Quim. Nova, Vol. 30, No.

4, 930-934, 2007

Artigo

ADSORO DE OLIGONUCLEOTDEOS EM NANOEMULSES OBTIDAS POR EMULSIFICAO

ESPONTNEA
rico Martini, Edison Carvalho e Helder Teixeira*
Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga, 2752, 90610-000 Porto Alegre RS, Brasil
Fabiana Leo e Mnica Cristina de Oliveira
Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Presidente Antnio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte
MG, Brasil
Recebido em 21/7/06; aceito em 12/9/06; publicado na web em 27/4/07

OLIGONUCLEOTIDE ADSORPTION ON NANOEMULSIONS OBTAINED BY SPONTANEOUS EMULSIFICATION. This paper

describes the adsorption of an oligothymidylate (pdT16) on nanoemulsions obtained by spontaneous emulsification procedures.
Formulations were composed by medium chain triglycerides, egg lecithin, glycerol, water (NE) and stearylamine (NESA). After
optimization of operating conditions, the mean droplet size was smaller than 255 nm. Adsorption isotherms showed a higher amount
of pdT16 adsorbed on cationic NESA (60 mg/g) compared to NE (20 mg/g). pdT16 adsorption was also evidenced by the inversion of
the -potential of NESA (from +50 to -30 mV) and the morphology of oil droplets examined through transmission electron microscopy.
The overall results showed the role of electrostatic interactions on the adsorption of pdT16 on the oil/water interface of nanoemulsions.
Keywords: cationic nanoemulsions; oligonucleotides; adsorption.

INTRODUO
A complexao de polinucleotdeos em sistemas coloidais
lipdicos catinicos (i.e., lipossomas, nanopartculas e nanoemulses) tem sido considerada como uma estratgia promissora para
sua administrao in vivo1-4.
Nos ltimos anos, a formao de complexos entre polinucleotdeos e nanoemulses catinicas tem sido particularmente descrita
na literatura5-14. Nanoemulses catinicas so geralmente constitudas de um ncleo oleoso (de origem natural ou semi-sinttica) estabilizado por mistura binria de fosfolipdeos e lipdeos catinicos.
Os polinucleotdeos formam espontaneamente um complexo em meio
aquoso atravs de interaes eletrostticas entre os grupamentos
fosfato e os grupamentos carregados positivamente dos lipdeos
catinicos. A carga de superfcie positiva dessas nanoestruturas conduz a um aumento significativo da penetrao intracelular dos
polinucleotdeos, em decorrncia das interaes com as membranas
celulares carregadas negativamente8,10,14. Alm disso, a formao do
complexo reduz a cintica de degradao dos polinucleotdeos frente ao ataque enzimtico6,7,11,12.
Estudos relativos formao de complexos entre polinucleotdeos
em fita simples, denominados oligonucleotdeos (ON), e nanoemulses catinicas obtidas por microfluidizao foram descritos por
Teixeira e colaboradores11-14. A carga de superfcie e o tamanho do
fragmento foram identificados como os principais fatores que influenciam a eficincia de complexao do ON com a nanoestrutura11.
Estudos posteriores de potencial zeta, transferncia de energia de
fluorescncia e de tenso interfacial permitiram caracterizar a interao dos oligonucleotdeos com os constituintes das formulaes
(fosfolipdeos e/ou lipdeos catinicos), sugerindo a adsoro dos
ON na interface leo/gua (O/A) das nanoemulses12,13.
Recentemente, foi descrita na literatura15,16 a viabilidade de preparao de nanoemulses catinicas contendo ON, atravs do procedimento de emulsificao espontnea. O interesse desse procedi*e-mail: helder@farmacia.ufrgs.br

mento reside, entre outros, na sua adequao para preparao de

pequenos lotes de formulao, a temperaturas moderadas, em estudos de bancada e na possibilidade de funcionalizao da interface
das nanoemulses, atravs da nanodeposio de polmeros pr-formados15,17. Esse procedimento baseia-se na emulsificao espontnea dos constituintes da fase interna (previamente solubilizados em
solvente orgnico) em gua, seguida da retirada do solvente geralmente por destilao sob presso reduzida. A formao das gotculas
ocorre quando a fase orgnica vertida na fase aquosa, provocando
uma turbulncia interfacial que ocorre durante a difuso do solvente
orgnico na gua, observando-se rpido espalhamento da interface,
como resultado da difuso mtua entre os solventes, o que fornece
energia suficiente para formao das gotculas18.
Diversos parmetros podem influenciar as propriedades fsicoqumicas das nanoemulses obtidas, entre eles, as condies de
emulsificao empregadas e a composio quali e quantitativa das
formulaes18,19. Como um exemplo recente, Bouchemal e colaboradores18 descreveram o efeito da viscosidade e do equilbrio hidrfilo-lipfilo do ncleo oleoso e a miscibilidade da fase orgnica
em gua sobre o dimetro de gotcula das nanoemulses.
Neste estudo, a primeira etapa teve por objetivo avaliar a influncia da natureza e quantidade de solvente orgnico utilizado no
procedimento de emulsificao espontnea sobre o dimetro de
gotcula das nanoemulses. Aps essa etapa de otimizao, a
isoterma de adsoro de um oligonucleotdeo politimidilato (pdT16)
foi realizada, bem como a avaliao da influncia da adsoro do
ON sobre a morfologia e as propriedades fsico-qumicas das nanoemulses (i.e., dimetro, potencial zeta e viscosidade).
PARTE EXPERIMENTAL
Materiais
pdT16 e estearilamina (SA) foram adquiridos junto Invitrogen
(Brasil) e Sigma (EUA), respectivamente. Triglicerdeos de cadeia
mdia dos cidos cprico e caprlico (TCM) e lecitina de gema de

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Adsoro de oligonucleotdeos em nanoemulses

ovo (Lipoid E-80) foram gentilmente doados pela Lipoid GmbH

(Alemanha). Todos os outros reagentes e solventes utilizados foram de grau analtico.
Preparao das nanoemulses
As nanoemulses foram preparadas atravs do procedimento
de emulsificao espontnea. Os constituintes das fases oleosa e
aquosa foram solubilizados em solvente orgnico e gua, respectivamente. Em seguida, a fase orgnica foi vertida sobre a fase aquosa atravs de funil calibrado, sob agitao moderada e constante,
seguida da retirada do solvente atravs de evaporao sob presso
reduzida em evaporador rotatrio. A Tabela 1 apresenta a composio final das formulaes. A fim de otimizar as condies de
emulsificao espontnea, as nanoemulses foram preparadas com
quantidades crescentes de acetona/gua e etanol/gua, nas propores de 1:2; 2:4; 3:6 e 4:8 (solvente orgnico:gua) para a obteno de 1 mL de formulao final. Aps o preparo, o pH das formulaes foi ajustado a cerca de 7.
Tabela 1. Composio final das nanoemulses NE e NESA (%, m/m)

Lipoid E-80
TCM
Estearilamina
Glicerol
gua q.s.p

NE

NESA

2,00
8,00
2,25
100,00

2,00
8,00
0,05
2,25
100,00

Validao da metodologia para quantificao do pdT16

Os parmetros de validao selecionados para doseamento do
pdT16 por UV seguiram as normas de validao dos procedimentos
analticos e de metodologias do International Conference on the
Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use 20. Foram avaliados os parmetros
de linearidade, repetibilidade, preciso intermediria e especificidade. Os ensaios foram realizados em um comprimento de onda de
266 nm, utilizando-se espectrofotmetro UV-Visvel modelo
Hewlett-Packard 8452A. O mtodo mostrou-se linear (r =0,9974)
em uma gama de concentrao de 2,5 a 25 g/mL e preciso (DPR =
2,05 e 1,70%, para repetibilidade e preciso intermediria, respectivamente). A especificidade foi testada na presena de glicerol
(fase externa das nanoemulses), demonstrando que esse adjuvante
no influencia na quantificao do pdT16.
Estudos de adsoro do pdT16
Em uma primeira etapa, a recuperao do pdT16 foi determinada
em unidades de ultrafiltrao constitudas de celulose regenerada de
30 kDa (Ultrafree, Millipore). Solues aquosas contendo pdT16
(25 a 250 g/mL) foram centrifugadas e a quantidade de pdT16 no
ultrafiltrado foi determinada. Por diferena entre a quantidade inicial e a detectada foi determinada a taxa de recuperao (%) do pdT16.
Para os estudos de adsoro, solues aquosas contendo o pdT16
(25 a 250 g/mL) foram preparadas. As nanoemulses (NE e NESA)
foram ento adicionadas s solues aquosas de pdT16 temperatura ambiente. Aps 30 min, as amostras foram colocadas nas unidades de ultrafiltrao e centrifugadas a uma velocidade de 5.000
rpm por 20 min e a concentrao de pdT16 no adsorvida foi determinada no ultrafiltrado. Para todas as amostras foi realizado um
espectro de absoro no UV na faixa de 200 a 400 nm, a fim de

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verificar a ausncia de qualquer pico interferente. Em todos os casos, a concentrao final de fase interna das nanoemulses no meio
de adsoro foi de 2 mg/mL. Os resultados foram expressos como
a mdia de trs experimentos independentes e a quantidade de pdT16
adsorvida por grama de fase interna de nanoemulso foi obtida
atravs da Equao
qi-qr
Qa =
qne
onde, Qa= quantidade de pdT16 adsorvido (mg de pdT16/g de fase interna); qi= quantidade de pdT16 inicial adicionada s nanoemulses (mg);
qr= quantidade de pdT16 recuperada no ultrafiltrado (mg) e, qne= quantidade de fase interna de nanoemulso no meio de adsoro (g).
Caracterizao das nanoemulses
As nanoemulses foram caracterizadas antes e aps a adsoro
do pdT16, como segue: o dimetro mdio das gotculas e o potencial zeta das formulaes foram determinados atravs de espectroscopia de correlao de ftons e da mobilidade eletrofortica, respectivamente, utilizando-se um Zetasizer 3000HS (Malvern
Instruments Ltd., Reino Unido), aps adequada diluio das amostras. O pH das nanoemulses foi determinado utilizando-se
potencimetro digital Micronal B 474 (Micronal, So Paulo, Brasil), antes e aps o seu ajuste a cerca de 7. A viscosidade das
nanoemulses foi determinada por viscosimetria capilar, segundo
a Farmacopia Brasileira21. Aps a determinao do tempo de escoamento, calculou-se a viscosidade das nanoemulses usando a
densidade determinada em picnmetro. A morfologia das gotculas
de nanoemulses foi avaliada por microscopia eletrnica de transmisso (MET). As amostras foram adicionadas em suportes metlicos (200 mesh) de cobre com revestimento de carbono e Formvar,
sendo o contraste negativo realizado com acetato de uranila a 2%
(m/v). Em seguida, as amostras foram armazenadas por 24 h e,
ento, submetidas anlise atravs de MET, com aumento de
100.000 vezes.
Anlise estatstica
Os resultados foram analisados atravs de teste t de Student,
considerando-se um nvel de significncia de 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSO
A Figura 1 apresenta a influncia da natureza e do volume dos
solventes empregados no procedimento de emulsificao espontnea
sobre o dimetro de gotcula e ndice de polidispersidade das
nanoemulses NE e NESA. Etanol e acetona foram selecionados para o
procedimento de emulsificao espontnea, uma vez que so solventes
miscveis com gua e classificados como de baixo potencial txico22.
Como pode ser observado, independente da natureza do solvente empregado e da presena do lipdeo catinico estearilamina, ocorre uma
reduo do dimetro de gotcula das nanoemulses, at cerca de 250
nm, com o aumento progressivo da quantidade de solvente utilizada.
A reduo do dimetro das gotculas pode ser atribuda maior velocidade de difuso da fase orgnica em gua, como conseqncia da
menor concentrao dos componentes da fase interna solubilizados na
soluo orgnica18,23. Contudo, no foi observada uma reduo suplementar do dimetro de gotcula (p<0,05) para a maior quantidade de
solventes empregada (proporo 4/8), sugerindo que, a partir de uma
determinada concentrao do soluto, a velocidade de difuso do
solvente orgnico no mais influenciada pela mesma, mas apenas
pelas propriedades de difuso do solvente empregado.

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Martini et al.

Quim. Nova

A avaliao da adsoro de ON com nanoemulses tem sido

realizada de maneira indireta11-13. De fato, o ON no complexado
quantificado em uma frao da fase aquosa externa das nanoemulses,
obtida aps prvia separao utilizando-se membranas de ultrafiltrao. A determinao da recuperao do ON atravs das membranas representa uma etapa prvia fundamental para se avaliar se a
membrana no representa um fator limitante passagem do ON solvel na fase aquosa externa. Neste estudo, a taxa de recuperao do
pdT16 em soluo aquosa foi superior a 98%, na faixa de concentrao das isotermas de adsoro, comprovando que a membrana de
ultrafiltrao selecionada no representa um fator limitante para a
passagem do ON pdT16 solvel na fase aquosa externa.
A Figura 2 apresenta as isotermas de adsoro do pdT16 para as
formulaes NE e NESA. Pode-se observar a adsoro do pdT16 at
cerca de 20 mg/g de fase interna de NE. Essa reduzida adsoro deve
estar relacionada com as propriedades de superfcie dessas formulaes. O potencial zeta negativo da formulao NE (Tabela 2) pode
limitar o acesso dos ON interface, devido a fenmenos de repulso
eletrosttica13,17. Contudo, para NESA a adsoro do pdT16 foi significativamente superior. A isoterma pode ser dividida em duas etapas.
Na primeira, ocorre um aumento progressivo da quantidade de pdT16
adsorvido at um mximo (~60 mg/g de fase interna). Possivelmente, isto ocorre devido elevada afinidade das cargas positivas das
gotculas pelos grupamentos fosfato carregados negativamente do
ON. Esses resultados indicam que a presena do lipdeo catinico na
interface de NESA aumenta substancialmente a capacidade de adsoro
do pdT16, atravs de interaes eletrostticas. Na segunda etapa, quantidades suplementares de pdT16 no alteram a quantidade de pdT16
associado, sugerindo o alcance da saturao dos stios de interao
carregados positivamente para a associao dos ON.

Figura 1. Dimetro mdio de gotcula (barras) e ndice de polidispersidade

(smbolos) da nanoemulso isenta de lipdeo catinico (NE) ou contendo o
lipdeo catinico estearilamina (NESA), utilizando acetona ou etanol como
solvente no procedimento de emulsificao espontnea

A NE isenta de lipdeo catinico apresenta um potencial zeta

negativo (Tabela 2) devido presena de fosfolipdeos cidos na
lecitina de gema de ovo, como a fosfatidilserina e o cido fosfatdico24.
A adio de estearilamina nanoemulso conduz inverso do potencial zeta para valores positivos, demonstrando sua localizao na
interface O/A. A estearilamina um lipdeo catinico que apresenta
um pK de 10,6, conferindo assim uma carga global positiva no pH
final das nanoemulses. A presena do lipdeo catinico tambm
influencia o pH final da formulao NESA, indicando o efeito do seu
grupamento polar, amina primria, sobre esse parmetro.
Tabela 2. Propriedades fsico-qumicas das nanoemulses NE e NESA

pH
Dimetro de gotcula (nm)
Potencial zeta (mV)
Viscosidade (cP)

NE

NESA

6,36 0,10
,230 7
,,-32 2
1,50 0,02

8,70 0,02
,255 14
,050 8
1,60 0,03

(a) pH das nanoemulses antes do ajuste a cerca de 7.

Figura 2. Quantidade de ON pdT16 adsorvido s nanoemulses NE () ou

NESA () em funo da quantidade de pdT16 adicionado

A Figura 3 apresenta a influncia da adsoro do pdT16 nas propriedades fsico-qumicas da NESA. Como pode ser observado, existe uma tendncia ao aumento do dimetro de gotcula de NESA (3A)
com a adsoro do pdT16. O dimetro mdio encontra-se prximo a
300 nm sendo, em todos os casos, superior ao dimetro original (Tabela 2), sugerindo que a adsoro do pdT16 conduz a um aumento do
raio hidrodinmico das gotculas. No caso especfico das concentraes compreendidas entre cerca de 3 e 30 mg/g, o dimetro mdio
superior a 300 nm. Esse resultado deve estar relacionado com a zona
de inverso do potencial zeta de NESA, o que poderia no momento da
adsoro do pdT16 (3C) ter originado agregados resultantes da
neutralizao de cargas. Apesar das diferenas em relao ao dimetro (3A), os resultados demonstram que no existe influncia do pdT16
na viscosidade das nanoemulses (3B): a viscosidade foi prxima
de 1 cP, independente da concentrao de pdT16. Contudo, observase uma reduo de cerca de 60% na viscosidade em comparao aos

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Adsoro de oligonucleotdeos em nanoemulses

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Figura 4. Fotomicrografias (MET) das nanoemulses antes e aps a associao

do pdT16. Legenda: NE (A), NE/pdT16 (C), NESA (B) e NESA/pdT16 (D)

2). Assim, as reas mais escuras observadas na interface das

gotculas podem ser atribudas elevada afinidade do reagente de
contraste (acetato de uranila) pelos cidos nuclicos27,28.
CONCLUSES

Figura 3. Dimetro (A), viscosidade (B) e potencial zeta (C) da nanoemulso

NESA, aps adio de quantidades crescentes do pdT16

valores obtidos antes da associao do ON (Tabela 2), indicando a

influncia da concentrao final de fase interna (2 mg/mL), obtida
aps a adio da soluo de ON. Uma menor concentrao de fase
interna reduz as interaes interparticulares, podendo resultar em
menor viscosidade das nanoemulses25,26.
Em relao ao potencial zeta, a adio de quantidades crescentes de pdT16 conduz sua reduo (Figura 3C). O potencial zeta de
NESA apresenta inicialmente um valor positivo de 50 mV. Aps a
adio das menores quantidades de pdT16 (0,325 e 3,25 mg/g), observa-se uma reduo no potencial zeta at cerca de 2030 mV. As
concentraes maiores de pdT16 conduzem rapidamente a uma inverso do potencial zeta original para valores negativos de cerca de
-30 mV, indicando a neutralizao das cargas positivas dos lipdeos
catinicos na interface da NESA. De fato, nas condies experimentais utilizadas, a relao de cargas [+/-] varia de 20 at 0,01, portanto, justificando os resultados de potencial zeta observados.
A avaliao da morfologia foi realizada por MET antes e aps
associao do pdT16 com NE e NESA (Figura 4). As fotomicrografias
(A e B) revelam estruturas esfricas de dimetro na faixa de 200300 nm, com interface definida e sem influncia da composio
das nanoemulses. Os resultados confirmam aqueles obtidos pela
tcnica de espectroscopia a laser de autocorrelao, como demonstrado na Tabela 2. As fotomicrografias C e D demonstram que os
dimetros de gotculas no sofrem influncia marcante aps adio do pdT16, sendo prximos aos valores observados antes da associao do pdT16. Em contrapartida, os resultados sugerem a formao de uma camada mais espessa no limite das gotculas oleosas da NESA, indicando a presena do pdT16 associado interface,
corroborando os resultados obtidos na adsoro do pdT16 (Figura

Este estudo demonstrou, na primeira etapa, a possibilidade de

modulao do dimetro de gotcula das nanoemulses a partir da
otimizao do volume de solventes empregados no procedimento de
emulsificao espontnea. A adsoro do pdT16 nas nanoemulses
foi claramente influenciada pela presena do lipdeo catinico
estearilamina na interface O/A. A maior associao do pdT16
interface das NE SA resultante das interaes eletrostticas
estabelecidas entre ambos. Essa adsoro foi igualmente evidenciada pela inverso do potencial zeta e atravs da avaliao da morfologia
das gotculas da fase interna por MET. No seu conjunto, esse trabalho demonstra as potencialidades de nanoemulses obtidas por
emulsificao espontnea como um sistema carreador de ON.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, FAPERGS, FAPEMIG e CAPES/COFECUB n 540/
06 pelo suporte financeiro e ao Centro de Microscopia Eletrnica
da UFRGS pelo suporte tcnico nas anlises de MET.
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