Clonagem de DNA

1 - Formar DNA recombinante

Bactrias esto sobre constante ataque de

bacterifagos (virus).
bacterifago
s
bacterifago
s

bacterifago
s
bacterifago
s
bacterifago
s

Enzimas de restrio
Para se protegerem muitas desenvolveram um sistema
para destruir DNA estranho (por ex dos
bacterifagos, impedindo assim o seu ataque).

So endonucleases--(enzimas de restrio, porque

restringem a infeco por bacterifagos)
Corta qualquer DNA que entra na bactria

PORQUE No destrudo o seu prprio DNA?

Possuem um gene que impede as Enz Rest de atacar o prprio DNA
cromossomal

2- Uso de plasmdeos

3 - Transformao

(vectores de clonagem)

4 - Reconhecimento

dos clones transformados

Transformao
Preparao de clulas
competentes

E.Coli- clula
hospedeira

cromossoma

Transformao qumica
- CaCl2 e choque trmico
Transformao elctrica
- Choques elctricos

Adio de DNA
recombinante
construdo in vitro

Transformao
Situaes que podem ocorrer:

1
3

1. E.Coli + DNA recombinante

2. E.Coli + plasmdio
3. E.Coli sem plasmdio
Lima, N.; Mota, M. 2003. Biotecnologia. Fundamentos e Aplicaes. Edies Tcnicas. pp. 130.

Que estratgias utilizar para seleccionar as

clulas com DNA recombinante?
Marcas de seleco do vector

Resistncia a antibiticos
- Ampicilina

Insero de DNA
estranho

Lac Z
AmpR

Actividade da -Galactosidase
(gene Lac Z)

Origem de
replicao

www.science.uwaterloo.ca/course-notes/biology

Resistncia ampicilina
Transformao

Seleco das clulas com

plasmdios

Clula com
plasmdio

Clulas sem
plasmdios

Clula com
plasmdio

Como seleccionar
as clulas com
DNA
recombinante?
Meio de cultura com ampicilina
www.science.uwatterloo.ca/course-notes/biology

Actividade da -Galactosidase
Gene Lac Z
desintegrado

Gene Lac Z
intacto
-Galactosidase

-Galactosidase

X-Gal

Pigmento azul
Meio de cultura com
ampicilina

+
X-Gal
www.science.uwatterloo.ca/course-notes/biology

Seleco dos clones

Pontos de Discusso
Questes:
Quantos fragmentos se obtm do DNA de um organismo?
Quantos clones podero existir?
Como procurar o Clone que nos interessa?
E se houver pouco material?
Como restringir a escolha?

Hibridizao DNA
Como encontrar a colnia com o gene
de interesse?
Master plate

Solution
containing
probe

Colonies
containing
gene of
interest

Radioactive
single-stranded
DNA

Probe
DNA

Gene of
interest
Filter

Filter lifted
and flipped over

A special filter paper is

pressed against the
master plate, transferring
cells to the bottom side of
the filter.

Hybridization
on filter

The filter is treated to break

open the cells and denature
their DNA; the resulting
single-stranded DNA
molecules are treated so that
they stick to the filter.

Master plate

Single-stranded
DNA from cell
The filter is laid
under photographic
film, allowing any
radioactive areas to
expose the film
(autoradiography).

After the developed

film is flipped over,
the reference marks
on the film and master
plate are aligned to
locate colonies
carrying the gene of
interest.