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2003-I
INDICE
1. INTRODUCCIN..3
1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR..3
1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA...4
1.3 LA PROTENA Bcl-2..6
1.4 CONTENIDO DE LA PROTENA Bcl-2 EN LOS
ORGANISMOS ENVEJECIDOS.8
2. JUSTIFICACIN....9
3. HIPTESIS..9
4. OBJETIVO GENERAL..9
4.1OBJETIVOS PARTICULARES..10
5. METODOLOGA....11
5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO..11
5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTENA Bcl-212
5.3 OBTENCION DE LOS PLSMIDOS..13
5.4 CO-TRANSFECCIN.18
5.5 NFECCIN20
6. SEMBRADO DE CLULAS PARA LAS DETERMINACIONES
A LO LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO.21
7. PARMETROS DE ENVEJECIMIENTO.23
7.1 PROLIFERACIN CELULAR..23
7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR.23
7.3 CUANTIFICACIN DE LA SENESCENCIA EN LAS CLULAS
DE CULTIVO PRIMARIO24
8. RESULTADOS26
9. DISCUSION Y CONCLUSION33
10. REFERENCIAS36
11. AGRADECIMIENTOS.38
molcula (Esteve, et. al; 1999). Por ltimo, Deng reporto que Bcl-2 est
tambin involucrado en la regulacin de la expresin o funcin de enzimas
de reparacin, adems que poder evitar rompimientos de las hebras del
ADN (Deng, et. al; 1999).
Todo lo anterior demuestra que an no se tiene claro el mecanismo de
accin de Bcl-2, por lo que es importante entender la relacin entre
envejecimiento y apoptosis. El conocer los mecanismos del dao oxidativo
al ADN y la participacin antioxidativa de Bcl-2, son crticos para la
comprensin de los mecanismos involucrados en las enfermedades
asociadas con el envejecimiento celular, como son las enfermedades
neurodegenerativas
Alzheimer,
de
enfermedades
Parkinson,
Huntintong,
cardiovasculares
como
esclerosis
la
lateral,
ateroesclerosis,
2. JUSTIFICACIN
El poder emplear el modelo in vitro de cultivo primario de fibroblastos de
ratn proporciona una herramienta til que permite obtener informacin
valiosa
permitiendo
tener
conocimiento
sobre
los
mecanismos
del
4. Objetivo General.
v Determinar el efecto de la sobre-expresin de la protena Bcl2 sobre
los parmetros de envejecimiento celular en fibroblastos de pulmn
de ratones viejos.
partculas
que
contengan
la
informacin
para
-galacatosidasa como
parmetro de senescencia.
v Cuantificar la funcionalidad mitocondrial de las clulas infectadas y
control, mediante la tcnica de MTT.
v Medir la proliferacin de las clulas infectadas y control.
10
5. METODOLOGA
5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO
Para este estudio, se utiliz como modelo experimental el cultivo primario
de fibroblastos de pulmn de ratn, que se ha reportado como un modelo
adecuado
para
el
estudio
de
dicho
fenmeno
(Campisi,
2000).
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
establecimiento
de
las
primeras
clulas
(cuando
stas
12
1. Transformacin:
Se transformaron bacterias E.coli de la cepa Mn522 y DH5
con los
13
14
2.
3.
4.
Se
agregaron
200l
de
una
solucin
recin
preparada
de
6.
7.
8.
9.
cuantific
la
concentracin
de
ADN
obtenido
por
15
2.
3.
4.
5.
6.
El tubo 2 (plsmido sin digerir): se agreg 2 l del plsmido de Bcl2, se agreg 1l de buffer H y 7l de agua, para llevarlo a 10 l.
7.
EL tubo 3 (plsmido sin digerir): se agreg 2 l del plsmido de Bcl2 y 8l de agua, para llevarlo a 10l.
8.
16
9.
17
5.4 CO-TRANSFECCIN
Los plsmidos fueron introducidos en clulas empaquetadoras (293-T) a
travs de la tcnica de fosfato de calcio. Esta tcnica permite que la
permeabilidad de la membrana cambie y as se introduzca el plsmido.
Cabe mencionar que fueron insertados dos plsmidos en las clulas 293 T,
gfp-bcl-2 y el plsmido pclEco. Como control se hizo otro tipo de
cotransfeccin en la que se us el plsmido gfp sin bcl-2 y pclEco.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
En seguida se prepararon 3 tubos 2, de los cuales uno era para bcl2 al que se le agreg 343.2l de agua, 0.4l de ADN acarreador,
18
8.
9.
las
48
horas
se
recogieron
las
partculas,
tomando
el
19
5.5 INFECCIN
Una vez establecido el cultivo primario de fibroblastos de pulmn de ratn,
se procedi a realizar la infeccin de estas clulas con las partculas virales
obtenidas. Para tener mejores resultados en cuanto a la insercin del
plsmido fue necesario cambiar el medio de cultivo de los pozos 24 hrs.,
antes de realizar la infeccin.
Se seleccionaron los pozos correspondientes para cada tratamiento, Bcl-2,
GFP y control. Se consider un volumen total de 1ml para cada pozo, por
lo que se adicionaron 500l de medio con Polibrent en una concentracin
de 2l/ml de medio y 500l de partculas virales para las clulas que
sobreexpresaran la protena Bcl-2, de igual forma para las clulas
especficas de GFP (500 l de medio con polibrent y 500 l de partculas
virales con el plsmido para la protena verde fluorescente) y por ltimo a
las clulas control se les adicionaron 500l de medio con polibrent y 500l
de medio. Cabe sealar que el medio utilizado no contena antibitico para
asegurar la infeccin y no estresar ms a las clulas.
Una vez realizada la infeccin, las clulas fueron incubadas durante 24
hrs. Pasado este tiempo se retir el tratamiento y se adicion nuevamente
medio de cultivo con todos los requerimientos (DMEM ms suero fetal
bovino 15%, aminocidos no esenciales y antibac). Se dejaron incubar
durante 5 das en las mismas condiciones para poder asegurar la
expresin de los genes introducidos en las clulas. Una vez transcurrido
ese tiempo se prosigui a realizar los ensayos para determinar los
parmetros de envejecimiento de los fibroblastos tales como: proliferacin
celular, senescencia asociada a la enzima -galactosidasa (SA--gal) y
funcionalidad celular.
Para corroborar que el plsmido que contena los genes bcl-2 y gfp
se
20
2.
3.
4.
5.
21
Clulas control 40 x
22
7. PARMETROS DE ENVEJECIMIENTO.
7.1 PROLIFERACIN CELULAR
La proliferacin celular se determin contando clulas vivas a lo largo del
tiempo de vida de los cultivos, utilizando azul tripano que es un colorante
vital que es excluido activamente de las clulas vivas. En las clulas
muertas, el colorante difunde fcilmente hacia el citoplasma (Doyle, et al;
1994). Esta tcnica evita contar falsos positivos.
Tcnica para determinar la proliferacin y la viabilidad celular
1.
Las clulas se lavaron con PBS una vez y se despegaron con 200 l
de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma).
2.
3.
4.
5.
23
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
-galactosidasa
2.
3.
4.
5.
6.
25
8. RESULTADOS
OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO
La obtencin de fibroblastos fue bsica para la elaboracin de la presente
investigacin.
26
3 4
6 7
Fig. 1
Electroforesis en agarosa al 0.8 % para evidenciar a los plsmidos digeridos con diferentes enzimas
de restriccin como aparece en el texto.
PARAMETROS DE ENVEJECIMIENTO
PROLIFERACIN CELULAR
En cuanto a la proliferacin, en la grfica 1 podemos observar que la curva
del cultivo control, presenta un periodo de establecimiento a partir del da
7 al 15, despus de este y hasta el da 18 comienza a tener un crecimiento
exponencial, despus se observa en el da 21 que las clulas entran en
senescencia y muerte, la que puede apreciarse al presentarse una fase
estacionaria, indicando el cese de la proliferacin.
En la misma grfica se muestra la curva del cultivo infectado con bcl-2,
donde se observa que del da 15 al 21 de cultivo las clulas presentan un
comportamiento de retardo de crecimiento en comparacin con el control,
27
ninguna diferencia con bcl-2 esto indica que la diferencia que se observa
con el control est dada nicamente por la infeccin. Para el da 21, se
mostr una diferencia entre bcl-2 y gfp con el control, pero no hubo alguna
diferencia entre ellos.
En el da 24 el control muestra una diferencia de proliferacin con el grupo
gfp, pero no as con el de bcl-2, aunque si hay diferencia estadstica entre
las clulas infectadas.
En el da 28 tanto las infectadas con bcl-2 como con gfp presentan
diferencia estadstica con el control y as mismo se muestra diferencia
entre ellos.
28
PROLIFERACIN CELULAR
m.
de
c
lul
as
x
10 5
6
5
control
{
3
*
*
*
*
bcl2
*
*
*
*
* *
gfp
0
0
Grfica 1.
2
Das de
0cultivo
4
0
29
FUNCIONALIDAD CELULAR
En la grfica 2 se muestra la funcionalidad de las clulas. Estos datos
representan la absorbancia a 570nm por nmero de clula, adems se
normalizaron con el control tomando al da 15 (inicio del experimento)
como el valor de 1.0.
No se observa una mejora estadstica en la funcionalidad de las clulas
que sobreexpresan bcl-2, pero tampoco un detrimento. Lo mismo ocurre
para las infectadas con gfp.
FUNCIONALIDAD CELULAR
N
o
r
m
a
li
z
a
d
o
D
O
/
c
l
u
l
a
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Control
bcl2
gfp
10
15
20
25
30
Das de cultivo
Grfica 2. Funcionalidad celular por el ensayo
MTT.
30
SENESCENCIA CELULAR
En la grfica 3 se puede observar que para las clulas control el nmero
de clulas positivas a -galactosidasa aumenta e manera constante a lo
largo del cultivo. Mientras que para las clulas infectadas con bcl-2 y gfp
se observa que a los mismos tiempos hay un mayor nmero de clulas
positivas a
31
80
70
60
**
50
%
de
c
lul
as
se
ne
sc
en
te
contro
l
40
bcl
2
30
gf
p
20
10
0
0
10
20
30
Das de cultivo
Grfica 3.
Diferencia estadstica con el control
32
9. DISCUSION Y CONCLUSION
Para iniciarla discusin me gustara aclarar que el trabajar con ratones
viejos es difcil, puesto que en primer lugar hay que esperar a que
envejezcan. En segundo lugar, los cultivos de fibroblastos de pulmn de
ratn que se obtienen cuentan con pocas clulas, ya que estn muy
daadas y se mueren, adems de que son muy susceptibles a
contaminarse.
Con respecto al manejo de los plsmidos y su amplificacin, se obtuvieron
con xito los plsmidos aislados para poder formar las partculas virales y
sebreexpresar las protenas en los cultivos primarios.
En la grfica 4 podemos apreciar el comportamiento que tienen las clulas
controles de cultivos primarios de fibroblastos de ratones viejos como de
jvenes. En ella se puede observar la diferencia de proliferacin entre una
poblacin y otra. Las clulas jvenes presentan una mayor proliferacin en
comparacin con las clulas viejas. Adems, en esta misma grfica se
observa disminuida la proliferacin en el cultivo de las clulas infectadas
en comparacin con el control. Al comparar bcl-2 con su control de
infeccin gfp se puede apreciar una ligera proteccin que es mnima s se
compara con las clulas sin infectar.
Los cultivos de fibroblastos de ratones viejos tienen un deterioro mayor,
adems que al momento de realizar la infeccin las clulas se daan an
ms, provocando que muchas clulas no resistan. Las que resistieron se
33
lo
obtenido
para
las
clulas
control
en
proliferacin,
34
bcl2
No.3
de
cl
ula
s x2
5
10
gfp
jvenes
1
viejas
0
7
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Das de cultivo
Grfica 4. Control de cultivo control de viejas y jvenes se puede observar el comportamiento de las
clulas jvenes y las clulas viejas sin infectar.
35
10. REFERENCIAS
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demonstrate
extended
cell
survival
and
follicular
37
38
11. AGRADECIMIENTOS
v A mis padres por su gran apoyo.
v A mi esposo.
v M. en C. Mina Konigsberg Faisntein.
v M. En B.E. Norma Edith Guerrero-Daz Lpez.
v Biol. Exp. Ma. Cristina Aguilar Calles.
v Dr. Pablo Damian Matsumura.
v M.V.Z. Rocio Vieria.
v CONACYT 400200-5-J34194-M
39