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Biotecnologia
MDULO III
Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos nas Referncias Bibliogrficas.
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MDULO III
4. Introduo
Um dos objetivos da biotecnologia a expresso de protenas de
interesse para a medicina e para a agropecuria em escalas industriais. Esta
perspectiva est baseada na prpria histria da transformao da biotecnologia
tradicional para a molecular, perodo no qual o desenvolvimento e a aplicao
da tecnologia do DNA recombinante aprimoraram a expresso de protenas.
Isto se deve ao conhecimento de tcnicas de clonagem molecular, as quais
permitiram que os genes de interesse fossem isolados e clonados em um vetor
de expresso. A produo de bens de interesse obtida aps a transformao
de um hospedeiro de escolha, sendo que a expresso heterloga pode ser
obtida tanto em organismos procariotos como em eucariotos.
Inmeras protenas heterlogas j foram expressas em clulas
procariotas ou eucariotas utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Isto
inclui as de interesses mdicos e comerciais, como a insulina humana e
hormnios de uso veterinrio. Contudo, a clonagem de uma sequncia
codificadora em um determinado vetor de expresso no assegura
necessariamente a expresso da protena. Outra questo a ser considerada
so os nveis de produo alcanados podem estar aqum do desejado.
Considerando os objetivos da implantao da biotecnologia molecular,
pesquisas foram direcionadas com o objetivo de alcanar nveis satisfatrios de
produo de protenas recombinantes. Entretanto, no h uma nica estratgia
que seja eficiente para todos os casos. Diferentes genes requerem
investimentos e tentativas especficas, com distintos protocolos de induo.
Uma opo de aplicao mais ampla a construo de novos vetores de
expresso.
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promotores e os terminadores;
II.
IV.
V.
VI.
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promotoras.
Os
nveis
de
expresso
esto
diretamente
de
diferentes
organismos,
tanto
procariotos
como
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Plasmdeo pBR316
Digesto HindIII
A
AGCTT
TTCGA
Digesto
nuclease S1
Preenchimento
DNAP1
AAGCT
AGCTT
TTCGA
TCGAA
T CTTAAG A
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antibitico;
III.
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restrio nicos reconhecidos por diferentes enzimas. Alm disso, possui trs
cdons de paradas nas trs fases de leitura, evitando que a transcrio
continue alm da sequncia de interesse, o que pode gerar um resultado falsopositivo. O gene reprter utilizado na construo do plasmdeo pKO1 uma
quinase derivada do operon gal de E. coli. Este constitudo pelos genes galE,
galT e galK, que codificam uma epimerase, uma transferase e uma quinase,
respectivamente. A quinase uma protena cuja deteco ocorre por mtodos
relativamente simples e sensveis, medindo os nveis da galactose-1-fosfato.
Para a seleo de promotores funcionais em E. coli, sequncias de
DNA suspeita de conterem promotores so digeridas e clonadas no pKO1. A
mistura de DNA contendo os possveis recombinantes so ento utilizadas
para transformar uma E. coli de gentipo galE+, galT+ e galK-. Esta linhagem,
quando alterada com um plasmdeo expressando a quinase, facilmente
selecionada por sua habilidade de crescer em meio cuja nica fonte de carbono
a galactose. Os transformantes com o vetor pKO1, nos quais foi clonada uma
sequncia promotora, so diferenciados pelas caractersticas fenotpicas de
colorao no meio McConkey.
A expresso do gene da quinase gera uma enzima com atividade
fermentadora, o que resulta em colnias que apresentam colorao vermelha
no meio de eleio. Os vetores cuja sequncia clonada no contm um
promotor funcional em E. coli no expressam a quinase, sendo distinguidas
pela colorao branco-amarelada das colnias.
A seleo dos clones pelas caractersticas fenotpicas utilizadas no
vetor pKO1 ainda permite a distino entre a fora das sequncias promotoras
clonadas. Para isso, inicialmente este vetor foi testado com sequncias
promotoras j conhecidas. O que se utilizou como base para a diferenciao foi
o crescimento das colnias. Promotores fortes induzem uma superexpresso
da enzima quinase, produzindo colnias vermelhas de crescimento lento. Isto
demonstra que altos nveis de transcrio de genes heterlogos representam
um esforo metablico significativo para a clula. Este resultado confirma a
potencialidade deste vetor no diferenciamento da fora dos promotores.
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Esta
caracterstica
faz
com
que
IPTG
seja
indutor
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por outro lado, a mesma comparao pode ser feita com o promotor selvagem
lac, o qual apresenta trs nucleotdeos diferentes (Fig. 51). Os nveis de
expresso obtidos pela variante so maiores se comparados aos obtidos pelo
promotor lac selvagem.
lac UV5
lac
Seqncia consenso
TTTACA -- 18 -- TATAAT
TTTACA -- 18 -- TATGTT
TTGACA -- 17 -- TATAAT
Figura 51: Comparao das sequncias promotoras lacUV5 e lac selvagem com a
sequncia consenso.
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Triptofano
Repressor + Triptofano
Repressor
x
Promotor
RNA polimerase
Repressor incapaz de
se ligar ao operador
Incio da
transcrio
RNA polimerase
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Este vetor contm a sequncia do promotor trc, sendo que seus nveis
de expresso so regulados pela protena repressora LacIq (destacada na
figura pelo boxe vermelho). (Fonte: Coelho, 2007). A questo de obter nveis de
expresso gnica significativos ainda enquadra outro promotor muito utilizado
em vetores de expresso, o pT7. Este promotor derivado do fago T7 e
representa uma sequncia de alta afinidade para a RNAP, gerando altos nveis
de transcritos. A fora deste promotor impulsionou o desenvolvimento de
vetores de expresso como os pET, tornando-os a escolha para a expresso
de genes de interesse (Fig. 55).
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deste tipo de cultura por humanos, uma vez que certos indivduos apresentam
respostas alrgicas aps ingerir estas substncias.
A instabilidade do plasmdeo e de algumas construes utilizadas nos
vetores de expresso constituem um agravante para a perpetuao da
tecnologia de expresso heterloga. Apesar de ser um mtodo bastante
simples e prtico, suas desvantagens so a causa da busca de alternativas
para solucionar este problema. Uma delas que vm sendo especulada a
integrao da sequncia de interesse no cromossomo da clula hospedeira.
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Identificar
sequncia
que
ser
interrompida
no
DNA
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Clivagem
proteoltica
do
precursor
da
protena.
Neste
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clulas eucariotas;
II.
ao RNAm.
Um exemplo de vetor de expresso eucarioto est representado na Fig.
59. O pVAX um vetor que possui todos os elementos genticos para a
expresso gnica em clulas de mamferos. um vetor muito utilizado no
desenvolvimento de vacinas de DNA.
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gnica
em
clulas
de
mamferos,
como
promotor
do
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de
leveduras
na
expresso
de
protenas
recombinantes
Saccharomyces cerevisiae.
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II.
III.
industrial;
IV.
caracterizadas;
V.
traducionais;
VII.
ele tem sido muito utilizado na indstria para a produo de diversos bens com
fins teraputicos para humanos, sem ter que passar por experimentaes que
comprovem o seu uso.
Algumas protenas produzidas por S. cerevisiae esto sendo testadas
em
fins
diagnsticos
ou
teraputicos;
outras
esto
disponveis
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I.
Plasmdeo
II.
Vetores de integrao
III.
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externo.
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larga escala;
II.
II.
vetores de interesse;
IV.
V.
industriais.
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biotecnolgicos.
Outras
no
convencionais
incluem:
Yarrowia
lipolytica;
Hansenula
polymorpha;
Arxula
adeninivorans.
Dentre as duas opes de leveduras convencionais, grupos de
pesquisa tm relatado sucesso obtido aps a expresso de protenas na
levedura Pichia pastoris. Por isso, grande ateno e investimentos tm sido
direcionados para esta levedura, visando seu aperfeioamento como sistema
de expresso.
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Figura 61: Mapa do Vetor pPICZ para a expresso em Pichia pastoris (Invitrogen).
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de metanol. Outro ponto a considerar que vrias cpias podem ser integradas
ao genoma, o que est relacionado com os nveis de expresso.
O promotor AOX1 regulado transcricionalmente pelo substrato
metanol. O uso deste indutor vantajoso sob o ponto de vista econmico, pois
seu custo considerado como relativamente barato. A regulao da
transcrio, a partir deste promotor, tambm ocorre pela presena de glicose
na cultura. A ativao de AOX1 e, portanto, o incio da transcrio somente se
inicia na ausncia completa de glicose.
Aps a induo da expresso com o metanol so obtidos altos nveis
de expresso, equivalentes queles obtidos por genes altamente expressos e
que esto sob o controle dos promotores envolvidos com a via glicoltica. Na
presena de metanol observa-se que os nveis de expresso da enzima lcool
oxidase representam cerca de 30% da protena celular total de Pichia pastoris,
o que confirma os altos nveis de expresso obtidos a partir deste promotor.
Alm disso, esta sequncia promotora fortemente regulada, sendo
reprimida em condies de crescimento com a ausncia de metanol. Assim,
por a transcrio ser fortemente regulada, a expresso da protena de interesse
acionada e desligada em tempos determinados. Esta caracterstica impede a
expresso por perodos inapropriados de protenas txicas cultura celular e
dificulta a proliferao, na cultura de leveduras, daquelas que no expressem o
gene de interesse.
As protenas expressas por este sistema podem ser apresentadas
tanto como intracelulares como sendo secretadas. Esta caracterstica depende
da adio ao vetor de expresso de um peptdeo sinal que permita o
endereamento proteico. Nestes casos, frequentemente utilizado o peptdeo
sinal derivado de S. cerevisiae (Fig. 62).
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4.8.1.4 Baculovrus
A produo de protenas recombinantes por meio de baculovrus uma
opo interessante para a expresso de protenas eucariotas. O uso deste
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expresso
em
clulas
de
mamferos
um
procedimento
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