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1996
RESUMEN
Con la finalidad de probar las tcnicas ELISA clsica y DOT -ELISA en el diagnstico de la
brucelosis, el antgeno crudo LPS-S se fij en micro placas de polyestireno y en papel de
nitrocelulosa y se enfrent a diferentes muestras de suero. Se utilizaron en ambas pruebas
301 sueros porcinos de distintas granjas del estado Aragua, clasificados en tres grupos:
Grupo I, 50 sueros de cerdos con evidencia clnica de brucelosis. Grupo II, 65 sueros sin
evidencia clnica, pero reaccionantes con ttulos bajos de anticuerpos. Grupo III, 186 sueros
no reaccionantes a ninguna prueba y sin evidencias clnicas. Despus de incubar con el
conjugado anti-IgG porcino -peroxidasa, lavar y luego adicionar el sustrato, fueron
considerados los sueros reaccionantes a una DO superior de 0, 153 para ELISA o la aparicin
de una mancha violacea sobre un fondo blanco en DOT -ELISA. La concentracin ptima del
antgeno fue de 50 ng para ELISA clsica, de 150 ng para DOT-ELISA y la dilucin ptima del
suero fue de 1:100 y 1:400, respectivamente. Los 301 sueros mostraron diferentes
reactividad; en el Grupo I, ELISA clsica detect anticuerpos en el 62% de los sueros y 52%
en DOT -ELISA. En el Grupo II, ELISA clsica slo detect en el 6,2% de los sueros y en el
Grupo III no se detectaron anticuerpos en ambas pruebas. La efectividad de los ensayos
inmunoenzimticos fueron comparados con las pruebas convencionales utilizadas en el
diagnstico de brucelosis, tomando como referencia la prueba de aglutinacin en placa. La
sensibilidad relativa para ELISA y DOT-ELISA en el Grupo I fue de 80% y 84%, mientras que
la especificidad relativa fue de 56% y 80%, respectivamente. En el Grupo II hubo
superioridad en la sensibilidad en las pruebas convencionales sobre las inmunoenzimticas.
Palabras Clave: Brucelosis; suinos; diagnstico.
INTRODUCCIN
La brucelosis porcina es una zoonosis de origen bacteriano causada por Brocella suis. Se
caracteriza por afectar el aparato reproductivo, provocando aborto, retencin de placenta,
muerte embrionaria, repeticin de celo, descarga vaginal, orquitis y disminucin de la
eficiencia reproductiva.
El diagnstico est basado en pruebas serolgicas de seroaglutinacin y de fijacin de
complemento, las cuales presentan dificultades para establecer un diagnstico adecuado en
animales recientemente infectados o en estado crnico, debido a su inespecificidad,
estandarizacin y costo.
Como alternativa ha surgido la tcnica de ELISA que ha sido adaptada para un gran nmero
de enfermedades (ENGVALL y PERLMANN, 1972), pero presenta como desventaja et alto
costo en los materiales que utiliza (VOLLER et al., 1979). Debido a esto se ha desarrollado
un sistema ms simple y menos costoso, reemplazando slo las placas de plstico que
sirven de soporte por papel de nitrocelulosa. Esto se conoce como DOT -ELISA y es
ampliamente aceptado por su gran versatilidad y rapidez (PAPPAS et al., 1983).
Con el objetivo de evaluar el uso de las tcnicas iomunoenzimticas en el laboratorio y en el
campo, en esta investigacin se utilizaron ambas tcnicas con la finalidad de detectar
anticuerpos anti-Brucella en sueros porcinos, estandarizndolas bajo una serie de
parmetros y comparndolas con las pruebas serolgicas convencionales para el diagnstico
de la brucelosis porcina.
MATERIALES Y MTODOS
Preparacin del antgeno
La cepa de B. abortus lisa 1119-3, donada por el Laboratorio de Produccin de
Inmunobiolgicos del Instituto de Investigaciones Veterinarias, fue utilizada para la
obtencin del antgeno (LPS-S). Se inocularon placas de agar triptosa y tubos con agar
papa, los cuales se incubaron por 48 h a 37C. A las 48 h se cosech la bacteria con
solucin buffer (PBS, pH 6,4).
Luego se inocularon en frasco de Roux con agar papa y paralelamente se cheque la pureza
y disociacin de las colonias. Al trmino de 48 h a 37C, se realiz la cosecha con buffer PBS
ms fenol al 0,5% y se centrifug a 2.500 xg por 15-20 min, a 4C.
Extraccin del LPS-S
Fue obtenido segn el mtodo Westphal descrito por BAKER y WILSON (1965), el cual
brevemente se resume: 9,3 g del material antignico obtenido fueron resuspendidos en 300
ml de agua destilada y en 300 ml de fenol al 90% y colocados en bao de Mara a 67-68C
en agitacin vigorosa por 15 min. Luego fue enfriado y centrifugado a 2.500 x 9 por 45 min.,
a 4C, obtenindose una fase acuosa y otro fenlica. La fase fenlica fue filtrada mediante
vaco en papel Whatman N3 y al filtrado se le aadi tres volmenes (150 ml) del reactivo
metanol fro, y se agit por 5-10 min. a 4C. Posteriormente, el material obtenido fue
centrifugado a 2000 x 9 por 15 min. y el precipitado obtenido fue resuspendido en 80 ml de
agua destilada y dejado toda la noche en agitacin a 4C.
Luego se realizaron tres lavados a 2.500 x 9 por 20 min., conservndose el sobrenadante
de cada lavado. Los tres sobrenadantes en un pool fueron sometidos a dilisis con varios
cambios de agua destilada, luego pervaporado a temperatura ambiente para un volumen
final de 50 ml. Al producto resultante se le aadi dos volmenes de metanol fro (120 ml),
el cual fue dejado por 2 h a 4C. El precipitado obtenido fue centrifugado a 2.500 x 9 por 15
min, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento resuspendido en 20 ml de agua destilada
para su liofilizacin en alcuotas de 2 1 por frasco.
Sueros
Se utilizaron 301 sueros de porcinos de diferentes granjas del estado Aragua que fueron
identificados por pruebas de aglutinacin en placa (AP), en tubo (AT) y pruebas
complementarias de 2-mercaptoetanol (2-ME) y card test (CT) y clasificados en tres grupos
con los siguientes criterios: Grupo I: formado por 50 sueros de animales que presentaron
evidencias clnicas de sufrir brucelosis, con historia de abortos, repeticin de celo y
nacimiento de animales dbiles. Grupo II: constituido por 65 sueros de piaras que tenan
antecedentes de animales reaccionantes con ttulo bajo (1:25 y/o 1:50) a la prueba en
placa, pero sin evidencia clnica de brucelosis. Grupo III: integrados por 186 sueros de
animales no reaccionantes a ninguna prueba y sin evidencia clnica de brucelosis.
Se usaron sueros controles positivos, negativos y para reactivos. Todos- los sueros fueron
diluidos en forma seriada en PBS- TWEEN 20 al 0,05%.
Procedimiento para ELISA Indirecto (Clsico)
Se utilizaron diferentes concentraciones de antgeno LPS en un rango entre 12,5
nanogramos y 100 ng/l00 l, preparados en buffer carbonato- bicarbonato 0,2 M (pH 9,6),
colocados en los pozos de microplacas de polyestireno (96 Flat Botton well-Limbro- TitertekFlow Lab. INC) e incubado por 1 h a 37C y por 18 h a 4C, luego las placas fueron lavadas
con 300 l de PBS- TWEEN 20 0,05%. Los pozos de la microplaca con el antgeno fueron
bloqueados por 1 h a temperatura ambiente con solucin PBS-Seroalbumina de bovino al
0,5%. Una vez eliminada la solucin bloqueadora, las diferentes concentraciones de
antgeno fueron enfrentadas a diferentes diluciones de sueros (1:50,1:100, 1:200) diluido
en PBS- TWEEN 20 -0,05% por 1 h a temperatura ambiente.
Las diluciones de sueros fueron aspirados y lavados tres veces con solucin PBS- TWEEN
-0,05%, despus del lavado se agregaron 100 l del conjugado anti IgG porcina
-peroxidasa diluido 1:2000 en PBS- TWEEN 0,05% (mxima dilucin que recomienda la casa
productora) por 1 h a temperatura ambiente, se repitieron los lavados con PBS- TWEEN
-0,05% y por ltimo se aadieron 100 l del sustrato Orto-fenil-endiamina (OPD) en buffer
citrato (pH 5) y H2O2 al 30% por 10, 15 y 20 min. Al finalizar el perodo de incubacin se
agregaron 50 l de H2SO4 ( 4N) para detener la reaccin enzimtica. Finalmente se ley la
densidad ptica (DO) producida por la reaccin y coloracin del cromgeno en un lector de
ELISA (Titertek Multiskan) con 492 nm.
Procedimiento para DOT -ELISA
Se utilizaron diluciones seriadas del antgeno LPS (12-0,00024 , g/microgota) preparados
en PBS. Tiras de membrana de nitrocelulosa fueron divididos en pequeos cuadrados de 8 x
8 mm (BIO-RAD/LAB-CAT 162-0112) y sumergidas en agua destilada por 10 min y luego en
PBS (pH 7,6) por 30 min. Las tiras fueron secadas al aire a temperatura ambiente, una vez
seca se aadi al antgeno depositando 2 l. Las tiras fueron procesadas a las 18-24 h o
guardadas a 20C para su posterior anlisis. En cualquier caso, las tiras fueron bloqueadas
con PBS- TWEEN 20 al 0,05% por 1 h en agitacin continua, para luego dejar secar a
temperatura ambiente.
Posteriormente, 300 l de diferentes diluciones del suero (1:25 -1:3.200) fueron colocados
sobre el cuadro de papel de nitrocelulosa con el antgeno en placas de cloruro de polivinil
con excavaciones de 0,5 ml de capacidad, por 1 h a 37C en agitacin lenta; luego las tiras
fueron lavadas 3-5 veces con PBS-TWEEN-0,05% y seguidamente 200 1 del conjugado antiIgG porcina -peroxidasa diluida 1:2000 como en el ELISA clsico, fue agregado e incubado
por 1 h a temperatura ambiente.
Se repitieron los lavados con PBS- TWEEN-0,05% y se aadieron 200 l de la solucin
sustrato (4-cloro-naftol), que consisti de 3 mg de 4-cloro-1- naftol en metanol y diluido 1:3
en PBS (pH 7,6) ms 151.11 de H2O2 (30%). El color desarroll en 20 min y las tiras fueron
lavadas con agua destilada, aspirando luego el contenido. La aparicin de una mancha color
violeta sobre un fondo blanco del papel de nitrocelulosa fue considerado como reaccionante
en referencia al control negativo (sin mancha).
Se determin la efectividad de los mtodos de diagnstico utilizados en la brucelosis
porcina, estimando la sensibilidad, especificidad y concordancia de cada una de las pruebas
sobre sueros del Grupo I, tomando como referencia la prueba de aglutinacin en placa y
utilizando para su clculo la tabla de contingencia de doble entrada (2 x 2). Los resultados
obtenidos en cada mtodo serolgico fueron comparados con los obtenidos en la prueba de
aglutinacin en placa.
El criterio de sensibilidad se estableci sobre la base del valor obtenido al medir la
proporcin de sueros reaccionantes provenientes de cerdos realmente infectados; para
especificidad, se tom el valor conseguido al medir la proporcin de sueros no reaccionantes
provenientes de cerdos que realmente no estaban infectados, y para concordancia, se
estableci el valor expresado en trminos de la proporcin de menos reaccionantes y no
reaccionantes que fueron detectados con cada uno de los mtodos.
Se consider que un animal estaba infectado cuando por la prueba de AP resultaba
reaccionante, adems de provenir de granjas con animales con signos clnicos de una
probable brucelosis. La sensibilidad, especificidad y concordancia fue calculada de acuerdo al
estado de infeccin y al resultado de la prueba serolgica evaluada con respecto a la prueba
en placa, tomando en consideracin los criterios de por RUPPANERet al. (1980) y MARQUEZ
(1987) (Cuadro 1).
Resultados de
la Prueba
N de
Infectado
infectados
Evaluada
Reaccionante
Total
a+b
No reaccionante
d+b
Total
a+c
d+b
..
a: Infectado y reaccionante
b: No infectado y reaccionante
c: Infectado y no reaccionante
d: No infectado y no reaccionante
a + b: Total de infectados con reaccionantes y no reaccionantes
b + d: Total de no infectados con reaccionantes y no reaccionantes.
Sensibilidad: a/a + c
Especificidad: d/b + d
Concordancia: a + d/Total de sueros
RESULTADOS
Determinacin de la concentracin ptima del antgeno y dilucin del suero en
ELISA clsica
Se observ que a medida que disminua la concentracin de antgeno, decrecan los valores
de densidad ptima (DO). El mismo fenmeno ocurri al aumentar las diluciones del suero.
De todas las combinaciones utilizadas entre la concentracin de antgeno y la dilucin del
suero, en la que se observ mayor diferencia entre el suero reaccionante y el suero no
reaccionante fue en la concentracin de 50 ng y dilucin de 1:100, respectivamente, con
una densidad ptica para el suero reaccionante de 1,002 y de 0,055 para el suero no
reaccionante, siendo la diferencia 18 veces mayor el reaccionante que en el no reaccionante
(Figura 1). La dilucin del conjugado encontrado ptima fue de 1:2000. En todos los sueros
no reaccionantes dio resultados negativos con todas las concentraciones de antgeno
utilizadas.
Con respecto a la reproducibilidad, 10 sueros reaccionantes a Brucella por las pruebas de
aglutinacin en tubo, 2-mercaptoetanol y card test se probaron tres veces y el nivel de
reactividad no present cambios significativos entre los experimentos.
corte correspondi a la menor dilucin del suero utilizado en la cual no hubo reaccin ni con
el suero reaccionante a bajo ttulo ni con el suero no reaccionante.
Los sueros del Grupo I analizados por los ensayos inmunoenzimticos, pruebas
convencionales y complementarias, mostraron diferente reactividad frente a cada uno de
ellas; hubo sueros que resultaron reaccionantes a las seis pruebas utilizadas, en tanto que
otras fueron negativos a todas producindose un gradiente intermedio con sueros
reaccionantes a uno, dos, tres, cuatro o cinco mtodos simultneamente (Cuadro 2). En el
Grupo II la reactividad fue diferente ya que hubo una mayora de sueros, que resultaron
reaccionates a dos pruebas y pocos a una prueba y tres pruebas (Cuadro 3). En el Grupo III
no hubo reactividad en los sueros probados.
En el Grupo I, la prueba de ELISA detect anticuerpos en el 64% de los sueros probados,
52% por DOT -ELISA, 50% en la prueba de aglutinacin en placa, 42% en tubo, 30% en 2
ME y 18% en card test. En el Grupo II, slo ELISA detect anticuerpos en el 6,2% de los
sueros, en placa el 60% y en tubo el 56,9%; con DOT -ELISA, 2-ME y CT no se logr
detectar anticuerpos en los sueros probados (Cuadro4).
Grupo I
Total
..
AP
AT
ME
CT
EIP
EIN
14
28
02
06
12
02
01
05
10
01
02
02
08
16
Todos negativos
07
14
Total
50
100
CUADRO 3. Resultados obtenidos en 115 sueros porcinos provenientes de los grupos I y II frente a seis
pruebas serolgicas
La sensibilidad relativa de cada una de las pruebas sobre sueros del Grupo I, tomando
como referencia la prueba en placa fue de 80% para ELISA,84% para DOT -ELISA, 84%
para prueba en tubo, 60% para 2-ME y 36% para CT .En relacin a la especificidad relativa
para ELISA fue de 56%, de 80% para DOT -ELISA y de 100% para la prueba en tubo, 2-ME
y CT (Cuadro 5).
Correlacin de ELISA y DOT -ELISA:
Noventa sueros porcinos reaccionantes a Brucella con ttulo alto (1:400), ttulo bajo (1:25
-1:50) y no reaccionante fueron utilizados a la dilucin de 1:100 con una concentracin de
antgeno de 150 g/microgota para DOT - ELISA y de 50 g/pozo para ELISA ambas
pruebas fueron conjugadas en la deteccin de anticuerpos anti IgG para Brucella; los
resultados mostraron una buena correlacin entre el gradiente visual de la prueba DOTELISA y la DO de la ELISA clsica (Cuadro 6).
El tiempo ptimo de incubacin para ambas pruebas, incluyendo antgeno, suero y
conjugado fue entre 30 y 60 min.
En lo que respecta a la conservacin, los discos o tiras de nitrocelulosa con el antgeno
guardado a -20C o 4C, por 18 das o ms, no mostraron prdida significativa en la
reactividad del ensayo. Por otra parte, las tiras o discos coloreados pueden ser mantenidos
en la obscuridad por ms de 1 ao a temperatura 0 a -20C sin afectar la estabilidad del
color desarrollado.
DISCUSIN
Diferentes investigaciones en donde se ha utilizado la prueba de ELISA para la deteccin de
anticuerpos contra B. abortus en sueros de bovinos han demostrado que la misma es ms
sensible que otras pruebas convencionales para la identificacin de animales infectados
(EYRD et al. , 1979; MAGEE, 1980; RUPP ANNER et al., 1980).
Contrastando con la abundante informacin existente sobre el diagnstico serolgico de la
Sensibilidad
Especialidad
relativa %
Relativa %
Aglutinacin en tubo
84
100
92
2 - Mercaptoetanol
60
100
80
Card- Test
36
100
68
Elisa Clsica
80
56
68
Dot - ELISA
84
80
82
Tcnicas Serolgicas
Concordancia
Sensibilidad relativa
Especialidad
Relativa %
Aglutinacin en tubo
84
100
2 - Mercaptoetanol
60
100
Card- Test
36
100
Elisa Clsica
80
56
Dot - ELISA
84
80
Tcnicas Serolgicas
Grupo II
Aglutinacin en tubo
100
93
2 - Mercaptoetanol
---
---
Card- Test
---
---
Elisa Clsica
10,8
100
Dot - ELISA
---
---
DOT .ELISA
ELISA (DO)
N sueros
(+)
492 nm
procesados
++++
0,90
18
+++
0,50 - 0,89
08
0,20 - 0,49
04
0,16 - 0,19
30
0,02 - 0,15
(C.N)30
10
11
12