejor sistema que permita que la muestra
de naringina pura ascendiera por capilaridad y se observar como una mancha
definida en una cromatoplaca poda ser la mezcla de metanol: acetona 90: 10
(Figura 13) por presentar el mayor Rf, seguido de metanol: acetona 80:20 (Figura
14), metanol 100% (Figura 11) y en ltimo caso el metanol: acetona 95:5 (Figura
12). La eleccin del disolvente o sistema de disolventes dependi del resultado
obtenido en la siguiente etapa experimental ya que se pretendi encontrar un
disolvente o mezcla de disolventes que permitiera la ascendencia por capilaridad
48

tanto de la naringina pura como de la naringina presente en jugo de naranja ya
que esta ltima poda verse afectada en su polaridad debido a la acidez del medio
en el que se encontraba.
Debido a que no se observ ascendencia por capilaridad en cromatografa en

capa fina de la naringina pura con el disolvente hexano 100% ( disolvente no
polar; ndice de polaridad Ip= 0) inferimos que la naringina es un flavonoide polar,
sin embargo, este flavonoide asciende por capilaridad en cromatografa en capa
fina muy poco con un disolvente de polaridad intermedia como la acetona 100%
(Ip= 5.4) (Figura 10), pero por otra parte con metanol 100% disolvente de alta
polaridad (Ip= 6.6) (Figura11) asciende por capilaridad de tal manera que permite
obtener un RF muy cercano a la unidad, por tanto podemos decir que la naringina
es un flavonoide de alta polaridad.
IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la naringina

presente en el jugo de naranja en cromatografa en capa fina.
Las mezclas evaluadas en esta etapa fueron: metanol 100% (Rf=0.645)

(Figura15), metanol: acetona 95:5 (Rf=1.67) (Figura 16), metanol: acetona 90:10
(Rf=0) (Figura 17) y metanol: acetona 80:20 (Rf= 0.8) (Figura 18), de acuerdo con
el Rf el mejor sistema apto para la ascendencia por capilaridad en cromatografa
en capa fina de la naringina presente en la naranja es metanol: acetona 90:10, sin
embargo, al observar la placa cromatogrfica no se observa una mancha definida
por tanto este sistema de disolventes fue descartado, eligiendo como mejores
sistemas aptos para la ascendencia por capilaridad de la naringina presente en la
naranja al metanol: acetona 80:20 ( Figura 18) seguido del metanol 100% (Figura
15).
49
Figura15. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en

cromatografa en capa fina utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.645).
Figura 16. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en

cromatografa en capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5
(Rf=1.67).
Figura17. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en

(Rf=0).
50
Figura 18. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en

(Rf=0.8).
Finalmente este experimento nos permiti saber que la polaridad de la naringina

presente en la naranja puede estar afectada por la presencia de otros
componentes o por las condiciones en las que se encuentra en la naranja.
IV.1.3 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de la naringina pura y la

naringina presente en las naranjas en cromatografa en capa fina.
Se encontr que la naringina pura (N) y la naringina presente en la naranja (n),
ascendieron por capilaridad en metanol 100% (Figura 20) alcanzando un Rf= 0.86,
pero su ascendencia por capilaridad mejor con metanol: acetona en 80:20
(Figura 19) presentando un Rf= 1 el cual fue calculado con respecto a la muestra
de referencia lo que nos sugiere que el mejor sistema para permitir la ascendencia
por capilaridad en cromatografa en capa fina de las muestras de naringina pura y
naringina de la naranja es el de metanol: acetona en 80:20. Por tanto para la
siguiente etapa experimental se trabajo con este sistema de disolventes.
51
Figura 19. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol: acetona 80:20 (Rf=1).
(N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 20. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol 100% (Rf=0.86). (N=
naringina; n= naringina de naranja).
IV.1.4 Evaluacin de la degradacin de la naringina por la naringinasa producida

por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en naranjas.
Pequeas muestras de jugo de las naranjas utilizadas en el experimento (n) se

compararon en una placa cromatogrfica contra una muestra de naringina pura
(N) tanto de las naranjas inoculadas por picadura con Aspergillus niger ATCC
1015 como las no inoculadas (controles). Despus de revelar las placas se
52

confirm la presencia de la naringina en el lote de naranjas sin inocular (Figura 21)
y de igual manera se confirmo la presencia de la naringina en el lote de naranjas
acabadas de inocular (Figura 22).
Figura 21. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20

(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 22. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger, metanol: acetona

80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
A las 24 horas del experimento se observ que todavia estaba presente la

naringina en el lote de naranjas sin inocular (Figura 23). En el lote de naranjas
53

inoculadas se observ que una naranja no present naringina en el punto de
inoculacin (Figura 24).
N n
N n
N n

N
N

A las 48 y 72 horas se observ la presencia de naringina en las naranjas no

inoculadas(Figura 25) junto con la presencia de otros compuestos, lo que podra
54

sugerir el inicio de la degradacin de la naringina presente en la naranja
probablemente por efecto de la maduracin. En las naranjas inoculadas (Figura
26) se observ el mismo comportamiento presentado a las 24 horas solo que
ahora haba presencia de otros compuestos que solo se observaron en una
longitud de onda larga al UV.
N
n
N

N
n

55

Despus de 96 hrs de haber iniciado el experimento se observ la presencia de
naringina en las naranjas no inoculadas (Figura 27) junto con la presencia de otros
compuestos que absorven en longiutud de onda larga al UV y en el lote de
naranjas inoculadas (Figura 28) con A. niger no se observ la presencia de
naringina.
n
N


56

A 120 hrs los controles (Figura 29) mostraron la presencia de naringina junto con
la presencia de otros compuestos que solo absorven en longitud de onda larga en
el UV. En las muestras de las naranjas inyetadas (Figura 30) con el hongo no se
observa la presencia de naringina probablemente debido a una hidrlisis inducida
por el microorganismo inoculado.
N
N n


57

IV.2 Recuperacin de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.
La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del CINVESTAV;
Figura 31) fue resembrada en agar Sabouraud (Figura 32) el cual fue preparado,
esterilizado y vaciado previamente en cajas petri, las cuales fueron resembradas
por picadura lo cual se muestra en la Figura 33. Dichas cajas se mantuvieron a
temperatura ambiente y cubiertas con papel aluminio por una semana para
obtener un ptimo crecimiento del microorganismo el cual se muestra en la Figura
34. El hongo comenz a crecer desde el primer da y alcanzo su ptimo a los 7
das de haberse sembrado. Este procedimiento se realiz mensualmente a
manera de conservar la cepa.
Figura 31. Cepa Aspergillus niger ATCC 1015 obtenida del cepario del
CINVESTAV.
58
Figura 32. Agar Saboraud.
Figura 33. Resiembra del microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015.
Figura 34. Crecimiento optimo de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.

59

IV.3 Fermentaciones.
El caldo nutritivo, como fue descrito en materiales y mtodos, fue adicionado con
diferentes fuentes de carbono (0.5% p/v) y con sales de calcio y magnesio al 1 M y
0.1mM. Sin embargo, en estas muestras no se observ el crecimiento del hongo
(peso del micelio).
IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.
Se observ crecimiento del microorganismo cuando se emple como fuente de

carbono naringina, ramnosa o melaza (0.5% p/v) en el caldo nutritivo. Cuando se
adicin las sales de calcio y/o magnesio en concentracin de 0.01mM se observ
crecimiento del microorganismo al contrario de cuando se utiliz una
concentracin de 1 y 0.1mM. Por ello se emple en todos los caldos nutritivos que
se trabajaron en este estudio una concentracin de 0.01 mM para las sales.
Es importante resaltar que cuando no se adicion sal alguna al medio de cultivo,

no se encontr diferencia significativa para las tres diferentes fuentes de carbono
empleadas. Lo cual concuerda con Bramn y Solomons (1965) que sugieren que no
es necesaria la adicin de factores de crecimiento para Aspergillus niger NRRL
72-4 en la produccin de naringinasa. Sin embargo, la presencia de CaCO3 y
MgCO3 individualmente favoreci significativamente (p0.05) el crecimiento de
A. niger solo cuando se utiliz melaza como fuente de carbono, siendo el mximo
de crecimiento 0.905 g/mL y 0.775 g/mL para CaCO3 y MgCO3 respectivamente
(Figura 35). Bramn y Solomons (1965) sugieren que el CaCO3 tiene un efecto
positivo en el crecimiento del hongo durante la produccin de la naringinasa
debido a que cuando se realiza dicha produccin en matraces agitados, y no en
fermentadores, en donde se pueden controlan todos los factores, se forma una
atmosfera limitada en oxigeno que afecta el crecimiento del hongo y esta limitacin
puede modificarse a travs de la adicin de CaCO 3. Esto podra aplicarse tambin
60

para el MgCO3, ya que lo que aporta el carbonato de calcio es oxigeno para
contrarrestar la deficiencia de este en el medio, sin embargo, para magnesio no
est comprobado. No obstante la adicin de la mezcla de ambas sales no mostr
diferencia significativa para alguna fuente de carbono empleada.
1
0.905
Peso del micelio en base seca g/ml
0.9
0.8
0.775
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
M 0.5%, Ca 0.01mM
0.2
M 0.5%, Mg 0.01mM
0.1
0
0
Das
Figura 35. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con adicin
de CacO3 () y melaza con adicin de MgCO3 ().
61

IV.4 Determinacin de protena en el medio de cultivo por el mtodo de Bradford.
La determinacin de la protena durante el crecimiento del microorganismo (no

toda la protena producida es enzima naringinasa) se realiz por triplicado para
todas las muestras tomadas cada 24 horas durante el transcurso de la
fermentacin y se utiliz como blanco la fuente de protena inicial (1% p/v).
Para la produccin de protena se encontr que existe diferencia significativa

(p0.05) dependiendo de la fuente de carbono que se utilice, siendo la naringina la
fuente de carbono que favorece ms la produccin proteica, lo cual se observa en
la Figura 36, Curva A.
Tambin se encontr diferencia significativa en la produccin de protena

dependiendo de la presencia o ausencia de sales de Ca2+ y/o Mg2+. En la Figura
36, Curva B se observa que la adicin de las sales favorece positivamente la
produccin de protena, teniendo un mayor efecto positivo el MgCO3 que el
CaCO3, sin embargo, se observa que el efecto positivo se incrementa cuando se
adiciona la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ y cuando se utiliza naringina como
fuente de carbono (Figura 37, Curva A). Probablemente el efecto de la mezcla de
las sales es mayor porque al adicionarlas juntas suman su efecto actuando
sinergistamente sobre la produccin proteica.
62
Figura 36. Curvas de comportamiento de la protena en relacin a la fuente de

carbono (A) y sales de Ca2+ y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger ATCC1015.
Tiempo de la fermentacin en das(C). N= naringina; R= ramnosa; M=melaza; 0=
sin sales; Ca= CaCO3; Mg=MgCO3; m= mezcla de sales. La lnea punteada
representa la media de los datos.
63
Figura 37. Curvas de produccin de protena mostrando las relaciones: fuente de

carbono-sales (A) y fuente de carbono-das (B), para naringina, melaza y ramnosa
y (C) la relacin sales-das para naringina. N= naringina; R= ramnosa; M=melaza;
0= sin sales; Ca= CaCO3; Mg= MgCO3; m= mezcla de sales.
Al analizar individualmente las diferentes formulaciones en funcin de la fuente de

carbono utilizada se encontr para el caso de naringina que existe diferencia
significativa (p0.05) en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o Mg2+.
Siendo el mximo de produccin de protena (Cuadro 9) para naringina sin adicin
de sales de 6192 g / mL; para naringina + Ca2+ de 11849 g / mL; para naringina
+ Mg2+ de 15154 g / mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ de 32553 g / mL. A
partir de dichos mximos de produccin de protena se observa que la adicin de
la mezcla de las sales incrementa significativamente la produccin de protena en
64

comparacin cuando no se adicionan sales o cuando se adicionan Ca2+ o Mg2+
individualmente.
Cuadro 9.Mximos de produccin de protena en la produccin de naringinasa por

medio de A. niger.
Ensayo
Produccin de
protena (g / mL)
naringina sin sales
6192
naringina +Ca2+ y Mg2+
32553
naringina + Ca2+
11849
naringina + Mg2+
15154
melaza sin sales
2339
melaza +Ca2+ y Mg2+
5033
melaza + Ca2+
4987
melaza + Mg2+
7368
ramnosa sin sales
2006
ramnosa+Ca2+ y Mg2+
3139
ramnosa + Ca2+
2845
ramnosa + Mg2+
19445
Sin embargo, no existe diferencia significativa en la produccin de protena al

adicionar Ca2+ y Mg2+ de manera independiente. Es posible que la adicin de la
mezcla de las sales tenga un efecto sinergista positivo en la produccin de
protena cuando se utiliza naringina como fuente de carbono.
65

Cuando se utiliz melaza como fuente de carbono se encontr diferencia
significativa en la produccin de protena en ausencia y presencia de las sales de
Ca2+ y/o Mg2+. Siendo el mximo de produccin de protena (Cuadro 9) para
melaza sin adicin de sales de 2339 g /mL; para melaza + Ca2+ de 4987 g / mL;
para melaza + Mg2+ de 7368 g / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ de 5033 g /
mL. Es importante mencionar que, a pesar de que la produccin de protena al
adicionar Mg2+ al caldo nutritivo es mayor, esta no es significativamente diferente
en relacin a la protena producida cuando no se hizo adicin de sales o cuando
se adicion solo Ca2+, sin embargo, s es significativamente mayor en relacin a la
producida cuando se adicion la mezcla de sales.
Finalmente cuando se utiliz ramnosa como fuente de carbono tambin se

encontr diferencia significativa en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o
Mg2+ en la produccin de protena (Cuadro 9). Siendo el mximo de produccin de
protena para ramnosa sin adicin de sales de 2006 g /mL; para ramnosa + Ca2+
de 3139 g / mL; para ramnosa + Mg2+ de 2845 g / mL y para ramnosa + Ca2+ y
Mg2+ de 19445 g / mL. A partir de los mximos obtenidos se observa que la
adicin de la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ al caldo nutritivo permite una mayor
produccin de protena con respecto a cuando no se adicionaron dichas sales, es
decir, la adicin de la mezcla de sales tiene un efecto positivo en la produccin de
protena. Por otra parte la adicin de Ca2+ al caldo nutritivo favoreci de igual
manera la produccin de protena en relacin a cuando no se adicion, pero esta
produccin no fue significativamente diferente a la obtenida cuando se adicion
Mg2+ o cuando se adicion la mezcla de Ca2+ y Mg2+. Cabe sealar que la adicin
de Mg2+ no tuvo un efecto significativo en la produccin de protena en relacin a
los otros caldos nutritivos.
Al hacer una comparacin entre las tres fuentes de carbono (naringina, melaza y
ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontr que al no adicionar sales
existe diferencia significativa en la produccin de protena entre la protena
(Cuadro 10) producida al adicionar naringina y al adicionar ramnosa (2006 g/mL)
66

como fuente de carbono, siendo mayor la produccin de protena cuando se utiliza
naringina (6192 g/mL), sin embargo, no existe diferencia significativa entre las
dos fuentes de carbono mencionadas anteriormente con respecto a melaza
cuando se utiliza como fuente de carbono.
Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes
en la produccin de protena, fueron en los que se utiliz naringina y melaza como
fuente de carbono (Cuadro 10), siendo mayor la produccin de protena para el
caso de naringina (11849 g/mL) en relacin con la melaza (4987 g/mL). El caldo
nutritivo en el que se empleo ramnosa como fuente de carbono no mostr ser
significativamente diferente a los anteriormente mencionados.
Cuadro 10. Comparativo de los mximos de produccin de protena significativos

(p0.05) en la produccin de naringinasa mediante diferentes fuentes de carbono
por medio de A. niger.
Ensayo
Produccin de
protena (g / mL)
naringina sin sales
6192
ramnosa sin sales
2006
naringina + Ca2+
11849
melaza + Ca2+
4987
naringina + Mg2+
15154
ramnosa + Mg2+
2845
naringina + Mg2+
15154
melaza + Mg2+
7368
naringina + Ca2+ y Mg2+
32553
melaza + Ca2+ y Mg2+
5033
naringina + Ca2+ y Mg2+
32553
2+
2+
ramnosa + Ca y Mg
19445
67

En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ se encontr diferencia
significativa en la produccin de protena (Cuadro 10), entre el que se utilizo como
fuente de carbono la naringina (15154 g/mL) y en el que se utilizo ramnosa (2845
g/mL), tambin se encontr diferencia significativa en la produccin de protena
entre naringina y melaza (7368 g/mL). Sin embargo, la produccin de protena
entre melaza y ramnosa no fue significativamente diferente.
En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,
tambin se encontr diferencia significativa en la produccin de protena (Cuadro
10), entre naringina (32553 g/mL) y melaza (5033 g/mL) utilizada como fuente
de carbono, de igual manera entre naringina y ramnosa (19445 g/mL).
Por otra parte el tiempo (das) mostr tener efecto en la produccin de protena
dependiendo de la fuente de carbono que se empleo, lo cual se observa en la
Figura 37B donde claramente se aprecia que los ensayos realizados con naringina
como fuente de carbono presentan mayor produccin de protena ya que a pesar
de que presenta variaciones a lo largo de la fermentacin, siempre se mantiene
por arriba de la produccin de protena producida con melaza y con ramnosa. Por
otra parte la Figura 37C, muestra la produccin de protena a lo largo del tiempo
de fermentacin utilizando naringina como fuente de carbono en relacin a la
ausencia y/o presencia de las sales de Ca2+ y Mg2+ donde se observa que es con
la mezcla donde se ve favorecida significativamente la produccin de protena a
pesar de la variacin de esta a lo largo de los das debido al metabolismo del
hongo.
68

IV.5 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa de A. niger en muestras
de cada fermentacin.
La determinacin de la actividad enzimtica se realiz durante el crecimiento del

hongo en el caldo nutritivo en diferentes condiciones por triplicado a lo largo de 7
das de fermentacin. Se utiliz como blanco una solucin de naringina 5.26M pH
6 en buffer de citratos.
En la Figura 38A se observa el efecto de las tres diferentes fuentes de carbono en

la actividad enzimtica. A travs del anlisis estadstico se encontr que existe
diferencia significativa entre ellas (p0.05) siendo la ramnosa la fuente de carbono
que favorece ms la produccin de naringinasa. Por otra parte en la figura 38B se
observa que la adicin de sales no influye significativamente en la actividad
enzimtica de esta enzima.
Figura 38. Curvas de Actividad enzimtica expresada en microgramos de glucosa

producida despus de 24hrs de hidrolisis, en relacin a las diferentes fuentes de
carbono 0.5%, sales de Ca2+ y/o Mg2+ 0.01mM y das. La lnea punteada
69

representa la media de los datos. N= naringina; R= ramnosa M=melaza; 0= sin
sales; m= mezcla de sales.
La produccin enzimtica obtenida en el presente trabajo puede explicarse a

travs de la teora econmica de los microorganismos (Koch, 1985) que establece
que la produccin de una enzima inducida, solo es favorecida cuando la
produccin de esta permite al microorganismo obtener ms nutrientes para su
crecimiento y multiplicacin. Adems este efecto puede incrementar si no existen
sustratos fcilmente asimilables, los microorganismos no regularan fuertemente la
produccin enzimtica de las enzimas constitutivas, o los costos enzimticos son
suficientemente bajos para permitir una continua produccin, y de acuerdo con
Stevens y col, (2005), las enzimas extracelulares como en este caso la
naringinasa son el principal medio por el cual los microorganismos degradan
compuestos orgnicos complejos en molculas pequeas que pueden ser
asimilables.
Por otra parte en la Figura 38C se observa que la produccin de naringinasa vara
de acuerdo con el metabolismo del hongo durante los das que dur la
fermentacin, siendo esta mayor el primer da despus del inicio de la
fermentacin y claramente se observa una disminucin de esta los ltimos das de
la fermentacin, quiz debido a una represin por catabolito (glucosa) (Munish y
col 2005, Bram y Solomons, 1965).Tambin el comportamiento ascendente y
descendente de la actividad enzimtica a lo largo del tiempo de fermentacin
puede explicarse a travs de lo citado por Chrst (1991) que establece que una
vez que la concentracin de productos incrementa lo suficiente, la sntesis
enzimtica se ve reprimida y la produccin regresa a un nivel basal.
70

Comparando la actividad enzimtica que se observa a travs de los das (Figura
38C) con la variacin de la protena presente en el medio de cultivo con respecto
al tiempo (Figura 36C) se observa que la cantidad la actividad enzimtica no es
proporcional a la produccin de protena ya que la actividad enzimtica mayor se
observa en el primer da despus del inicio de la fermentacin (Figura 39B)
despus de lo cual desciende y es hasta el sexto da cuando vuelve a subir pero
no alcanza el mximo alcanzado el primer da, lo que es contrario para la
produccin de protena donde se observa (Figura 36B) que esta aumenta y
disminuye repetitivamente, es decir no muestra la misma tendencia que en el caso
de la actividad enzimtica . De acuerdo con Koch, 1985; Pelletier y Sygush, 1990;
Chrst, 1991; Sinsabaugh y Moorhead, 1994, debido a la produccin de nitrgeno
y energa, los microorganismos solo deben producir enzimas a expensas del
crecimiento y metabolismo, es decir; cuando la disponibilidad de nutrientes es
escasa, la produccin de enzimas aumenta, ya que de esta manera los
microorganismos pueden movilizar los nutrimentos de las fuentes complejas
(Harder y Dijkhuizen, 1983).
En este trabajo no se cuantific la cantidad de enzima producida sino la actividad

enzimtica de la enzima producida, en este sentido, la actividad enzimtica de la
naringinasa producida no, fue proporcional a la produccin de protena.
Por otra parte tambin se encontr que las relaciones de Fuente de carbono-Sales
(Figura 39A), Fuente de Carbono- Das (Figura 39B), Sales-Das (Figura 39C),
tienen un efecto significativo en la actividad enzimtica determinada.
71
Figura 39. Curvas de actividad enzimtica mostrando las relaciones fuente de

carbono-sales, fuente de carbono-das y sales-das. N= naringina; R= ramnosa
M=melaza; 0= sin sales; m= mezcla de sales. La lnea punteada representa la
media de los datos.
Al analizar los diferentes caldos nutritivos en los que se emple naringina como
fuente de carbono se encontr que no existe diferencia significativa entre ellos en
cuanto a la actividad enzimtica determinada (Cuadro 11), sin embargo, el mximo
de actividad enzimtica encontrado para naringina sin sales fue de 2605 g de
glucosa/mL; para naringina + Ca2+ fue de 5536 g de glucosa / mL; para naringina
+ Mg2+ fue de 3122 g de glucosa/mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ fue de 3122
g de glucosa/mL. Las unidades de actividad enzimtica son expresadas en este
72

trabajo en microgramos de glucosa debido a que a partir del mtodo utilizado se
cuantifica la cantidad de glucosa producida por la hidrlisis de la naringinasa
presente en el medio de cultivo sobre una muestra de naringina pura de
concentracin conocida.
Cuadro 11.Mximos encontrados de actividad enzimtica en la produccin de

naringinasa por medio de A. niger (No diferencia significativa).
Ensayo
Actividad
enzimtica (U/g)
Naringina sin sales
2605
Naringina +Ca2+ y Mg2+
3122
Naringina + Ca2+
5536
Naringina + Mg2+
3122
Melaza sin sales
2605
Melaza +Ca2+ y Mg2+
2432
Melaza + Ca2+
2743
Melaza + Mg2+
3225
Ramnosa sin sales
6139
Ramnosa+Ca2+ y Mg2+
4932
Ramnosa + Ca2+
1638
Ramnosa + Mg2+
2777
En el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo melaza como
fuente de carbono se encontr que no existe diferencia significativa entre ellos en
cuanto a la actividad enzimtica determinada (Cuadro 11), sin embargo, el mximo
de actividad enzimtica encontrado para melaza sin sales fue de 2605 g de
glucosa / mL; para melaza + Ca2+ fue de 2743 g de glucosa / mL; para melaza +
73

Mg2+ fue de 3225 g de glucosa / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ fue de 2432 g
de glucosa/mL.
Finalmente, para el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo
ramnosa como fuente de carbono tampoco se encontr diferencia significativa
entre ellos en cuanto a la actividad enzimtica determinada (Cuadro 11), sin
embargo, el mximo de actividad enzimtica encontrado para ramnosa sin sales
fue de 6139 g de glucosa / mL; para ramnosa + Ca2+ fue de 1638 g de glucosa /
mL; para ramnosa + Mg2+ fue de 2777 g de glucosa / mL y para ramnosa + Ca2+
y Mg2+ fue de 4932 g de glucosa / mL.
Por otra parte, al hacer una comparacin entre las tres fuentes de carbono
(naringina, melaza y ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontr que al no
adicionar sales s existe diferencia significativa entre en la actividad enzimtica
determinada en el caldo nutritivo adicionado con naringina y el adicionado con
ramnosa, encontrndose un mximo de actividad enzimtica para naringina de
2605 g de glucosa /mL y de 6139 g de glucosa /mL para ramnosa (Cuadro 12).
Cuadro 12. Comparativo de los mximos de actividad enzimtica significativos

(p0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes fuentes de carbono por
medio de A. niger.
Ensayo
Actividad
enzimtica (U/g)
Naringina sin sales
2605
Ramnosa sin sales
6139
Melaza sin sales
2605
Ramnosa sin sales
6139
Naringina + Ca2+
5536
Melaza + Ca2+
2743
74

Tambin se encontr diferencia significativa entre la actividad enzimtica
determinada en el caldo nutritivo adicionado con melaza y el adicionado con
ramnosa, encontrndose un mximo de actividad enzimtica para melaza de 2605
g de glucosa /mL, lo que claramente significa que el caldo de cultivo en el que se
emplea ramnosa como fuente de carbono permite obtener una mayor actividad
enzimtica comparada con la de las otras dos fuentes de carbono (Cuadro 12).
Cabe sealar que no se encontr diferencia significativa entre la actividad
enzimtica de la naringinasa determinada en el caldo nutritivo adicionado con
Naringina y el adicionado con melaza.
Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes
en la actividad enzimtica fueron en los que se utiliz naringina y melaza como
fuente de carbono (Cuadro 12), siendo mayor la produccin de protena para el
caso de Naringina (5536 g de glucosa /mL) en relacin con la melaza para la que
se encontr una actividad enzimtica de 2743 g de glucosa /mL. El caldo de
nutritivo en el que se empleo Ramnosa como fuente de carbono no mostr ser
significativamente diferente a los anteriormente mencionados.
En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ no se encontr diferencia
significativa en la actividad enzimtica, entre el alguna de las fuentes de carbono
empeladas en este trabajo.
En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,
tampoco se encontr diferencia significativa en la actividad enzimtica
determinada entre los caldos de cultivo adicionados con las diferentes fuentes de
carbono.
De acuerdo a los resultados anteriores se seleccion el caldo nutritivo que

present mayor actividad enzimtica. De tal manera que la eleccin se realiz ente
la actividad enzimtica para los caldos nutritivos en los que no se adicion sales y
cuando se adicion Ca2+, para las fermentaciones llevadas a cabo sin adicin de
75

sales, el caldo nutritivo adicionado con ramnosa fue quin mostro mayor actividad
enzimtica (6139 g de glucosa /mL) y para las llevadas a cabo con adicin de
Ca2+ la actividad enzimtica mayor encontrada fue cuando se utiliz Naringina
(5536 g de glucosa /mL) como fuente de carbono. Por lo que la fraccin de
ramnosa sin sales fue la elegida para realizar la siguiente parte del experimento.
IV.6 Estudio de la actividad enzimtica del caldo nutritivo seleccionado.
La fraccin seleccionada para la concentracin de la protena y la determinacin

de las constantes fue la de la ramnosa sin adicin de sales del primer da despus
del inicio de la fermentacin. El uso de la ramnosa como fuente de carbono
permite obtener una naringinasa con mayor actividad comparada con la producida
utilizando
como fuente de
carbono
naringina
o melaza.
Quiz
este
comportamiento pude explicarse por lo sugerido por Munish y colaboradores en el

2005, quienes sealan que los medios utilizados para producir naringinasa por A.
niger, adicionados con ramnosa, producen elevadas cantidades de enzima quiz
ya que estos medios tienen un bajo contenido de carbohidratos. Sin embargo,
Elinbaum y col. 2002 sugieren que en el caso de una fermentacin slida la
naringina es mejor inductor que la ramnosa para la produccin de la naringinasa
utilizando A. terreus, adems tambin sugieren que una fermentacin solida
provee mejores resultados para la produccin de naringinasa que una
fermentacin liquida.
Haciendo una comparacin de la produccin proteica a lo largo del tiempo de

fermentacin en relacin a la actividad enzimtica se observa que no son
proporcionales y por tanto una mayor produccin proteica no conlleva a una mayor
actividad enzimtica aunque la naturaleza de la enzima sea proteica, ya que una
actividad enzimtica elevada puede estar dada tanto por haber alto contenido de
protena en el medio de cultivo o por que la enzima es altamente activa. Tambin
es importante resaltar que la actividad enzimtica puede ser reprimida debido a
76

una inhibicin por glucosa (producto de la hidrlisis de la naringina por la
naringinasa) ya que de acuerdo con lo reportado por Munish y colaboradores en el
2005; Gallego y col en el 2001; Bram y Solomons en 1965 y Clarke y Brammer en
1964, la glucosa reprime la produccin de naringinasa.
Como se mencion con anterioridad, el caldo nutritivo donde se encontr mayor
actividad enzimtica fue el adicionado con ramnosa como fuentes de carbono y sin
adicin de sales durante las primeras 24 horas de la fermentacin. Sin embargo,
debido a que se contaba con una pequea cantidad de muestra se decidi juntar
todas las muestras tomadas cada da durante el periodo de la fermentacin y se
procedi a una concentracin de protena. El contenido de protena determinado
despus del proceso de concentracin al que se someti la muestra fue de 66851
g/mL de protena.
La determinacin de la actividad enzimtica de las fracciones de ramnosa (del

conjunto de muestras obtenidas cada da) sin adicin de sales se prob sobre la
hidrlisis de naringina y se obtuvo una actividad enzimtica de 0.010U/mg
(U=1mol de glucosa liberada / min) la cual se reporta en el Cuadro 13. Tal vez
este valor tan pequeo encontrado se debe a que al juntar todas las fracciones
disminuy la actividad enzimtica inicial la cual fue de 0.947 U / min.
La actividad encontrada para la naringinasa presente en el concentrado de

protena es mayor comparada con la informada por Bram y Solomons 1965 para la
naringinasa de A. niger NRRL 72-4 (Cudadro 13, No5) y es menor comparada con
la informada por diferentes autores, los valores se presentes en el Cuadro 13, sin
embargo, es importante resaltar que la mayora de ellos determinaron la actividad
enzimtica utilizando sustratos inespecficos como el p-nitrofenol o el dietilen glicol
alcalino, que esta actividad fue determinada utilizando diferentes condicione, y que
la produccin de la enzima se realiz utilizando diferentes condiciones de
fermentacin como en el caso de Glten y col, 2006 (Cuadro13, No.2).
77

Por otra parte tal vez la produccin de naringinasa por el hongo en estudio podra
mejorarse si se hace una adicin de la fuente de carbono en diferentes etapas de
la fermentacin de acuerdo con lo que sugiere Bram y Solomons (1965), sin
embargo, como ellos mismos establecen la adicin continua de la fuente de
carbono a lo largo de la fermentacin es un mtodo ms difcil y que requiere de
mayor control y de un fermentador.
Cuadro 13. Actividad enzimtica de la naringinasa producida por diferentes

microorganismos y determinada mediantes diferentes sustratos.
Sustrato
Actividad
narignina
(1)
0.010 U/mg
naringina
(2)
469 U/mg
p-nitrofenol (3)
91 U/mg
p-nitrofenol (4)
1.7 U/mL
dietilen glicol alcalino (5)
90-94 U/mL
dietilen glicol alcalino (6)
3.99x 10-4 IU/mL
p-nitrofenol (7)
0.059 U
(1) Naringinasa de A. niger ATCC1015 producida en el presente trabajo. Medio de

cultivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono. Regulador de citratos
0.05M, pH=6, 35C, [naringina]=0.00526mM. U=1mol de glucosa liberada / min.
(2) Naringinasa de P. decumbens, Glten y col, 2006. Fermentacin solida.
Regulador de acetato de amonio 0.1M, pH= 4, 40C, U= 1 mol de glucosa
liberado/ min.
78

(3) -L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo
adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50C. U=
cantidad de enzima necesaria para liberar 1mol p-nitrofenol/min.
(4) -L-ramnosidasa de A. terreus, Elinbaum y col, 2002. Medio de cultivo
adicionado con carbono de bagazo de caa de azcar. Regulador de cido.
succnico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30C. U=cantidad de enzima
necesaria para liberar 1mol p-nitrofenol/min.
(5) Naringinasas de A. niger NRRL 72-4, Bram y Solomons 1965. Regulador de

citratos sin molaridad especifica reportada, pH=4, 45C. U=cantidad de enzima
necesaria para hidrolizar 1mol naringina/min. Mtodo de Davis 1947.
(6) Naringinasa de A. niger MTCC 1344, Munish y col en el 2005. Medio de cultivo
adicionado con ramnosa. Regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4, 30C.
IU=cantidad de enzima necesaria para liberar 1mol naringina/min. Mtodo de
Davis 1947.
(7) -ramnosidasa de la naringinasa de A. niger. Manzanares y col, 1997. Medio
de cultivo adicionado con naringina. Regulador MacIIvaine, pH=4.5, 30C.
U= mol de ramnosa/min.
Para determinar la constante de velocidad (Vmx) y la constante de MichaelisMenten (Km) se utilizaron los modelos grficos de Michaelis-Menten, LineweaberBurk, Eadie-Hofsteen y Agustinson y el mtodo grfico de Wilkinson 1960. La
Figura 40 muestra las curvas para los modelos grfico.
79

0.25
0.2
1/V
0.15
0.1
0.05
0
0
0.005
0.01
0.015
0.02
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0.025
y = 0.010x + 6.279
R = 0.868
500
1500
1/S
0.12
0.25
0.1
y = -0.002x + 0.176
R = 0.725
0.2
0.08
0.15
0.06
S/V
1000
0.04
0.1
y = 4.508x + 0.016
R = 0.978
0.02
0.05
0
0
0
0.005
0.01
0.015
S
0.02
0.025
20
40
60
V/S
Figura 40. (A)Curva de Michaelis Menten para Naringinasa donde Y=

6.683x+0.068; R2=0.908; (B) Curva de Lineweaber-Burk para Naringinasa; (C)
Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de Eadie-Hofsteen para la
naringinasa de A. niger ATCC1015.
En el cuadro 14 se muestra los datos calculados para las curvas correspondientes.

Los valores correspondientes a Vmx y Km para la naringinasa de A. niger a partir
de cada modelo grfico y el calculado por el mtodo estadstico de Wilkinson se
muestran en el cuadro 15.
80
80

Cuadro 14. Parmetros calculados para las curvas de Michaelis- Menten,
lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson para la naringinasa de A.niger
ATCC1015.
Michaelis-Menten
Agustinson
Lineweaber-Burk
EadiHoffsten
[s] mM
V g/min
1/[S]
1/V
[S]/V
V/[S]
65.2
0.01535
0.0153
65.36
65.2
1.3
69.5
0.769
0.014.4
0.0187
1.3
53.47
69.5
2.6
78.1
0.385
0.0128
0.33
2.6
30.04
78.1
5.26
11.3
0.190
0.0089
0.465
5.26
2.148
11.3
14.9
0.125
0.0067
0.537
1.8625
14.9
20
19.1
0.05
0.0053
1.047
20
0.955
19.1
Cuadro 15. Parmetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-Menten,

Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de A.
niger ATCC1015.
Curva
Michaelis-Menten
Vmax
( U/mg min)
0.0158
Km
(mM)
0.0954
Lineweaverburk
13.24
1.6
Eadie-Hoffsten
18.46
7.21
Agustinson
14.64
2.1
Wilkinson*
17.63
3.3
81

En el Cuadro 16 se presentan los valores para la Vmx y Km determinadas para
A. niger y P. decumbens, as como los valores reportados por diferentes autores
para la naringinasa.
Cuadro 16. Constantes de Vmx y Km para la naringinasa producida por

diferentes microorganismos.
Sustrato
Vmx
Km
17.63U/mgmin
3.3mM
2.92
8.4
0.45mol/mgmin
0.1.22mM
p-nitrofenol (4)
20.6 U/mg
2.9 mM
p-nitrofenol (5)
10.7 U /mg
1.52 mM
p-nitrofenol (6)
84U/mg
0.17mM
narignina
(1)
naringina (2)
naringina
(3)
(1) Naringinasa de A. niger. Medio de cultivo adicionado con ramnosa como fuente
de carbono. Regulador de citratos 0.05M, pH=6, 35C, [naringina]=0.00526mM.
U=1mol de glucosa liberada / min (Mtodo de Wilkinson).
(2) Naringinasa de P. decumbens (Sigma). Regulador de citratos 0.05M, pH=4.5,

35C, [naringina]=0.00526mM. U=1mol de glucosa liberada / min (Mtodo de
Wilkinson).
(3) Naringinasa de Penicillium. Decumbens. Glten y col, 2006. Fermentacin

solida. Regulador de acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, 40C. U= 1 mol de glucosa
liberado/ min. (Lineweaberburk).
(4) -ramnosidasa de la naringinasa de A. niger .Manzanares y col, 1997.
Regulador MacIIvaine pH=4.5, 30C.U= mol de ramnosa liberados / min
82

(5) -L-ramnosidasa de Penicillium sp Romero y col, 1985. Regulador de cido.
succnico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30C. U=cantidad de enzima
necesaria para liberar 1mol p-nitrofenol/min.
(6) -L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo
adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50C. U=
cantidad de enzima necesaria para liberar 1mol p-nitrofenol/min. (Michaelis)
En este trabajo se encontr que los valores de Vmx y Km para la naringinasa de

A. niger ATCC1015 (Cuadro16, No.1) coinciden con los encontrados para la
naringinasa de P. decumbens (Cuadro16, No.2), lo que significa que a pesar de
haber una aparente produccin proteica baja para la naringinasa producida por A.
niger, las constantes resultaron ser del mismo orden que las encontradas para la
naringinaa de P. decmbens por lo cual los resultados obtenidos son
comparativamente buenos.
El valor de Vmx reportados por Gallego y colaboradores en el 2001 (Cuadro 16,

No 6) para la -L-ramnosidasa de A. terreus es menor comparada con el obtenido
en el presente trabajo (Cuadro 16, No. 1) sin embargo, la enzima obtenida
presenta una menor afinidad por el sustrato naringina ya que obtuvo una Km
mayor (Cuadro 16, No.1) quiz porque esta enzima no solo presenta la actividad
de -L-ramnosidasa sino tambin la de -glucosidasa.
Por otra parte el valor informado para la -L-ramnosidasa de A. niger por
Manzanares y colaboradores en 1997 y el informado por Romero y colaboradores
en 1985 es menores que el encontrado en el presente trabajo mediante el mtodo
de Wilkinson ya que este engloba de manera estadstica a todos los dems.
El valor de Vmx para la -L-ramnosidasa de A. niger informado por Manzanares y
col. 1997 (Cuadro 16, No.4) es mayor a lo encontrado en el presente trabajo lo
83

que significa que la actividad enzimtica de la enzima encontrada es menor
teniendo ambas actividades (-L-ramnosidasa y -D-glucosidasa).
Glten y col. en el 2006 determinaron las constantes de actividad enzimtica de la

naringinasa de P. decumbens a travs del mtodo de Linewaver-Burk,
encontrando una Km menor a la encontrada, lo que significa que dicha naringinasa
tiene ms afinidad por el sustrato que la que tiene la naringinasa producida
(Cuadro 64, No.3).
Sin embargo todos los autores anteriormente mencionados determinaron la las

constantes de Vmx y Km utilizando un sustrtos inespecficos como el p-nitrofenol,
obteniendo los valores presentes en el Cuadro 16.
84
___________________________________________________________ CONCLUSIONES
V. CONCLUSIONES
El presente trabajo nos permiti encontrar una cepa capaz de producir una enzima
con las caractersticas encontrada en una enzima comercial, por lo que usando
fuentes de carbono econmicas se puede encontrar un nicho que a nivel comercial
puede ser ms rentable.
La prueba presuntiva en cromatografa en capa fina mostr presuntivamente que

la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015 es capaza de producir naringinasa.
Las diferentes fuentes de carbono y la concentracin en la que se emplearon

produjeron naringinasa a partir de A. niger ATCC 1015 como respuesta por parte
del microorganismo a la presencia de compuestos orgnicos que pueden ser
asimilables a travs de estas enzimas.
Cuando se adicionaron las sales de calcio y magnesio se encontr que un factor

determinante para el crecimiento del microorganismo es la concentracin en la
que stas se adicionan.
La fuente de carbono que favorece ms el crecimiento del microorganismo es la

melaza y este crecimiento incrementa cuando se adiciona carbonato de calcio.
La mayor produccin proteica se obtuvo cuando se emple naringina como fuente

de carbono y sta fue favorecida positivamente al adicionar la mezcla de sales.
La mayor actividad enzimtica encontrada fue la de la enzima producida utilizando

el caldo nutritivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono sin adicin de
sales.
Por lo tanto las condiciones que favorecieron el crecimiento del hongo y la

produccin de la protena no fueron las ideales para favorecer la mayor actividad
enzimtica de la naringinasa producida. De acuerdo a lo encontrado las
85
___________________________________________________________ CONCLUSIONES
condiciones ms adversas utilizadas en este estudio para el crecimiento del hongo
favorecieron la produccin de enzima con mayor capacidad de hidrlisis de la
naringina. Lo que significa que no existe relacin alguna entre el crecimiento del
hongo y la actividad enzimtica de la enzima producida. A dems tampoco existe
relacin alguna entre la produccin proteica con respecto una mayor actividad
enzimtica ni entre el crecimiento del microorganismo con respecto a la
produccin proteica. Sin embargo en este trabajo si existi una relacin entre la
actividad enzimtica y la adquisicin de nutrientes por parte del microorganismo.
Debido a que la naturaleza de A. niger es producir acido ctrico, la tendencia

natural del medio de cultivo tiende a ser acida, quizs controlando estas
condiciones puede mejorarse la produccin enzimtica y la actividad de esta y
esto puede lograrse haciendo un escalamiento de dicha produccin a
fermentadores controlados ya que con una aeracin controlada y vigorosa puede
inhibirse la produccin de acido ctrico por este hongo y favorezca la produccin
de naringina. Adems el proceso podra ser optimizado ya que existen
investigaciones que suguieren que la adicin de fuentes de carbono en diferentes
etapas podra proveer mejores resultados en cuanto a la actividad enzimtica de la
naringinasa que se produce utilizando A. niger.
Finalmente mediante este estudio no es posible esclarecer la relacin entre la

concentracin enzimtica y la degradacin del sustrato, enigma que tambin
permanece poco entendible en la literatura.
86
_____________________________________________________________ BIBLIOGRAFA
VI. BIBLIOGRAFA
1) Abarca Ma. L. 2000. Taxonoma e identificacin de especies implicadas en

la aspergillosis nosocomial. Rev Iberoam Micol., 17:S79-S84.
2) Asmar F., F. Eiland and N. E. Nielson. 1994. Effect of extracellular enzyme

activities on solubilization rate of soil organic nitrogen. Biology and Fertility
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3) Atkinson M. R., J.F. Jackson and R. K. Morton. 1961.Nicotinamide

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97
_________________________________________________________________ ANEXOS
ANEXOS
Anexo 1. Curva tipo de protena obtenida por el mtodo de Bradford.
0.8
0.7
0.6
Abs (nm)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
200
400
600
800
1000
1200
microgramos de protena /ml
Figura 1A. Curva tipo de protena donde Y=5.78x + 0.1408; R2=0.9579.
98
_________________________________________________________________ ANEXOS
Anexo 2. Estudio y determinacin de la actividad enzimtica de la naringinasa
comercial de Penicillium decumbens.
2a.1. Estudio del efecto de la concentracin de la naringinasa de P. decumbens en

la velocidad de hidrlisis de la naringina.
El efecto de la concentracin de la naringinasa de P. decumbens sobre la hidrlisis

de naringina (Figura 2A; Cuadro 1A) se observa como el aumento de la
concentracin de enzima adicionada. Esta se refleja en un incremento en la
concentracin de azucares reductores en un mismo tiempo, la concentracin
elegida en base a este experimento para montar la curva tipo de naringina fue de
50 g/ml. A dems tambin se observ que el tiempo de incubacin empleado (15
minutos) provee una medida excesiva del grado de hidrlisis.
Cuadro 1A. Efecto de la concentracin en la velocidad de hidrlisis de la

naringinasa de P. decumbens.
Concentracin
g/ml
10
UK
30
22.33
50
111.33
75
140
100
240
125
248.66
150
263.33
200
269
99
_________________________________________________________________ ANEXOS
300
250
UK
200
150
100
50
0
0
50
100
150
200
250
microgramos glucosa /mililitro de hidrolizado
Figura 2A. Efecto de la concentracin de la naringinasa de P. decumbens en la

hidrlisis de la naringina.
100
_________________________________________________________________ ANEXOS
2a.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la naringina por
la naringinasa de Penicillium decumbens.
Del estudio anterior se seleccion la concentracin de naringinasa de 50 g/ml a
la cual se observ claramente la hidrlisis de la naringina. Esta concentracin fue
elegida para determinar el efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la
naringina por la naringinasa de P. decumbens. Dicha concentracin se mantuvo
constante durante todo el experimento.
El objetivo de realizar el experimento de efecto del tiempo en la velocidad de

hidrolisis de la naringina fue encontrar un tiempo adecuado al cual se llevara a
cabo la hidrlisis de la naringina de manera que fuera suficiente pero no excesiva,
para evitar subestimar o sobrestimar los resultados. En la curva de efecto del
tiempo en la velocidad de hidrlisis (Figura 3A; Cuadro 2A) se observa que a
mayor tiempo de incubacin es mayor el grado de hidrlisis, y que un tiempo
adecuado para montar la curva tipo de naringinasa es de 10 minutos.
Cuadro 2A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la naringina por la

Tiempo
min
5
UK
278.66
10
335.33
20
370.66
30
426.66
40
660
50
926.66
60
1060
101
_________________________________________________________________ ANEXOS
1200
1000
UK
800
600
400
200
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo en minutos
Figura 3A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la naringina por la

102
_________________________________________________________________ ANEXOS
Anexo 3. Curva tipo de naringina.
Para el montaje de la curva tipo de naringina, una vez conocidos tanto la

concentracin de naringinasa a emplear (50 g/ml) y el tiempo de hidrlisis ms
adecuado para observar tal efecto (10 min), se prepar una solucin de
naringinasa en concentracin de 50 g/ml en regulador de citratos 0.005 mM pH
4.5. La concentracin de la naringina empleada fue de 0.005 M y se utilizaron los
siguientes volmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 ml.
Transcurrido el tiempo de incubacin la reaccin fue detenida agregando 4 ml de
DNS y los tubos fueron puestos a ebullicin durante 5 minutos, una vez fros se
llevo a cabo la lectura a 540 nm en un fotocolormetro con filtro verde (Figura 4A).
Los resultados se muestran en el Cuadro 3A.
Cuadro 3A. Curva tipo de naringina.

Naringina
0.0005 M
(ml)
0.05
UK
promedio
83
g de glucosa
producida/ml de
naringina hidrolizada
110.273
0.1
109
155.293
0.2
136
200.462
0.4
155
232.996
0.6
178
272.380
0.8
197
304.332
219
344.948
1.2
240
381.155
1.4
260
415.637
1.6
283
455.293
1.7
294
474.258
1.8
305
510.465
1.9
316
512.189
103
_________________________________________________________________ ANEXOS
350
300
250
UK
200
150
100
50
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
1.6
1.8
microgramos de glucosa producida/ml de naringina hidrolizada
Figura 4A. Curva tipo de naringina, Y= 129.22+ 80.535, R2= 0.921.
104
_________________________________________________________________ ANEXOS
Anexo 4. Curva tipo de glucosa.
700
600
UK de glucosa
500
400
300
200
100
0
0
200
400
600
800
1000
1200
microgramos de glucosa /ml
Figura 5A. Curva tipo de Azcares reductores obtenida por el mtodo del cido
3,5-dinitro saliclico (DNS) donde Y=0.6456x - 2.2889; R2=0.987.
105
_________________________________________________________________ ANEXOS
Anexo 5. Determinacin de las constantes de Vmx y Km para la naringinasa de
P. decumbens por los mtodos grficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,
Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.
Cuadro 4A. Parmetros Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen y

Agustinson para la naringinasa de P. decumbens.
Michaelis-Menten
Lineweaber-Burk
Agustinson
Eadie-Hofsteen
[s] mM
V g/min
1/[S]
1/V
[S]/V
V/[S]
1.51
132.2
0.66
0.00358
0.0054
1.5
309
154.5
154
0.5
0.00324
0.0065
357
142.8
0.5
214.4
0.4
0.0028
0.007
2.5
385
128.33
244
0.33
0.0026
0.0078
424
121.1
1.5
279.5
0.29
0.00236
0.0083
3.5
465
116.3
309
0.25
0.00215
0.0086
--
2.5
357
--
--
--
--
--
385
--
--
--
--
--
3.5
424
--
--
--
--
--
465
--
--
--
--
--
4.5
540
--
--
--
--
--
106
_________________________________________________________________ ANEXOS
Cuadro 5A. Parmetros de Vmx y Km para las curvas de Michaelis- Menten,
Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de
P. decumbens.
Curva
Vmax
Km
Lineweaver-Burk
3.968
2.5
Eadie-Hofsteen
4.379
4.8
Agustinson
4.88
3.7
Wilkinson
2.92
8.4
La Vmx esta expresada en U/mg protena donde una U = cantidad de enzima

para liberar 1mol de glucosa/ min.
107
_________________________________________________________________ ANEXOS
600
500
g/ min
400
300
200
100
0
0
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
mM
Figura 6A. Curva de MichaelisMenten para naringinasa de Penicillium

decumbens donde Y= 83.256x+145.42; R2=0.9842.
108
_________________________________________________________________ ANEXOS
0.004
0.0035
0.003
min/g
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
mM-1
Figura 7A. Curva de Lineweaber-Burk para naringinasa de Penicillium decumbens

Y= 0.0035x+0.0014; R2=0.9722.
109
_________________________________________________________________ ANEXOS
500
450
y = -3.703x + 879.0
R = 0.949
g/min
400
350
300
250
110
115
120
125
130
135
140
145
150
155
160
g/minmM
Figura 8A. Curva de Eadie-Hofsteen para naringinasa de Penicillium

decumbens.
110
_________________________________________________________________ ANEXOS
0.009
0.0085
0.008
mM
0.0075
y = 0.001x + 0.004
R = 0.978
0.007
0.0065
0.006
0.0055
0.005
1.5
2.5
3.5
4.5
minmM/g
Figura 9A. Curva de Agustinson para naringinasa de Penicillium decumbens.
111

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Instituto Politcnico Nacional

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

POSGRADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS

EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA

Maestra en Ciencias de los Alimentos

Q. A. RAQUEL GONZLEZ VZQUEZ

El trabajo experimental se realiz en el laboratorio de Tecnologa de

Fue dirigido por la Dra. Yadira Rivera Espinoza y por la M. en C.

Agradezco a CONACyT, institucin que me apoy econmicamente.

Agradezco al programa de formacin de investigadores PIFI del IPN

II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos................ 6

II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos..............

II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.............................. 8

II. 2.Mtodos fisicoqumicos del sabor amargo en los jugos de frutas

II. 4.1. Caractersticas del gnero Aspergillus.............................................

II. 5. Factores que influyen en la produccin de naringinasa......................

II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa...................................................

II. 7. Actividad enzimtica y constantes de Km y Vmx reportadas para la

II. 8. Mtodos para determinar la actividad enzimtica de la naringinasa...

II. 8.1 Modelos grficos para la determinacin de la actividad enzimtica.. 18-19

II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten..........................................................

II 8.1.1.1 Determinacin de las contantes de MichaelisMenten................

II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk...........................................................

II 8.1.2.1Determinacin de las contantes de Lineweaber-Burk...................

II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen.............................................................

II 8.1.3.1. Determinacin de contantes de Eadie-Hofsteen.........................

II 8.1.4. Modelo de Agustinson....................................................................

II 8.1.5 Modelo de Wilkinson........................................................................ 27-28

III. Materiales y mtodos...........................................................................

III.1 Desarrollo experimental........................................................................

III.2 Materias primas....................................................................................

III.3 Material de laboratorio y reactivos........................................................

III.5.1 Evaluacin preliminar de la capacidad productora de naringinasa

III.5.1.1 Determinacin del mejor disolvente que permite la ascendencia

III.5.2 Recuperacin de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo

III.5.3 Preparacin del inculo de A. niger por medio de turbidimetria........

III.5.4 Fermentaciones para la produccin de naringinasa por medio de

III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de

III.6 Mtodos analticos................................................................................

III.6.1 Determinacin de protena en el medio de cultivo............................. 40

III.6.1.1 Preparacin del reactivo de Bradford............................................

III.6.1.2 Patrn de albmina srica bobina (ASB)........................................ 40-41

III.6.2 Determinacin de la actividad enzimtica de la naringinasa

III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentracin de naringinasa de

III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrlisis de la

III.6.2.3 Curva tipo de naringina................................................................... 43

III.6.2.4 Determinacin de las constantes de Vmx y Km para la

III.6.3 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa producida por

III.6.4 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa producida por

III.6.5 Anlisis estadstico para determinar la confiabilidad de los

IV.1 Evaluacin de la capacidad productora de naringinasa de la cepa

IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la

IV.1.4 Evaluacin de la degradacin de la naringina por la naringinasa

IV.2 Recuperacin de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo

IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de

IV.4 Determinacin de protena en el medio de cultivo por el mtodo de

IV.5 Estudio de la actividad enzimtica de la naringinasa de A. niger en

VI. Bibliografa............................................................................................ 87-97

Anexo 1. Curva tipo de protena obtenida por el mtodo de Bradford........ 98

Anexo 2. Estudio y determinacin de la actividad enzimtica de la

Anexo 3. Curva tipo de naringina................................................................ 103-104

Anexo 4. Curva tipo de glucosa..................................................................

Anexo 5. Determinacin de las constantes de Vmx y Km para la