Biotecnologia 02

Curso de
Biotecnologia
MDULO II
Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos nas Referncias Bibliografias.
MDULO II
3.
A Tecnologia do DNA Recombinante
As descobertas da estrutura e da funo do DNA e da sntese proteica

foram os primeiros passos para o isolamento e, consequentemente, uma
anlise mais detalhada dos genes. Alguns motivos justificam este interesse:
I.
O isolamento de um gene permite a determinao da sequncia
nucleotdica, caracterizando marcos internos do mesmo, como introns e

peptdeos sinais. Esta sequncia pode ainda ser utilizada na genmica
comparativa, que consiste em comparaes de sequncias entre organismos
filogeneticamente prximos. Assim, alm de possibilitar estudos de evoluo,
pode auxiliar tambm na descoberta da funo do gene isolado;
II.
A composio de aminocidos, assim como a de nucleotdeos,
tambm auxilia na histria da genmica comparativa, deduzindo-se a funo de

determinada protena;
III.
Um gene pode ser transferido de um organismo a outro,
possibilitando o desenvolvimento de organismos transgnicos. Estes possuem

diversas utilizaes na biotecnologia, seja na pesquisa bsica ou mesmo em
aplicaes comerciais especializadas. Um exemplo a produo de insulina a
partir de bactrias transgnicas que contm e expressam o gene humano que
codifica esta protena.
As aplicaes a que o isolamento e caracterizao de um gene
permitem so inmeras, incluindo a produo de medicamentos e de vacinas,
por exemplo. Portanto, o isolamento gnico se tornou indispensvel para a
gerao de novos bens e servios biotecnolgicos. Este mdulo trata das
metodologias
envolvidas
com
este
processo,
tecnologia
do
DNA
recombinante.
O aprofundamento em conhecimentos de gentica abriu a imaginao
dos pesquisadores e esta cincia se tornou uma das ferramentas mais
importantes para o desenvolvimento de tcnicas biotecnolgicas. Aliado a isto,
64
Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores.
o conhecimento multidisciplinar de reas como a biologia molecular e

bioqumica permitiu que a biotecnologia avanasse a aplicaes industriais. A
metodologia envolvida neste processo abarca diversas tcnicas que englobam
a manipulao do DNA visando produo de bens de interesse comercial.
Esta tecnologia do DNA recombinante, tambm conhecida como clonagem
gnica ou clonagem molecular, compreende processos de transferncia da
informao gentica (DNA) de um organismo a outro. Apesar de no haver
uma metodologia universal, os experimentos seguem um protocolo similar (Fig.
26):
I.
O primeiro passo consiste em caracterizar um gene de interesse.
Tendo-se um conhecimento prvio do mesmo, o segundo passo consiste em

isolar o DNA do organismo que o contm; este denominado organismo
doador;
II.
O DNA de um organismo doador extrado e sofre uma clivagem
ou digesto enzimtica. Em seguida, os fragmentos gerados na digesto so

ligados a outra molcula de DNA que deve ter uma replicao autnoma, tais
como os plasmdeos bacterianos. Esta molcula atua como portadora dos
fragmentos de DNA e denominada vetor de clonagem. Assim, h a formao
de um DNA hbrido, ou uma molcula de DNA recombinante. Este tambm
designado como DNA quimrico, uma analogia ao monstro grego mitolgico
Quimera;
III.
O passo seguinte obteno da molcula de DNA que codifica
uma protena de interesse permitir a perpetuao do vetor recombinante at

a produo do bem de escolha. Para isso, h a necessidade de selecionar uma
clula hospedeira apropriada a qual ser introduzido o vetor recombinante. A
introduo do material gentico na clula hospedeira ocorre por um processo
denominado transformao;
IV.
As clulas hospedeiras so ento plaqueadas e deixadas crescer
em colnias separadas. Uma clula individual transformada com um nico

vetor recombinante ir se dividir em uma colnia com milhes de clulas, todas
portando o mesmo vetor recombinante. Portanto, esta clula individual capaz
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de se multiplicar e gerar uma populao que contm cpias idnticas do DNA

hbrido; esta populao designada clone de DNA. Neste caso, diz-se que o
hospedeiro amplificou a molcula recombinante de interesse;
V.
Como o DNA foi digerido em muitos fragmentos que podem
conter insertos de DNA diferentes, necessrio selecionar o clone bacteriano

que contenha o material gentico desejado;
VI.
Uma vez obtido o clone de interesse, o passo final consiste em
submet-lo a uma srie de anlises que permitam verificar se a construo

recombinante em um determinado hospedeiro capaz de expressar, tanto
quantitativa quanto qualitativamente, a protena de interesse.
Fonte de DNA
Vetor
DNA alvo
Digesto enzimtica
Digesto enzimtica
Ligao entre vetor e inserto
Transformao da clula hospedeira
Expresso da protena de interesse
Figura 26: Metodologia geral utilizada pela tecnologia do DNA recombinante.
O DNA do organismo doador e o do vetor so digeridos com enzimas

de restrio. O fragmento de interesse e o vetor linearizado so ligados e
transformados em uma clula hospedeira apropriada. Esta permite a expresso
da protena de interesse (representada pelas trs bolinhas vermelhas).
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A gerao de molculas recombinantes pela clonagem molecular deve

ser diferenciada daquelas obtidas por processos de crossing-over que ocorre
entre cromossomos homlogos de eucariotos. A tecnologia do DNA
recombinante consiste em procedimentos de manipulao experimental que
permitem que DNA de fontes diferentes ou heterlogas seja inserido em um
hospedeiro capaz de perpetuar o material gentico de interesse, produzindo-o
de maneira apropriada.
3.1 Isolamento de Genes
3.1.1 Extrao de DNA
Como comentado anteriormente, o passo inicial no isolamento de um

gene consiste em extrair o DNA do organismo doador. Diferentes tipos de
protocolos esto disponveis e permitem que a extrao obtenha um material
em grande quantidade e com alto grau de pureza. Aps identificar quais genes
se deseja estudar, procede-se ao isolamento do DNA genmico de eucariotos
ou de procariotos.
Para o vetor, o procedimento a ser adotado dependente da natureza
do mesmo. No caso de DNA plasmidial, este pode ser purificado do DNA
genmico aps a ultracentrifugao em um gradiente de densidade do cloreto
de csio contendo brometo de etdeo. Este material, alm de ser um agente
intercalante de DNA, permite que o mesmo seja visualizado aps sua
exposio luz ultravioleta. Aceita que o DNA plasmidial se torne mais denso
que o genmico e, com isso, os plasmdeos formam uma banda distinta na
centrifugao e podem ser separados (Fig. 27).
67
plasmdeo
DNA
cromossmico
Figura 27: Isolamento de DNA plasmidial por ultracentrifugao em cloreto de csio.
Inicialmente, um clone selecionado e certificado se contm o material

de interesse, o que geralmente se faz por seleo a antibiticos. (1) O DNA
ento extrado e colocado em um gradiente de cloreto de csio e brometo de
etdeo; (2) esta mistura submetida a uma ultracentrifugao neste gradiente.
Devido ligao diferencial do brometo de etdeo nestas duas espcies de
DNA, o DNA plasmidial se torna mais denso que o cromossmico. Assim, duas
bandas distintas entre as duas espcies de DNA so formadas. Aps um furo
na poro de baixo do tubo, pode-se separar o (3) DNA cromossomal e (4)
DNA plasmidial.
O DNA plasmidial ainda pode ser extrado por uma tcnica
rotineiramente utilizada em laboratrios de biotecnologia, a lise alcalina. Este
mtodo se baseia na observao de que sob um determinado pH alcalino o
DNA genmico bacteriano se desnatura, o que no ocorre com os plasmdeos.
Este material desnaturado ento submetido a uma neutralizao que
precipita o DNA genmico, mas os plasmdeos permanecem em soluo.
Procedimentos semelhantes ao utilizado no isolamento de plasmdeos
so aproveitados para outros vetores, como cosmdeos. No caso de fagos,
recupera-se uma suspenso pura dos mesmos e o DNA obtido aps a lise
das partculas virais. Aps a extrao e purificao do DNA genmico e do
vetor, o fragmento de DNA contendo o gene de interesse precisa ser isolado e
ligado a um vetor de clonagem, proporcionando a perpetuao do DNA hbrido.
O primeiro impasse a este procedimento o isolamento do fragmento.
68
Inicialmente, o DNA cromossmico era submetido a um processo de

quebras mecnicas aleatrias, o que pode ser obtido por sucessivas
passagens do material por uma seringa ou mesmo por sonicao. Contudo,
este procedimento gera desde fragmentos grandes, como 5 Kb, at mesmo
fragmentos muito pequenos. Aliado a isto, esta fragmentao aleatria, o que
aumenta a probabilidade de que a sequncia de interesse seja fragmentada e
somente pores desta sejam clonadas. Assim, para o isolamento de uma
determinada sequncia, vrios clones devem ser analisados.
A fragmentao aleatria de sequncias de DNA ainda interfere na
eficincia da clonagem. As extremidades geradas no so complementares, o
que dificulta a ligao do inserto ao seu vetor de clonagem. A eficincia da
clonagem ainda afetada pelo tamanho dos fragmentos. Fragmentos menores,
de baixo peso molecular, so mais fceis de lig-los ao vetor. Contudo, eles
so facilmente perdidos ou no recuperados. Por outro lado, a clonagem de
fragmentos de alto peso molecular um procedimento mais complicado e de
baixa eficincia.
Uma grande conquista que permitiu o salto da tecnologia do DNA
recombinante foi a descoberta de enzimas que clivam o DNA aps o
reconhecimento de sequncias especficas. As enzimas responsveis por esta
digesto enzimtica so as enzimas de restrio.
3.1.2 Enzimas de Restrio
As enzimas de restrio so endonucleases responsveis pela quebra

enzimtica da ligao fosfodister do DNA. O termo restrio foi adotado
devido histria da descoberta destas enzimas. Durante o estudo da infeco
de E. coli por bacterifagos observou-se que somente algumas bactrias eram
infectadas por estes vrus e, por isso, os pesquisadores relatavam que a
infeco ficava restrita. Estudos posteriores demonstraram que aps a
penetrao do DNA do fago na bactria, certas enzimas de E. coli eram
capazes de reconhec-lo e cliv-lo. Estas enzimas foram denominadas
69
genericamente como enzimas de restrio.

A nomenclatura das enzimas de restrio feita pelas iniciais do
organismo a partir do qual ela foi isolada, incluindo a identificao da linhagem,
e por algarismos romanos que indicam a ordem na qual foi encontrada na
cepa. Assim, por exemplo, a EcoRI, uma enzima extremamente utilizada em
procedimentos de biologia molecular, significa que esta foi a primeira enzima
isolada de Escherichia coli, linhagem R. A primeira letra em maisculo
representa o gnero e as primeiras duas letras da espcie so escritas em
minsculo. Os nmeros em algarismos romanos so utilizados para designar a
ordem de caracterizao de diferentes enzimas de restrio isoladas do
mesmo organismo. Muitas enzimas de restrio j foram isoladas e seus stios
de restrio identificados (Tabela 1).
Enzima
Stio de restrio
EcoRI
G A-A-T-T-C
Tipo de extremidade
Extenso 5 fosfato
C-T-T-A-A G
BamHI
G G-A-T-C-C
Extenso 5 fosfato
C-C-T-A-G G
PstI
C-T-G-C-A G
Extenso 3 fosfato
G A-C-G-T-C
PvuII
C-A-G C-T-G
Extremidade cega
G-T-C G-A-C
HpaI
G-T-T A-A-C
Extremidade cega
C-A-A T-T-G
HaeIII
G-G C-C
Extremidade cega
C-C G-G
NotI
G C-G-G-C-C-
Extenso 5 fosfato
G-C
C-G-C-C-G-GCG
Tabela 1: Stios de restrio reconhecidos por diferentes enzimas de restrio e o tipo

de extremidade que elas geram (Tabela modificada de Glick & Paternak, 1994).
70
As enzimas de restrio so endonucleases que reconhecem regies

especficas de DNA de 4 a 8 pb, chamados stios de restrio. Qualquer
molcula de DNA, desde vrus at o de humanos, contm stios alvos de
enzimas de restrio, que se encontram distribudos ao acaso. Assim, com a
digesto enzimtica do DNA obtidos de diversas fontes, os fragmentos gerados
apresentam um tamanho definido e adequado para os procedimentos de
clonagem. A clivagem enzimtica ocorre entre o oxignio do carbono 3 do
acar de um nucleotdeo e ao grupo fosfato do carbono 5 do carbono do
acar adjacente.
As enzimas de restrio so classificadas em trs tipos: I, II e III. Todas
estas enzimas reconhecem stios de restrio especficos. Contudo, as
enzimas I e III clivam fora desta sequncia. Por sua vez, as do tipo II clivam
dentro do stio reconhecido por elas. Portanto, as enzimas de restrio do tipo
II so mais teis em procedimentos que envolvem engenharia gentica, pois
seu padro de clivagem previsvel quando a sequncia de DNA conhecida.
O stio de restrio das enzimas do tipo II possui um duplo eixo de
simetria rotacional, tendo a mesma sequncia quando lida no sentido 5' para 3'
em ambas as fitas. Em outras palavras, ambos os filamentos de DNA
reconhecidos pelas enzimas de restrio tm a mesma sequncia de
nucleotdeos, porm em orientao antiparalela. Sequncias que possuem
estas caractersticas so denominadas palindrmicas.
As aplicaes das enzimas de restrio do tipo II para a tecnologia do
DNA recombinante so inmeras. Uma delas a construo de mapas fsicos.
Como a amostra de DNA tratada com uma destas enzimas sempre apresentar
stios de restrio reconhecidos na digesto enzimtica, estas permitem a
construo de mapas que representam o conjunto de restrio reconhecido por
enzimas diferentes dentro da mesma sequncia.
Estes designam uma ordem linear de stios de restrio referente a um
fragmento de DNA especfico. Este mapa obtido aps a clivagem unicamente
com uma determinada enzima e depois com uma combinao delas. A posio
dos stios de clivagem deduzida aps a anlise do peso molecular destes
71
fragmentos em gel de agarose (Fig. 28).

A
Digesto
BamHI
Digesto
EcoRI
Digesto
EcoRI + BamHI
950
850
600
600
500
400
300
250
300
100
100
EcoRI
500
100
EcoRI
300
400
100
BamHI
850
300
250
600
950
600
BamHI
Figura 28: Mapa de restrio.
(A) anlise eletrofortica representando o peso molecular da amostra

de DNA obtida aps a digesto enzimtica com as enzimas EcoRI e BamHI
separadamente e com as duas enzimas juntas. (B) mapa de restrio gerado
aps a digesto enzimtica e separao por eletroforese. (Figura modificada de
Glick & Paternak, 1994).
Outras aplicaes das enzimas de restrio do tipo II so decorrentes
da caracterstica que a clivagem gera nas extremidades. A posio em que
ocorre a clivagem do DNA pode gerar dois tipos de extremidades: abruptas (ou
cegas), quando a clivagem ocorre no centro de simetria, ou coesivas (pontas
adesivas), quando a clivagem ocorre fora do centro de simetria (Fig. 29). Neste
ltimo caso, pode-se gerar uma extremidade saliente 5'ou 3' (Tabela 1).
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CCGGGATCCTAAG
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
GGCCCTAGGATTC
Digesto com
enzima de
restrio
CCGG
GGCCCTAG
Digesto com
enzima de
restrio
GATCCTAAG
CCGGGA
TCCTAAG
GATTC
GGCCCT
AGGATTC
Extremidades coesivas
Extremidades cegas
Figura 29: Extremidades cegas e coesivas geradas aps a digesto com enzimas de
restrio.
Enzimas de restrio que clivem o DNA gerando desde extremidades

cegas ou mesmo coesivas podem ser utilizadas com sucesso na clonagem
molecular. Contudo, a ligao do inserto ao seu vetor facilitada quando
ambos sofrem uma digesto enzimtica que geram par de pontas adesivas
unifilamentares idnticas. Estas pontas so chamadas de adesivas porque
permitem que haja um pareamento com sequncias complementares que
sero unidas (grudadas) por pontes de hidrognio.
As enzimas de restrio que geram fragmentos de extremidades
coesivas so extremamente interessantes quando se deseja a insero de uma
sequncia codificadora em especfico. Isto se deve ao fato de que somente
filamentos complementares sejam capazes de se ligar. Assim, uma digesto
dupla com duas enzimas diferentes permite que a clonagem seja direcional; ou
seja, que a sequncia codificadora se ligue a um stio de distncia ideal ao seu
promotor e na correta fase de leitura para a protena.
Analisando a ao das enzimas de restrio, pode-se afirmar que as
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mesmas tm pelo menos duas propriedades teis clonagem molecular:

primeiramente, os fragmentos de restrio apresentam um peso molecular
adequado para a clonagem. Segundo muitas enzimas de restrio clivam o
DNA de forma a gerar extremidades coesivas, facilitando a ligao de fontes
diferentes de DNA que possuam extremidades complementares. Esta ligao
ainda ocorre de forma que a sequncia codificadora ocorra de maneira
direcional, ou seja, na fase correta de leitura.
O uso unicamente de enzimas de restrio, entretanto, insuficiente
para finalizar o procedimento de clonagem molecular. As extremidades geradas
pela clivagem enzimtica podem se alinhar, mas a fora das pontes de
hidrognio envolvidas na complementaridade de bases no suficiente para
manter as molculas de DNA referentes ao inserto e ao vetor juntas. H a
necessidade de refazer a ligao internucleotdica entre o grupo hidroxila 3' e o
grupo fosfato 5' das extremidades onde a quebra das molculas de DNA foi
gerada. A anlise da replicao do DNA forneceu uma alternativa enzimtica.
Este problema resolvido aps o passo da ligao enzimtica.
3.1.3 Ligao Enzimtica
Recapitulando, o DNA de um organismo doador sofre uma digesto

enzimtica a fim de produzir fragmentos com peso molecular adequados para a
clonagem molecular. Para que este procedimento seja facilitado, rotineiramente
se adota como estratgia a digesto, tanto do inserto como do vetor, com a
mesma enzima de restrio. De preferncia, se utiliza enzimas que produzam
stios de restrio com extremidades coesivas para facilitar a ligao. Embora
os filamentos complementares permitam que as molculas se liguem por
complementaridade de bases, as sequncias acar fosfato ainda no esto
completas nas duas posies de cada juno (Fig. 30). Para selar esta ligao,
so utilizadas enzimas como a ligase.
74
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digesto com
enzima de
restrio
OH
CCGG
GATCCTAAG
GGCCCTAG
GATTC
P
OH
Anelamento
OH P
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
P OH
Ligao
Ligase T4
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Figura 30: Ligao entre extremidades coesivas pela ao da Ligase.
Aps a digesto enzimtica, so geradas extremidades coesivas.

Molculas digeridas com a mesma enzima iro se unir pela complementaridade
de bases. A especificidade entre o pareamento de bases permite a formao
de pontes de hidrognio. Contudo, a unio entre molculas de DNA finalizada
pela formao de uma ligao fosfodister entre as duas fitas de DNA por ao
da enzima ligase.
As ligases so capazes de catalisar a formao de pontes fosfodister
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ao final das fitas de DNA que estejam mantidas juntas pela complementaridade
de bases ou mesmo quando as extremidades cegas estejam em contato ao se
ligarem enzima. A enzima responsvel por este processo a DNA ligase e
em procedimentos biotecnolgicos frequentemente se utiliza a isolada do
bacterifago T4.
Conhecendo as tcnicas e os procedimentos genricos para a
tecnologia
do
DNA
recombinante,
os
prximos
tpicos
trataro
de
procedimentos mais especficos, como os procedimentos para o isolamento de

genes. Contudo, inicialmente preciso ter clara a diferena de estrutura entre
um gene eucarioto e um procarioto.
3.1.4. Diferena Estrutural entre Genes Eucariotos e Procariotos
Para a obteno do inserto, inicialmente deve-se considerar se o gene

de interesse pertence a um organismo procarioto ou a um eucarioto. Esta
diferenciao deve-se s caractersticas estruturais dos genes destes dois
organismos. Em procariotos, a sequncia codificadora de uma protena
frequentemente representa uma minscula parcela do DNA cromossomal
(<0,02%). Os genes so sequncias de DNA contnuas e organizadas em um
operon.
Esta unidade transcricional permite que todos os genes relacionados a
uma determinada funo sejam transcritos em um nico RNAm policistrnico.
Por outro lado, o gene de eucariotos formado pela sequncia codificadora, os
exons, que so interrompidos por sequncias grandes e no codificadoras, os
introns. Portanto, diferentes estratgias de clonagem devem ser adotadas para
o isolamento e clonagem de genes eucariotos e procariotos.
3.1.5 Obteno do Inserto
3.1.5.1 Construo de Bibliotecas Genmicas e de Bibliotecas de CDNA
76
A obteno de um determinado gene depende dos objetivos da

clonagem, das caractersticas do gene e, enfim, do conhecimento prvio que se
tem a respeito do mesmo. Se no h um conhecimento prvio da sequncia,
uma das alternativas para o isolamento do inserto consiste em subdividir o
DNA cromossomal em pequenos fragmentos que sero ento clonados em
vetores. Em seguida, os vetores recombinantes so transformados em um
hospedeiro
ento
analisados
caracterizados.
Teoricamente,
este
procedimento capaz de obter clones que representam todo o DNA genmico

do organismo a ser estudado. Este o princpio da criao de uma biblioteca
genmica ou banco gnico, elemento bsico do processo inicial do
sequenciamento de genomas.
Uma das maneiras de criar uma biblioteca genmica tratando o DNA
com uma endonuclease de restrio cujo stio de restrio reconhea quatro
pares de bases. Assim, teoricamente o DNA ser clivado aproximadamente a
cada 256 pb. Entretanto, como as enzimas de restrio reconhecem stios
especficos, pode ocorrer que os fragmentos gerados sejam muito grandes, o
que dificulta a clonagem. Se nem todos os fragmentos referentes ao genoma
total so clonados, ento a biblioteca disponvel para a seleo est incompleta
e, assim, o fragmento de interesse pode estar interrompido ou mesmo ausente,
dificultando a seleo de um determinado gene.
Para solucionar este problema, o DNA cromossomal ento submetido
a uma digesto parcial. Assim, geram-se fragmentos de diferentes tamanhos,
permitindo que todos os fragmentos estejam representados aps a clonagem
em um determinado vetor (Fig. 31).
77
Stio de
restrio
a
Stio de
restrio
b
Stio de
restrio
c
Digesto parcial
b
a+b
d
d
a+b+c
a
b+c+d
a+b
a
a
Figura
c+d
d
b+c
b
c+d
31:
Digesto
parcial de uma amostra

de DNA com enzimas de
restrio.
A digesto parcial realizada por variaes no tempo ou na quantidade

de enzima utilizada. O resultado a gerao de fragmentos de vrios
tamanhos, o que permite que todos sejam clonados e que a biblioteca
genmica seja representativa. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994).
Alm da biblioteca genmica, h a possibilidade de desenvolver uma biblioteca
de DNA complementar ou cDNA. O cDNA um DNA sinttico que tem como
molde molculas de RNAm total de uma clula. Para este procedimento, utilizase uma enzima especial chamada transcriptase reversa que ir fazer uma fita
de DNA a partir de um molde de RNA. Essa enzima foi originalmente isolada
de membros da famlia Retrovidea, como o vrus da imunodeficincia humana
(HIV).
A gerao de cDNA inicialmente se baseia em uma caracterstica
estrutural do RNAm, a cauda poliA. Esta caracterstica usada para separar a
frao composta por RNAm de outros componentes, inclusive de outros tipos
78
de RNA, como RNAr e RNAt. Isto possvel, pois somente o RNAm possui a
cauda de poliA em sua estrutura. Para a sua purificao, o material derivado da
extrao de RNA passado por uma coluna seletiva, na qual esto ligadas
pequenas cadeias curtas de resduos de timina de aproximadamente 15
nucleotdeos. Ento, o RNAm se liga coluna devido ao pareamento de bases
entra a cauda poliA e os resduos de timina.
Por outro lado, os RNAt e os RNAr passam com o fluxo e no so
retidos na coluna, pois no h um pareamento de bases que permita a ligao.
Finalmente, o RNAm eludo da coluna aps um tratamento com um tampo
capaz de interromper as pontes de hidrognio formadas entre adenina e timina,
liberando a molcula de RNAm.
Antes que as molculas de RNAm possam ser clonadas em um
determinado vetor, elas precisam ser convertidas em uma molcula de DNA
dupla fita. O sucesso deste experimento depende da ao sucessiva de duas
enzimas diferentes: a transcriptase reversa e do fragmento de Klenow da
DNAP
I.
Inicialmente,
so
adicionadas
pequenas
molculas
de
oligonucleotdeos compostos somente por timinas ao material de RNAm eludo

da coluna seletiva.
Adicionalmente, juntada a enzima transcriptase reversa e os quatro
desoxirribonucleotdeos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Neste procedimento, os
pequenos oligonucleotdeos de timina se pareiam a regio da cauda poliA,
providenciando uma extremidade 3 hidroxila para que a sntese de uma fita de
DNA complementar seja iniciada.
A transcriptase reversa utiliza como molde uma fita simples de RNA
para polimerizar uma cadeia de DNA. Assim, os oligonucleotdeos referentes
composio estrutural do DNA vo sendo incorporados cadeia que est
sendo
polimerizada
pela
transcriptase
reversa,
baseando-se
na
complementaridade de bases. Entretanto, a sntese in vitro realizada por esta

enzima frequentemente um procedimento incompleto e somente uma fita
simples de DNA produzida. Contudo, antes que a sntese desta fita simples
de DNA seja finalizada, h a formao de um looping, ou uma volta, na
79
poro 5, onde a fita de DNA se dobra sobre si mesma. Esta sequncia pode
ento ser utilizada como um primer para a polimerizao da fita dupla de
DNA.
A segunda fita de DNA sintetizada aps a adio do fragmento de
Klenow. Esta enzima adiciona nucleotdeos complementares aos especificados
pela fita simples sintetizada pela transcriptase reversa, concluindo ento a
cadeia dupla de DNA. Para isto, o fragmento utiliza como iniciador a volta
formada pela dobra na poro 5do cDNA.
Para finalizar o processo de gerao de uma fita dupla de DNA a partir
de RNAm, a amostra tratada com a enzima RNase H que tem por finalidade
degradar molculas de RNAm molde. Finalmente, a volta de DNA formado na
extremidade 5 do cDNA desfeita pela ao da nuclease S1, que tem como
princpio geral degradar extenses de DNA fita simples. Ao final de todo o
procedimento, tem-se uma amostra que apresenta uma mistura composta de
cDNA de dupla fita correspondente aos RNAm que sejam os mais
representativos na amostra inicial. Este material ser clonado em um vetor
apropriado. Um esquema geral do procedimento envolvido na gerao de
cDNA est descrito na Fig. 32.
RNAm
Oligo (dT)
Transcriptase reversa e
polimerizao de cDNA
RNAm
cDNA
RNase H
Degrada fita de RNA
cDNA
Fragmento de
Klenow
Nuclease S1
DNA dupla fita
Figura 32: Sntese de cDNA.
80
Um iniciador composto de nucleotdeos de timina adicionado

amostra contendo os RNAm purificados. A transcriptase reversa e os quatro
nucleotdeos constituintes da molcula de DNA so adicionados ao RNAm. A
fita simples de DNA complementar ao RNAm cDNA polimerizada, sendo
que na poro 3 do cDNA h a formao de uma volta sobre esta molcula fita
simples de DNA, que servir como iniciador para a fita complementar ao cDNA
para a de DNA fita dupla. O looping que serviu de iniciador rompido pela
ao da nuclease S1. As fitas de RNAm so degradadas pela ao da
RNaseH.
A escolha entre as abordagens de construo de uma biblioteca
genmica ou de uma biblioteca de cDNA depende do experimento em questo
e das perguntas que se deseja responder. Se a pesquisa tem por finalidade o
sequenciamento de um genoma, a biblioteca necessita obter clones que
representem todo o material gentico daquele organismo. Somente assim a
sequncia pode ser finalizada e anotada. A procura de um determinado gene
em especfico e a anlise de como ele se encontra estruturado no genoma,
como em um operon, alm das anlises de sequncias reguladoras, requerem
que uma determinada sequncia grande esteja contida em um determinado
clone. Nestes casos, a melhor opo se faz pela construo de uma biblioteca
genmica.
H casos em que a inteno de realizar um experimento a anlise de
um determinado produto proteico. Um exemplo o exame de expresso de um
gene especfico e peculiar a um determinado tipo de tecido ou mesmo que se
suspeita estar envolvido com o desenvolvimento de uma determinada
patologia. O conhecimento de qual tecido o gene est sendo expresso facilita a
seleo deste gene de interesse, j que o mesmo deve estar enriquecido de
seus transcritos. Portanto, este tecido utilizado como fonte de extrao de
RNAm.
Outro aspecto se a finalidade em isolar um gene para que o mesmo
seja expresso em um hospedeiro diferente para fins comercias. Nestes casos,
a biblioteca de cDNA uma opo. Isto vantajoso principalmente quando se
81
deseja expressar genes de eucariotos em clulas bacterianas. Como o cDNA

uma cpia complementar ao RNAm maduro, que j sofreu processamentos,
ento este cDNA no ir conter introns em sua sequncia. Como as clulas
bacterianas no so capazes de remover os introns e unir somente os exons, a
biblioteca de cDNA mais til nestes casos. Contudo, deve-se lembrar que o
cDNA no apresenta as regies reguladoras que constituem um gene. Assim,
neste ltimo caso, a biblioteca genmica mais til.
Em casos em que um determinado gene a ser estudado quanto a sua
estrutura e composio, o que no possvel simplesmente pela anlise de
cDNA, pode-se restringir a frao genmica usada na construo da biblioteca
genmica. Levando em considerao que determinados genomas so
extremamente grandes e at mesmo composto por um conjunto de
cromossomos, a restrio se faz possvel se o pesquisador conhecer
previamente em qual cromossomo o gene est localizado.
Uma das tcnicas utilizadas neste processo baseia-se na seleo de
cromossomos com o uso de um instrumento denominado citmetro de fluxo.
Uma suspenso de cromossomos separada por este aparelho de acordo com
o peso molecular e a frao contendo o gene de interesse utilizada na
construo da biblioteca genmica.
Outra tcnica possvel fracionar cromossomos inteiros pela tcnica
de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A eletroforese uma tcnica
que separa fragmentos de cido nucleico ou protenas em gis de acordo com
o tamanho quando expostos a um campo eltrico. A PFGE ou pulse field
uma eletroforese mais especializada que permite a separao de molculas
muito longas de DNA.
A tcnica consiste em imprimir vrios campos eltricos oscilantes
orientados em vrias direes diferentes. Esta estratgia permite at mesmo
que determinadas molculas cromossomais inteiras passem no gel para
posies diferentes de acordo com o tamanho de cada uma (Fig. 33). O
cromossomo desejado ento separado do gel, eludo e finalmente utilizado
na construo da biblioteca genmica.
82
Aparelho de PFGE
Resoluo dos fragmentos de DNA
Visualizao em gel de agarose corado com brometo de etdeo
Figura 33: Metodologia do PGFE.
O gel de agarose com as amostras de DNA so corridas em um

aparelho hexagonal que permite que o campo eltrico seja alternado a 120 a
cada 90 segundos por 18 a 24 horas a 14C. As molculas de DNA migram
paralelamente ao campo eltrico. Os fragmentos de peso molecular maior
levam mais tempo para migrarem no gel em relao s de peso molecular
menor. Isto permite que bandas distintas sejam visualizadas em um gel de
agarose. S1, S2 e S3 so amostras diferentes; Mkr: marcador de peso
molecular.
A construo de bibliotecas utilizada quando no h um
conhecimento prvio a respeito da sequncia de nucleotdeos que constituem
um gene. Em casos de organismos em que o genoma j foi sequenciado, o
isolamento de sequncias especficas extremamente facilitado, sendo que a
produo pode ser sinttica ou mesmo por tcnicas de biologia molecular,
como o PCR.
83
3.1.5.2 Produo Sinttica de Genes
A produo qumica de um gene ou mesmo de seus fragmentos ocorre

pela sntese de cada fita complementar separadamente. Fragmentos curtos,
entre 60 a 80 pb, podem ser produzidos por fitas complementares
separadamente que depois so aneladas entre si. Contudo, para a produo
de fragmentos maiores, como acima de 300 pb, tcnicas mais apuradas devem
ser utilizadas. Isto se deve ao fato da eficincia de ciclos envolvidos durante a
sntese qumica no apresentarem uma eficincia de 100%.
Um dos mtodos para a sntese de fragmentos maiores consiste na
sntese inicial de oligonucleotdeos complementares e sobrepostos, compostos
de 20 a 60 nucleotdeos. O planejamento para a sntese de cada fita ocorre de
maneira que aps o anelamento, os dois fragmentos de um gene sejam
alinhados de forma que suas extremidades se mostrem cegas, sem fitas
complementares. Cada fita sintetizada apresenta seu segmento complementar
e as extremidades 5 e 3 so tambm projetadas para que apresentem uma
complementaridade, o que permite a montagem dos fragmentos de acordo com
a sequncia do gene (Fig. 34).
Aps o anelamento entre os fragmentos, o ltimo passo para concluir a
sntese qumica de um gene selar os fragmentos entre as extremidades 5 e
3 das fitas adjacentes. Isto possvel pela ao da T4 DNA ligase.
84
S n te se d e fita s in d iv id u a is
P
2
P
3
OH
OH
5
OH
OH
6
OH
OH
A n e la m e n to
OH
OH
OH
OH
OH
OH
L ig a o
P
OH
OH
Figura 34: Sntese de uma sequncia codificadora a partir do anelamento entre

oligonucleotdeos.
Estes so fabricados de forma que o anelamento entre as fitas

complementares permita que uma fita dupla de DNA completa seja formada.
Para selar a cadeia, as ligaes fosfodister so ligadas por ao da enzima
T4 ligase. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994). Uma modificao
deste mtodo foi criada como alternativa para a produo qumica de genes.
Inicialmente, so sintetizados oligonucleotdeos complementares e sobrepostos
por aproximadamente 40 a 100 nucleotdeos.
Aps o anelamento entre as fitas complementares, permanecem
grandes regies de sequncias que no anelaram a outra sequncia
complementar, ou seja, compostas somente por fita simples (Fig. 35). Apesar
disso, as fitas se mantm unidas, o que se deve regio de nucleotdeos
sobrepostos.
Estes
buracos
constitudos
por
fita
simples
so
ento
completados pela ao de polimerizao da DNAP I de E. coli. Aps a

finalizao deste processo, as fitas so seladas pela ao da enzima T4 DNA
85
ligase.
Sntese de oligonucleotdeos
P
2
OH
OH
OH
OH
Anelamento
OH
OH
OH
OH
Ligao
P
OH
OH
Figura 35: Sntese in vitro de um gene a partir de oligonucleotdeos sintetizados quimicamente.
As sequncias dos oligonucleotdeos so desenhadas de maneira que

ao se anelarem suas sequncias complementares haja tambm fitas simples
no pareadas (gaps). Para a formao de fita dupla por toda molcula de
DNA, os gaps so preenchidos por meio de uma sntese enzimtica pela
DNAP I e, finalmente, a fita de DNA selada pela ao da enzima T4 ligase.
(Figura modificada de Glick & Paternak, 1994).
Para fragmentos maiores que 1.000 pb, a sequncia gnica completa
frequentemente feita a partir da unio de fragmentos de fita dupla de 20 a 60
pb, que se anelam entre si pela complementaridade entre quatro a seis
nucleotdeos sobrepostos. Se h uma quantidade suficiente de fragmentos fita
dupla aps a sntese e anelamento, eles so simplesmente ligados uns aos
outros. Caso contrrio cada fragmento deve ser clonado a um vetor para que a
86
quantidade de DNA seja amplificada. Contudo, em ambos os casos as

construes de fragmentos fita dupla de DNA so ligados de forma sequencial,
a fim de formar a sequncia completa de um determinado gene.
Mesmo sendo a sntese qumica uma estratgia capaz de atingir seus
objetivos com sucesso, como mencionado anteriormente ela no 100%
eficaz. Assim, o fragmento obtido por este procedimento deve ser
necessariamente sequenciado. Isto envolve gastos, que se somados ao alto
custo do prprio procedimento de sntese qumica, pode se tornar invivel.
Alternativas esto disponveis e so capazes de realizar o mesmo
procedimento quando se tem o prvio conhecimento a respeito da sequncia
de um gene. Uma destas tcnicas a amplificao do DNA, atravs da reao
em cadeia pela polimerase, o PCR.
3.1.5.3 Reao em Cadeia pela Polimerase - PCR
A reao em cadeia pela polimerase (PCR) muito efetiva em gerar

quantidades extraordinrias do DNA de interesse in vitro. uma tcnica
extremamente sensvel, sendo capaz de amplificar DNA a partir de picogramas
da amostra. Alguns requerimentos so essenciais para a realizao da tcnica:
I.
Um
par
de
oligonucleotdeos
sintticos,
denominados
de
oligonucleotdeos iniciadores (primers), deve ser desenhado de maneira

complementar sequncia de interesse. Estes iniciadores devem ser
compostos por aproximadamente 20 pb e sua composio de nucleotdeos
deve ser idealmente balanceada para que haja uma equivalncia da proporo
A + T e C + G. Um dos iniciadores deve ser desenhado de maneira
complementar fita molde e o outro codificadora. A sequncia dos dois
iniciadores deve ser orientada de maneira oposta s fitas de DNA;
II.
A sequncia alvo a ser amplificada e que se encontra dentro da
amplitude dos iniciadores deve ser composta de 100 a 5.000 nucleotdeos em

sua extenso. Entretanto, a biologia molecular moderna tem avanado
enormemente e muitos produtos novos tm sido aprimorados. Portanto, o
87
tamanho do fragmento a ser amplificado deve ser condizente com a

capacidade de polimerizao de cada enzima polimerase especfica a ser
utilizada no processo;
III.
A enzima responsvel pela polimerizao das cpias referente
sequncia especfica, genericamente conhecida como Taq DNA polimerase,

deve ser capaz de resistir a altas temperaturas, como 95C ou mais;
IV.
Para que a reao de polimerizao ocorra, devem ser
adicionados mistura contendo DNA, enzima e tampo, os quatros

oligonucleotdeos (dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
A metodologia adotada para a amplificao de fragmentos de DNA
muito similar ao processo de transcrio, sendo que uma das diferenas que
ao final da PCR so obtidas molculas de DNA fita dupla ao invs de
molculas de RNA fita simples. A metodologia da PCR consiste em vrios
ciclos sucessivos, sendo que cada um tm pelo menos trs passos bsicos:
I. Desnaturao: o primeiro passo consiste na desnaturao do DNA
pelo aumento de temperatura, geralmente obtido a 95C. Esta temperatura
mantida por aproximadamente um minuto;
II. Anelamento: neste passo, realizado a aproximadamente 55C, o par
de iniciadores se anela sequncia complementar de DNA da amostra;
III. Polimerizao: este passo realizado com uma temperatura mdia
de 72C, que tima para a funo cataltica da Taq DNA polimerase. A
sntese se inicia na poro hidroxila 3 de cada iniciador.
IV. A durao de cada um dos passos e a temperatura utilizada nos
mesmos variam enormemente e, por isso, cada protocolo precisa ser
padronizado para a sua utilizao. A reao de amplificao ocorre em um
aparelho automatizado e programvel, o termociclador.
Para entender como se sucede a amplificao dos fragmentos de DNA,
deve-se ter em mente a localizao de cada iniciador durante o anelamento.
No primeiro ciclo, os iniciadores se ligam em direes opostas a cada uma das
molculas geradas pela desnaturao do DNA. Nos ciclos iniciais, a
amplificao vai alm da sequncia complementar ao outro iniciador (Fig. 36),
88
gerando fitas mais longas. No segundo ciclo, isto tambm acontece; porm, h
a amplificao de fragmentos mais curtos, que tm a sequncia de um iniciador
na extremidade de uma fita e o outro, na outra extremidade da fita
complementar. Em ciclos subsequentes, os fragmentos de amplificao mais
curtos vo se acumulando e, ao final de 30 ciclos, elas predominaro.
Iniciador 1
Iniciador 2
DNA fita
dupla
desnaturao
Anelamento
Extenso
Primeiro
ciclo
Segundo
ciclo
Terceiro
ciclo
Figura 36: Reao de PCR.
Durante os estgios iniciais de amplificao so geradas fitas de DNA

mais longas. Em ciclos subsequentes, o material amplificado consistir de uma
fita de DNA composta pelos iniciadores em suas extremidades. Estes
amplicons mais curtos predominaro ao final de 30 ciclos de amplificao. Uma
das aplicaes da PCR na tecnologia do DNA recombinante o isolamento de
um gene especfico, que ser produzido em grande quantidade e este pode ser
clonado em um vetor apropriado.
Para a clonagem, deve-se considerar que a Taq DNA polimerase tm
uma atividade enzimtica incomum, adicionando um nucleotdeo de adenina ao
final 3 de cada fita. Isto ideal para a clonagem em vetores do tipo que
apresentam um acrscimo de timina na poro 5 de cada fita. Apesar de esta
caracterstica dificultar a clonagem de fragmentos que possuem extremidades
89
cegas, este fato nem sempre verdadeiro. H diferentes tipos de Taq DNA
polimerases especializadas em distintas funes e nem todas possuem a
caracterstica de acrescentar adeninas extremidade 3 das fitas de DNA.
A clonagem de insertos gerados por PCR facilitada quando tanto o
vetor como os insertos so digeridos com a mesma enzima de restrio, pois
este procedimento gera extremidades coesivas que ainda permitem a
clonagem direcional. Contudo, alguns insertos no possuem a sequncia a ser
reconhecida pela enzima desejada e a digesto com a enzima de interesse
ocorre de maneira que a sequncia codificadora seja clonada fora da fase de
leitura. Este um ponto crtico para procedimentos que tm por objetivo a
expresso de protenas. Para facilitar estes procedimentos, fragmentos de DNA
adaptadores, contendo os fragmentos de restrio desejados, podem ser
adicionados sequncia dos insertos.
3.1.5.3.1 Adaptadores
Os adaptadores so pequenos fragmentos de nucleotdeos que contm

a sequncia nucleotdica reconhecida por uma determinada enzima de
restrio. Uma estratgia muito utilizada na construo destes adaptadores
inserir a sequncia da enzima de restrio ao desenhar o par de iniciadores a
ser utilizado na PCR (Fig. 37). Esta tcnica, alm de ser de fcil realizao,
ainda permite que mesmo aps a insero do stio de restrio, a sequncia
codificadora de uma determinada protena seja inserida no vetor com a fase de
leitura correta.
90
Figura 37: Desenho de iniciadores

com sequncias adaptadoras.
O iniciador 1 idntico em sequncia fita codificadora. O iniciador 2

complementar fita codificadora. Os stios de restrio so acrescidos
poro 5 de cada iniciador (esto em itlico e sublinhados; a enzima que os
reconhece est entre parnteses). Os adaptadores constituem, portanto, uma
estratgia que facilita a clonagem. O passo seguinte ento a escolha de um
vetor de clonagem mais apropriado para um determinado inserto e para um
dado experimento.
3.2 Vetores de Clonagem
O vetor ideal deve reunir em uma molcula diversas caractersticas,

como:
I-
Ser uma molcula pequena e de fcil manipulao;
II-
Ser capaz de se replicar de forma autnoma e intensa, o que
permite a amplificao do fragmento de interesse;

III- Deve
conter
diferentes
sequncias
que
permitam
91
reconhecimento por enzimas de restrio. Neste caso, stios nicos so

interessantes porque a insero pode ser direcionada e no h problema de
perda de fragmentos aps a digesto enzimtica. Com esta finalidade, vrios
vetores foram modificados para permitir a insero de um stio mltiplo de
clonagem. Este representa uma sequncia sinttica construda de maneira a
portar somente um nico stio de restrio reconhecido por diferentes enzimas;
IV- Ter um mtodo fcil e rpido de identificao de clones que
portam o vetor recombinante.
Atualmente, esto disponveis no mercado diversos tipos diferentes de
vetores que permitem que o procedimento de clonagem seja realizado. A
escolha entre eles depende basicamente das caractersticas do inserto e da
aplicao pretendida para o gene clonado.
3.2.1 Plasmdeos
Plasmdeos
extracromossomal,
so
que
molculas
apresentam
de
a
DNA
dupla
capacidade
de
fita
circular
autorreplicao.
Virtualmente, quase todos os gneros de bactrias possuem plasmdeos. Eles

podem conter os mais variados tipos de informao. Alguns carregam
informaes que os permite se transferirem de uma clula para a outra
(plasmdeos F); podem ainda conter genes de resistncia a antibiticos ou
codificarem protenas envolvidas com metabolismos exticos. Aparentemente,
alguns plasmdeos podem no apresentar nenhuma funo extra, quando so
ento denominados de crpticos.
Os plasmdeos podem pertencer ao grupo de alto nmero de cpias
com 10 a 100 cpias por clula hospedeira, ou ao grupo de baixo nmero de
cpias com 4 a 10 cpias por clula hospedeira. Independente do nmero de
cpias, mais de um plasmdeo com funes diferentes pode coexistir numa
mesma clula. A literatura j descreveu micro-organismos contendo at mesmo
de um a oito plasmdeos diferentes por clula. Alm disso, devido
especificidade da origem de replicao, os plasmdeos podem se replicar em
92
uma espcie especfica ou mesmo em vrias espcies de clulas hospedeiras;

por esta caracterstica, os plasmdeos so denominados como estritos ou no a
um hospedeiro.
Por
serem
molculas
autorreplicativas,
os
plasmdeos
so
considerados como excelentes veculos para a clonagem molecular. Com este

objetivo, os plasmdeos naturalmente isolados de bactrias foram modificados
por engenharia gentica para permitir a incluso de caractersticas essenciais a
um vetor de alta eficincia, como:
I.
Serem molculas de baixo peso molecular, pois a eficincia de
transformao diminui com vetores de peso acima de 15Kb;

II.
A presena de um nico stio de restrio a ser reconhecido por
uma determinada enzima de restrio;

III.
Possuir um ou mais marcadores de seleo que facilitem o
reconhecimento e a seleo do vetor hbrido.

IV.
Dois vetores plasmidiais tm sido utilizados em gentica, o
pBR322 e pUC (Fig. 38). Eles se derivam de plasmdeos encontrados

naturalmente em espcies bacterianas, porm com modificaes genticas que
permitiram sua adaptao como vetores de clonagem eficientes.
Figura 38: Plasmdeos. (A) pBR322; (B) pUC19
93
O pBR322 possui uma estrutura mais simples que a do pUC. Possui

dois genes de resistncia a drogas: um codifica a ampicilina e outro, a
tetraciclina. Dentro da sequncia codificadora de cada um destes genes h
stios de restrio nicos, os quais tm sido utilizados na clonagem. Contudo,
geralmente a insero realizada no stio de BamHI presente na sequncia
codificadora
da
tetraciclina.
Isto
tem
implicaes
na
seleo
dos
transformantes, como ser discutido mais adiante.

O vetor pUC mais avanado e permite uma segunda alternativa de
seleo dos transformantes. Alm da resistncia ao antibitico ampicilina,
possvel uma seleo fenotpica por colorao. O vetor constitudo por parte
do operon Lac. Uma frao do gene lacZ (Z) est sob o controle do promotor
indutvel do operon Lac e da protena repressora LacI. Dentro da regio
codificadora do gene lacZ foi inserido o stio mltiplo de clonagem.
Outros plasmdeos que permitem uma clonagem eficiente em at 5
minutos so aqueles que possuem adio de timinas s extremidades 5 de
cada fita do vetor linearizado. Estes vetores so rotineiramente utilizados em
laboratrios para a clonagem de produtos de PCR. Isto se deve adio de
adeninas s extremidades 3 dos amplicons, como j referido anteriormente
(Fig. 39).
Figura 39: Vetor para clonagem de produtos de PCR.
94
O vetor apresenta em suas extremidades 5 um nucleotdeo de timina,

que pode se parear com um resduo de adenina presente no inserto devido
ao da Taq Polimerase. Os pequenos plasmdeos que contm grandes
inseres de DNA heterlogo tendem a perder espontaneamente a insero.
Portanto, a escolha de plasmdeos como vetor de clonagem deve ser feita
quando os fragmentos de insero contenham at 10 kb de tamanho. Assim, a
clonagem
de
fragmentos
maiores
deve
levar
em
considerao
as
caractersticas de outros vetores.
3.2.2 Bacterifagos
Para a formao de uma biblioteca genmica, a clonagem de

fragmentos maiores facilita para que a mesma seja mais representativa,
contendo todo ou a maior parte do contedo cromossmico. Com essa
finalidade, foram desenvolvidos veculos de clonagem como os bacterifagos
ou fagos lambda. Em seu ciclo de vida, o bacterifago infecta a E. coli e pode
culminar em dois destinos diferentes: no ciclo lisognico ou no ltico. No ciclo
lisognico, o DNA do fago injetado na clula hospedeira pode ser integrado ao
cromossomo da bactria.
Este material conhecido como profago e pode ser mantido
indefinidamente na clula hospedeira. Contudo, sob determinadas condies
de estresse ambiental ou nutricional, o fago pode entrar no ciclo ltico. Neste
caso, o DNA do fago pode ser excisado e utilizado na formao de novas
partculas virais, resultando na lise da clula hospedeira. Com propsitos de
us-lo na tecnologia do DNA recombinante, o DNA do fago recombinante
contendo o inserto precisa ser perpetuado como um bacterifago por meio de
vrios ciclos lticos.
A formao de partculas completas do fago uma sequncia de
eventos altamente coordenada. Um bacterifago formado por uma cauda de
protenas tubulares e por um capsdeo que comporta cerca de 50 kb de DNA
(Fig. 40), sendo que aproximadamente 20 kb so essenciais para os eventos
95
de integrao e exciso deste material gentico no cromossomo da clula

hospedeira. Cada extremidade 5 da molcula linear composta por uma fita
simples de doze nucleotdeos. Estas sequncias so complementares e por
isso, conhecidas por extremidades coesivas ou sequncia cos. Por serem
complementares, elas permitem que este DNA linear possa se circularizar
como um plasmdeo.
Figura 40: Composio estrutural do fago lamba.
Na fase inicial do ciclo ltico, h a replicao do material gentico do

fago com a criao de uma molcula linear composta por muitas unidades de
50 kb. Cada capsdeo comporta entre 38 a 50 kb de DNA e a localizao das
sequncias cos assegura isto (Fig. 41).
Figura 41: Empacotamento do DNA no capsdeo do fago lamba durante o ciclo ltico.
96
As sequncias cs asseguram que somente 50 kb de DNA sero

utilizados na formao de cada partcula viral. (Figura modificada de Glick &
Paternak, 1994). Os bacterifagos foram ento manipulados por engenharia
gentica para permitir a incluso de stios BamHI nas regies flanqueadoras da
sequncia que codifica protenas relacionadas com a integrao do genoma do
fago. O uso da enzima gera trs fragmentos de restrio: o L, o I/E e o R. O
fragmento L contm a informao gentica para a produo do capsdeo e da
cauda. O R codifica os genes relacionados com a replicao do DNA e do ciclo
ltico. O I/E contm os genes necessrios para a integrao e exciso do DNA
do fago.
Com o propsito de utilizar os bacterifagos na clonagem molecular, as
sequncias I/E so substitudas pelo inserto de interesse. Para isso, o DNA de
interesse submetido a uma digesto enzimtica com BamHI e fragmentos de
aproximadamente 20 kb so selecionados como inserto. Estas amostras so
ento ligadas ao DNA do fago digerido com a mesma enzima (Fig. 42). O DNA
recombinante ento empacotado e utilizado na formao de novas partculas
de fago durante o ciclo ltico.
BamHI
BamHI
BamHI
Digesto BamHI
BamHI
cos
I/E
R
cos
Digesto BamHI
Seleo fragmento
de 20kb
I/E
T4 ligase
cos
R
cos
Figura 42: Sistema de clonagem do bacterifago lambda.
97
O Bacterifago lamba modificado por engenharia gentica para

permitir que stios de restrio da enzima BamHI sejam inseridos nas
extremidades flanqueadoras da regio I/E. O DNA de interesse tambm
digerido com a mesma enzima e fragmentos resultantes de peso molecular de
20 kb so selecionados para a clonagem. Com o auxlio da T4 ligase, o inserto
selecionado ligado s regies L e R. (Figura modificada de Glick & Paternak,
1994).
A formao da partcula do fago contendo o DNA recombinante foi
possvel aps estudos in vitro que demonstraram a viabilidade do processo.
Partculas infectivas podem ser produzidas aps uma simples mistura dos
elementos constituintes da partcula do fago: capsdeo, a cauda e o DNA
recombinante. Os fagos so, portanto, teis na clonagem de fragmentos que
apresentem peso molecular variando entre 20 a 25 Kb.
Contudo, a obteno de insertos maiores desejvel em determinadas
situaes, como para o sequenciamento de longas molculas de DNA do
cromossomo eucarioto. Para a clonagem de genes destes organismos,
frequentemente necessrio obter fragmentos superiores a 25 kb. Como os
genes de eucariotos podem variar de 30 a 40kb, o que se deve presena de
introns, a clonagem de fragmentos maiores possibilita a incluso de toda uma
sequncia em um nico clone. Por este motivo, outros vetores tm sido
desenvolvidos para a clonagem destes fragmentos. Entre eles esto os
cosmdeos, os YACs (cromossomo artificial de leveduras) e os BACs
(cromossomo artificial bacteriano).
3.2.3 Cosmdeos
Os cosmdeos so vetores hbridos que associam elementos de

plasmdeos origem de replicao, gene de resistncia a antibiticos e o stio
mltiplo de clonagem e de fagos. Assim, o inserto de DNA pode ser
englobado no capsdeo do fago, responsvel por inserir o DNA recombinante
98
na clula hospedeira. Ao entrar na clula, as sequncias cos complementares,

derivadas dos fagos, permitem que o DNA linear do fago possa se circularizar
como um plasmdeo (Fig. 43). A diferena entre fagos e cosmdeos o
tamanho do inserto que pode ser clonado nos dois vetores. O inserto
heterlogo que o cosmdeo carrega cerca de trs vezes maior que o do fago
(aproximadamente 45kb).
Cos
ScaI
BamHI
Cos
DNA
Tet R
Cos
Digesto BamHI
ScaI
Cos
BamHI
BamHI
Ligao T4 ligase
Cos
Cos
50kb
Formao de Partculas
de fagos
Infeco
Figura 43: Sistema de clonagem utilizando cosmdeo como vetor.
99
O cosmdeo contm duas sequncias intactas de stios cos

flanqueando o stio nico da enzima ScaI, um nico stio de BamHI e a
sequncia codificadora da tetraciclina, o que permite a seleo por antibitico
de clones transformados com os cosmdeos. O vetor ento digerido com ScaI
e BamHI. A fonte de DNA digerida com BamHI e os fragmentos de 40kb so
selecionados como insertos. O vetor e o inserto so ligados com o auxlio da
T4 ligase e utilizados na formao de novas partculas infectivas de fagos.
Estes infectam E. coli e as sequncias cs permitem que este DNA
recombinante
se
circularize
como
um
plasmdeo.
Finalmente,
os
transformantes so selecionados por sua capacidade de crescerem em meio

contendo tetraciclina. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994).
Para a construo de um cosmdeo, a maior parte do DNA relacionado
com a estrutura do fago deletada, permanecendo somente os stios cos. Esta
estrutura modificada permite que quase toda a sequncia do DNA doadora
possa ser inserida, desde que no exceda 50 kb, capacidade mxima de DNA
que o capsdeo do fago comporta. Estratgias similares aos cosmdeos foram
desenvolvidas, como os bacterifagos P1. A vantagem do uso destes outros
vrus que os mesmos podem acomodar molculas de DNA de at 100 kb.
Fragmentos ainda maiores podem ser clonados em outros vetores, como os
BAC e os YAC.
3.2.4. Bac e Yac
Os BAC so vetores similares a outros plasmdeos, exceto que sua

origem de replicao e as protenas envolvidas na replicao so derivadas do
plasmdeo fator F de E. coli. Isto permite que os BAC sejam transferidos
clula hospedeira por conjugao (Fig. 44). Estes vetores podem conter
fragmentos de at 300 kb.
100
cromossomo
BAC
pilus
Clula F+
Clula F-
Estabilizao no pareamento
entre as clulas
Replicao e transferncia de
uma das fitas
Sntese da fita complementar
Finalizao da transferncia
com a separao das clulas
Clula F+
Clula F+
Figura 44: Transferncia de BAC s clulas hospedeiras.
Por serem derivados do plasmdeo F, que possuem os elementos

genticos necessrios conjugao bacteriana, o BAC contendo o gene de
interesse pode ser transferido clula hospedeira atravs da conjugao.
Contudo, rotineiramente se tem utilizado a transformao como meio de
transferir o BAC para as bactrias.
A clonagem de fragmentos ainda maiores de DNA foi possvel aps a
descoberta de elementos funcionais de cromossomos de leveduras, como
centrmero, telmero e sequncias que asseguram a replicao autnoma e a
segregao correta dos cromossomos. Isto permitiu a construo de
cromossomos artificiais de leveduras que funcionam como vetores de
101
clonagem. Os YAC so molculas de DNA fita dupla linear que podem conter
insertos de at um megabase (1.000 Kb). Assim, podem-se isolar clones que
apresentem
sequncias
sobrepostas
de
insertos
que
contenham
coletivamente quase um cromossomo humano inteiro (Fig. 45).
Digesto com
BamHI e EcoRI
DNA de interesse
Ligao
Seleo
Figura 45: Construo de YAC.
A partir de um vetor que contm todos os elementos necessrios para

a perpetuao de um cromossomo eucarioto, feita uma digesto enzimtica
para a linearizao do vetor. O DNA de interesse extrado, purificado e
digerido com as mesmas enzimas. Procede-se com a ligao entre as
102
extremidades coesivas do vetor e do inserto, sendo que este DNA

recombinante ser transformado em uma levedura de eleio e os clones
recombinantes sero selecionados por resistncia a antibiticos.
3.2.5 Vetores de Expresso
Os vetores de expresso so vetores de clonagem que possuem todos

os
elementos
genticos
que
permitem
expresso
de
protenas
recombinantes. Se os elementos genticos permitem a expresso em clulas

bacterianas, este um vetor de expresso procarioto. o tipo mais utilizado
em pesquisas, pois a manipulao de culturas bacterianas mais fcil.
Contudo, bactrias no so capazes de processar o RNAm de eucariotos e,
neste caso, os insertos a serem utilizados devem ser derivados de bibliotecas
de cDNA. Uma alternativa a esta questo o uso de vetores de expresso
eucariotos, que possuem um promotor eucarioto e sinais de poliadenilao, por
exemplo.
Os vetores de expresso so utilizados quando a busca de uma
determinada sequncia se faz por meio da deteco da protena por ela
codificada. Para isso, o stio mltiplo de clonagem inserido prximo regio
promotora. As desvantagens do uso de vetores de expresso para o
isolamento
de
um
determinado
gene
de
interesse
se
devem
ao
desconhecimento da sequncia do inserto. Para que haja a expresso de uma

determinada protena, o inserto deve se ligar ao vetor de forma que a fase de
leitura correta seja reconhecida pela maquinaria celular. Se isto no ocorrer,
novas protenas sero formadas e, portanto, a sequncia de interesse no ser
detectada, mesmo que ela esteja presente em um determinado clone.
3.3 Transformao da Clula Hospedeira
O processo de transformao refere-se introduo de um DNA

exgeno
em
uma
clula
hospedeira.
Este
processo
foi
inicialmente
103
desenvolvido em clulas bacterianas e, posteriormente, adaptado a clulas de

diferentes organismos, como leveduras, fungos, clulas vegetais e de
mamferos. A transferncia de material gentico para clulas bacterianas pode
ocorrer por meio de trs processos distintos: transduo, conjugao e
transformao.
A transduo o processo em que a aquisio do material gentico
mediada pela ao de bacterifagos. Para isso, inicialmente o fago deve
infectar e realizar o ciclo ltico. Durante a replicao e formao das partculas
do fago h a aquisio do material gentico da clula infectada, que
considerada como a clula doadora. A troca de material gentico ocorrer
quando a partcula viral infectar a clula receptora e nela introduzir o DNA
bacteriano da clula doadora.
Em biotecnologia, esse processo utilizado em determinados
procedimentos, como na transferncia do material gentico clonado na
sequncia do fago ou mesmo de cosmdeos, como j exposto anteriormente. A
conjugao o processo por meio do qual o material gentico transferido de
uma clula doadora para uma receptora por meio de contato clula a clula.
Para que o material gentico seja transferido de uma clula a outra,
necessrio um ntimo contato entre as clulas, com a formao de uma juno
atravs da qual o material ser transportado.
Na biotecnologia, a realizao da conjugao normalmente necessita
da presena de plasmdeos que contenham as funes conjugativas, ou seja,
que possibilitem a juno clula a clula. Se o plasmdeo portando o inseto de
interesse no possui estas funes, pode-se introduzir na mesma clula outro
plasmdeo que contenha as funes de conjugao.
O protocolo envolve o uso de trs receptores bacterianos distintos: o
primeiro, contendo o plasmdeo conjugvel, deve estar em contato com a clula
que contm o plasmdeo recombinante. Neste processo, o conjugvel
transferido segunda clula. Ento, a clula contendo os dois plasmdeos deve
entrar em contato com uma terceira. Esta ser transformada com o plasmdeo
recombinante graas ao do plasmdeo conjugvel.
104
Este procedimento no to simples, exigindo uma seleo rigorosa

dos clones transformantes. Portanto, em processos biotecnolgicos, a
conjugao consiste em uma alternativa quando a transferncia do material
gentico deva ser a uma clula hospedeira cuja transformao um processo
complicado.
A transformao o processo natural onde o DNA exgeno liberado
aps a lise celular capturado por outra clula, a receptora. A clula apta a
receber um DNA exgeno dita como competente. A competncia est
relacionada presena de receptores na superfcie das clulas doadoras, os
quais se ligam ao DNA exgeno e o aproximam da superfcie celular. Este
material ento internalizado e, finalmente, incorporado ao genoma da clula
receptora.
A eficincia da transformao um processo que depende de vrios
fatores, tais como o estado fisiolgico das clulas, os componentes presentes
na cultura destas bactrias e as caractersticas genticas da espcie em
questo. O processo j foi descrito tanto para bactrias Gram-positivas como
Gram-negativas.
No ambiente, a transformao um evento raro. Por isso, os cientistas
que trabalham com a tecnologia do DNA recombinante desenvolveram
metodologias que permitem o aprimoramento da tcnica. Basicamente, o que
se faz induzir o estado de competncia da clula bacteriana, pelo tratamento
com ctions bivalentes, e/ou criar poros artificiais na membrana celular, por
meio de choque eltrico ou trmico.
A
transformao
por
choque
trmico
um
dos
mtodos
corriqueiramente utilizados nos laboratrios. A escolha deste se baseia na

facilidade de manipulao e por no ser necessria a aquisio e uso de
equipamentos sofisticados. Para isso, a induo de competncia se d por um
tratamento com ctions bivalentes. A hiptese de que estes sejam capazes
de formar uma ponte salina entre a superfcie da membrana bacteriana, que
tem carga lquida negativa, e o DNA a ser inserido, que tambm
negativamente carregado.
105
Assim, os ons seriam receptores naturais, facilitando a adsoro do

DNA. Foi relatado que estes ons tambm facilitam a abertura de poros na
superfcie bacteriana. As clulas bacterianas so ento incubadas com o DNA
e h um choque trmico entre 37 e 42C. Este mtodo tem uma eficincia de
transformao (ou seja, o nmero de transformantes por microgramas de DNA
adicionados) de 107 a 108.
O
mtodo
da
eletroporao
consiste
em
sujeitar
as
clulas
competentes, em presena do DNA, a uma alta corrente eltrica. O mtodo

diferenciado para cada espcie bacteriana. Em linhas gerais, inicialmente a
clula hospedeira tambm submetida a um tratamento para induzir seu
estado de competncia.
A cultura celular lavada com uma soluo aquosa, que tem por
objetivo a retirada de restos de meios de cultura, cujos componentes podem
aumentar a condutividade do meio, influenciando nas condies do choque
eltrico. Em seguida, a clula submetida ao choque eltrico que desestabiliza
a membrana externa ou plasmtica, provocando a formao de poros nestas
estruturas, possibilitando a entrada do DNA no espao citoplasmtico.
As vantagens deste procedimento incluem sua maior eficincia em
relao ao de choque trmico e amplamente utilizado para vrios tipos
celulares, como bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, leveduras, fungos,
clulas vegetais e de mamferos.
Alternativa na transformao de clulas consiste em forar a entrada
do DNA recombinante por meio de partculas de ouro ou tungstnio, revestidas
pelo DNA exgeno. Estas partculas sofrem uma acelerao no vcuo com o
auxlio de um equipamento especial. Estas micropartculas revestidas so
capazes de perfurar a clula hospedeira, liberando o DNA em seu interior. Este
mtodo conhecido como biobalstica e eficiente em muitos casos. Contudo,
as desvantagens incluem a necessidade de adquirir equipamentos especficos
e caros, alm de determinadas condies experimentais pouco acessveis
rotina laboratorial.
Aps a transformao, muitos procedimentos requerem uma alta
106
quantidade de DNA. Por isso, os clones podem ser submetidos a um processo

que permita que o DNA recombinante seja amplificado.
3.4 Amplificao do DNA Recombinante
O DNA quimrico transformado em um hospedeiro apropriado capaz

de se replicar. Isto ocorre porque os vetores de clonagem utilizados possuem
uma origem de replicao autnoma. Entretanto, aps a ligao, o inserto
tambm faz parte do vetor. Assim, quando o vetor se divide, o inserto
automaticamente replicado junto com o seu portador. O resultado que cada
vetor que entra na clula ir formar mltiplas cpias de si mesmo na clula
hospedeira. A quantidade de DNA recombinante ainda se torna maior aps
diversos ciclos de diviso da clula hospedeira. A cultura em que estas
bactrias se encontram conter bilhes de cpias do inserto de um
determinado clone. Este processo a uma maneira de amplificao do DNA
hbrido.
A amplificao do DNA recombinante produz uma quantidade maior do
DNA quimrico, um pr-requisito para muitos procedimentos de biologia
molecular. Alm disso, este procedimento ainda apresenta como vantagem o
sistema de verificao da sequncia de DNA aps a sua replicao na clula
hospedeira, como visto na introduo gentica. Assim, a possibilidade de
mutao menor que quando a amplificao se realiza por outras tcnicas.
Aps a transformao, diversos tipos de clones podem ser obtidos.
Alm daqueles que capturaram a molcula de DNA recombinante, h outros
que capturaram somente o inserto, ou mesmo o vetor que se anelou nele
mesmo. Frente a estas possibilidades, so necessrios mecanismos que
permitam a seleo dos clones que contenham somente o inserto desejado.
3.5 Seleo de Clones Transformados com o DNA Hbrido
A seleo de clones que realmente foram transformados com o DNA
107
hbrido normalmente feita por seleo a antibiticos. Plasmdeos e

cosmdeos possuem em sua estrutura entre uma a duas sequncias
codificadoras de polipeptdeos que permitem que a clula transformada seja
resistente a dois antibiticos. No caso do plasmdeo pBR322, h dois genes
que codificam resistncia a antibiticos: um para tetraciclina e outro para
ampicilina.
Normalmente, para os procedimentos de clonagem, a digesto
enzimtica realizada com a enzima BamHI. O stio de restrio reconhecido
por esta enzima se localiza na regio codificadora da tetraciclina. Assim, a
sequncia de tetraciclina interrompida aps a digesto e ligao do inserto
neste stio; logo, todos os clones contendo o inseto so sensveis a este
antibitico. Por outro lado, os clones transformados com o vetor que
recircularizou, isto , sem ter havido a ligao do inserto, resistente
tetraciclina. Assim, esta a primeira seleo de clones transformados, que
realizada aps plaquear a cultura de transformantes em meio contento o
antibitico.
Outra seleo consiste na tcnica rplica plate. Neste caso,
inicialmente as culturas so plaqueadas em meio contendo o antibitico
ampicilina. Todos os clones transformados com o vetor so capazes de crescer
neste meio. Esta placa servir de mapa para o prximo plaqueamento. A placa
de ampicilina demarcada em seus pontos e pressionada contra um pano de
veludo. Posteriormente, a segunda placa que tem como meio de seleo a
tetraciclina carimbada neste pano de veludo contra o qual os clones
resistentes a ampicilina foram pressionados. Assim, somente aqueles ao qual o
inserto se ligou ao vetor crescero.
A tcnica de rplica plate um procedimento de difcil execuo e, por
isso, muitas vezes ele eliminado da rotina de laboratrios. Uma alternativa
consiste em selecionar os transformantes plaqueando-os em meio ao qual
foram acrescidos os dois antibiticos, tetracilina e ampicilina. Frente a este
problema, outros vetores foram manipulados de forma a proporcionar outros
mecanismos que facilitem a seleo de transformantes.
108
Vetores tais como os derivados do pUC permitem que a seleo de

transformantes seja feita por antibiticos e por um outro sistema, como
exemplo, a caracterstica fenotpica entre colnias brancas e azuis. Este vetor
possui um segmento da protena Lac Z (LacZ), que representa uma poro do
gene que codifica a enzima beta-galactosidase. A expresso desta protena
regulada pelas sequncias reguladoras do operon Lac: o promotor e a protena
repressora LacI.
Portanto, quando os transformantes so crescidos sob a presena do
indutor IPTG do operon Lac, a protena inibidora incapaz de se ligar ao
promotor e o gene lacZ ento expresso. Para que a enzima betagalactosidase seja ativa, necessrio que os vetores sejam transformados em
linhagens de bactrias que possuam a insero da sequncia codificadora da
outra frao do gene lacZ. Para isso, as duas pores expressas pelo vetor e
pelo DNA cromossomal se combinam para formar a protena ativa da betagalactosidase. Este processo denominado complementao alfa. A enzima
ativa capaz de hidrolisar o substrato genericamente conhecido como X-gal, o
que produz colnias azuis.
Para a clonagem no vetor pUC, so realizados os mesmos
procedimentos utilizados para outros vetores. Tanto o vetor como o inserto
sofre digesto enzimtica, de preferncia com enzimas que produzem
extremidades compatveis. O stio mltiplo de clonagem dos vetores pUC se
localizam na regio codificadora da protena LacZ. Assim, ao sofrer a digesto
enzimtica, a sequncia codificadora referente frao LacZ interrompida.
Sem esta frao, a clula hospedeira incapaz de formar uma enzima com
atividade biolgica. Portanto, as colnias transformadas com os vetores que
possuem o inserto no so capazes de clivar a X-gal e, por isso, formam
colnias brancas.
Portanto, alm da seleo por antibitico, adicionalmente possvel
distinguir os transformantes pela caracterstica fenotpica entre colnias
brancas ou azuis (Fig. 46)
109
Figura 46: Placa contendo bactrias transformadas que apresentam a caracterstica

fenotpica de colorao branca e azul.
3.5.1 Seleo por Hibridizao de DNA
Uma determinada sequncia de DNA pode ser identificada pela tcnica

da hibridizao. A especificidade de pareamento de bases por pontes de
hidrognio, primeiramente descobertas na molcula de DNA, a base para
esta tcnica. Inicialmente, o DNA da amostra desnaturado quando exposto a
altas temperaturas ou a substncias alcalinas. Estes tratamentos rompem as
pontes de hidrognio, mas no as ligaes fosfodister. As fitas abertas so
fixadas a um suporte de nylon ou nitrocelulose e o passo seguinte consiste na
busca por sequncias especficas de DNA.
Para isso, fragmentos de DNA previamente conhecidos, compostos
geralmente por 100 a 1.000 pb, so sintetizados, desnaturados e ento
adicionados em soluo ao suporte em que a amostra est fixada. Este
material denominado sonda. Ao encontrar uma sequncia complementar, h
o pareamento de bases, assim como ocorre na replicao do DNA.
110
Frequentemente, este pareamento requer uma complementaridade acima de

80% dentro de um segmento de 50 bases. Para a identificao do pareamento
de bases entre a sonda e o DNA da amostra, a sonda marcada por algum
mtodo que permite a visualizao, como o uso de radioistopos. A
visualizao, neste caso, se faz por autorradiografia.
Quando a amostra fixada ao suporte de DNA, a tcnica
denominada Southern Blot. Esta pode ser feita aps a extrao do DNA com
uma digesto enzimtica. Contudo, no caso do isolamento de genes, os clones
de uma biblioteca so plaqueados na placa mster. Esta ser marcada,
permitindo a identificao da localizao de cada clone.
Os clones so ento transferidos ao suporte de nitrocelulose. Estas
clulas sofrem uma lise, seguida por desproteinizao e desnaturao do DNA
e ligao do DNA matriz. Neste estgio, a sonda marcada adicionada. Se
h hibridizao, um sinal ser detectado na autorradiografia, estas colnias so
buscadas novamente na cultura mster, de acordo com a localizao de cada
clone plaqueado e identificado antes da transferncia (Fig. 47).
Figura 47: Busca de um determinado clone por hibridizao de DNA.
111
(1) Os clones so plaqueados em uma cultura mster e, em seguida,

transferidos a uma matriz de nitrocelulose. (2) As clulas so lisadas e o DNA
desnaturado. Este ento se liga matriz. (3) Um oligonucleotdeo com
sequncia complementar de um determinado gene de interesse utilizado
como sonda. Ao se ligar sua sequncia complementar, a sonda marcada
reage e permite a identificao do clone contendo a sequncia de interesse. (4)
Sempre se deve manter uma subcultura dos clones da placa mster.
Como a maioria das bibliotecas criada pela digesto parcial da
amostra de DNA, alguns clones podem gerar um sinal aps a hibridizao. O
prximo passo determinar qual clone realmente contm a sequncia e, de
preferncia, completa. Geralmente, o vetor hbrido utilizado na clonagem
isolado, purificado e sequenciado, mas como isto significa mais gastos, podemse selecionar clones a serem submetidos ao sequenciamento por resultados
preliminares de mapeamento por restrio.
Este mecanismo revela o tamanho de cada inserto, sendo que os que
possuem um determinado tamanho compatvel sequncia do gene em
questo so escolhidos e deste modo possvel montar toda a sequncia do
gene. A hibridizao, apesar do sucesso em determinadas pesquisas, possui
algumas limitaes. No possvel garantir que a sequncia completa de um
gene alvo estar presente em uma determinada biblioteca genmica. Uma
alternativa para este problema a criao de outra biblioteca a partir da
digesto enzimtica com enzimas diferentes e que permitam a gerao de
fragmentos maiores; assim, aumenta-se a chance de que algum clone
contenha toda a sequncia de um gene em especfico.
A construo de outra biblioteca um processo caro e trabalhoso.
Outras opes podem ser utilizadas para a busca de um gene de interesse a
ser isolado, como a pesquisa por atividade imunolgica ou proteica.
3.5.2 Busca por Atividade Imunolgica
Quando uma sonda de DNA no est disponvel ou mesmo a
112
hibridizao no est sendo eficiente, alguns mtodos de identificao

imunolgica podem ser utilizados na busca de uma determinada sequncia
codificadora. Para isto, a biblioteca deve ter sido construda de forma que os
fragmentos de DNA tenham sido clonados em vetores de expresso. Estes
sistemas permitiro que a protena, ou parte dela sejam expressas e possibilita
o reconhecimento das mesmas por anticorpos especficos.
A pesquisa de uma determinada sequncia pela ligao de anticorpos
especficos uma tcnica mista de ELISA e hibridizao. Os clones da
biblioteca so plaqueados em uma placa mster, permitindo identificar a
localizao de cada clone. Uma amostra destes clones transferida para uma
matriz, onde as clulas so lisadas e as protenas referentes aos insertos so
liberadas e fixadas membrana. Esta matriz tratada com um anticorpo
primrio, que se liga especificamente a uma protena ou parte dela.
Prossegue-se ento a uma lavagem, que retira materiais e anticorpos
no ligados e a amostra ento tratada com o anticorpo secundrio, que
reconhece o anticorpo primrio. O anticorpo secundrio marcado com uma
enzima, como a fosfatase alcalina, permitindo a visualizao das amostras que
reagiram (Fig. 48).
Figura 48: Busca de um clone pela anlise imunolgica.
113
As clulas transformadas so plaqueadas na placa mster, que servir

como fonte de identificao de cada clone. (1) Todos os clones so transferidos
a uma matriz de nitrocelulose. (2) As clulas expressando as protenas
recombinantes sero lisadas, o que permite a ligao das protenas matriz.
(3) O lisado ento submetido a um tratamento com anticorpos primrios, (4)
lavados e tratados com o anticorpo secundrio. (5) Aps uma segunda
lavagem, faz-se a deteco dos clones que reagiram no teste imunolgico. (6)
Sempre interessante manter uma subcultura dos clones representados na
placa mster.
Os clones so posteriormente identificados na cultura mster. Em
seguida, eles devem ser caracterizados e sequenciados, para verificar se
algum possui a sequncia completa do gene de interesse. Esta tcnica tem
como desvantagem ter que se conhecer previamente alguma caracterstica da
protena. Alm disso, como os anticorpos geralmente reconhecem sequncias
conformacionais; portanto, mesmo que estejam presentes sequncias parciais
da protena, o anticorpo pode no se ligar.
Por ltimo, se os insertos foram clonados em uma fase de leitura
errada, a protena no ser expressa de maneira adequada. Neste caso,
mesmo que a sequncia presente em um determinado clone esteja completa,
no ser possvel sua identificao por este mtodo.
3.5.3 Busca por Atividade Proteica
Outra opo para a identificao de genes a partir de uma biblioteca

consiste na identificao de clones que contm a sequncia codificadora para
uma enzima e na seleo dos transformantes que apresentem atividades
especficas do polipeptdeo expresso. Assim, a biblioteca construda a partir de
insertos clonados em vetores de expresso selecionada pela capacidade da
enzima em utilizar determinado substrato, como diferentes antibiticos.
Este mtodo exibe desvantagens relevantes, como a possibilidade de
que a expresso proteica no esteja sendo realizada a partir da fase de leitura
114
correta, a expresso de somente determinados fragmentos que no compe

uma enzima ativa e a necessidade de utilizar linhagens bacterianas com
mutaes especficas que evitem a interferncia no mtodo de seleo
escolhido. Aps terem sido selecionados clones que contenham o inserto de
interesse, certos procedimentos que permitam a confirmao da sequncia de
interesse devem ser adotados. Entre os mtodos, so muito utilizadas a PCR e
a digesto enzimtica, alm do sequenciamento.
3.6 Confirmao do Inserto
Quando se h um conhecimento prvio a respeito da sequncia a ser

isolada, a confirmao de que o inserto foi clonado feita por PCR. Este
procedimento um mtodo rpido e de alta especificidade. Os iniciadores so
desenhados a partir de uma sequncia especfica e complementar, sendo que
a especificidade ainda pode ser aumentada alterando-se determinados
parmetros envolvidos na reao de amplificao.
Os amplicons produzidos so analisados por eletroforese quanto ao
peso molecular esperado para o fragmento determinado. Mas a PCR uma
anlise inicial e frequentemente so necessrias informaes adicionais, como
verificar se somente um determinado fragmento foi clonado a um vetor. Estas
questes so ento verificadas por digesto enzimtica.
A digesto enzimtica se baseia no mapa de restrio de uma
sequncia. Enzimas que flanqueiam a regio de ligao inserto/vetor e que
reconhecem stios especficos dentro de uma sequncia so utilizadas nesta
metodologia. Os fragmentos de restrio so analisados assim como os
produtos de PCR, de acordo com o peso molecular obtido aps uma
eletroforese, comparando-se ao esperado. Contudo, para realmente confirmar
uma sequncia e sua estrutura, como por exemplo, se h alteraes de bases,
e para analisar sequncias das quais no se tem conhecimento prvio, deve-se
sequenciar o clone.
O sequenciamento a tcnica que permite determinar a ordem em que
115
os nucleotdeos se encontram em uma sequncia de DNA. O mtodo baseia-se

na sntese de DNA fita simples a partir do DNA molde da amostra. A
polimerizao das novas cadeias inclui a incorporao dos quatro nucleotdeos
(dNTPs) e de dideoxinucleotdeos (ddNTPs). Os ddNTPs diferem dos dNTPs
por no possurem o grupo 3 OH necessrio elongao da cadeia. Portanto,
a adio de um destes ddNTPs impede a formao da ligao fosfodister com
o prximo dNTP e a elongao da cadeia termina nesse ponto.
A sntese das novas cadeias inicia-se na posio de um iniciador que
se anela fita molde e cada molcula sintetizada termina com uma base
especfica: A, C, G ou T. Utilizando-se os quatros ddNTPs diferentes em quatro
reaes independentes, obtm-se a informao completa da sequncia do
DNA (Fig. 49).
Fragmentos de DNA
amplificados com
nucleotdeos
marcados
eletroforese
Mtodo manual
Mtodo automtico
Migrao
do DNA
Figura 49:
Sequenciamento de DNA.
Laser
Detector
Dados gerados por computador

cromatograma
116
A figura mostra o resultado final do sequenciamento, com o padro de

bases a que cada banda corresponde.
-------------------FIM DO MDULO II------------------------
117

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Curso de

A Tecnologia do DNA Recombinante

As descobertas da estrutura e da funo do DNA e da sntese proteica

O isolamento de um gene permite a determinao da sequncia

nucleotdica, caracterizando marcos internos do mesmo, como introns e

A composio de aminocidos, assim como a de nucleotdeos,

tambm auxilia na histria da genmica comparativa, deduzindo-se a funo de

Um gene pode ser transferido de um organismo a outro,

possibilitando o desenvolvimento de organismos transgnicos. Estes possuem

o conhecimento multidisciplinar de reas como a biologia molecular e

O primeiro passo consiste em caracterizar um gene de interesse.

Tendo-se um conhecimento prvio do mesmo, o segundo passo consiste em

O DNA de um organismo doador extrado e sofre uma clivagem

ou digesto enzimtica. Em seguida, os fragmentos gerados na digesto so

O passo seguinte obteno da molcula de DNA que codifica

uma protena de interesse permitir a perpetuao do vetor recombinante at

As clulas hospedeiras so ento plaqueadas e deixadas crescer

em colnias separadas. Uma clula individual transformada com um nico

de se multiplicar e gerar uma populao que contm cpias idnticas do DNA

Como o DNA foi digerido em muitos fragmentos que podem

conter insertos de DNA diferentes, necessrio selecionar o clone bacteriano

Uma vez obtido o clone de interesse, o passo final consiste em

submet-lo a uma srie de anlises que permitam verificar se a construo

Ligao entre vetor e inserto

Transformao da clula hospedeira

Expresso da protena de interesse

Figura 26: Metodologia geral utilizada pela tecnologia do DNA recombinante.

O DNA do organismo doador e o do vetor so digeridos com enzimas

A gerao de molculas recombinantes pela clonagem molecular deve

3.1 Isolamento de Genes

3.1.1 Extrao de DNA

Como comentado anteriormente, o passo inicial no isolamento de um

Figura 27: Isolamento de DNA plasmidial por ultracentrifugao em cloreto de csio.

Inicialmente, um clone selecionado e certificado se contm o material

Inicialmente, o DNA cromossmico era submetido a um processo de

3.1.2 Enzimas de Restrio

As enzimas de restrio so endonucleases responsveis pela quebra

genericamente como enzimas de restrio.

Tabela 1: Stios de restrio reconhecidos por diferentes enzimas de restrio e o tipo

As enzimas de restrio so endonucleases que reconhecem regies

fragmentos em gel de agarose (Fig. 28).

Figura 28: Mapa de restrio.

(A) anlise eletrofortica representando o peso molecular da amostra

Enzimas de restrio que clivem o DNA gerando desde extremidades

mesmas tm pelo menos duas propriedades teis clonagem molecular:

3.1.3 Ligao Enzimtica

Recapitulando, o DNA de um organismo doador sofre uma digesto

Figura 30: Ligao entre extremidades coesivas pela ao da Ligase.

Aps a digesto enzimtica, so geradas extremidades coesivas.

procedimentos mais especficos, como os procedimentos para o isolamento de

3.1.4. Diferena Estrutural entre Genes Eucariotos e Procariotos

Para a obteno do inserto, inicialmente deve-se considerar se o gene

3.1.5 Obteno do Inserto

3.1.5.1 Construo de Bibliotecas Genmicas e de Bibliotecas de CDNA

A obteno de um determinado gene depende dos objetivos da

procedimento capaz de obter clones que representam todo o DNA genmico

parcial de uma amostra

A digesto parcial realizada por variaes no tempo ou na quantidade

oligonucleotdeos compostos somente por timinas ao material de RNAm eludo

complementaridade de bases. Entretanto, a sntese in vitro realizada por esta

DNA dupla fita

Figura 32: Sntese de cDNA.

Um iniciador composto de nucleotdeos de timina adicionado