Instruo es

para a realizaa o do teste

ra pido imunocromatogra ico Alere
para diagno stico sorolo gico da
leishmaniose visceral canina

Elaboraao
Andreza Pain Marcelino
Job Alves de Souza Filho
Servio de Doenas Parasitrias
Laboratrio de Referncia Nacional em Diagnstico
da Doena de Chagas e Leishmaniose Visceral
IOM - FUNED

Colaboraao
AlereTM
Marcelo Santos Genelhu
Responsvel tcnico AlereTM
Ministrio da Sade
Secretaria de Vigilncia em Sade
Grupo Tcnico das Leishmanioses (GT-Leishmanioses)
UVTV/CGDT/DEVIT
Lucas Edel Donato
Referncia tcnica GT-Leishmanioses

Belo Horizonte
Agosto/2015

Instruo es para a realizaa o do teste

ra pido imunocromatogra ico Alere para
diagno stico sorolo gico da leishmaniose
visceral canina

Sumrio
1.1. Agente etiolgico ................................................................... 2

Conceitos bsicos da

1.2. Vetores ................................................................................... 2

Leishmaniose Visceral (LV)

1.3. Principal reservatrio - Leishmaniose visceral canina (LVC) .. 2

e instrues para a

2. Teste rpido imunocromatrogrfico (TRI) para LVC ..................... 4

realizao do teste rpido

2.1. TRI Alere Leishmaniose .......................................................... 5

imunocromatogrfico

2.2. Apresentao do kit TRI Alere ................................................ 5

(TRI) para o diagnstico

2.3. Coleta e preparao da amostra ............................................ 6

da Leishmaniose Visceral

2.4. Procedimentos para a realizao do TRI Alere ...................... 8

Canina (LVC)

2.5. Leitura e interpretao dos resultados ................................ 10

2.6. Precaues ........................................................................... 13
3. Consideraes Finais ................................................................... 13
4. Referncias bibliogrficas ........................................................... 14

Instrues para a realizao do teste rpido imunocromatogrfico Alere para

diagnstico sorolgico da leishmaniose visceral canina

1.Aspectos gerais da leishmaniose visceral (LV) ............................... 2

.Aspectos gerais da leishmaniose visceral (LV)

A leishmaniose visceral (LV) uma zoonose causada por protozorios do
gnero Leishmania e transmitida aos animais e humanos por insetos flebotomneos.
A LV caracterizada por febre alta, perda substancial de peso, anemia,
hepatomegalia e esplenomegalia. Se deixada sem tratamento, a forma visceral tem
uma taxa de letalidade prximo a 100%. Mundialmente, h uma estimativa de 400 mil
novos casos de LV por ano, sendo que, cerca de 97% dos casos de LV nas Amricas

1.1. Agente etiolgico

A leishmaniose causada por protozorios da famlia Tripanosomatidae,
gnero Leishmania. Nas Amricas, a Leishmania (Leishmania) infantum chagasi a
espcie comumente envolvida na transmisso da LV.

1.2. Vetores
Os seres humanos so infectados atravs da picada de flebotomneos, que
geralmente se reproduzem em solos midos de reas florestais ricos em matria
orgnica ou em tocas de pequenos roedores (Figura 1). No Brasil, duas espcies
esto relacionadas com a transmisso da doena, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia
cruzi, sendo o L. longipalpis a principal espcie transmissora da Leishmania infantum.
Durante o repasto sanguneo a fmea do flebotomneo ingere macrfagos parasitados
por Leishmania que, no intestino do vetor, seguem o ciclo necessrio para o seu
desenvolvimento. Posteriormente ocorre a contaminao de seres humanos e animais
pela picada do flebtomo infectado.

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diagnstico sorolgico da leishmaniose visceral canina

ocorrem no Brasil.

1.3. Principal reservatrio - Leishmaniose visceral canina (LVC)

Nas ltimas dcadas, a LV tem passado por um processo de urbanizao e os
ces (Canis familiaris) so considerados os principais reservatrios responsveis pela
persistncia da LV nas reas endmicas. Surtos de infeces humanas so
comumente associados presena de ces soropositivos. A permanncia de ces
peridomiclio e em reas prximas a florestas so os principais fatores de risco para a
infeco canina.

A doena no co de evoluo lenta e incio insidioso. A leishmaniose visceral

canina (LVC) uma doena sistmica severa e as manifestaes clnicas so
dependentes do tipo de resposta imunolgica expressa pelo animal infectado. O
quadro clnico dos ces infectados apresenta um espectro de caractersticas clnicas
que varia do aparente estado sadio a um severo estgio final.
Classicamente a LVC se manifesta por leses cutneas, principalmente
descamao, eczema e pequenas lceras localizadas mais frequentemente nas
orelhas, focinho, cauda e articulaes. O pelo pode ficar opaco. Nas fases mais
da

esplenomegalia,

doena,

observa-se

linfoadenopatia,

com

alopecia,

grande

frequncia:

dermatites,

lceras

onicogrifose,
de

pele,

ceratoconjuntivite, hiperqueratose, coriza, apatia, diarria, hemorragia intestinal,

edema de patas e vmito. Na fase final da infeco, pode ocorrer paralisia das patas
posteriores, caquexia, inanio e morte. Entretanto, ces infectados podem
permanecer sem sinais clnicos por um longo perodo de tempo.

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diagnstico sorolgico da leishmaniose visceral canina

adiantadas

3
Figura 1 Foco e transmissores da leishmaniose.

'. Teste ra pido imunocromatrogra fico (TRI) para LVC

O diagnstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) complexo, devido
presena de sinais clnicos no especficos e a presena de ces assintomticos.
Portanto, o uso de testes que combinam velocidade, sensibilidade, especificidade e
exijam o mnimo de equipamentos e complexidade de realizao, tais como os testes
rpidos imunocromatograficos (TRIs), ganharam grande importncia.
Uma das abordagens para diagnosticar a LV envolve TRIs que detectam

de um antgeno especfico produzido pelo complexo Leishmania donovani e foi

utilizada nas duas ltimas dcadas para o diagnstico sorolgico. Estes testes so
rpidos, apresentam o resultado em aproximadamente 20 minutos, minimamente
invasivos e, normalmente, necessitam de apenas uma gota de sangue total ou soro,
sendo assim, adequados para o uso no campo.
O DPP (Dual Path Platform, Bio-Manguinhos/FIOCRUZ) para LVC um TRI
que usa a protena recombinante rK28 (antgenos rK9, rK39 e rK26) como antgeno.
Aps ensaio de validao multicntrica ocorrida em 2011, o TRI DPP se tornou o
teste recomendado pelo Programa de Vigilncia e Controle da Leishmaniose
Visceral/Ministrio da Sade no Brasil para a triagem de casos de LVC.No entanto,
atualmente a produo de TRI DPP no est atendendo a demanda nacional de
diagnstico, e alternativas diagnsticas so necessrias para manter as atividades de
vigilncia e controle da LV. Para ser utilizado no diagnstico da LVC os kits
diagnsticos necessitam de ter registro no Ministrio da Agricultura, Pecuria e
Abastecimento. No mercado atual est disponvel comercialmente, com este registro,
o TRI de plataforma nica produzido pela empresa AlereTM, que possui similaridade

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imunoglobulina G (IgG) que se ligam protena recombinante rK39. A rK39 derivada

ao TRI DPP quanto sua composio antignica, a protena recombinante K28,

fornecendo uma nova opo de TRI para o diagnstico da LVC.

2.1. TRI Alere Leishmaniose

Alere Leishmaniose Ac Test Kit um imunoensaio imunocromatogrfico para
deteco qualitativa de anticorpos anti Leishmania infantum, atravs da protena
recombinante rK28 (antgenos rK9, rK39 e rK26) em amostras de soro, plasma ou
sangue total canino, com resultados qualitativos (positivo ou negativo) para o
diagnostico animal.

O kit Alere Leishmaniose fornece os seguintes componentes (Figura 2):

1)
2)
3)
4)
5)

5 ou 10 Cartes de resultados
5 ou 10 Tubos de amostra descartveis com EDTA
1 Frasco com soluo tampo de teste
5 ou 10 Dispositivos de teste
5 ou 10 Tubos capilares de 10 microlitros (L)

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2.2. Apresentao do kit TRI Alere

Figura 2 Componentes do Alere Leishmaniose Ac Test Kit.

Nota: as lancetas para coleta de sangue capilar sero

fornecidas juntamente com o kit, como um anexo, portanto
sua descrio no consta na embalagem do produto.

2.3. Coleta e preparao da amostra

Amostras de sangue
Para realizao do teste no campo, pode-se utilizar a lanceta para a obteno
de sangue capilar a partir da orelha, patas ou rabo do animal e em seguida utilizar os

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tubos capilares para coletar 10l de sangue (Figura 3).

Figura 3 Coleta de sangue capilar para realizao do TRI Alere no campo

Ateno!
Para o uso de sangue a fresco, colocar a amostra imediatamente aps a coleta
na plataforma teste. Desta forma evita-se a formao de pequenos cogulos
que podem interferir no desempenho do teste diagnstico.

Para realizao do teste no laboratrio/UVZ, poder ser coletado sangue total

em tubos com anticoagulante, ou em tubos sem anticoagulante para obteno do
soro, usando o procedimento padro de coleta de sangue por puno venosa (Figura
4). As amostras de sangue total com anticoagulante podem ser armazenadas por at
24 horas em refrigerador (2 a 8C), mas no devem ser congeladas. Caso as amostras
de sangue total no puderem ser testadas dentro desse perodo de tempo, separar o

Figura 4 Coleta de sangue para realizao do TRI Alere no laboratrio/UVZ

Amostras de plasma
Coletar as amostras de sangue total em frascos de coleta apropriados contendo
anticoagulantes, como EDTA (os tubos fornecidos pelo kit tm capacidade para coleta
de 0.5ml de amostra de sangue), heparina ou citrato de sdio usando o procedimento
padro de coleta de sangue por puno venosa (Figura 4). Separar o plasma atravs
de centrifugao. As amostras de plasma devem ser estocadas refrigeradas (2 a 8C)
por at cinco dias; para estocagens mais longas, congelar a -20C em frascos selados.

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plasma atravs de centrifugao e estocar como descrito no prximo procedimento.

Amostras de soro
Coletar as amostras de sangue total em frascos de coleta apropriados sem
anticoagulante usando o procedimento padro de coleta. Separar o soro atravs de
centrifugao. As amostras de soro devem ser estocadas refrigeradas (2 a 8C) por
at cinco dias; para estocagens mais longas, congelar a -20C em frascos selados.

2.4. Procedimentos para a realizao do TRI Alere

1) Remover o cassete da embalagem e coloc-lo numa superfcie plana e seca.
2) Adicionar 10L de sangue total, soro ou plasma, utilizando a pipeta capilar, no
orifcio marcado com a letra S no cassete de teste. Quando o teste for realizado no
laboratrio, a amostra deve ser homogeneizada antes do teste.
3) Adicionar 2 gotas de tampo no orifcio marcado com a letra S no cassete de teste;
4) Quando o teste comear a reagir, deve-se observar uma cor rosa se movendo

5) Interpretar os resultados do teste em 20 minutos.

Amostra de soro,
plasma ou sangue
(capilar ou venoso)

Figura 5 Procedimento de realizao do TRI Alere

Ateno!
Os tubos capilares possuem uma marcao de 10L (Figura 6). Quantidades
inferiores 10L podem resultar em testes falso negativos e quantidades
superiores a 10L podem invalidar o teste (Figura 7). Portanto utilizar sempre
os tubos capilares disponibilizados no kit.

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atravs da janela de resultado no centro do dispositivo de teste.

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Figura 6 Marcao de 10L no tubo capilar

Figura 7 Teste invalido devido ao excesso de amostra na plataforma de teste.

2.5. Leitura e interpretao dos resultados

O Alere Leishmaniose Ac Test Kit possui uma letra T (como linha teste) e uma
linha C (como linha controle) na superfcie do cassete. Ambas as linhas no so
visveis na janela de resultado antes da aplicao da amostra. A linha de controle (C)
usada para controle de procedimento. Esta linha deve sempre aparecer se o
procedimento do teste estiver correto e se os reagentes da linha de controle estiverem
funcionando. Uma linha roxa ser visvel na janela de resultado (T) se houver a
presena de anticorpos anti Leishmania infantum na amostra testada. Antgenos
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diagnstico sorolgico da leishmaniose visceral canina

selecionados so utilizados na banda de teste como materiais de captura e deteco.

10

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO
A presena de duas linhas coloridas (C e T), no importa qual aparecer primeiro,
indica um resultado POSITIVO.

INVLIDO
Quando a linha controle C no for visvel depois da execuo do teste, o resultado
deve ser considerado INVLIDO. Deve-se repetir o teste com um novo dispositivo de
teste.

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A presena de somente uma linha na janela C indica um resultado NEGATIVO.

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Escala visual para interpretao dos resultados

Nota: A intensidade da cor das linhas C e T podem ser diferentes, ou seja, a

linha controle C poder ser mais fraca que a linha teste T ou vice-versa.
Considerar o resultado POSITIVO em qualquer situao.

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2.6. Precaues
1) O kit sensvel ao calor. Segundo informaes da bula o kit deve ser armazenado
temperatura de 2 a 7C. No entanto, ensaios de es tabilidade em tempo real
realizados pelo produtor demonstraram que o kit estvel em temperaturas de
armazenamento de 2 a 30C. Este estudo encontra-se em anlise pelo Ministrio da
Agricultura, Pecuria e Abastecimento para futuras alteraes nas recomendaes
constantes na bula (processo nmero 21028005636/2014-13).

3) Realizar o teste imediatamente aps a abertura do envelope.

4) No reutilizar a plataforma de teste.
5) No utilizar o kit aps o vencimento.
6) Se a amostra no for testada imediatamente, manter sob refrigerao (2 a 8 C) por
24 horas (amostras de sangue total) ou at cinco dias (plasma ou soro). Se for
necessrio armazenar por um prazo maior, recomendado o congelamento (-20C).
7) Manusear todas as amostras do sangue como sendo capazes de transmitir doenas
infecciosas.
8) Fazer o descarte correto dos materiais utilizados considerando-os como resduo
com risco biolgico e utilizar descarte de perfuro-cortante para agulhas e lancetas.
.

1. Considerao es Finais

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2) No congelar o kit

Recomenda-se o algoritmo proposto pelo Ministrio da Sade para o

diagnstico

da

Leishmaniose

visceral

canina

imunocromatogrfico e confirmao pelo ELISA.

(LVC):

triagem

com

teste

Um co estar confirmado

sorologicamente para LVC quando as duas metodologias (Teste rpido e ELISA)

apresentarem resultados reativos -Nota tcnica conjunta N 01/2011 CGDTCGLAB/DEVIT/SUS/MS.

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3. Refere ncias bibliogra ficas

Alvar, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS one
7, e35671 (2012).
Feliciangeli, M. D. Natural breeding places of phlebotomine sandflies. Medical and
veterinary entomology 18, 71-80 (2004).

Ready, P. D. Epidemiology of visceral leishmaniasis. Clinical epidemiology 6, 147-154

(2014).
WHO, World Health Organization. Report of a meeting of the WHO Expert Committee
on the Control of Leishmaniases Vol. 949 (Geneva, 2010).

Referncia tcnica: bula do Alere Leishmaniose Ac Test Kit. Verso: 01/Dez 2014.

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diagnstico sorolgico da leishmaniose visceral canina

Maia, Z. et al. Comparative study of rK39 Leishmania antigen for serodiagnosis of

visceral leishmaniasis: systematic review with meta-analysis. PLoS neglected tropical
diseases 6, e1484 (2012).

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Servio de Doenas Parasitrias

Instituto Octvio Magalhes
Fundao Ezequiel Dias
Tel.: 31-3314 4663/4661
leishmania.iom@gmail.com

Departamento de Assessoria Tcnica

Para esclarecimentos de dvidas quanto ao produto e assessoria tcnica:
Tel: 0800 11 3262
veterinria.br@alere.com
Responsvel tcnico: Marcelo Santos Genelhu
marcelo.genelhu@alere.com

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