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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUB UNIFEI

Programa de Ps Graduao em Materiais para Engenharia


Departamento de Fsica e Qumica/ Instituto de Cincias Exatas
Dissertao de Mestrado

Alessandra Nogueira Santos

ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMO


NANOPLATAFORMAS PARA APLICAES CLNICAS

Itajub / MG
2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUB UNIFEI


Programa de Ps Graduao em Materiais para Engenharia
Departamento de Fsica e Qumica/ Instituto de Cincias Exatas
Dissertao de Mestrado

Alessandra Nogueira Santos

ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMO


NANOPLATAFORMAS PARA APLICAES CLNICAS

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado da


Universidade Federal de Itajub, como requisito para a
obteno do ttulo de mestre em Cincias dos Materiais para
Engenharia.
rea de concentrao: Biomateriais

Orientador: Prof. Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz - UNIFEI


Co-orientador: Prof. Dr. Demtrio A. Werner Soares - UNIFEI

Itajub / MG
2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUB UNIFEI


Programa de Ps Graduao em Materiais para Engenharia
Departamento de Fsica e Qumica/ Instituto de Cincias Exatas
Dissertao de Mestrado

ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMO


NANOPLATAFORMAS PARA APLICAES CLNICAS

Alessandra Nogueira Santos

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado da


Universidade Federal de Itajub, como requisito para a
obteno do ttulo de mestre em Cincias dos Materiais para
Engenharia.
rea de concentrao: Biomateriais
Aprovada por:
_____________________________________________ (Orientador)
Prof. Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz- UNIFEI
_____________________________________________ (Co- orientador)
Prof. Dr.Demtrio Arthur Werner Soares- UNIFEI
_____________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Gribel Lacerda- UFMG
_____________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Carlos Brando Ramos- UNIFEI
Itajub / MG
2008

Agradecimentos
A Deus, que mais uma vez permaneceu ao meu lado me dando fora e sade para vencer
todos os obstculos surgidos.
Aos meus pais, Araci Augusto e Diva, pelo esforo contnuo para que eu pudesse ir busca
da realizao de um sonho.
Aos meus filhos, Victor Augusto e Arthur, demonstrando uma maturidade incomum s suas
idades.
Ao meu irmo Fbio Nogueira, exemplo de garra e sabedoria.
Ao professor Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz, exemplo de competncia, amizade e
acima de tudo, paixo pela cincia.
Ao professor Dr. Demtrio Arthur Werner, por ter acreditado em mim, pela pacincia,
pelos conhecimentos transmitidos e pela co-orientao.
Ao professor Dr. cio pelo incentivo, amizade e pelos ensinamentos.
Ao professor Dr. Luiz Francisco Pontin pela amizade, pacincia, incentivo e pelas
contribuies.
profesora Dra. Ana Cludia pelas colaboraes, amizade e pelos conselhos.
professora Dra.Maria Helena e seu esposo professor Dr. Filiberto, pela amizade e
confiana.
Aos demais professores que de alguma forma contriburam para o meu desenvolvimento
cientfico.
Aos tcnicos de laboratrio Glauber e Kal, por sempre me fornecerem todas as
ferramentas necessrias para o desenvolvimento de meu trabalho e pela amizade.

s funcionrias da PRPPG, em especial Maria Alta, Snia, Margarete e Cristina.


Aos funcionrios da secretaria do ICE-UNIFEI, em especial Roseli, Marlia, Edvandra, e
Helinho.
Aos profissionais da sade, Dr.Vincius e Dr. Alessandro, exemplos de competncia.
Aos responsveis pelos laboratrios de anlises clnicas Carlos Chagas, Pasteur, Prestolab,
Dalmo Coutinho, Laboratrio Darto; pelas informaes e experincias transmitidas.
Aos amigos mestres Edson Fernandes, Nirton Cristi, Mayler Martins e Vanessa Giarola
pelas contribuies.
Aos colegas de classe, em especial, Wagner, Marcelo, Amaury, Adelaine, Alexandra,
Janderson, Celso, Fabiana, Cristiano, enfim, a todos os colegas, pelo apoio e amizade.
Capes pelo auxlio financeiro.
Por fim, a todos que, com seus conhecimentos, incentivos e crticas colaboraram para o
desenvolvimento deste trabalho.

Dedico este trabalho, em especial,


a dois grandiosos homens, Vctor
Augusto e Arthur Nogueira. Sem
o apoio de vocs, a realizao
deste, seria impossvel.

Sumrio

i
SUMRIO
Lista de Figuras

Lista de Tabelas

ix

Lista de Abreviaturas

Resumo

xii

Abstract

xiv

Introduo

Captulo 1 Biossensores para a monitorao de hemometablitos

1.1 Introduo

1.2 Histrico do desenvolvimento dos biossensores e o Estado da arte

1.3 Biossensores eletroqumicos

1.3.1 Biossensores amperomtricos

1.3.2. Biossensores potenciomtricos

12

1.3.3 Biossensores pticos

14

1.3.4 Biossensores piezoeltricos

15

1.3.5 Biossensores trmicos ou calorimtricos

16

1.4 Consideraes parciais

18

1.5 Referncias

19

Captulo 2 A natureza qumica das enzimas

22

2.1 Noes gerais

22

2.2 Classificao das enzimas

24

2.3 Mecanismos das reaes catalisadas por enzimas

25

2.4 Stio ativo cataltico

27

2.4.1 Modelo chave-fechadura

28

2.4.2 Modelo do encaixe induzido

28

Sumrio

ii

2.5 Mecanismos catalticos

29

2.6 Fatores que influenciam a atividade enzimtica

33

2.7 Tcnicas de imobilizao

36

2.7.1 Mtodos de imobilizao de enzimas por reteno fsica

37

2.7.1.1 Adsoro

37

2.7.1.2 Reteno em membranas

37

2.7.1.3 Microencapsulamento

37

2.7.1.4 Eletropolimerizao

37

2.7.1.5 Ocluso em matriz polimrica

38

2.7.2 Mtodos de imobilizao qumica

38

2.7.2.1 Ligao covalente

38

2.7.2.2 Ligaes covalentes reticuladas

40

2.8 Cintica enzimtica

41

2.9 Aplicaes das enzimas em biossensores

48

2.9.1 A enzima glicose oxidase (GOx)

48

2.2.2 A enzima colesterol oxidase (COx)

49

2.2.3 A enzima urease

51

2.10 Consideraes parciais

53

2.11 Referncias

54

Captulo 3 - Plataformas nanoestruturadas para a imobilizao de enzimas

58

3.1 O desenvolvimento dos dendrmeros

58

3.2 Histrico sobre a Sntese dos Primeiros Dendrmeros

61

3.3 Os dendrmeros e suas propriedades

64

3.4 A sntese de macromolculas dendrticas

66

3.5 Dendrmeros estudados neste trabalho: CHD, PGLD e PPID

67

i
i

i
i

Sumrio

iii

3.6 Consideraes parciais

70

3.7 Referncias

71

Captulo 4 Os mediadores de eltrons nas reaes enzimticas

73

4.1 O mecanismo de ao das enzimas e o processo de mediao de eltrons

73

4.2 Sistemas utilizados como mediadores de eltrons

74

4.3 Polmeros condutores como mediadores de eltrons

75

4.3.1 As Polianilinas

77

4.3.2 Estrutura de transporte na interface polmero-metal

80

4.4 Consideraes parciais

83

4.5 Referncias

84

Captulo 5 As redes neurais artificiais no processo de transduo de sinais

88

5.1 Inteligncia Artificial

88

5.2 Paralelo entre Redes Neurais Artificiais e Redes Neurais Naturais

89

5.3 Histrico das Redes Neurais artificiais

92

5.4 Arquitetura da rede

96

5.5 Funcionamento das redes neurais artificiais

98

5.6 Dificuldades encontradas

100

5.7 Consideraes parciais

101

5.8 Referncias

102

Captulo 6 Objetivos da dissertao

105

Captulo 7 Procedimento experimental

106

7.1 Reagentes

106

7.2 Sntese dos dendrmeros PGLD, CHD e PPID e preparo dos bioconjugados

106

7.3 Preparo dos eletrodos enzimticos

109

7.4 Referncias

113

i
i
i

i
i
i

Sumrio

iv

Captulo 8 Resultados e discusses

115

8.1 Caracterizao dos nanotubos de PANI

115

8.2 Caracterizao dos Dendrmeros

119

8.3 Biossensores de glicose

121

8.4 Biossensores de colesterol

130

8.5 Biossensores de uria

138

8.6 Determinao dos hemometablitos glicose, colesterol e uria simultaneamente


utilizando uma RNA

145

8.7 Referncias

151

Captulo 9 Concluses

154

Captulo 10 Perspectivas futuras

156

i
v

i
v

Lista de figuras

Lista de Figuras
Figura 1.1 - Representao de um biossensor: biocatalizador

Figura 1.2 - Eletrodo de oxignio de Clark. A) Eletrodo de trabalho Pt, B) eletrodo de


referncia Ag/AgCl, C) eletrlito semi-saturado de KCl, D) membrana de
Teflon, E) anel de borracha para fixao, F) fonte de tenso para polarizao
e G) instrumento para medio da corrente de sada
Figura 1.3 - Grfico comparativo para os tipos de biossensores mais estudados

6
8

Figura 1.4 - Representao esquemtica para biossensores amperomtricos segundo o


processo de transferncia de cargas

Figura 1.5 Biossensores amperomtricos comerciais utilizados em anlises clnicas

10

Figura 1.6 - Representao esquemtica de um biossensor amperomtrico de primeira gerao

11

Figura 1.7 (A) Estrutura de um MOSFET (a) em comparao com um ISFET (b).
(B) Estrutura fsica de um MOSFET

13

Figura 1.8 Montagem de um ENFET. (A) Substrato de Silcio, (B) Dopagem e


formao de xido, (C) Deposio da membrana on-seletiva e (D)
imobilizao da enzima e membrana protetora

14

Figura 1.9 Ilustrao de um biossensor ptico

15

Figura 1.10 (A) Microbalana de cristal de quartzo; (B) Foto de um transdutor

16

Figura 1.11 (A) Diagrama esquemtico de um biossensor calorimtrico;


(B) Ilustrao de um termistor do tipo NTC

18

Figura 2.1 - Diagrama energtico de reao catalisada e de reao no-catalisada

26

Figura 2.2 - Modelo chave-fechadura. A interao entre a enzima (com estrutura rgida) e seu substrato

28

Figura 2.3 - Modelo do encaixe induzido. A ligao do substrato enzima induz


uma mudana conformacional na enzima produzindo um melhor encaixe

29

Figura 2.4 - Catlise por proximidade e orientao

30

Figura 2.5 - Representao esquemtica do mecanismo para a reao catalisada pelo on Metlico

31

Figura 2.6 - Reao cido-base geral: hidrlise de um ster

32

Figura 2.7 - Representao de uma catlise covalente. Onde X = RCOO-, RNH2, ArOH, His, ROH, RSH

33

Figura 2.8 - Efeito da temperatura sobre a velocidade de uma reao catalisada por enzima

34

Figura 2.9 - Atividade enzimtica versus pH

35

Figura 2.10 - Ilustrao das tcnicas de imobilizao enzimtica

36

Figura 2.11 - Ligao covalente da enzima (com agrupamento amina) na superfcie


do eletrodo. (A) Complexao com cloreto cianrico, (B) ligao
covalente por silanizao, (C) complexao com carbodiimina e (D) glutaraldedo
Figura 2.12 - Acoplamento qumico de uma molcula de glutaraldedo a duas enzimas

40
41

Lista de figuras

vi

Figura 2.13 - Fotografias de Leonor Michaelis e Maud Menten

42

Figura 2.14 - Efeito da concentrao de substrato na cintica enzimtica

43

Figura 2.15 - Linearizao da equao de Michaelis-Menten por Lineweaver-Burk

46

Figura 2.16 - Ilustrao da reao catalisada pela enzima glicose oxidase

47

Figura 2.17 - Ilustrao da estrutura da enzima glicose oxidase na forma de fitas.

48

Figura 2.18 - Ilustrao da reao catalisada pela enzima colesterol oxidase

49

Figura 2.19 - Ilustrao da estrutura da enzima colesterol oxidase na forma de fitas

51

Figura 2.20 - Ilustrao da estrutura da enzima urease na forma de fitas

52

Figura 3.1 - Ilustrao estrutural de um dendrmero GnPZn, n=4 (quarta gerao)

59

Figura 3.2 (a) Estruturas polimricas clssicas. (b) Estruturas dendrticas

60

Figura 3.3 - Esquematizao do crescimento em geraes do dendrmero PAMAM

61

Figura 3.4 Primeira tentativa de sntese de um dendrmero pela rota divergente

62

Figura 3.5 Representao esquemtica do crescimento dendrimrico pela rota divergente

63

Figura 3.6 Nmero de publicaes na rea de dendrimeros nos timos dez anos

64

Figura 3.7 - Representao esquemtica de um dendrmero segundo o mtodo divergente

67

Figura 3.8 - Representao esquemtica da sntese de um dendrmero pelo mtodo convergente

67

Figura 3.9 - Estrutura do poliglicerol dendrtico de gerao 4 (PGLD G4)

68

Figura 3.10 Estrutura do dendrmero de quitosana (CHD)

69

Figura 3.11 Representao das arquiteturas do dendrmero PPID

70

Figura 4.1 Mecanismo de funcionamento das enzimas

73

Figura 4.2 - Estudo comparativo entre os valores de condutividade eltrica,


(S/ cm), de materiais polimricos dopados com os de materiais convencionais

77

Figura 4.3 Frmula geral da polianilina (PANI)

78

Figura 4.4 Representao da formao da banda de conduo polarnica em polianilina

79

Figura 4.5 Representao esquemtica da Energia de Fermi para um sistema metal-semicondutor

81

Figura 4.6 Representao fsica de um buffer

83

Figura 5.1 - Delineamento da estrutura dos constituintes de um neurnio biolgico

90

Figura 5.2 Ilustrao esquemtica do neurnio projetado por McCulloch e Pitts

92

Figura 5.3 - Rede de perceptrons proposta por Rosemblatt

93

Figura 5.4 - Ilustrao representativa das redes ADALINE e MADALINE

94

Figura 5.5 - Estrutura do mtodo Backpropagation; (a) camada de sada;


(b) camada escondida; (c) camada de entrada

95

Figura 5.6 - Sinais funcionais e de erro de uma rede neural

96

Figura 5.6 Representao de uma rede neural com trs camadas

97

Figura 5.7 Representao da arquitetura de uma Rede Neural Artificial

99

Figura 7.1 Esquema das arquiteturas dendrticas; CHD, PGLD e PPID, respectivamente

107

Figura 7.2 Ilustrao do processo de imobilizao das enzimas GOx, CHD e urease nos dendrmeros

108

Lista de figuras

vii

Figura 7.3 Ilustrao do biossensor preparado neste trabalho atravs da tcnica de imobilizao
fsica dos bioconjugados nos nanotubos de polianilina

110

Figura 7.4 Unidade fonte medidora Keithley modelo 237 utilizado na caracterizao do
dispositivo biossensor
Figura 7.5 Ilustrao da configurao da rede neural artificial utilizada neste trabalho

111
113

Figura 8.1 Vista lateral e frontal da configurao atmica de uma seo de um nanotubo de
carbono. A estrutura cristalina deste tubo particular denotada como (7, 7)

115

Figura 8.2 Micrografia MEV de PANINTs contendo os dendrmeros bioconjugados depositados


eletroquimicamente em eletrodos de Al. Ampliaes: 5000 (A) e 15.000 x (B)
Figura 8.3 Oxidao da molcula de glicose pela ao da enzima glicose oxidase

118
121

Figura 8.4 A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores PGLD (A),
CHD (B) e PPID (C) em NaPBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de Glicose: 20 mM

122

Figura 8.5 Curva de corrente-tempo para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C),
a 300 mV, pH 7,4 e 37 oC, em soluo de glicose de 20 mM

123

Figura 8.6 A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose para os biossensores
PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS e pH 7,4 a 37 oC

125

Figura 8.7 Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores PGLD (A),


CHD (B) e PPID (C). PGLD: [I]-1= 0,02708[S]-1+0,00474 (r2= 0.999),
CHD: [I]-1= 0,04351[S]-1 +0,00648 (r2=0.997) e PPID:
[I]-1=0,09491[S]-1 +0,01258 (r2=0.994)

126

Figura 8.8 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para glicose medida


para os biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais
representam a divergncia medida em trs sensores diferentes. Quando no
em uso, os sensores foram armazenados em NaPBS (0.1 M, pH 7,4) a 4 oC
Figura 8.9 Representao da reao de catlise da enzima colesterol oxidase

129
130

Figura 8.10 A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores


PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em PBS pH 7.02 a 37 oC. Concentrao
de colesterol: 1 mmol.dm-3

131

Figura 8.11 Dependncia de tempo da corrente resposta para os biossensores


PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC.
Concentrao de colesterol: 1 mM

133

Figura 8.12 A relao entre corrente resposta para o PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C) eletrodos enzimticos e concentrao de colesterol
de 0,1 M PBS, pH 7.02 a 37 oC e 0,8 V

134

Figura 8.13 Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores de


colesterol PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A):
[I]-1 =0.0096 [S]-1 0.01142 (r2=0.941), CHD (B): [I] -1 = 0,0159 [S]-1-0,0171 (r2=0.950)
e PPID: [I]-1=18,621 [S]-1 + 2,977 (r2=0.854)

136

Lista de figuras

viii

Figura 8.14 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para medida


de colesterol para os biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais
representam a divergncia medida em trs sensores diferentes. Quando no em uso, os
sensores foram armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC
Figura 8.15 Esquema do biossensor de uria

137
138

Figura 8.16 A relao entre corrente resposta e o potencial para os biossensores PGLD (A),
CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS, pH 7,02 e 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM

140

Figura 8.17 Dependncia do tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM

141

Figura 8.18 A relao da corrente resposta dos eletrodos enzimticos PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C) e a concentrao de uria em 0,1 M PBS, pH 7,02 a 37 oC e 0,6 V

142

Figura 8.19 Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores de uria


baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A):
[I]-1 =0.168[S]-1 9.86.10-4 (r2=0.990), CHD (B): [I]=0,321[S]-1-0,0011 (r2=0.994)
e PPID: [I]-1=0.305 [S]-1 + 0.016 (r2=0.999)

143

Figura 8.20 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para uria medida para
os biossensores de uria baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C). As barras verticais representam a divergncia medida em
trs sensores diferentes. Quando no em uso, os sensores foram
armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC

145

Figura 8.21 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA
para as concentraes de glicose. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:
Y = 1,023 (+0,014) [Glicose] - 0,335 (+0,177), R= 0,999

149

Figura 8.22 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA
para as concentraes de colesterol. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:
Y =0,943 (+ 0,025) [Colesterol] 0,02452 (+ 0,0159), R = 0,997

150

Figura 8.23 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA
para as concentraes de uria. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:
Y = 0,998 (+ 0,008) [Uria] 0,500 (+ 0,0190), R = 0,999

151

Lista de tabelas

ix

Lista de Tabelas
Tabela 1.1 Alguns eletrodos enzimticos utilizados em determinaes analticas

Tabela 2.1 Velocidade de reaes no catalisadas e catalisadas por enzimas

23

Tabela 2.2 Classificao das enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular

25

Tabela 5.1 Quadro comparativo entre crebro e o computador

91

Tabela 5.2 Comparativo entre computadores e neurocomputadores

91

Tabela 8.1 Os trs estados de oxidao mais importantes da polianilina: leucoesmeraldina,


esmeraldina (isolante e condutora) e pernigranilina

117

Tabela 8.2 Caractersticas fsico-qumicas caractersticas do PPID, CHD e PGLD sintetizados neste trabalho

120

Tabela 8.3 Parmetros cinticos eletroqumico para a GOx imobilizada em dendrmeros bioconjugados

127

Tabela 8.4 Parmetros cinticos eletroqumico para a CHO imobilizada em dendrmeros bioconjugados

135

Tabela 8.5 Parmetros cinticos eletroqumico para a urease imobilizada em dendrmeros bioconjugados

144

Tabela 8.6 Concentraes das solues dos hemometablitos glicose, uria e colesterol
para treinamento da rede neural

147

Tabela 8.7 Erro obtido durante o teste da rede neural para os hemometablitos colesterol,
glicose e uria em ensaios in vitro

148

Lista de abreviaturas

Lista de Abreviaturas
ISFET- trasnsistores de efeito de campo on-seletivos
MOSFET- transistor de efeito de campo metal-xido semicondutor
ENFET- Enzyme-field effect transistor

ENFETs- Transistores de Efeito de Campo Enzimticos


FET- transistor de efeito de campo
GOx- glicose oxidase
POx- peroxidase
NTC- Negative Temperature Coefficient
(S)- substrato
(E)- enzima
(P)- produto
IUBMB- Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular
(Ea)- energia de ativao
(ES)- enzima-substrato
(EP)- enzima-produto
KM- constante cintica de uma reao
Vmax- velocidade mxima
FAD- flavina adenina dinucletido
FADH2- Flavina adenina dinucleotdeo reduzida
COx- colesterol oxidase
PAMAM Poli(amidoamina)

G- nmero de gerao
PGLD- poliglicerol dendrtico
PPID- poli(propileno imina) dendrtico
CHD- quitosana dendrtico
Unifei- Universidade federal de Itajub
ICP- polmeros intrinsecamente condutores
PANI- polianilina
CTC- complexo de transferncia de carga

Lista de abreviaturas

EB- base esmeraldina


ES -sal de hidrocloreto de esmeraldina
HPM- heterojunes do tipo polmero-metal
PANI/M- polianilina-metal
IA- Inteligncia Artificial
SIH- sistema de informao hospitalar
RNAs- Redes Neurais Artificiais
RNA- Rede Neural Artificial
DARPA- Defense Advanced Research Projects Agency
INNS- International Neural Networks Society
ENIAC- Eletronic Numerical Interpreter and Calculator
VLSI- Very Large Scale Integration
MLP- Multi-Layer Perceptrons
PANINTs- nanotubos de polianilina
NaPBS- soluo tampo fosfato de sdio salino
NTCs- nanotubos de carbono
SWNT- nanotubos de parede simples
MEV- microscopia eletrnica de varredura
GPC- cromatografia de permeao em gel
EPROM- erasable programmable read-only memory

xi

Resumo

xii

Resumo
Hoje em dia, os dendrmeros representam um interessante e promissor material orgnico
sendo usado em desenvolvimento de novos materiais para a indstria farmacutica, tais como
sistemas de liberao de drogas e, mais recentemente, como propriedades sensoras para protenas
e hemometablitos. As propriedades intrnsecas dos dendrmeros como a monodispersividade,
elevados grupos funcionais perifricos em macromolculas e boas propriedades biocompatveis
destas nanopartculas, tem conduzido para sua difuso e usados em uma variedade de aplicaes
na medicina e biotecnologia. Neste trabalho foram desenvolvidos biossensores de glicose,
colesterol e uria baseados em poliglicerol bioconjugado (PGLD), poli(propileno imina) (PPID) e
dendrmeros de quitosana (CHD). Os dendrmeros PGLD, PPID e CHD foram bioconjugados
com as enzimas glicose oxidase (GOx), colesterol oxidase (COx) e urease para obter dendrmeros
com propriedades sensoras de glicose, colesterol e uria. Os dendrmeros bioconjugados PGLD,
PPID e CHD foram atrados em nanotubos de polianilina (PANINTs) durante polimerizao
eletroqumica template de anilina. Os PANINTs foram usados como mediadores de eltrons,
devido sua alta habilidade para promover as reaes de transferncia de eltrons, envolvendo
catlise enzimtica. A resposta de corrente observada em enzimas transformadas na interface do
eletrodo demonstrou que nanotubos de polianilina so eficientes mediadores para desenvolver
biossensores. As respostas de corrente para as propriedades dos hemometablitos glicose,
colesterol e uria bioconjugados com PGLD, PPID e CHD, e GOx, COx e urease, ocorreram s
tenses de 400 mV, 700 mV e 600 mV, respectivamente. Foi obtido que a corrente resposta para
os bioconjugados PGLD, PPID e CHD facilmente atinge o estado de saturao. Os resultados
correspondentes corrente de saturao mais acentuada para o biossensor de PGLD do que para
os bioconjugados CHD e PPID. A constante aparente de MichaelisMenten (KappM) d indicaes
da cintica enzima-substrato para os bioconjugados PPID, CHD e PGLD e foi calculada a partir
da equao eletroqumica de LineweaverBurk. O biossensor baseado em PGLD, PPID e CHD
mostrou uma boa performance em concentraes de interesse clnico de glicose, colesterol e
uria. A afinidade enzimtica para o substrato (KappM), indica que a atividade cataltica enzimtica
decai na ordem PGLD>CHD>PPID. O resultado mostra que o PGLD aparenta ser um candidato
bastante promissor para o desenvolvimento de biossensores de alta performance, em comparao
com os dendrmeros CHD e PPID. Uma rede neural artificial, tipo Back-Propagation com trs

Resumo

xiii

camadas de neurnios, foi treinada e aplicada, predizendo a quantia dos hemometablitos glicose,
colesterol e uria atravs da resposta de corrente dos biossenssores desenvolvidos. A rede neural
desenvolvida para determinao de hemometablitos mostrou-se ser eficiente em ambas fases, de
treinamento e teste, respectivamente.

Abstract

xiv

Abstract
Today, dendrimers represent a promising and interesting organic material being used in
developing new materials for pharmaceutical industry such as drug delivery systems and more
recently, intelligent materials with sensing properties to proteins and haemometabolites. The
intrinsic properties of dendrimers like as monodispersity, highly functional groups at
macromolecule periphery and good biocompatible properties of these nanoparticles has led to
their widespread use in a variety of applications in medicine and biotechnology. In this work
glucose, cholesterol and urea biosensors based on bioconjugated polyglycerol (PGLD),
poly(propylene imine) (PPID) and chitosan dendrimers (CHD) were developed. The dendrimers
PGLD, PPID and CHD were bioconjugated with the enzymes glucose oxidase (GOx), cholesterol
oxidase (COx) and urease to obtain dendrimers with glucose, cholesterol and urea sensing
properties. The bioconjugated PGLD, PPID and CHD dendrimers were entrapped in polyaniline
nanotubes (PANINTs) during template electrochemical polymerization of aniline. PANINTs
were used as electron mediator due to their high ability to promote electron-transfer reactions
involving enzyme catalysis. The current response observed in enzymes transformations at
electrodes interfaces demonstrated that polyaniline nanotubes are an efficient mediator for
biosensors design. The response current properties to haemometabolites glucose, cholesterol and
urea of PGLD, PPID and CHD bioconjugated with GOx, COx and urease occurs at 400 mV, 700
mV and 600 mV, respectively. It was found that the response current of the PGLD, PPID and
CHD bioconjugates easily reaches to steady state. The results about the current saturation peak
for the PGLD biosensors are meaningfully higher than CHD and PPID bioconjugates. The
apparent MichaelisMenten constant (KappM), which gives an indication of the enzymesubstrate
kinetics for the PPID, CHD and PGLD bioconjugates were calculated from the electrochemical
LineweaverBurk equation. The based PGLD, PPID and CHD biosensors showed a good
performance in glucose, cholesterol and urea concentrations of clinical interest. The enzyme
affinity for the substrate (KMapp) indicate that the enzyme catalytic activity declines in the
crescent order PGLD>CHD>PPID. The results show that PGLD appears to be a very promising
candidate for development of high-performance biosensors relatively to the CHD and PPID
dendrimers. An artificial neural network Back-Propagation type with three layers of neurons was
trained, and applied, in predicting the amount of haemometabolites glucose, cholesterol and urea

Abstract

xv

in relation to the current response of developed biosensors. The neural network developed for
determining the haemometabolites was shown to be efficient in both, training phase and the test,
respectively.

Introduo

Introduo
O aumento da longevidade humana visto ao longo do ltimo sculo, fez com que um
grande nmero de indivduos viesse a atingir uma idade crtica para o desenvolvimento de
inmeras doenas. Consequentemente, como resultado da maior longevidade humana h o
aparecimento de morbidades relacionadas ao envelhecimento, como: hipercolesterolemia,
hiperglicemia e elevao nos nveis de uria no sangue.
A hipercolesterolemia um importante fator de risco cardiovascular porque o colesterol
exerce efeito pr-oxidante que leva ao aumento na produo de radicais livres, os quais tm
importante papel na gnese da aterosclerose. A hiperglicemia, caracterizada pelo excesso de
acar no sangue, uma disfuno causada pela falta de insulina, pela diminuio na produo
ou ainda pela incapacidade de exercer suas funes. J o excesso de uria no sangue, um
indicativo forte de que o indivduo possue doenas renais e hepticas.
Tendo em vista a problemtica acima mencionada, verifica-se a importncia do controle
dos nveis de glicose, colesterol e uria no fluido sanguneo, uma vez que estes esto sujeitos a
flutuaes contnuas. As consequncias do descontrole dos nveis de glicose, colesterol e uria
so diabetes melito, infarto do miocrdio, amputao de membros inferiores, hemodilise, perda
da viso dentre outras. Surge ento a necessidade de se criar um dispositivo que monitore
diariamente os nveis destes hemometablitos simultaneamente.
A aplicao ideal de um biossensor multienzimtico seria a produo de um dispositivo
implantvel para monitoramento contnuo dos metablitos. Este dispositivo estaria conectado a
um microprocessador de controle de um sistema de liberao de frmacos pela pele, que
controlaria os nveis de glicose, colesterol e uria.
A evoluo dos mecanismos utilizados na monitorao de hemometablitos, seu
funcionamento e suas aplicaes so apresentados no captulo 1. Como pode ser observado neste
captulo, os biossensores amperomtricos so ainda os mais pesquisados em funo de suas
caractersticas nicas, tais como transferncia direta de eltrons entre a enzima e a superfcie do
eletrodo trabalhando a baixos potenciais.
Uma vez que as enzimas so os biocatalizadores responsveis pela gerao do sinal no
transdutor, o captulo 2 trata da natureza qumica das enzimas, suas classificaes, grupos aos
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Introduo

quais pertencem e aponta os mecanismos das reaes catalisadas por estes compostos, vantagens
e desvantagens. apresentando ainda neste captulo os modelos para os mecanismos de catlise
enzimtica bem como os fatores que influenciam a atividade do biocatalizador. As tcnicas de
imobilizao fsicas e qumicas das enzimas tambm so tratadas neste captulo. Um outro fator
que deve ser levado em considerao a cintica da enzima; neste intuito a equao
eletroqumica de Michaelis-Menten foi estudada e sua linearizao foi feita a partir do grfico de
Lineweaver-Burk. Para finalizar o captulo, uma abordagem do uso das enzimas glicose oxidase,
colesterol oxidase e urease estudadas nesta dissertao no emprego de biossensores e seus
mecanismos foram relatados.
As enzimas para serem imobilizadas, necessitam de um suporte ideal, com este intuito,
estruturas altamente ramificadas, com peso molecular uniforme e com elevada concentrao de
grupos funcionais em suas periferias foram estudadas no captulo 3. Macromolculas dendrticas
de poliglicerol (PGLD), quitosana (CHD) e poli(propileno imina) foram sintetizados, purificados
e caracterizados anteriormente pelo grupo de biomateriais da Unifei. O captulo 3 aborda
essencialmente algumas caractersticas destas macromolculas.
Uma das principais preocupaes na construo de biossensores amperomtricos a
velocidade de transferncia de eltrons do stio ativo da enzima para a superfcie do eletrodo o
qual transmite o sinal para o sistema que ir converter o sinal da reao biolgica em um sinal
eltrico. O captulo 4 trata dos mediadores de eltrons mais utilizados, em especial a polianilina
(PANI) que um polmero condutor. Os polmeros intrinsecamente condutores podem combinar
as propriedades mecnicas e a processabilidade dos polmeros convencionais com um
comportamento eltrico, tico e/ou mecnico semelhantes ao de metais e semicondutores
inorgnicos.
Houve a necessidade de um sistema que pudesse tratar estatisticamente os dados das
reaes das concentraes dos substratos em relao aos picos de corrente gerados pela reao
enzima/ substrato. No captulo 5, um sistema inteligente denominado Rede Neural, foi utilizado
com o intuito de distinguir os valores das concentraes dos hemometablitos: uria, colesterol e
glicose. tratado neste captulo as aplicaes das redes neurais, seus mecanismos de
funcionamento e sua evoluo no decorrer do tempo. Um paralelo entre a rede neural utilizada e a
rede neural natural (do crebro humano), foi traado; afinal a rede neural foi projetada a partir do

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Introduo

modelo do crebro humano. Foi utilizado o algoritmo backpropagation como mtodo de


aprendizagem.
O captulo 6 define os principais objetivos desta dissertao.
No captulo 7 descrita a metodologia experimental adotada para este trabalho e no
captulo 8 os resultados obtidos com relao resposta do biossensor so discutidos.
No captulo 9 so apresentadas as principais concluses obtidas neste trabalho.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de


hemometablitos
1.1- Introduo
A enzimologia clnica surge como um meio de desenvolver e utilizar exames clnicos que
ofeream o mximo de informao com um mnimo de invasibilidade, auxiliando no diagnstico
de doenas, no prognstico de quadros clnicos diversos e na avaliao do estado nutricional dos
pacientes.
A histria da enzimologia relativamente recente, tendo dado seus primeiros passos a
partir dos trabalhos publicados por Vitor Henri em 1901, e por Leonor Michaelis entre 1910 e
1914. Estas pesquisas ofereceram subsdio terico para que em 1927, King e Armstrong
utilizassem pela primeira vez a enzima fosfatase alcalina para o diagnstico clnico. Em meados
da dcada de 1940, as enzimas sricas j eram utilizadas como meio auxiliar de diagnstico.1
O mtodo mais utilizado nos laboratrios de anlises clnicas o mtodo enzimtico, por
ser de baixo custo e simples. Assim, o exame rotineiro de hemometablitos realizado por este
mtodo, identificando a concentrao de glicose, colesterol, uria, dentre outros metablitos.
Os hemometablitos de interesse neste trabalho so a glicose, o colesterol e a uria. Por
serem de suma importncia nos diagnsticos de doenas e necessitarem de monitoramento
constante.
As anlises clnicas so de custo elevado uma vez que dependem de instrumentos de
grande porte caros, funcionrios devidamente qualificados e local apropriado dentre outros
custos. Alm disso, trazem ao paciente certo incmodo pelo fato da amostragem do fludo
biolgico para realizao das anlises clnicas, podendo assim ser considerado um mtodo
invasivo.
Os biossensores surgem ento como alternativa para substiturem os mtodos
colorimtricos convencionais do laboratrio clnico. A anlise pode ser feita pelo prprio
paciente a qualquer hora do dia e local, necessitando apenas de uma nica gota de sangue.
Alm de ser uma ferramenta analtica pouco invasiva, os dispositivos biossensores geram
no sistema de sade uma economia considervel em relao aos exames convencionais. Outra
vantagem do uso de biossensores para o monitoramento de hemometablitos se deve ao fato de

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

que h pacientes que necessitam de monitoramento dirio dos nveis desses hemometablitos,
como por exemplo, os pacientes diabticos.

1.2- Histrico do desenvolvimento dos biossensores e o Estado da arte


Biossensores so dispositivos eletrnicos capazes de converter uma reao biolgica/
bioqumica em um sinal apropriado. Este sinal pode ser potenciomtrico, amperomtrico,
condutimtrico, ptico, piezeltrico ou entalpimtrico.2-3 O sinal produzido proporcional
concentrao de analito, tambm conhecido como substrato. Com isso, ocorre a unio da
especificidade e sensitividade dos sistemas biolgicos com o poder da engenharia, oferecendo
uma ferramenta muito poderosa para ser utilizada em anlises clnicas.
As espcies imobilizadas nos biossensores agem como biocatalizadores necessrios para
deteco dos respectivos analitos. Estas espcies imobilizados nas superfcies dos transdutores
podem ser de vrios tipos, tais como, tecidos celulares, microorganismos, organelas, membranas,
enzimas, anticorpos, dentre outros.4
A Figura 1.1 mostra os componentes bsicos de uma biossensor. Em (a), tem-se o
biocatalizador, onde ocorre a reao bioqumica responsvel pela gerao do sinal, em (b) tem-se
o transdutor, em (c) o amplificador e em (d) a apresentao do resultado.
(a)

(b)

(c)

(d)

Figura 1.1- Representao de um biossensor: biocatalizador.5

Em 1962, Clark e Lions desenvolveram o primeiro biossensor, o qual ficou conhecido


como eletrodo enzimtico 6 (ver Figura 1.2). A partir deste marco, diversos tipos de biossensores
foram desenvolvidos para os mais diversos tipos de anlises clnicas, obtendo maior destaque as
anlises biomdicas. O monitoramento de hemometablitos no sangue humano (como glicose,
colesterol e uria), a deteco de atividades bacterianas (principalmente em alimentos), a
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

deteco de tipos especficos de protenas bem como a determinao da concentrao de certos


ons em solues biolgicas, tem despertado a ateno de vrios pesquisadores.7-8

Figura 1.2 Eletrodo de oxignio de Clark. A) Eletrodo de trabalho Pt, B) eletrodo de referncia
Ag/AgCl, C) eletrlito semi-saturado de KCl, D) membrana de Teflon, E) anel de borracha para
fixao, F) fonte de tenso para polarizao e G) instrumento para medio da corrente de sada.9

Os biossensores ou eletrodos enzimticos so usados em uma srie de determinaes


analticas (Tabela 1.1), das quais, a deteco da taxa de glicose no sangue (analito de informao
vital para o controle do diabetes) destaque.10

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

Tabela 1.1- Alguns eletrodos enzimticos utilizados em determinaes analticas.11


Analito

Enzima

Espcie monitorada

Glicose

Glicose oxidase

Pt(H2O2)/O2

Uria

Urease

NH3/NH4

cido rico

Uricase

O2

lcool

lcool oxidase

O2

L-tirosina

Tirosina descarboxilase

CO2

Oxalato

Oxalato oxidase

O2

Salicilato

Salicilato hidroxilase

O2

Creatinina

Creatininase

NH3

Ascorbato

Ascorbato oxidase

O2

L-lisina

lisina descarboxilase

CO2

Accar

Invertase ou glicose oxidase

Pt(H2O2)/O2

Lactato

Lactato dehidrogenase

O2

Penicilina

Penicilinase

Ph

Os biossensores geralmente so classificados de acordo com o sinal que gerado no


transdutor. Os biossensores amperomtricos so os tipos mais usados e pesquisados, como pode
ser verificado na Figura 1.3. Porm, existem outros tipos de biossensores baseados em outros
tipos de sinais, dos quais, os mais usados sero brevemente abordados nos tpicos seguintes.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

450
400
350

Biossensor
amperomtrico
Biosensor ptico

300
250

Biosensor
calorimtrico
Biosensor
potenciomtrico

200
150
100
50
0
08
20

06
20

04
20

02
20

00
20

98
19

Anos
Figura 1.3 Grfico comparativo para os tipos de biossensores mais estudados. Fonte: Scielo.

1.3- Biossensores eletroqumicos


Os biossensores eletroqumicos so dispositivos capazes de fornecer sinais analticos do
meio operacional atravs do uso de componentes biolgicos como parte do sensor. O
biocomponente responsvel pela alta seletividade molecular e pela formao de produtos
detectveis, se o analito em si no for eletroativo.12 A deteco eletroqumica pode ser
amperomtrica (medindo-se uma diferena de cargas), potenciomtrica (medindo-se uma
diferena de potencial), condutomtrica (medindo-se mudanas na condutncia entre eletrodos),
impedanciomtrica (medindo-se mudanas de impedncia no eletrodo).13-14 No entanto, os
biossensores amperomtricos so os mais pesquisados, em funo de seu relativo baixo custo de
construo, potencial para miniaturizao, facilidade de automao e construo de equipamentos
simples e portteis.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

1.3.1- Biossensores amperomtricos


Os biossensores amperomtricos fornecem a possibilidade de se captar um sinal eltrico
que seja proporcional concentrao de analito. A linearidade da resposta do biossensor faz com
que este seja recalibrado. Se o oxignio suprido por uma membrana de espessura d e rea A, a
corrente i pode ser aproximada pela Equao 1.1; onde D o coeficiente de difuso, e p a
solubilidade e a presso parcial de O2 na membrana, respectivamente, e F 96500 C.

I = 4 FAD

p
d

(1.1)

Atravs da aplicao de um nvel de tenso contnua apropriada, a concentrao de


substrato pode ser medida pela transferncia de carga entre a superfcie do eletrodo e o substrato.
Os biossensores amperomtricos, se dividem em trs grupos, segundo o processo envolvido na
transferncia de carga; primeira, segunda e terceira gerao; como ilustrado na Figura 1.4.

Figura 1.4- Representao esquemtica para biossensores amperomtricos segundo o processo


de transferncia de cargas.15

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

10

Em suma, os biossensores amperomtricos baseiam-se em reaes de transferncia de


cargas (oxi-reduo) entre o material biocataltico e o analito com um eletrodo de referncia
polarizado a uma tenso pr-definida.14
O primeiro biossensor amperomtrico foi desenvolvido por Updike e Hicks em 1967 para
a medida de glicose, no qual se fazia uso do eletrodo enzimtico desenvolvido por Clark e
Lions.16
A maior parte dos biossensores utilizados para a anlise de hemometablitos se baseiam
no uso de mediadores, com limites de leitura de cerca de 10 a 600 mg.dL-1. Esses biossensores
so vendidos em lotes (10, 25 ou 50 biossensores, para o caso da Accu-Chec) separadamente do
dispositivo eletrnico para anlise. Os preos no mercado para a Accu-Chec (o mais comum),
variam, aproximadamente R$2,50 cada fita, dependendo da quantidade de fitas no lote e do local
de compra. A Figura 1.5 ilustra um modelo comercial de um biossensor amperomtrico, utilizado
na monitorao de hemometablitos tais como; colesterol, uria e glicose.

Figura 1.5- Biossensores amperomtricos comerciais utilizados em anlises clnicas.5


Os biossensores amperomtricos de primeira gerao baseiam-se na diminuio da
concentrao de oxignio, no qual os dois eletrodos so separados da amostra por uma membrana
de gs permevel. Neste caso, o oxignio difundido atravs da membrana reduzido num
eletrodo catodicamente polarizado na presena de um eletrodo de referncia. Os biossensores
amperomtricos, podem ser baseados tambm na deteco da concentrao de perxido de
hidrognio que oxidado em um eletrodo polarizado anodicamente, gerando o sinal eltrico.16 A
Figura 1.6, ilustra um biossensor amperomtrico de primeira gerao.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

11

Figura 1.6- Representao esquemtica de um biossensor amperomtrico de primeira gerao.16

Os biossensores amperomtricos de primeira gerao trabalham a elevados potenciais e se


baseiam na diminuio da concentrao de oxignio, onde dois eletrodos so separados da
amostra por uma membrana permevel a gs. Deste modo, o oxignio difundido atravs da
membrana reduzido em um eletrodo catodicamente polarizado na presena de um eletrodo de
referncia.
Um biossensor de segunda gerao se baseia no uso de um mediador para transferncia de
carga entre o stio ativo da enzima e a superfcie do eletrodo.17 Esses mediadores podem ser
materiais orgnicos, inorgnicos ou complexos de metais de transio e ainda polmeros
condutores.
Finalmente, os biossensores de terceira gerao se caracterizam pela transferncia direta
de eltrons entre a enzima e a superfcie do eletrodo trabalhando a baixos potenciais.18
As principais aplicaes dos biossensores amperomtricos so na indstria, na medicina e
no monitoramento do meio ambiente. Eles do uma anlise mais precisa do analito a ser medido,

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

12

pois a relao entre a quantidade de substrato e o sinal gerado varia linearmente de acordo com a
equao 1.2.19

I = nFAva

(1.2)

sendo I a corrente criada na reao, n o nmero de eltrons transferidos, A rea do eletrodo, F a


constante de Faraday e va a velocidade com que a reao ocorre, sendo esta proporcional
concentrao do substrato.

1.3.2- Biossensores potenciomtricos


Os biossensores potenciomtricos so dispositivos ons-seletivos os quais so constitudos
de uma membrana contendo enzimas imobilizadas onde a reao catalisada enzimaticamente gera
ou absorve ons de hidrognio, alterando o pH do meio. Uma diferena de potencial criada entre
um eletrodo de referncia e o eletrodo on-seletivo.20
A resposta de um biossensor potenciomtrico dada pela equao de Nerst.21

E = E0 +

RT
ln([i])
zF

(1.3)

sendo E o potencial medido, E0 o potencial caracterstico do meio, R a constante universal dos


gases, T a temperatura absoluta, z o nmero de cargas trocadas na reao, F a constante de
Faraday e [i] a concentrao de ons livres na soluo.
Um desenvolvimento recente de eletrodos on-seletivos, a produo de trasnsistores de
efeito de campo on-seletivos (ISFETs).22 Um ISFET um MOSFET (Transistor de efeito de
campo metal-xido semicondutor) modificado. A diferena, que o eletrodo porta do MOSFET
substitudo por um eletrodo de referncia contido em uma soluo e em contato com o xido da
regio da porta, agora no mais existente. O contato entre o xido e o eletrodo de referncia
feito geralmente atravs da soluo. Uma alterao do potencial da soluo controla o fluxo de

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

13

corrente entre a fonte e o dreno do ISFET. A Figura 1.4 ilustra a estrutura de um ISFET em
comparao a um MOSFET.

(A)

(B)

Figura 1.7- (A) Estrutura de um MOSFET (a) em comparao com um ISFET (b). (B) Estrutura
fsica de um MOSFET.9-23

Atravs da imobilizao de enzimas no eletrodo porta, estes dispositivos eletrnicos


podem ser aplicados em biossensores. So os chamados ENFETs (Transistores de Efeito de
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

14

Campo Enzimticos), ilustrado na Figura 1.5. Neste caso a reao catalizada pela enzima que
altera o potencial do meio, sendo esta alterao proporcional concentrao do analito.24
A vantagem desses dispositivos a possibilidade do uso da microeletrnica na sua
produo, possibilitando a confeco em larga escala. Em contra partida, a principal desvantagem
a dificuldade de isolamento do FET do meio reacional, o que pode influenciar o desempenho do
biossensor.22

Figura 1.8- Montagem de um ENFET. (A) Substrato de Silcio, (B) Dopagem e formao de
xido, (C) Deposio da membrana on-seletiva e (D) imobilizao da enzima e
membrana protetora.9
1.3.3- Biossensores pticos
Biossensores pticos baseiam-se na determinao das mudanas de absoro entre os
reagentes e produtos da reao, ou na medida da sada de luz por um processo luminescente.25 A
forma mais comum envolve o uso de tiras colorimtricas, as quais, contm enzimas oxi-redutoras
e um cromgeno. O produto gerado na reao entre a enzima e o analito (na maioria das vezes
H2O2), oxida o cromognio. A absorvncia do composto formado proporcional concentrao
do analito a ser determinada.
O uso mais comum de biossensores pticos o controle do diabetes pela determinao do
nvel de glicose no sangue usando-se as enzimas glicose oxidase (GOx) e peroxidase (POx),
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

15

juntamente com o composto que no obsorve luz na regio visvel. O perxido de hidrognio
(H2O2) resultante da oxidao da glicose pela GOx, na presena da POx, oxida o composto sem
absorvncia no visvel em um composto colorido. A avaliao das tiras tingidas feita pelo uso
de medidores portteis de reflectncia ou pela comparao com uma cartilha colorida
previamente elaborada.
A Figura 1.5 ilustra um biossensor ptico comercial de ltima gerao. O paciente pode
acompanhar a concentrao dos hemometablitos de interesse analisando a cor da lente e
comparando esta resposta com uma tabela de cores do estojo, para verificar a qualquer hora do
dia a concentrao dos hemometablitos.

Figura 1.9- Ilustrao de um biossensor ptico.26

1.3.4- Biossensores piezoeltricos


Esses tipos de biossensores contm cristais piezoeltricos em seus transdutores com
espcies imobilizadas. A Figura 1.10 ilustra os componentes de um biossensor piezoeltrico.
Todos os cristais piezoletrico vibram na presena de um campo eltrico. A frequncia (f)
dessa vibrao depende da espessura e do corte do cristal, sendo que cada cristal possui um
frequncia de vibrao caracterstica. Esta frequncia caracterstica muda quando o cristal
absorve ou desadsorve molculas em sua superfcie, de acordo com a Equao 1.4.27

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

f =

k p f 2 m
A

16

(1.4)

sendo f a variao da freqncia caracterstica, m a variao da massa do material adsorvido,


k uma constante dependente cristal e A a rea de superfcie adsorvida. Como a variao de
frequncia proporcional variao de massa do material adsorvido, tal variao pode ser
determinada por circuitos eletrnicos.27
Um bom exemplo de um biossensor piezoeltrico um transdutor para a deteco de
formaldedo gasoso.28 Este basicamente formado por dehidrogenase imobilizada em um cristal
de quartzo. Este sistema sensvel ao formaldedo gasoso.
O principal inconveniente destes dispositivos a interferncia da umidade atmosfrica na
medida e a dificuldade em us-los para a determinao de analitos em soluo.29 Entretanto,
biossensores piezoeltricos so relativamente baratos, pequenos e capazes de dar uma resposta
rpida.30 A exemplo, a Figura 1.10 ilustra uma microbalana de quartzo que realiza medidas de
massa e viscosidade em processos que ocorrem em superfcies, prximos a superfcies ou no
interior de filmes finos. Realiza tambm, medidas de freqncia e resistncia.

Figura 1.10-Microbalana de cristal de quartzo (A); Transdutor de preciso de massa (B).31-32


1.3.5 - Biossensores trmicos ou calorimtricos
Muitas reaes que so catalizadas enzimaticamente so exotrmicas, ou seja, geram
calor. Dessa forma, os biossensores calorimtricos baseiam-se na medida da variao de
temperatura entre a entrada e a sada de uma pequena coluna contendo um biocatalizador
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

17

(enzima) imobilizado temperatura constante. Tal medida efetuada atravs de termistores, que
so semicondutores sensveis temperatura.33
Os termistores, usados para detectar a mudana de temperatura funcionam variando sua
resistncia eltrica com a temperatura, obedecendo relao:

B
R1
= e T T
R2
1

(1.5)

onde, R1 e R2 so as resistncias dos termistores nas temperaturas absolutas T1 e T2, e B uma


temperatura constante caracterstica do termistor.
A principal vantangem de um biossensor calorimtrico sua aplicabilidade geral e a
possibilidade de uso em solues densas e fortemente coloridas. Porm existe a dificuldade de se
manter a temperatura do biocatalizador constante, fato que pode levar desnaturao da enzima,
prejudicando assim, o funcionamento do biossensor.
A Figura 1.11 ilustra o funcionamento de um biossensor calorimtrico. O fluxo de
amostra (a) atravessa a caixa separadora externa (b) para o controlador de calor (c) dentro de um
bloco de alumnio (d), de onde flui para o termistor de referncia (e) e no bioreator de cama
acumulado (f) 1 ml de volume, contendo o biocatalizador onde a reao acontece. A mudana de
temperatura determinada pelo termistor (g) e o produto final (h).

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

18

Figura 1.11- (A) Diagrama esquemtico de um biossensor calorimtrico; (B) Ilustrao de um


termistor do tipo NTC.34-35
O NTC (Negative Temperature Coefficient) um termistor ou componente eletrnico
semicondutor sensvel a temperatura, utilizado para controle, medio ou polarizao de circuitos
eletrnicos. Possui um coeficiente de variao de resistncia que varia negativamente conforme a
temperatura aumenta, ou seja, a sua resistncia eltrica diminui com o aumento da temperatura.35
1.7- Consideraes parciais
Biossensores so dispositivos compactos, capazes de fornecer uma resposta quantitativa
para o monitoramento de diversos analitos. Eles so classificados de acordo com o sinal que
gerado (amperomtrico, ptico, potencimtrico etc) na reao entre o analito e o material
biolgico (na maioria das vezes enzimas) imobilizado na superfcie de um elemento transdutor.
A simplicidade relativa das anlises promovidas pelos biossensores faz deste dispositivo
um excelente candidato para monitorao diria dos nveis dos hemometablitos.
Os biossensores enzimticos so alternativas interessantes para o monitoramento dos
hemometablitos, pelo baixo custo e elevada seletividade.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

19

Os biossensores enzimticos vm sendo empregados em um grande nmero de


determinaes analticas, principalmente em anlises clnicas. A monitorao da taxa de glicose
dentre outras anlises como concentrao de uria, cido rico, colesterol, oxalato, creatinina,
lisina, lactato, e cistena, esto entre os principais metablitos, cujas concentraes plasmticas,
teciduais ou urinrias so relevantes para o diagnstico clnico.36-37
O elemento principal de um biossensor o biocatalizador utilizado no reconhecimento do
analito a ser quantificado. Neste sentido, uma anlise mais detalhada a respeito do mecanismo de
atuao dos sistemas enzimticos apresentada no captulo seguinte.

1.8- Referncias
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Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos

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Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

22

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas


2.1- Noes gerais
O componente fundamental de um biossensor enzimtico so as enzimas. As enzimas so
biocatalisadores que apresentam alta seletividade; observada especialmente para as enzimas
glicose oxidase, colesterol oxidase e urease, utilizadas no presente trabalho.
A palavra enzima foi introduzida por Kuhne em 1878 para designar a ocorrncia no
levedo de algo responsvel pela sua atividade fermentativa. Berzelius, 50 anos antes, tinha
reconhecido a presena de fermentos de ocorrncia natural que promoviam reaes qumicas e
antecipou o conceito de catalisadores biolgicos. Berzelius classificou os fermentos em
organizados e no-organizados com base na presena ou ausncia de microorganismos intactos.
Kuhne aplicou a palavra enzima aos fermentos derivados de extratos de levedos.1
Em 1897 Bchner preparou um filtrado de extratos de levedo que foi o primeiro extrato
enzimtico removido de clulas vivas que pode catalisar a fermentao. A natureza qumica das
enzimas permaneceu controversa. Em 1926, Sumner cristalizou a urease a partir de extratos de
feijo, no entanto, a preparao tinha pequena atividade cataltica e outros investigadores
atriburam o efeito cataltico a contaminantes e no protena. Willstntter, por outro lado,
purificou a peroxidase com elevada capacidade cataltica e ausncia de outras protenas. No
incio dos anos 30, Northrop e colaboradores cristalizaram a pepsina e a tripsina demonstrando
definitivamente que as enzimas eram protenas.2
As enzimas so protenas com a funo especfica de acelerar reaes qumicas que
ocorrem sob condies termodinamicamente no favorveis. Elas aceleram consideravelmente a
velocidade das reaes qumicas em sistemas biolgicos quando comparadas com as reaes
correspondentes no catalisadas. Consegue-se isso atravs do abaixamento da energia de ativao
necessria para que ocorra uma reao qumica, resultando no aumento da velocidade da reao e
possibilitando o metabolismo dos seres vivos. A capacidade cataltica das enzimas torna-as
adequadas para aplicaes industriais, como na indstria farmacutica ou na alimentar.
Em sistemas vivos, a maioria das reaes bioqumicas d-se em vias metablicas, que so
sequncias de reaes em que o produto de uma reao utilizado como reagente na reao
seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metablicas, agindo de modo a
no interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulao da sua atividade,
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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

23

aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via


metablica que se requer.
Algumas enzimas so capazes de aumentar a velocidade de certas reaes cerca de 1014
vezes, sem requerer condies extremas de temperatura, presso e pH. 3 A Tabela 2.1 ilustra as
velocidades de reaes catalisadas e no catalisadas por enzimas.
Tabela 2.1- Velocidade de reaes no catalisadas e catalisadas por enzimas.3

A reao catalisada por uma enzima pode ser ilustrada como:


Substrato (S)

Enzima (E)

Produto (P)

A enzima atua sobre o substrato (S) que se transforma em produto(P). Na ausncia de


enzima pouco produto (ou nenhum) formado, mas em presena da mesma, a reao se processa
em alta velocidade. Como a maioria das reaes reversvel, os produtos da reao numa direo
tornam-se substratos para a reao inversa.
As enzimas so os catalisadores mais especficos que se conhece, tanto para o substrato
como para o tipo de reao efetuada sobre o substrato como para o tipo de reao efetuada sobre
o substrato. A especificidade inerente da enzima reside em uma cavidade ou fenda de ligao do
substrato, que est situada na superfcie da protena enzimtica. A cavidade, denominada stio
ativo, um arranjo de grupos presentes em cadeias laterais de certos aminocidos que ligam o
substrato por ligaes no-covalentes. Muitas vezes, os resduos de aminocidos que formam o

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

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stio ativo ficam em regies distantes, na seqncia primria, mas prximos no stio ativo, pelo
enovelamento de cadeia polipeptdica (estrutura terciria).
Algumas enzimas tm outra regio na molcula, o stio alostrico, afastada do stio ativo.
No stio alostrico molculas pequenas especficas se ligam e causam alteraes na conformao
protica que afetam o stio ativo, aumentando ou reduzindo a atividade enzimtica.
A maioria das enzimas necessita de molculas orgnicas ou inorgnicas pequenas,
essenciais sua atividade e denominadas coenzimas e co-fatores.

2.2- Classificao das enzimas


Com a descoberta de grande nmero de enzimas, houve a necessidade de sistematizao
da nomenclatura. A Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB) adotaram
um sistema racional e prtico de nomenclatura identificando as enzimas em seis classes, de
acordo com a natureza da reao qumica que catalisam. Para cada enzima, so atribudos dois
nomes e um nmero de classificao de quatro dgitos que identificam as classes, as subclasses e
as sub-subclasses.
Na classificao internacional sistemtica, as enzimas so divididas em seis grupos de
acordo com o tipo de reao catalisada, como pode ser visto na Tabela 2.2.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

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Tabela 2.2- Classificao das enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia
Molecular (IUBMB).4
1.

Oxirredutases (reaes de oxirreduo ou transferncia de eltrons Desitrogenases e Oxidases)


1.1 atuando em CH-OH
1.2 atuando em C=O
1.3 atuando em C=O1.4 atuando em CH-NH2
1.5 atuando em CH-NH1.6 atuando em NADH, NADPH

2.

Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases e
Transaminases)
2.1 grupo com um carbono
2.2 grupos aldedo ou acetona
2.3 grupos acil
2.4 grupos glicosil
2.5 grupos fosfatos
2.6 grupos contendo enxofre

3.

Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente Peptidases)


3.1 steres
3.2 ligaes glicosdicas
3.3 ligaes peptdicas
3.4 outras ligaes C-N
3.5 anidridos cidos

4.

Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e remoo de molculas de gua, amnia e gs


carbnico Dehidratases e Descarboxilases)
4.1 =C=C=
4.2 =C=O
4.3 =C=N-

5.

Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos Epimerases)


5.1 racemases

6.

Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas prexistentes, sempre s custas de energia Sintetases)
6.1 C-O
6.2 C-S
6.3 C-N
6.4 C-C

2.3 Mecanismos das reaes catalisadas por enzimas


Para reagirem, as molculas presentes em uma soluo devem colidir com orientao
apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitiam formar o complexo ativado,
denominado estado de transio que representa os reagentes em seu estado ativado. Para atingir o
estado de transio, necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia de ativao
(Ea) ou mais comum em bioqumica energia livre de ativao, G (o smbolo () indica o
processo de ativao). Sob condies fisiolgicas, a velocidade das reaes pode ser aumentada
pela reduo da energia livre de ativao conseguida pela ao das enzimas.2-3
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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

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A comparao do perfil energtico das reaes catalisadas e no-catalisadas mostrada na


Figura 2.1 para a reao:
A+B C+D
Na Figura 2.1, o estado de transio correspondente ao ponto de mais alta energia da
reao no-catalisada a medida da energia livre de ativao, G. Ou ainda, G a energia
livre do estado de transio subtrada da energia livre dos reagentes. No complexo ativado
(estado de transio do sistema), os reagentes esto em forma intermediria de alta energia e no
podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O complexo do estado de
transio aquele em que pode ser decomposto em produtos ou voltar aos reagentes.5 No estado
de transio o exato momento onde o substrato se transforma em produto, este estado
corresponde ao mximo de energia.

Figura 2.1- Diagrama energtico de reao catalisada e de reao no-catalisada.6

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

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A diferena entre os valores da energia de ativao de uma reao catalisada e de uma


reao no-catalisada indica a eficincia do catalisador.
A velocidade de uma reao inversamente proporcional ao valor de sua energia livre de
ativao. Quanto maior o valor de G, menor ser a velocidade da reao. Os catalisadores
aumentam a velocidade da reao reduzindo a energia livre de ativao.5
Trs propriedades distintas das enzimas permitem que elas exeram papel central na
promoo e regulao dos processos celulares, caracterizando-as como componentes vitais aos
sistemas vivos.7
i) Elevada especificidade da reao. Como em geral, cada reao sob condies apropriadas
catalisada por uma enzima especfica. Diante de vrias rotas potencialmente possveis, a enzima
escolhe a com menor energia livre de ativao.
ii) Condies reacionais mais brandas. A atividade de cada enzima dependente do pH, da
temperatura, da presena de vrios co-fatores e das concentraes de substratos e produtos.
iii) Capacidade de regulao da concentrao e da atividade. Permite o ajuste fino do
metabolismo em diferentes condies fisiolgicas.

2.4- Stio ativo cataltico


Stio ativo a regio na superfcie da enzima onde ocorre a catlise. O substrato liga-se ao
stio ativo por ligaes no-covalentes (interaes eletrostticas, pontes de hidrognio, interaes
de van der Waals e interaes hidrofbicas). Os grupos que participam das ligaes so a
carboxila do cido glutmico ou do cido asprtico, o grupo -amino da lisina, o amidazol da
histidina, a hidroxila da serina etc.
Somente uma pequena poro do substrato onde ocorre transformao est ligada
enzima. Isso no implica, entretanto, que os aminocidos no stio ativo estejam um ao lado do
outro na estrutura primria da protena. Em conseqncia das dobras e enovelamento da enzima
(estrutura secundria e terciria), certos resduos de aminocidos podem estar distantes um do
outro na sequncia primria, ainda que juntos no stio ativo da protena completa.
A especificidade da ligao enzima-substrato depende do arranjo precisamente definido
de tomos no stio ativo. Uma das explicaes para a elevada especificidade das enzimas que
suas estruturas tridimensionais permitem um perfeito encaixe com o substrato. Dois modelos

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

28

foram propostos para explicar a especificidade enzimtica, o modelo chave-fechadura e o modelo


do encaixe induzido.
2.4.1- Modelo chave-fechadura
Foi sugerido por Emil Fischer, em 1894, que esse fato era devido a que tanto as enzimas
como os substratos apresentam formas geomtricas complementares, fazendo com que encaixem
de maneira precisa umas nos outros.7 Este processo muitas vezes referido como modelo chavefechadura. No entanto, apesar de deste modelo explicar a especificidade das enzimas, falha em
explicar a estabilizao dos estados de transio que as enzimas exibem. A Figura 2.2 ilustra o
modelo chave-fechadura descrito por Emil Fischer.

Figura 2.2 - Modelo chave-fechadura. A interao entre a enzima (com estrutura rgida) e seu
substrato.7
2.4.2- Modelo do encaixe induzido
Em 1958, Daniel Koshland sugeriu uma modificao ao modelo de chave-fechadura: uma
vez que as enzimas exibem estruturas flexveis, os stios ativos alteram a sua forma de maneira
continuada atravs de interaes com o substrato, enquanto esse mesmo substrato vai interagindo
com a enzima.8 Como resultado, o substrato no se liga simplesmente a um stio ativo que
rgido. As cadeias laterais dos aminocidos que formam os stios ativos sofrem uma reorientao
de maneira a que as suas posies potenciem a ao cataltica da enzima. Em alguns casos, como
nas glicosidases, a molcula de substrato tambm sofre alteraes de conformao medida que
vai se aproximando do stio ativo.9 O stio ativo continua a sofrer modificaes at que o
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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

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substrato esteja completamente ligado e neste momento em que a conformao final e a carga
so determinadas.10 A Figura 2.3 ilustra o modelo encaixe-induzido descrito por Daniel
Koshland.

Figura 2.3- Modelo do encaixe induzido. A ligao do substrato enzima induz uma mudana
conformacional na enzima produzindo um melhor encaixe.8
2.5- Mecanismos catalticos 11
As reaes qumicas envolvidas na transformao dos substratos variam com os
mecanismos de ao das enzimas. Os principais tipos de mecanismos catalticos que as enzimas
utilizam so: (i) efeitos de proximidade e orientao, (ii) catlise eletrosttica, (iii) catlise cidobsica e (iv) catlise covalente.
(i) Efeitos de proximidade e orientao
Os substratos se aproximam dos grupos funcionais catalticos da enzima em uma
orientao espacial apropriada para que a reao possa ocorrer. Aps o correto posicionamento
do substrato, uma modificao na conformao da enzima resulta em um complexo enzimasubstrato orientado. Essa orientao leva o complexo enzima-substrato ao estado de transio,
como pode ser visto na Figura 2.4.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

30

Figura 2.4 Catlise por proximidade e orientao.12


(ii) Catlise por ons metlicos
A fora das interaes eletrostticas est relacionada com a capacidade das molculas
solventes vizinhas em reduzir os efeitos de atrao entre os grupos qumicos. Como a gua
excluda do stio ativo quando o substrato se liga, a constante dieltrica local muitas vezes
baixa. A distribuio de cargas nos stios ativos das enzimas pode influenciar a reatividade
qumica do substrato. Uma ligao mais eficiente do substrato reduz a energia livre do estado de
transio, que acelera a reao (ver Figura 2.5).

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

31

Figura 2.5 Representao esquemtica do mecanismo para a reao catalisada pelo on


Metlico.12
(iii) Catlise cido-base geral
Os grupos qumicos podem se tornar mais reativos pela adio ou remoo de prtons
(ver Figura 2.6). Os stios ativos das enzimas contm cadeias laterais que podem atuar como
doadores ou receptores de prtons. Esses grupos so denominados cidos gerais ou bases gerais.
Por exemplo, a cadeia lateral da histidina (grupo imidazol) muitas vezes atua como catalisador
cido e/ou bsico em concerto porque tem pKa na faixa de pH fisiolgico.

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32

SEM CATALISADOR

COM CATALISADOR

Figura 2.6 Reao cido-base geral: hidrlise de um ster.12


(iv) Catlise covalente
Acelera a velocidade da reao pela formao de uma ligao covalente transitria entre a
enzima e o substrato. Um grupo nucleoflico da cadeia lateral do catalisador forma uma ligao
covalente instvel com um grupo eletroflico do substrato. O complexo enzima-substrato ento
forma o produto (ver Figura 2.7).

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

33

Figura 2.7- Representao de uma catlise covalente. Onde X = RCOO-, RNH2, ArOH, His,
ROH, RSH.13

2.6- Fatores que influenciam a atividade enzimtica


Vrios fatores influenciam a atividade enzimtica, incluindo a temperatura, pH,
concentrao do substrato, tempo e produto da reao.14
Com relao temperatura, as reaes qumicas so afetadas de acordo com a lei de
VantHoff. Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reao. A velocidade aumenta
porque mais molculas adquirem energia suficiente para atingir o estado de transio. Em reaes
catalisadas por enzimas, a velocidade acelerada pelo aumento da temperatura at atingir uma
temperatura tima na qual a enzima opera com a mxima eficincia. Como as enzimas so
protenas, os valores de temperatura tima situam-se entre 35 a 40C e dependem do pH e da
fora inica. Acima dessa temperatura, a atividade das enzimas declina adruptamente por
desnaturao protica. Sob condies de hipotermia, a atividade enzimtica deprimida. As
relaes acima descritas so ilustradas na Figura 2.8.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

34

Figura 2.8- Efeito da temperatura sobre a velocidade de uma reao catalisada por enzima.15

A concentrao de ons hidrognio afeta as enzimas de vrios modos. Primeiro, a


atividade cataltica das enzimas est relacionada ionizao de aminocidos no stio ativo. Por
exemplo, a atividade cataltica de certas enzimas necessita a forma protonada da cadeia lateral do
grupo amina. Se o pH torna-se suficientemente alcalino de tal modo que o grupo amino perde seu
prton, a atividade da enzima pode ser reduzida. Alm disso, os substratos podem tambm ser
afetados. Se um substrato contm um grupo ionizvel, as mudanas no pH afetam a capacidade
de ligao ao stio ativo. Segundo alteraes nos grupos ionizveis podem modificar a estrutura
terciria das enzimas. Mudanas drsticas no pH promovem a desnaturao de muitas enzimas.1617-18

A Figura 2.9 ilustra a atividade enzimtica versus pH de uma enzima.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

35

Figura 2.9- Atividade enzimtica versus pH (considerando-se os outros fatores constantes).19

Enzimas tal como a quimotripsina (enzima que hidrolisa protena) ou a triosefosfato


isomerases so ativas sem necessitar a presena de outro fator. No entanto, quase um tero das
enzimas conhecidas requer um componente no protico para sua atividade, denominado cofator.
Os cofatores podem ser ons metlicos Fe++, Mn++, Mg++,Zn++, ou molculas orgnicas, muitas
delas derivadas de vitaminas do complexo B.
Certas molculas podem inibir a ao cataltica de uma enzima, denominadas de
inibidores. Estes podem ocupar temporariamente o centro ativo por semelhana estrutural com o
substrato original (inibidor competitivo) ou alterar a conformao espacial da enzima, impedindo
sua unio ao substrato (inibidor no competitivo).
Em

anlises

clnicas

as

condies

ideais

para

anlise

so

similares

s do fluido fisiolgico, ou seja, pH 7,4 e temperatura de 37C.


Em um biossensor a enzima encontra-se normalmente imobilizada na superfcie do
eletrodo. necessrio analisar as tcnicas de imobilizao a serem utilizadas para que se possa
obter uma melhor atividade enzimtica, a partir do melhor mtodo de imobilizao para o
processo requerido.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

36

2.7- Tcnicas de imobilizao


Pelo seu alto poder cataltico e especificidade, as enzimas tm sido utilizadas na
construo de biossensores. Dessa forma, a enzima deve ser imobilizada na superfcie do
eletrodo, mantendo sua atividade cataltica. A enzima imobilizada pode ser reutilizada, o que
diminui o custo consideravelmente.
As caractersticas ideais para o suporte devem girar em torno da insolubilidade em gua,
se ligar facilmente enzima e ser inerte quimicamente.
Em 1916, Nelson e Griffing,20 mostraram que a invertase imobilizada por adsoro em
carvo ativado conservava sua atividade cataltica. A partir de ento, muito tem sido pesquisado
em termos de novos suportes e tcnicas de imobilizao.
Em termos gerais, os mtodos 21 para imobilizao enzimtica podem ser classificados em
reteno fsica, onde a enzima no sofre nenhuma alterao em sua estrutura qumica, e ligao
qumica, onde a enzima quimicamente ligada ao suporte por ligaes covalentes, como pode ser
observado na Figura 2.10.

Figura 2.10- Ilustrao das tcnicas de imobilizao enzimtica.22

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

37

2.7.1 Mtodos de imobilizao de enzimas por reteno fsica


2.7.1.1 Adsoro
As enzimas se unem ao suporte mediante ligaes fracas como fora de Van der Waals ou
ligaes de hidrognio. Sobre o ponto de vista mecnico, so pouco estveis e a unio ao suporte
fraca (podendo haver desoro devido mudana de temperatura, pH, pelo substrato, solvente
ou conveco), porm, o mtodo o mais simples e pode ser realizado em condies brandas de
imobilizao, preservando-se a enzima (mudana conformacional mnima ou nula). Coloca-se
uma gota da soluo aquosa contendo a enzima em contato com a superfcie do suporte que, aps
seco, estar pronto para uso.23

2.7.1.2 Reteno em membranas


A reteno de enzimas em membranas polimricas foi a primeira tcnica descrita para
fabricao de biossensores, onde a enzima foi colocada sobre o eletrodo e retirada por uma
membrana polimrica dialtica. Uma membrana adicional semipermevel pode barrar elementos
interferentes e possibilitar somente a passagem dos produtos da reao enzimtica.24

2.7.1.3 Microencapsulamento
Nesta tcnica, as enzimas esto envolvidas por membranas semipermeveis que permitem
a passagem de molculas de substrato e produto, mas no da enzima; so de forma esfrica com
tamanhos entre 1 a 100 micrometros de dimetro.21 A enzima e um monmero hidroflico so
misturados em soluo aquosa e adicionados em solvente orgnico insolvel em gua. Com a
adio de monmero hidrofbico, se inicia a reao de polimerizao, levando formao de
microesferas.24 Com este mtodo pode-se encapsular simultaneamente uma grande variedade de
enzimas, o que faz com que reaes que se sucedem em mltiplas etapas possam ser levadas a
cabo. Os principais tipos de membranas utilizadas so: Teflon, Nafion, colgeno acetato de
celulose e policarbonato.
2.7.1.4 Eletropolimerizao
No mtodo da imobilizao enzimtica por eletropolimerizao, um monmero em
soluo contendo a enzima, ao se polimerizar pela ao de um potencial eltrico, sofre deposio
na superfcie do eletrodo aprisionando simultaneamente a enzima. O monmero eletricamente
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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

38

oxidado em potencial que facilita o crescimento de radicais livres do monmero e, este,


adsorvido pela superfcie do eletrodo onde uma srie de reaes ocorre para a formao da matriz
polimrica.25
O processo ser regido pelo potencial do eletrodo e pelo tempo de reao, o que permite o
controle da espessura do filme resultante. Para algumas reaes de polimerizao, devido a
acidez do meio, este pode no ser o mais adequado, pois a enzima pode sofrer desnaturao e ter
sua atividade cataltica comprometida.

2.7.1.5 Ocluso em matriz polimrica


Neste mtodo, a enzima retida dentro de uma rede polimrica tridimensional insolvel
em gua. A ocluso pode ser feita em gel

26

(a soluo de enzima misturada a um monmero,

que ento polimerizado a um gel, retendo a enzima), em eletrodos de pasta de carbono

27

(a

enzima pode ser misturada a uma pasta consistindo de p de grafite e um leo e a pasta pode ser
misturada a diferentes componentes) e em polmeros (a enzima pode ser adicionada a um
monmero, em soluo aquosa, e este ser quimicamente polimerizado junto com a enzima). A
enzima tambm pode ser imobilizada dentro de matrizes slidas porosas.28

2.7.2- Mtodos de imobilizao de enzimas por ligao qumica


Pode-se imobilizar a enzima em um suporte, ou eletrodo, por meio de reaes qumicas
especficas deste com grupos funcionais presentes na estrutura protica, tais como amino grupos,
grupos carboxlicos, grupo imidazol da histidina e etc. Os mtodos qumicos incluem ligao
covalente e reticulao.21

2.7.2.1- Ligao covalente


Este mtodo consiste no uso de grupos qumicos do suporte, por meio da ativao da
matriz slida, e conseqente unio com a enzima. Dos 20 aminocidos que compem a estrutura
enzimtica, os mais empregados para ligarem-se ao suporte so principalmente a lisina, cistena,
tirosina e histidina, e em menor grau, a metionina, triptofano, arginina e os cidos asprtico e
glutmico. O restante, devido ao carter hidrofbico, no se encontra expostos na superfcie
protica, e no podem ento intervir nas ligaes. A ativao da matriz pode consistir em
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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

39

silanizao (Pt, vidro, quartzo), reao com carboimidas (amidas, nylon, grafite) e glutaraldedo
(aminas).29-30
Para tal mtodo, faz-se necessrio conhecer a densidade de grupos funcionais por unidade
de superfcie, j que este condiciona o nmero de unies enzima-substrato bem como prev a
posio da enzima na superfcie do eletrodo. O processo de imobilizao pode alterar a estrutura
do centro ativo inativando total ou parcialmente a enzima.
Geralmente os suportes polimricos insolveis para o acoplamento qumico de enzimas
contm grupos funcionais que aps ativao podem imobilizar o composto bioativo via um grupo
funcional especfico. Os principais grupos funcionais de suportes polimricos insolveis
utilizados no processo de imobilizao enzimtica so: hidroxilas (-OH), carbonilas (C=O),
carboxilas (CO(OH)) e aminas primrias (NH2).
Os grupos funcionais podem ser ativados quimicamente para imobilizao da enzima via
seu grupo NH2 funcional, mantendo a atividade enzimtica em nveis adequados para o
desenvolvimento de biossensores.
Cada suporte contendo um grupo funcional requer uma ativao especfica como pode ser
verificado na Figura 2.11.
(i) Hidroxilas
Suportes contendo hidroxilas podem ser ativados pela reao com cloreto cianrico e este se ligar
enzima por meio da reao entre o seu grupo funcional hidroxila e o grupo funcional amina da
enzima.
(ii) Carbonilas
Suportes ricos em grupos funcionais carbonlicos podem sofrer um processo de silanizao para
posterior complexao com glutaraldedo possibilitando, assim, reaes com as aminas
enzimticas.
(iii) Carboxilas
Suportes contendo carboxilas podem ser ativados com carbodiiminas e estas servirem de
complexo de ligao s enzimas.
(iv) Aminas primrias
Os suportes que contm grupos funcionais amina podem ser ativados pelo glutaraldedo que se
liga s enzimas pela reao entre os grupos funcionais aminas primrias e carbonilas.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

40

Figura 2.11- Ligao covalente da enzima (com agrupamento amina) na superfcie do eletrodo.
(A) Complexao com cloreto cianrico, (B) ligao covalente por silanizao,
(C) complexao com carbodiimina e (D) glutaraldedo.22

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41

2.7.2.2- Ligaes covalentes reticuladas


Reagentes bi ou multifuncionais, que podem originar unies intermoleculares entre as
molculas de enzima, so usados para reagirem com os aminogrupos livres contidos na cadeia
protica, havendo a formao de uma rede polimrica devido a formao de ligaes covalentes
cruzadas entre as molculas de enzima e ou um suporte com grupos funcionais. O agente mais
aplicado para este fim tem sido o glutaraldedo, por possuir baixa toxicidade e baixo custo
comparado aos demais reativos qumicos. O resultado um reticulado com ligaes
intermoleculares irreversveis capazes de resistir a condies extremas de pH e temperatura e a
solventes orgnicos (ver Figura 2.12). O reticulado possibilita enzima resistir desnaturao
por estar mais estvel estericamente. A maior desvantagem que muitas enzimas so sensveis ao
acoplamento qumico com glutaraldedo, podendo perder sua atividade por desnaturao.31

Figura 2.12- Acoplamento qumico de uma molcula de glutaraldedo a duas enzimas.22

Uma maneira de anlise da atividade de uma enzima, aps o processo de imobilizao


atravs de sua cintica.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

42

2.8- Cintica enzimtica


Admite-se que, inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversivelmente, formando
um composto intermedirio denominado complexo enzima-substrato que, por sua vez, ou se
decompe ou reage com outra substncia, regenerando a enzima e formando os produtos da
reao.32-33
A teoria da cintica enzimtica para sistemas com um nico substrato foi desenvolvida em
1913 por Michaelis e Menten, cujas fotos esto ilustradas na Figura 2.13.

Figura 2.13 Fotografias de Leonor Michaelis e Maud Menten.34


O estudo da velocidade da reao uma das maneiras de se compreender a bioqumica
das reaes catalisadas pelas enzimas. A velocidade da reao sofre forte influncia da
concentrao do substrato. Entretanto, estudar os efeitos da concentrao do substrato [S]
complicado devido ao fato deste variar durante o curso da reao, enquanto o substrato se
transforma em produto. Uma abordagem simplificada para o estudo da cintica de uma reao
enzimtica medir a velocidade inicial V0 quando [S] muito maior que a concentrao da
enzima [E]. Assim sendo, para um tempo curto, as variaes de [S] sero desprezveis. A
Figura 2.14 mostra o efeito de [S] sobre V0. O aumento de V0 aproximadamente linear para
baixas concentraes de substrato. A media que [S] cresce, V0 cresce a taxas cada vez menores,
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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

43

at alcanar um valor de [S] em que no existe variao significativa no valor de V0. Este valor
de V0 muito prximo da velocidade mxima, Vmx.

Figura 2.14- Efeito da concentrao de substrato na cintica enzimtica.35


O complexo ES formado, desempenha um papel fundamental para a compreenso do
comportamento cintico da reao. Michaelis e Maud Menten postularam que a ao enzimtica
se d em etapas, se iniciando pela rpida formao de um complexo reversvel enzima-substrato:
k1

E + S ES
k 1

(2.1)

A quebra do complexo ES liberando a enzima livre e o produto P, se d em uma segunda


etapa mais lenta, que representada pela reao:
k2

ES E + P
k 2

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(2.2)

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

44

A velocidade da reao enzimtica limitada pela segunda reao, uma vez que esta
ocorre mais lentamente. Sendo assim, a velocidade da reao deve ser proporcional a [ES]. A
relao entre [S] e V0 possui a mesma forma geral para todas as enzimas.
Segundo Michaelis e Menten a forma matemtica desta relao, foi descrita considerando
a hiptese bsica de que, no estado estacionrio, a velocidade da reao limitada pela quebra do
complexo ES. Esta relao, denominada equao de Michaelis-Menten, a equao da
velocidade de uma reao enzimtica com um nico substrato, e dada pela relao a seguir:

V0 =

Vmx [ S ]
km + [S ]

(2.3)

onde km denominada constante de Michaelis-Menten sendo expressa por:

km =

(k1 + k2 )
k1

(2.4)

A velocidade inicial V0, a velocidade mxima Vmx, e a concentrao do substrato [S],


esto relacionados pela constante de Michaelis-Menten. A constante de Michaelis, Km, ento
definida como a concentrao do substrato em que, a uma dada concentrao de uma enzima,
produz a metade de sua velocidade mxima. Esta constante km permite a avaliao da afinidade
de uma enzima por um substrato.

V0 =

Vmx
2

(2.5)

Ao substituir a Equao 2.5 na equao de Michaelis-Menten e dividindo por Vmx,


obtemos:
1
[S ]
=
2 km + [S ]

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(2.6)

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

45

Chega-se concluso que:


k m = [S ]

(2.7)

Deste modo, Km pode ser definido como sendo a concentrao de substrato quando V0
equivale a 1/2 Vmx. Logo, a equao de Michaelis-Menten pode ser linearizada
matematicamente, de modo a permitir a determinao experimental de km e Vmx atravs de
mtodos grficos. Uma simples transformao a inverso da equao, da seguinte forma:
1 K m + [S ]
=
V0 Vmx [ S ]

(2.8)

A partir de transformaes matemticas simples, esta equao pode ser descrita da


seguinte forma:
K 1
1
1
= m
+
V0 Vmx [ S ] Vmx

(2.9)

A equao de Lineweaver-Burk obtida atravs da linearizao da equao de MichaelisMenten que permite obter experimentalmente os valores de km e Vmx, atravs de uma curva 1/V0
versus 1/[S], como ilustrado na Figura 2.15.

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46

Figura 2.15- Linearizao da equao de Michaelis-Menten por Lineweaver-Burk.


Em biossensores amperomtricos pode-se escrever a equao eletroqumica de MichaelisMenten como a relao entre a concentrao de substrato e a corrente emitida, obtendo-se assim
o valor de concentrao do hemometablito a ser analisado.
A velocidade da reao enzimtica pode ser reduzida pela desnaturao da enzima, que
consiste, para as enzimas globulares, no desenovelamento da cadeia polipeptdica, causando sua
perda de atividade. A temperatura, o grau de acidez, a concentrao de sais e outros fatores
ambientais podem afetar a estrutura espacial das protenas, fazendo com que as molculas se
desenrolem e percam sua configurao original.
No projeto de biossensores, importante encontrar um mtodo adequado de imobilizao
para que se tenha alta atividade enzimtica e melhor estabilidade, evitando o processo de
desnaturao. Ao mesmo tempo, matrizes polimricas com elevado grau de funcionalidade tem
despertado a ateno de inmeros pesquisadores.
De acordo com a literatura, os polmeros sintticos constituem a classe mais importante de
materiais utilizados no desenvolvimento de suportes para imobilizao de enzimas. fato
conhecido, que os polmeros so ricos em grupos funcionais que podem ser convenientemente
ativados para o processo de imobilizao.

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

47

Neste trabalho, de particular interesse a utilizao de dendrmeros, uma nova classe de


materiais polimricos, no desenvolvimento de biossensores de hemometablitos tais como
glicose, colesterol e uria. As propriedades biomimticas e a elevada densidade de grupos
funcionais na periferia fazem dessa macromolcula um atraente sistema para o projeto de
biossensores.

2.9- Aplicaes das enzimas em biossensores


2.9.1- A enzima glicose oxidase (GOx)
A glicose oxidase uma enzima que catalisa a oxidao da -D-glucose com formao de
d-gluconolactona. A enzima contm um grupo prosttico, a flavina adenina dinucletido (FAD),
que confere protena a capacidade para catalisar reaes de oxidao-reduo.
A reao d-se em dois passos, no primeiro dos quais a coenzima oxidada sofre uma
reduo a FADH2, que acompanhada pela oxidao da -D-glucose a d-gluconolactona. No
segundo passo a flavina reoxida-se por ao de oxignio, que, por sua vez, se converte em
perxido de hidrognio (ver Figura 2.16).

Figura 2.16- Ilustrao da reao catalisada pela enzima glicose oxidase.22

A atividade da glicose oxidase,36 extrada do Aspergillus niger foi primeiramente relatada


por Mller em 1922. A partir de ento, esta enzima tem sido extrada e purificada desse fungo.37

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

48

A Figura 2.17 representa a simulao computacional da molcula GOx atravs de um


modelo de fitas. Observa-se em vermelho o stio ativo desta enzima, no qual a FAD est contida.

Figura 2.17- Ilustrao da estrutura da enzima glicose oxidase, na forma de fitas. O FAD est
representado pela regio vermelha.38
Em virtude da sua elevada especificidade, a glicose oxidase, utilizada como elemento
biocataltico para se medir os nveis de acar no sangue, seja atravs de testes colorimtricos ou
sensoriais.25-39

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49

2.2.2- A enzima colesterol oxidase (COx)


Turfitt, em 1994, foi o primeiro a isolar a enzima, a partir do micrbio Nacordia
erythropolis e demonstrar seu efeito na oxidao do colesterol.40 Desde ento, a enzima foi
encontrada e isolada a partir de um grande nmero de microorganismos, em especial a partir da
Arthrobacter, Corynebacterium, Nacordia erythropolis, Mycobacterium, Pseudomonas e
Rhodococcus sp., entre outros. Alguns microorganismos estocam a enzima em membranas
intracelulares, enquanto outros a dispersam em seu meio de cultivo.
Cerca de 70% do colesterol existente no plasma sanguneo se encontra na forma
esterificada. Assim, o procedimento tpico para determinao do colesterol total geralmente se
inicia pela quebra dos steres de colesterol pela enzima colesterol estearase, produzindo
colesterol livre e cidos graxos. As molculas de colesterol podem ento sofrer a ao da enzima
colesterol oxidase, produzindo 4-colesten-3-ona e perxido de hidrognio, como ilustrado na
Figura 2.18.40

Figura 2.18- Ilustrao da reao catalisada pela enzima colesterol oxidase.35

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

50

A colesterol oxidase (COx) pode ser sintetizada atravs de uma grande variedade de
microorganismos,

em

ambientes

completamente

distintos.

Algumas

linhagens

de

microorganismos so capazes de promover a oxidao do colesterol a taxas superiores a 70%.


O custo da enzima colesterol oxidase se mantm relativamente alto devido,
principalmente, baixa produtividade dos microorganismos e pela necessidade de adio de
colesterol ao meio de cultura para induzir o aumento da produo da enzima.
As propriedades fsicas da COx variam de acordo com o microorganismo de origem. Em
geral a atividade da COx tima temperatura de 37 C e pH neutro em soluo aquosa.
Dependendo da origem, a COx pode apresentar melhor estabilidade trmica e atividade tima em
intervalos de pH entre 4 e 10.
A COx uma macromolcula de alto peso molecular, em torno de 60 kDa, com um
pequeno centro ativo localizado nas proximidades do centro da estrutura. O centro ativo contm
um cofator, que um colaborador no protico necessrio para a atividade enzimtica. Na COx o
cofator constitudo por Flavina Adenina Dinucletideo (FAD). A estrutura da COx
apresentada pela Figura 2.19.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

51

Figura 2.19- Ilustrao da estrutura da enzima colesterol oxidase, na forma de fitas.38


2.2.3- A enzima urease
A enzima foi primeiramente isolada na forma cristalina, mas isto foi compreendido
melhor quando Summer em 1926 isolou urease de feijo e evidenciou que estes cristais consistem
em protenas.
A Uria, principal produto do catabolismo das protenas e aminocidos, tem sua
concentrao srica afetada pela dieta e pelo estado de hidratao, constituindo uma indicao
grosseira do estado da funo renal. A urease um enzima que catalisa a hidrlise da uria em
dixido de carbono e amnia. A reao apresentada a seguir:

(NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3

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Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

52

Os valores aumentados da uria plasmtica so classificados como:


(i) Causa pr-renal, resultante de defeitos de excreo observado na descompensao cardaca,
choque hemorrgico, desidratao aguda, catabolismo protico elevado (queimaduras, febre).
(ii) Causa renal, como conseqncia de doena renal aguda ou crnica (glomerulonefrite,
pielonefrite, necrose tubular) com diminuio da filtrao glomerular podendo ser observado
nveis plasmticos de uria de 300 mg/dL ou mais.
(iii) Causa ps-renal, geralmente resultante de uma obstruo do trato urinrio, pode ocorrer nas
litases renais, nos tumores por compresso da bexiga.
A diminuio da uria srica, ocorre apenas em poucas situaes, como na insuficincia
heptica aguda, na inanio, no ltimo trimestre da gravidez.
Ureases (EC 3.5.1.5) catalisam a reao de hidrlise da uria duas molculas de amnia
e dixido de carbono. As ureases vegetais so hexmeros ou trmeros de uma subunidade de
aproximadamente 90 kDa, com 2 tomos de nquel por subunidade. A Figura 2.20 ilustra a
estrutura da enzima urease na forma de fitas.

Figura 2.20- Ilustrao da estrutura da enzima urease na forma de fitas.38


Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

53

fato conhecido que as enzimas reduzem significativamente a barreira energtica de uma


reao, porm, sua utilizao na forma pura muitas das vezes inviabiliza o processo dado seu
elevado custo. Sendo assim, a opo pode ser a imobilizao da enzima em suportes insolveis, o
que possibilita sua reutilizao vrias vezes. A reutilizao de biocatalizadores reduz
significativamente o custo do processo.
Em meio sculo de pesquisas e desenvolvimento de processos tecnolgicos, vrias
tcnicas foram desenvolvidas para a imobilizao de enzimas. O objetivo de um processo de
imobilizao reduzir o custo da enzima viabilizando o processo tecnolgico e aumentar a
estabilidade frente s flutuaes de temperatura no processo.
Desde o desenvolvimento do primeiro biossensor, em 1962, diversos outros foram
construdos utilizando diferentes enzimas e procedimentos de imobilizao. Apresentam
caractersticas importantes, tais como seletividade, baixo custo e facilidade na construo,
potencial para miniaturizao, resposta rpida, potencial de automao e construo de
equipamentos simples e portteis.1
O desenvolvimento de tcnicas de imobilizao tem sido importante por proporcionar a
reutilizao das enzimas, aumentar a estabilidade, reduzir custos e aumentar, em alguns casos, a
atividade enzimtica. Esses fatores dependem principalmente da escolha apropriada do suporte e
dos reagentes utilizados no processo de imobilizao.2-9

2.10- Consideraes parciais


A elevada aplicabilidade da atividade enzimtica acrescida sua eficincia cataltica e
especificidade, permitem sua aplicao em processos analticos da medicina clnica.
Atualmente, o nmero de enzimas conhecidas e caracterizadas quimicamente se aproxima
do valor de 2000. Porm o nmero de enzimas que so produzidas e aplicadas industrialmente em
grandes quantidades, no ultrapassa mais de duas dezenas. Sendo assim, torna-se necessrio um
estudo avanado das enzimas e suas condies timas de atuao.
Em vista do exposto, conclui-se que a estrutura qumica ntegra das protenas com
atividade cataltica determinante para a atuao dos biocatalizadores. Porm, fatores externos
que alteram a conformao protica, e, portanto, a velocidade das reaes enzimticas permitem
a modulao das reaes metablicas dos seres vivos.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas

54

No processo de desenvolvimento de biossensores, a deciso pelo melhor mtodo de


imobilizao est diretamente ligada performance do biossensor. Quanto maior for a atividade
enzimtica aps a imobilizao, maior ser a estabilidade e a sensibilidade do biossensor. A
escolha do suporte para imobilizao do biocatalizador constitui em uma tarefa importante para o
desenvolvimento do dispositivo clnico.
O desenvolvimento de sistemas macromoleculares que possam funcionar como
nanoplataformas para a imobilizao de enzimas desempenha um papel importante no presente
sculo. Os sistemas macromoleculares arborescentes tm atrado a ateno de importantes grupos
de pesquisa mundiais. O prximo captulo desta dissertao aborda algumas propriedades de tais
sistemas.

2.11- Referncias
[1] BROCK, T. Biology of Microorganisms. Pretice-Hall Inc. Industrial Microbiology, cap.12,
1997.
[2] STRYER, L.; BERG, M.J.; TYMOCZKO, L.J. Bioqumica. Guanabara Koogan, 2002.
[3] LEHNINGERR, L.A. Bioqumica 1. Edgar Blcher, 1976.
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Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

58

Captulo 3- Plataformas nanoestruturadas


3.1 O desenvolvimento dos dendrmeros
Dendrmeros so macromolculas monodispersas, altamente ramificadas, apresentando
estruturas bem definidas e um peso molecular uniforme. Esta classe de compostos tem recebido
grande ateno dos pesquisadores nestes ltimos anos devido particularidade de suas
propriedades fsicas e qumicas.1-2
Os dendrmeros eram originalmente conhecidos como molculas cascata, nas duas ltimas
dcadas houve uma grande evoluo na qumica dos dendrmeros, mas a grande evoluo deu-se
nos anos 90. Hoje j existe uma grande variedade de dendrmeros, tanto em nmeros de ncleos
iniciadores, ou seja, a molcula central ou o ncleo do dendrmero, como nos ramos e bem como
as unidades finais.
O termo dendrmero, deriva do grego dendron (rvore) e meros (parte ou frao).
Descreve uma arquitetura de uma nova classe de molculas; estas fundamentalmente so
formadas por um ncleo que uma molcula qual se liga os ramos. Estas molculas so
altamente ramificadas, mas so tambm altamente simtricas, em geraes muito altas, a partir da
quarta gerao especialmente, elas tendem a ter uma estrutura em forma de uma esfera, devido s
interaes entres as cadeias (Figura 3.1).

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

59

Figura 3.1- Ilustrao estrutural de um dendrmero GnPZn, n=4 (quarta gerao).3


Os dendrmeros so caracterizados por estruturas quase esfricas, tamanhos nanomtricos,
grande nmero de subgrupos funcionais reativos e espaos interiores protegidos. Esta
combinao nica de propriedades torna-os perfeitos para aplicaes em diferentes reas da
qumica e medicina.
Essas macromolculas tridimensionais possuem pontos de ramificao em cada unidade
monomrica que so capazes de reproduzir estruturas com definidos nmeros de geraes e
grupos funcionais terminais. Elas apresentam, ainda, elevado controle do peso molecular e da
forma, o que proporciona a sntese de micelas unimoleculares.
Os dendrmeros so fundamentados na aplicao de progresses matemticas para a
sntese orgnica e, como tais, possuem uma topologia molecular bem definida.
Conhecidos como polmeros altamente ramificados, os dendrmeros diferenciam-se dos
polmeros normais devido s suas ramificaes serem altamente regulares e a macromolcula ser
bastante simtrica.
A Figura 3.2 ilustra uma comparao entre a estrutura de polmeros clssicos e a estrutura
de um dendrmero. Pela figura percebe-se que os dendrmeros possuem uma estrutura bem
definida com um alto grau de simetria e altamente organizada, apresentam um ncleo central e
possuem muitos grupos funcionais perifricos. Alm disso, so macromolculas sintticas,
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

60

monodispersas, com elevado peso molecular, elevada rea superficial e tamanho nanomrico, ao
contrrio dos polmeros lineares. Este tipo de molcula possui superfcies e interfaces altamente
controladas e apresenta cavidades internas, o que permite, por exemplo, o encapsulamento de
molculas hospedeiras bioativas.4-5

Figura 3.2 (a) Estruturas polimricas clssicas. (b) Estruturas dendrticas.6


O processo de polimerizao clssico, o qual resulta em polmeros lineares, usualmente
randmico em natureza e produz molculas com um elevado ndice de polidisperso, enquanto o
tamanho e a massa molecular dos dendrmeros podem ser especificamente controlados durante a
sntese.
Estas molculas crescem a partir de um ncleo (designado Gerao 0) e cada conjunto de
unidades monomricas adicionadas so designadas por Gerao (Figura 3.3). Esta adio torna
cada gerao mais ramificada que a anterior at se obter uma estrutura globular e densa.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

(A)

61

(B)

Figura 3.3- Esquematizao do crescimento em geraes do dendrmero PAMAM.7


Com a introduo de novos domnios cientficos, no entendimento da topologia molecular
e orientao de grupos funcionais, possvel estabelecer esforos no sentido de atuar em dois
extremos da sntese orgnica. O estudo da qumica supramolecular, e, em particular a qumica
dendrimrica, podendo constituir um mtodo til na resoluo de novos problemas sintticos.8-9

3.2- Histrico sobre a Sntese dos Primeiros Dendrmeros


A primeira tentativa de sntese de dendrmeros foi feita por Vgtle em 1978, que aplicou
este conceito na sntese de aminas com baixo peso molecular.10-11-12 Na sntese utilizada
exaustivamente a adio tipo Michael, seguida de uma reduo dos grupos nitrilos a aminas
primrias, como apresentada na Figura 3.4.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

62

Figura 3.4- Primeira tentativa de sntese de um dendrmero pela rota divergente.13

No entanto, esta sntese encontrou problemas na reduo dos grupos nitrilos. Assim o
processo s podia ser repetido duas vezes, por isso s dava aminas disubstitudas, e o rendimento
era muito baixo.
Tomalia sintetizou pela primeira vez dendrmeros

14

, acidentalmente, quando em seu

laboratrio com os colaboradores sintetizava, atravs de um processo padro, polmeros de


cadeias lineares chamados poliamidoaminas, em que um certo dia adicionou metanol aos
reagentes iniciais, embora que pelo processo tradicional no seja requerido, com o objetivo de
facilitar a agitao da mistura reacional. Mas Tomalia no estava espera que o metanol alterase
as substncias nesta reao quimicamente. O resto do processo de polimerizao foi igual,
introduzindo na mistura os dois monmeros: o acrilato de metila e o etileno diamina.
Normalmente os dois monmeros formam cadeias longas, ligando-se entre eles na razo
de um para um, mas a molcula formada naquele dia, no era linear e consistia na ligao de dois
grupos acrilato de metila a um de etileno diamina. Neste caso o metanol afetou a reao,
aparentemente, facilitou a remoo dos hidrognios dos tomos de azoto no etileno diamina e
permitiu o acrilato de metila se ligar aos azotos.
Tomalia imaginou ento um sistema molecular que crescia com resultado em grandes
estruturas simtricas construdas por etapas. Ou seja, o dendrmero era construdo por um ncleo
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

63

iniciador, e que se juntava a uma segunda molcula linear, produzindo assim os ramos do
dendrmero.15
Esta bsica aproximao teve resultado na criao de uma nova classe de arquitetura
polimrica, os monmeros. Estes, por sua vez, esto ligados entre eles e os ramos ligados
concentricamente a uma simples molcula (ncleo iniciador), criando assim, uma estrutura em
trs dimenses, que em geraes muito altas, devido s interaes entre os ramos, podem ser
esfricas.
A partir desta primeira sntese acidental, Tomalia ajustou as propriedades de sntese,
usando duas operaes repetidamente, utilizando como ncleo iniciador uma molcula de
amnia. A esta molcula de amnia foi adicionado metanol suficiente para facilitar a substituio
dos hidrognios da amnia pelo acrilato de metila, e assim criar um dendrmero de gerao zero.
Em seguida adicionou-se o segundo monmero, que respectivamente etileno diamina, que ataca
livremente as trs molculas do monmero adicionado anteriormente, obtendo-se assim o
dendrmero de 1 gerao. Depois os dois hidrognios do azoto do etileno diamina so
substitudos novamente pelo acrilato de metila, obtendo-se um dendrmero de 2 gerao. E assim
sucessivamente at se obter o dendrmero pretendido, ou de gerao pretendida, como mostra a
Figura 3.5.

Figura 3.5- Representao esquemtica do crescimento dendrimrico pela rota divergente.16

A partir da divulgao da sntese deste dendrmero, apareceram muitos outros


investigadores a publicar trabalhos a cerca da sntese deste novo tipo de molcula.
A uniformidade molecular dos dendrmeros, a sua superfcie multifuncional, bem como a
presena de cavidades internas, fazem dessas macromolculas sistemas interessantes para uma
vasta rea de aplicaes.17-18
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

64

Macromolculas com estrutura dendrtica so sistemas isomoleculares cuja estrutura


tridimensional tem atrado a ateno de muitos grupos de pesquisa com relao ao projeto de
biossensores para aplicaes clnicas como pode ser visto pela Figura 3.6.
A estrutura mimetizante de protenas globulares bem como sua elevada rea superficial
tornam os dendrmeros sistemas macromoleculares atraentes para o projeto de biossensores
enzimticos. Enzimas imobilizadas em superfcies dendrimricas possuem um alto grau de
orientao em relao matriz polimrica na qual o dendrmero ser ligado, possibilitando a
exposio de um maior nmero de stios ativos na superfcie do polmero conjugado.

1200

Nmero de publicaes

1000
800
Nmero de
publicaes

600
400
200
0
1998

2000

2002 2004
Ano

2006

2008

Figura 3.6- Nmero de publicaes na rea de dendrimeros nos timos dez anos. Fonte: Scielo.

3.3- Os dendrmeros e suas propriedades 1-19


Devido sua arquitetura molecular, os dendrmeros apresentam uma melhora significativa
em suas propriedades fsicas e qumicas quando comparados aos polmeros lineares tradicionais.
Dentre as propriedades dos dendrmeros, podemos mencionar as que mais se evidenciam;
(i) Em soluo, os polmeros de cadeias lineares so flexveis enquanto que os
dendrmeros formam esferas concntricas.
(ii) Solues de dendrmeros possuem uma viscosidade significativamente menor que os
polmeros lineares e, esta, uma das propriedades mais importantes dessas macromolculas. A
viscosidade aumenta com o aumento do nmero de monmeros, mas a partir de uma certa
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

65

gerao (em geral, a partir da gerao 4), a viscosidade volta a diminuir, de tal forma que os
dendrmeros de gerao mais alta apresentam mais grupos terminais, porm menor viscosidade
que os dendrmeros de gerao mais baixa. Este comportamento diferente dos polmeros
lineares. Afinal, para polmeros clssicos a viscosidade intrnseca aumenta continuamente com a
massa molecular.
(iii) O nmero de grupos funcionais na superfcie da macromolcula determina a gerao
do dendrmero.
(iv) A presena de muitas cadeias terminais responsvel por uma alta solubilidade,
micibilidade e reatividade dos dendrmeros. A sua solubilidade fortemente influenciada pela
natureza dos grupos da superfcie. Os dendrmeros terminais em grupos hidroflicos so solveis
em solventes polares enquanto os dendrmeros terminais com grupos hidrofbicos so solveis
em solventes apolares.
(v) A massa molar, M, dos dendrmeros pode ser descrita pela seguinte relao
matemtica:

nG 1
+ M t nmG
M = M C + nC M m m
nm 1

(3.1)

sendo Mc a massa molar do ncleo, Mm a massa molar do monmero ramificado, Mt a massa


molar do grupo terminal, nc a multiplicidade do ncleo, nm a multiplicidade da ramificao e
G o nmero de gerao.
(vi) O aumento do nmero de grupos terminais descrito por uma progresso geomtrica:
Z = nC .nmG

(3.2)

Sendo nc a multiplicidade do ncleo, nm a multiplicidade da ramificao e G o nmero de


gerao.
(vii) O peso molecular mdio e a polidisperso de dendrmeros so dois parmetros muito
importantes para a determinao e explicao do comportamento fsico desses sistemas
macromoleculares. Dendrmeros de peso molecular muito baixo geralmente apresentam uma
menor rea superficial, o que indesejvel para o projeto de biossensores. J as macromolculas
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Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

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de peso molecular muito elevado so pouco solveis e, por isso, geralmente no possvel
utiliz-los no revestimento de superfcies sintticas.
(viii) A capacidade de encapsulamento de molculas na macromolcula interior uma das
propriedades nicas que os dendrmeros apresentam devido a sua forma globular e a presena de
cavidades internas.

3.4 A sntese de macromolculas dendrticas


A sntese de macromolculas com estrutura dendrtica envolve uma reao de
policondensao controlada que utiliza uma estratgia sinttica repetitiva.20-21 Desta maneira
possvel um controle do peso molecular e do tamanho da macromolcula, o que produz polmeros
isomoleculares.
A preparao de dendrmeros pode ser efetuada de duas maneiras distintas, seguindo uma
rota divergente ou convergente de sntese.1-18-20 Ambas as maneiras fornecem estruturas
altamente simtricas, hiper-ramificao, elevado grau de funcionalizao terminal e
monodisperso.21-22
O mtodo divergente envolve o crescimento a partir de um ncleo central, onde as
ramificaes so justapostas atravs de etapas sintticas repetitivas. Este mtodo caracterizado
por reaes que ocorrem por um aumento do nmero de stios reativos, como se o dendrmero
estivesse sendo construdo de dentro para fora. O procedimento geral ilustrado pela Figura 3.7.
O mtodo de sntese divergente apresenta como principais inconvenientes as reaes
incompletas dos grupos terminais, que introduzem defeitos na macromolcula. Para impedir a
formao de defeitos, normalmente se utilizam grandes quantidades de precursores, o que
dificulta a purificao do produto final.23
A sntese pelo mtodo convergente principia pelo que gerar a superfcie externa da
macromolcula, ou seja, pelas ramificaes. O princpio bsico do mtodo envolve a construo
de pequenos fragmentos denominados dendrons que sofrem policondensao e constituem o
ncleo central e que evoluem para a formao final do dendrmero. O mtodo convergente
ilustrado a seguir pela Figura 3.8. O monmero de partida contm um grupo reativo de um lado
da subunidade estrutural e um grupo terminal na outra extremidade formando, na gerao final, a
camada externa do dendrmero. Esse fragmento pode, ento, reagir com grupos reativos da
unidade de repetio, que tambm contm stios protegidos. Depois da converso para um novo
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Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

67

grupo reativo a sntese pode ser continuada por reao com uma segunda unidade de repetio. A
repetio do ciclo de reao leva construo de grandes dendrons. A reao dos dendrons
desprotegidos com grupos reativos de um ncleo terminal constitui o dendrmero final.19-24
Embora a formao de defeitos no dendrmero seja minimizada na rota sinttica
convergente e a purificao do produto final seja mais fcil relativamente rota sinttica
divergente, o impedimento estrico, causado pelos grupos volumosos na periferia do dendrmero,
impede a obteno de sistemas de elevadas geraes.24

Figura 3.7- Representao esquemtica de um dendrmero segundo o mtodo divergente.1

Figura 3.8- Representao esquemtica da sntese de um dendrmero pelo mtodo convergente.1

3.5- Dendrmeros estudados neste trabalho: CHD, PGLD e PPID


Os dendrmeros para que sejam considerados suportes ideais para utilizao como
biossensor, devem possuir caractersticas que no interfiram na atividade da enzima a ser
imobilizada. A macromolcula dendrtica deve possuir alta funcionalidade, o que facilita o
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Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

68

procedimento de imobilizao da enzima; baixo custo e possuir boas propriedades de


biocompatibilidade. Estas caractersticas so atraentes devido ao fato que dendrmeros em escala
nanomtrica, frequentemente exibem propriedades fsicas e qumicas ideais para utilizao como
plataformas para a imobilizao de biocatalizadores. Tais caractersticas podem influenciar
significativamente na resposta do dispositivo sensor.
Neste trabalho, foram estudados trs diferentes tipos de dendrmeros utilizados como
nanoplataformas para imobilizao de enzimas a saber: PGLD, PPID e CHD.
O grupo de biomateriais da Unifei tem se empenhado recentemente na sntese e
caracterizao de dendrmeros bioativos que possam ser utilizados em biossensores ou como
sistemas de liberao controlada de frmacos. Neste sentido, dendrmeros de poliglicerol
(PGLD), dendrmeros de quitosana (CHD) e poli(propileno imina) foram sintetizados,
purificados e caracterizados por diversas tcnicas fsico-qumicas.19-25
O dendrmero de PGLD foi estudado quanto s suas propriedades hemocompatveis,
sendo comprovado que este material possui baixa adsoro de fibrinognio, e elevada adsoro
de albumina e no ativa as plaquetas de sangue. Tais caractersticas incentivam a utilizao deste
material no desenvolvimento de biossensores, em especial os biossensores implantveis. A Figura
3.9 ilustra a estrutura do dendrmero PGLD.

Figura 3.9 Estrutura do poliglicerol dendrtico de gerao 4 (PGLD G4).

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Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

69

O dendrmero de quitosana (CHD) foi sintetizado com a finalidade de se obter um


material para imobilizar as enzimas. No entanto, deve-se precaver de que a atividade destas
enzimas no sofram um decaimento em funo da imobilizao. Neste sentido, o dendrmero de
quitosana demonstra ser um material atrativo para aplicaes em biossensores.A Figura 3.10
ilustra a estrutura do dendrmero CHD.

Figura 3.10- Estrutura do dendrmero de quitosana (CHD).


O dendrmero poli(propileno imina) (PPID) por possuir elevada funcionalidade dos
grupos terminais apresentando tambm uma alta densidade de grupos aminas (-NH2), surge como
um material promissor para aplicaes mdicas. Os grupos funcionais deste dendrmero podem
ser modificados em uma segunda etapa sinttica e usados como stio para imobilizao de
compostos bioativos. A Figura 4.8 ilustra a estrutura do dendrmero PPID.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

70

Figura 3.11- Representao das arquiteturas do dendrmero PPID.


3.6- Consideraes parciais
Os dendrmeros como materiais do sculo XX tm se tornado um importante campo
interdisciplinar na atual cincia dos polmeros. A sntese de dendrmeros permite gerar
arquiteturas moleculares similares s observadas em sistemas biolgicos e, devido a isso, essas
macromolculas so conhecidas como protenas artificiais. Por isso, as propriedades biolgicas
dos dendrmeros so de extrema importncia para suas aplicaes biomdicas.
Muitas aplicaes potenciais de dendrmeros so baseadas em sua uniformidade
molecular, superfcie multifuncional e presena de cavidades internas. Essas propriedades
especficas tornam os dendrmeros apropriados para uma variedade de aplicaes de alta
tecnologia, incluindo aplicaes biomdicas e industriais.
Os dendrmeros estudados neste trabalho fazem parte dessa classe de materiais versteis e,
por isso, apresentam um futuro promissor na rea de aplicaes biomdicas. Devido presena
de grupos funcionais perifricos, estes dendrmeros podem ser aplicados como agentes
imobilizadores de enzimas para fabricao de biossensores. Entretanto, tais sistemas so isolantes
e a utilizao de sistemas mediadores de eltrons de fundamental importncia para sua
utilizao como dispositivos biossensores.
O captulo seguinte abordar sistemas mediadores de eltrons que auxiliam no processo
de transio de eltrons entre o eletrodo e a nanoplataforma dendrtica na qual a enzima foi
imobilizada.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

71

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Captulo 3 Plataformas nanoestruturadas

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Itajub. Orientador: Prof. Dr. lvaro A.A. de Queiroz.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

73

Captulo 4- Mediadores de eltrons


4.1- O mecanismo de ao das enzimas e o processo de mediao de eltrons
As enzimas so protenas especializadas na catlise de reaes biolgicas. Elas esto
entre as biomolculas mais notveis devido a sua extraordinria especificidade e poder
cataltico, que so muito superiores dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente
todas as reaes que caracterizam o metabolismo celular so catalisadas por enzimas.
No mecanismo de catlise enzimtica h o uso de substratos, que so compostos que
vo reagir quimicamente. Sendo a enzima o catalisador que far com que a reao se d mais
facilmente; e por fim o produto o composto que se ir formar na reao.
Como catalisadores celulares, as enzimas so extremamente versteis, acelerando a
velocidade de uma reao, sem no entanto participar dela como reagente ou produto. As
enzimas atuam ainda como reguladoras de um conjunto complexo de reaes. Sendo portanto,
consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. So catalisadores biolgicos
extremamente eficientes e aceleram em mdia 109 a 1012 vezes a velocidade da reao,
transformando de 100 a 1000 molculas de substrato em produto por minuto de reao.
Atuam em concentraes muito baixas e em condies suaves de temperatura e pH. Possuem
todas as caractersticas das protenas. Podem ter sua atividade regulada e esto quase sempre
dentro da clula, e compartimentalizadas.
As

enzimas oxidorredutases

como as desidrogenases

e as oxidases

so

biocatalizadores que catalisam reaes de transferncia de eltrons, ou seja, reaes de oxireduo tal como ilustrado na Figura 4.1.

Figura 4.1- Mecanismo de funcionamento das enzimas.1


Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

74

4.2- Sistemas utilizados como mediadores de eltrons


Durante dcadas uma das principais preocupaes na construo de biossensores
amperomtricos centralizou-se na velocidade de transferncia de eltrons do stio ativo da
enzima para a superfcie do eletrodo.2-3 Isto pe-se claramente em evidncia, quando observase todas as transformaes atravs das quais os biossensores tem passado, a procura de uma
maior seletividade e eficincia na transferncia de eltrons. Os biossensores da primeira
gerao, baseados na eletroatividade do substrato ou produto da reao enzimtica,
apresentavam problemas de interferncias devido necessidade de potenciais muito altos.4 Na
tentativa de diminuir estes potenciais, surgiram os biossensores de segunda gerao, onde o
emprego de mediadores de eltrons, tinham como funo o transporte (shuttling) de eltrons
entre a enzima e o eletrodo.4
Um mediador de eltrons uma substncia de baixa massa molecular com
propriedades redox que, numa primeira etapa, interage com o substrato ou produto de uma
determinada reao e, ento se difunde at a superfcie do eletrodo de trabalho, onde sofre
uma transferncia de eltrons rpida sob um potencial substancialmente menor quele
necessrio para a eletrooxidao ou reduo de um analito.5-6
Em um biossensor, o mediador de eltrons imobilizado na matriz polimrica,
juntamente com a enzima, e tem a funo de promover a reduo cataltica do perxido de
hidrognio gerado a partir da reao bioqumica. Os eltrons produzidos pela reduo do
perxido de hidrognio, atravs do mediador, so elevados superfcie do eletrodo. Alguns
dos mediadores de eltrons comumente utilizados de acordo com a literatura so o polipirrol e
a polianilina.7-8-9
Recentemente, Schreyer e Mikkelsen,10 divulgaram a sntese de uma cistena oxidase
artificial, a qual apresentou atividade para a oxidao dos tiis, cistena e glutationa. Esta
enzima artificial consiste de um anel -Ciclodextrina (-CD, formado por sete molculas de
glicose) no qual foi ligado covalentemente um grupo derivado ferroceno,11 habitualmente
usado como mediador de eltrons na construo de biossensores enzimticos de segunda
gerao.12
No sentido de diminuir-se os potenciais na determinao eletroqumica direta de GSH
(glutationa), eletrodos de carbono quimicamente modificados com mediadores de eltrons tm
sido avaliados, no intuito de minimizar possveis interferentes principalmente em amostras
biolgicas.13 Neste sentido, eletrodos de carbono quimicamente modificados com ftalocianina
de cobalto14-15 foram empregados na eletrooxidao de GSH. GSH e cistena foram
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

75

eletrocataliticamente oxidadas em eletrodos de grafite modificados com tetraciano-pquinodimetanotetrahidro-fulvaleno e 1,1-dimetilferroceno16. Derivados de rutnio (III)17-18
tambm foram empregados em algumas determinaes voltamtricas como mediadores de
eltrons na deteco de tiis incluindo a glutationa. Outros sistemas mediadores de eltrons
frequentemente utilizados so o ferricianeto de potssio e ferricianeto de sdio.

4.3- Polmeros condutores como mediadores de eltrons


A utilizao de polmeros condutores como mediadores de eltrons, tm atrado a
ateno de vrios pesquisadores. Os polmeros intrinsecamente condutores (ICP intrinsically conducting polymers) podem combinar as propriedades mecnicas e a
processabilidade dos polmeros convencionais com um comportamento eltrico, tico e/ou
mecnico semelhantes ao de metais e semicondutores inorgnicos. Esta caracterstica
responsvel pelo enquadramento destes materiais na categoria dos referidos metais sintticos
ou metais orgnicos.19- 20-21-22
At meados dos anos 1970 os polmeros se destacavam na rea de materiais pelas suas
boas capacidades de isolamento eltrico e de versteis propriedades mecnicas. O primeiro
polmero condutor foi obtido em 1977 atravs da exposio de poliacetileno sob a forma
isolante, na presena de agentes dopantes, oxidantes ou redutores, tornando-o um ICP.23
Entretanto, aps a descoberta da alta condutividade do poliacetileno dopado em 1977
os polmeros comeam a adquirir o status de materiais com propriedades eletrnicas.23 Tornase possvel alterar, reversivelmente, a condutividade eltrica desses materiais variando-a
desde um valor muito baixo (isolante), at valores tpicos dos metais.
Nos anos que se seguiram at os dias de hoje, dezenas de outros polmeros foram
sintetizados, apresentando comportamento isolante-condutor similar ao do poliacetileno.24
Dentre esses polmeros, os que tm sido mais amplamente estudados so as polianilinas, os
polipirris, os politiofenos, os poli(p-fenilenos) e os poli(p-fenilenivinilenos).24-25
Um exemplo da rpida evoluo desta rea foi o desenvolvimento, no comeo da
dcada de 1980, de uma bateria usando eletrodos polimricos, que serviu futuramente de base
para o desenvolvimento de baterias recarregveis.25 Atualmente, diodos, transistores, sensores
de gases, sensores qumicos e biolgicos, dosmetros, aplicaes em eletrnica biomolecular,
msculos artificiais, diodos emissores de luz, displays luminosos, clulas fotovoltaicas so
outros exemplos de aplicaes dos polmeros eletrnicos.26-27

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

76

Nesse contexto, o estudo e a caracterizao de filmes e sistemas orgnicos base de


polianilina (PANI) para aplicaes em dispositivos eletrnicos tm despertado grande
interesse tecnolgico.28-29 Isto ocorre pelo fato desse polmero apresentar, alm da
possibilidade de controle da sua condutividade eltrica por meio da exposio a solues
cidas ou bsicas, baixos custos de produo, solubilidade em diversos solventes orgnicos,
facilidades de processamento e de manufatura na forma de filmes finos e, finalmente,
estabilidades trmica, qumica e eltrica.30 Em outras palavras, propriedades fsico-qumicas e
caractersticas mecnicas e eltricas promissoras para o desenvolvimento de dispositivos
eletrnicos inovadores.
Um critrio importante na seleo de polmeros potencialmente condutores a
facilidade com que o sistema pode ser oxidado ou reduzido. Isto leva a escolha de polmeros
com instauraes conjugadas, que possuam baixo potencial de oxidao. Os eltrons de
carter podem ser facilmente removidos ou adicionados para formar um on polimrico, sem
a destruio das ligaes necessrias para a estabilidade da macromolcula.
Polmeros que possuem ligaes duplas e simples alternadas ao longo da cadeia
principal, apresentam eltrons , que se deslocam ao longo da mesma, sendo conhecidos
como polmeros conjugados.22 Os eltrons podem ser facilmente removidos ou adicionados
para formar um on polimrico, sem que ocorra a destruio das ligaes necessrias para a
estabilidade da macromolcula.31 Estes materiais podem ser facilmente oxidados ou reduzidos
atravs do emprego de agentes de transferncia de cargas (dopantes), resultando na obteno
de polmeros condutores. Desta forma, um critrio importante na seleo de polmeros
potencialmente condutores a facilidade com que o sistema pode ser oxidado ou reduzido.32
Os dopantes promovem a oxidao por meio de agentes aceptores de eltrons ou a
reduo pelo emprego de doadores de eltrons e, desta forma, convertem um polmero
isolante em condutor. A oxidao ou reduo da cadeia resulta na formao de um complexo
de transferncia de carga (CTC), que orienta os contra-ons ao longo da cadeia polimrica.32
Dentre os vrios mtodos para criar estados excitados, a dopagem qumica tem sido
amplamente utilizada para os polmeros conjugados.22
A conduo da corrente eltrica, isto , o transporte de eltrons ao longo do esqueleto
polimrico decorrente da excitao eletrnica do sistema conjugado, confere uma maior
rigidez cadeia, baixa solubilidade e elevadas temperaturas de fuso.32
A Figura 4.2 ilustra a condutividade, expressa em termos de ordem de grandeza, de
alguns polmeros dopados em comparao com materiais convencionais.33

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

77

Figura 4.2- Estudo comparativo entre os valores de condutividade eltrica, (S/ cm), de
materiais polimricos dopados com os de materiais convencionais.33

O poliacetileno ainda constitui o polmero que tem alcanado os mais elevados valores
de condutividade, igualando-se aos do cobre (105 S/cm). No entanto, pela instabilidade
trmica e ambiental, alm da m processabilidade do mesmo, decorrente da sua insolubilidade
e infusibilidade, outros polmeros condutores tm sido extensivamente investigados com o
objetivo de superar tais dificuldades.34 Por este motivo, a polianilina e polmeros derivados da
anilina tm recebido grande ateno nos ltimos anos pela sua estabilidade qumica
condies ambientais, fcil obteno e baixo custo de produo.32 Alm disso, a polianilina
atingiu recentemente condutividade da ordem de 104 S/cm para um polmero de alta massa
molar orientado uniaxialmente.
4.3.1- As Polianilinas
As polianilinas representam uma classe de polmeros, cuja composio qumica na
forma de base (no dopada) dada por uma frmula geral como segue na Figura 4.3.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

78

Figura 4.3- Frmula geral da polianilina (PANI).35

composta por y e (1-y) unidades repetitivas das espcies reduzidas e oxidadas,


respectivamente. O valor de y pode variar continuamente entre um para o polmero
completamente reduzido (contendo somente nitrognios amina) e zero, no caso do polmero
completamente oxidado (contendo somente nitrognios imina).35 Os diferentes graus de
oxidao da polianilina so designados pelos termos leucoesmeraldina, protoesmeraldina,
esmeraldina, nigranilina e pernigranilina quando y for igual a 1; 0,75; 0,5; 0,25; e 0,
respectivamente.
A polianilina forma uma nova classe de polmeros condutores porque pode ser dopada
por protonao, isto , sem que ocorra alterao no nmero de eltrons (oxidao ou reduo)
associado cadeia polimrica.35 Logo o nitrognio desta espcie pode estar total ou
parcialmente protonado para se obter o polmero na forma de sal, (forma dopada). A dopagem
qumica da polianilina na forma esmeraldina feita por protonao em soluo cida aquosa,
promovendo um aumento da condutividade de cerca de 10 ordens e grandeza ( =1-5 S/cm)
em relao a polianilina no dopada. O estado de oxidao esmeraldina e a forma na qual
aps dopagem, a PANI alcana os maiores valores de condutividade. O grau de protonao da
base depende do grau de oxidao que o polmero foi sintetizado, e do pH da soluo dopante.
A PANI pode ser obtida via sntese qumica com o uso de agentes oxidantes como
K2Cr2O7, H2O2, Cr2O4 ou KClO3, em meio cido (HCl, H2SO4, DBSA-cido dodecilbenzeno
sulfnico). Na eletrodeposio as molculas de anilina so oxidadas a filme de PANI no
anodo por uma corrente eltrica em meio cido. Os eltrons so removidos da cadeia
polimrica durante a oxidao e contra-ons, provenientes da dissoluo cida, na soluo so
inseridos para balancear a carga eltrica da cadeia. Os mtodos eletroqumicos oferecem
materiais com melhores propriedades de conduo em forma de filmes finos, devido a
dopagem do polmero ser unicamente eletroqumica, sendo que, a quantidade de carga usada
na reao determina seu grau de dopagem. A Figura 4.4 ilustra a dopagem da polianilina por
protonao.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

79

Os demais polmeros condutores 36 possuem, em geral, ons de carbono, porm o sal de


esmeraldina difere destes apresentando-se como um polmero, no qual a carga positiva reside
primordialmente no nitrognio.

Figura 4.4- Representao da formao da banda de conduo polarnica em polianilina.


EB = base esmeraldina; ES = sal de hidrocloreto de esmeraldina.36

O tipo de dopante utilizado (inorgnico, orgnico ou policido) influncia


decisivamente nas estruturas e propriedades das polianilinas (solubilidade, cristalinidade,
resistncia mecnica).
A polianilina pode sofrer um efeito de autodopagem quando a forma esmeraldina
reage com cido sulfrico concentrado. Neste caso, um tomo de hidrognio do anel
benznico e substitudo pelo grupo SO3H, resultando em uma polianilina sulfonada dopada (
= 0,1 S/cm).37 O prton dopante no consegue se difundir para longe da cadeia polimrica,
devido ao contra-on ao qual est quimicamente ligado e a PANI se mantm dopada mesmo
para meios neutros ou levemente bsicos, o que no ocorre para PANI convencionalmente
dopada.
Outro fenmeno importante do dopante se refere a dopagem secundaria,38-39 no qual a
combinao de um acido orgnico funcionalizado e um solvente apropriado promove uma
mudana conformacional das cadeias polimricas de enoveladas para estendidas, efeito este

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

80

acompanhado por um aumento adicional da condutividade da PANI, atingindo


aproximadamente 200 S/cm.
4.3.2- Estrutura de transporte na interface polmero-metal 40-41
As heterojunes do tipo polmero-metal (HPM) obtiveram, nas ltimas duas dcadas,
um avano significativo da optoeletrnica uma vez que propiciou o projeto de dispositivos
eletrocrmicos, transistores de efeito de campo (FETs), supercapacitores, entre outros. As
principais caractersticas fsico-qumicas de tais materiais so a facilidade de processamento e
o baixo custo.
A probabilidade de se obter HPMs com superfcies nanoprojetadas atraente uma vez
que torna possvel a obteno de materiais cujas caractersticas eltricas possam ser
moduladas topologicamente.
Estas

heterojunes

so

particularmente

interessantes

para

projeto

de

nanodispositivos envolvendo a aquisio de interfaces do tipo polmero conjugado-metal.


Tais sistemas so particularmente interessantes para o projeto

de biossensores

amperomtricos de vasta utilidade em anlises clnicas.


Quando se tem uma heterojuno do tipo semicondutor-metal geralmente suposto
como teoria padro a emisso terminica atravs da juno (modelo de Schottky). A corrente
aumenta exponencialmente ao se aplicar uma polarizao direta; em contraste, uma corrente
muito pequena flui quando se aplica uma tenso reversa. Nesse caso, tem-se o comportamento
retificante de um diodo (diodo Schottky). Como o metal no possui lacunas, no h
armazenamento de cargas e nem tempo de recuperao reverso sendo muito utilizado em
computadores digitais de alta velocidade e diodos de retificao de sinais de alta frequncia.
O comportamento tipo diodo Schottky, no prprio dos materiais polimricos, deve-se
interface semicondutor polianilina-metal (PANI-M). fato bem conhecido que os nveis de
energia de Fermi (EF) so diferentes na interface metal-polmero (ver Figura 4.5). Uma vez
que os eltrons so os nicos portadores de carga, o equilbrio somente atingido quando os
nveis de EF no semicondutor e no metal se alinham atravs de um fluxo de cargas do
semicondutor (tipo-n) para o metal. Uma camada de dipolos ento formada, conduzindo a
um abaixamento da banda de conduo e a formao de uma barreira de potencial que se ope
a um fluxo eletrnico adicional. Este comportamento confere heterojuno PANI-M um
carter retificador.
No interior dos semicondutores do tipo-n a carga dos eltrons mveis compensada
pelos doadores fixos ionizados, positivos, enquanto que nos do tipo-p tem-se buracos mveis
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

81

e aceitadores fixos ionizados, negativos, mantendo-se, portanto, um equilbrio entre os


transportadores de carga. No caso dos semicondutores do tipo-n os transportadores
majoritrios so os eltrons, enquanto que nos do tipo-p os transportadores majoritrios so os
buracos.
O diagrama de bandas de energia de um metal e de um semicondutor tipo-n,
eletricamente isolados apresentado na Figura 4.5 (a). A partir da figura, podemos identificar
a funo trabalho q m do metal , que corresponde diferena de energia entre o nvel do
vcuo e o nvel de Fermi, a funo trabalho q s do semicondutor, e a afinidade eletrnica do
semicondutor q , definida como a distncia entre o nvel do vcuo e o fundo da banda de
conduo EC do semicondutor.

Figura 4.5- Representao esquemtica da Energia de Fermi para um sistema metalsemicondutor.42

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

82

Aps o contato, o diagrama de bandas passa ser ilustrado pela Figura 4.5 (b),
considerando-se que, no equilbrio, os nveis de Fermi de ambos os materiais devem se
alinhar, promovendo um encurvamento no diagrama de banda de conduo prximo
interface, enquanto que, distante da juno, as propriedades de cada um dos materiais so
mantidas. O diagrama de banda do metal se mantm inalterado, tanto na interface como
distante da juno. A fim de alinhar os nveis de Fermi, do metal e do semicondutor, eltrons
devem ser transferidos do semicondutor para o metal, deixando doadores ionizados no
semicondutor.
Para uma melhor compreenso da Figura 4.5 (b), pode-se observar que a funo
trabalho do metal maior do que a funo trabalho do semicondutor, e o nvel de Fermi do
semicondutor, antes do contato, so mais alto do que o do metal. A diferena de potencial

Vbi = ( m s )
denominada potencial de contato e corresponde diferena entre a funo trabalho do metal
e do semicondutor, representando o valor do encurvamento
total da banda de conduo no equilbrio. A altura da barreira de potencial

q B = q( m )
entre o metal e o semicondutor, comumente chamada de barreira Schottky, apresentada no
caso ideal, pela diferena entre a funo trabalho do metal e a afinidade eletrnica q do
semicondutor.
O espaamento entre os estados energticos criados pela proximidade dos tomos no
slido depende do nmero de estados presentes; quanto maior o nmero de estados, mais
prximo esto os nveis eletrnicos permitidos. Portanto, no caso dos slidos, os nveis
energticos esto to prximos que mais conveniente ignorar a existncia de nveis discretos
e pensar em termos de uma banda contnua dos nveis de energias permitidos.
Este trabalho utilizou nanotubos de polianilina PANI que ao passar por um processo
de dopagem apresentam caractersticas de um semicondutor, obedecendo ao comportamento
ilustrado pela Figura 4.5. Os nanotubos de PANI foram utilizados no processo de mediao de
eltrons na interface dendrmero bioconjugado/eletrodo. Estes nanotubos foram sintetizados
pelo grupo de biomateriais da Unifei e utilizados em dispositivos biossensores. Os resultados
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

83

obtidos foram significativamente promissores quanto s caractersticas eltricas na transduo


do sinal.

4.4- Consideraes parciais


Aps muitos anos de investigaes tericas e experimentais, alguns mecanismos
relacionados ao mecanismo de mediao de eltrons ainda no so muito bem entendidos e
uma condio ideal para se produzir novos e melhores materiais da classe dos polmeros
condutores ainda no foi obtida.
O mediador de eltrons ideal deve possuir como caractersticas fsico-qumicas, alta
estabilidade, boa condutividade eltrica e boa propriedade de adeso superfcie do eletrodo.
Neste sentido, os polmeros conjugados parecem ser uma escolha interessante para
desempenharem o papel de mediadores de cargas em biossensores.
Um ponto importante a se discutir no processo de anlises clnicas refere-se ao
processo de aquisio e tratamento dos sinais eltricos gerados no dispositivo biossensor.
Os dispositivos biossensores comerciais so monoenzimticos, ou seja, o sistema
analisa apenas um nico metablito. Tais dispositivos trabalham geralmente com
armazenamento dos dados em uma memria que funciona como buffer. Na cincia da
computao, buffer uma regio de memria temporria utilizada para escrita e leitura de
dados. Os dados podem ser originados de dispositivos externos ou internos ao sistema. Os
buffers podem ser implementados em software (mais usado) ou hardware. A Figura 4.6 ilustra
a estrutura fsica de um buffer.

Figura 4.6- Representao fsica de um buffer.43

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 4 Mediadores de eltrons

84

Os dados recebidos so interpretados em uma curva de calibrao previamente


estabelecida. Neste caso, o tratamento dos sinais no envolve uma tarefa complexa.
O presente trabalho envolve a obteno de biossensores multienzimticos, ou seja,
sistemas que permitem a anlise de vrios metablitos, a saber: glicose, uria e colesterol.
Neste sentido, o tratamento dos dados por uma rede neural uma parte importante e que no
pode ser ignorada.
No prximo captulo sero abordados alguns conceitos fundamentais sobre as redes
neurais e sua utilizao em dispositivos biossensores.
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Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

88

,Captulo 5- Redes neurais artificiais


5.1- Inteligncia Artificial
Desde os primeiros momentos da histria da computao, os cientistas tm sonhado com a
idia de criar um crebro eletrnico. Entre todas as pesquisas tecnolgicas modernas, esta busca
por sistemas computacionais artificialmente inteligentes tem sido uma das mais ambiciosas. Mas
os cientistas tambm foram cativados desde cedo pelo potencial que tal tecnologia poderia ter
para a medicina, com computadores inteligentes capazes de armazenar e processar vastos
repositrios de conhecimentos na realizao de diagnsticos clnicos.1-2
A Inteligncia Artificial (IA) no recente. Sua histria se inicia nos idos dos anos 40,
onde havia pesquisas em torno de sequncias de estratgia e anlise do funcionamento do crebro
com objetivos de formalizao de seu comportamento. Estes dois ramos de pesquisa eram
dissociados entre si, sem nenhuma preocupao com a construo de uma Inteligncia Artificial.
Buscava-se, apenas, novas alternativas de utilizao do computador, ainda em projeto.3
Com o passar dos anos, foram sendo distinguidas duas linhas de pesquisa: uma biolgica,
calcada em torno do funcionamento do crebro e dos neurnios; e outra, fruto do estudo da
cognio, do raciocnio.3
Muitos sistemas foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar os mdicos no
diagnstico de doenas, tipicamente com a inteno de serem utilizados durante um encontro
clnico com o paciente. O sistema Dxplain, desenvolvido na Universidade Harvard pelo Dr. Octo
Barnett,1 um bom exemplo de sistemas de apoio deciso clnica. Este sistema usado para
diagnstico em medicina interna, a partir de um conjunto de achados clnicos, incluindo sinais,
sintomas e dados laboratoriais, produz uma lista de diagnsticos possveis por ordem decrescente
de importncia e sugere investigaes posteriores. O sistema contm uma base de probabilidades
aproximadas para cerca de 4,5 mil manifestaes associadas a 2 mil doenas diferentes.2
Outro mtodo utilizado o HELP, que uma espcie de sistema de informao hospitalar
baseado no conhecimento, e foi desenvolvido em 1980 na Universidade de Utah. Ele no apenas
apia as aplicaes de rotina de um sistema de informao hospitalar (SIH), incluindo o
gerenciamento das admisses e altas, e das prescries mdicas, mas tambm inclui uma funo
de apoio deciso, o qual foi incorporado s funes rotineiras do SIH. O sistema de apoio

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Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

89

deciso fornece alertas e lembretes aos clnicos, interpretao de dados e diagnstico de doenas,
sugesto de manejo de pacientes e protocolos clnicos. A ativao do apoio deciso feita a
partir de cada aplicativo, mas tambm pode ser disparada automaticamente medida que um
conjunto de dados clnicos est sendo digitado no registro computadorizado do paciente.2
A partir da dcada de 90 consolidam-se as redes neurais como parte integrante do estudo
da Inteligncia Artificial propriamente dita. Reconhece-se, tambm, que os paradigmas biolgico
e psicolgico so complementares e necessrios para sistemas mais evoludos. Desta forma,
comeam nesta dcada a serem construdos os chamados Sistemas Hbridos. Estes sistemas
permitem a construo de grandes sistemas que abrangem uma forma mais completa de
representao do comportamento humano atravs da prpria Inteligncia Artificial.2
As redes neurais artificiais tm suas razes nas reas da neurocincia, matemtica,
estatstica, fsica, cincia da computao e engenharia. Suas aplicaes podem ser encontradas
em campos to diversos quanto modelagem, anlise de sries temporais, reconhecimento de
padres, processamento de sinais e controle;4 alm disso, tem sido recentemente introduzida no
campo da cincia dos materiais.5-6 As redes neurais, em geral, so modelos estatsticos flexveis
utilizados para a resoluo de problemas no-lineares de alta complexidade.7
5.2 Paralelo entre Redes Neurais Artificiais e Redes Neurais Naturais 4
Ao longo do processo evolucionrio, o homem desenvolveu seu crebro, sua inteligncia,
sua capacidade de raciocnio, a linguagem e outras habilidades bem mais poderosas e complexas
do que qualquer outra espcie. Isso quer dizer que o homem atingiu certo nvel de conhecimento
o que fundamental para a sua sobrevivncia, assim como para qualquer animal.
O crebro humano considerado o mais admirvel processador baseado em carbono
existente, sendo composto por aproximadamente 10 bilhes de neurnios. Todas as funes e
movimentos do organismo esto relacionados ao funcionamento destas pequenas clulas. Os
neurnios esto conectados uns aos outros atravs de sinapses, e juntos formam uma grande rede,
chamada Rede Neural. As sinapses transmitem estmulos atravs de diferentes concentraes de
sdio (Na+) e potssio (K+), e o resultado disto pode se alargar por todo o corpo humano. Esta
grande rede proporciona uma fabulosa capacidade de processamento e armazenamento de
informao.8-9

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

90

O sistema nervoso formado por um conjunto extremamente complexo de neurnios. Nos


neurnios a comunicao realizada atravs de impulsos, quando um impulso recebido, o
neurnio o processa, e passado um limite de ao, dispara um segundo impulso que produz uma
substncia neurotransmissora o qual flui do corpo celular para o axnio (que por sua vez pode ou
no estar conectado a um dendrito de outra clula). O neurnio que transmite o pulso pode
controlar a frequncia de pulsos aumentando ou diminuindo a polaridade na membrana pssinptica. Eles tm um papel essencial na determinao do funcionamento, comportamento e do
raciocnio do ser humano. Ao contrrio das redes neurais artificiais, redes neurais naturais no
transmitem sinais negativos, sua ativao medida pela frequncia com que emite pulsos,
frequncia esta de pulsos contnuos e positivos. As redes naturais no so uniformes como as
redes artificiais, e apresentam uniformidade apenas em alguns pontos do organismo. Seus pulsos
no so sncronos ou assncronos, devido ao fato de no serem contnuos, o que a difere de redes
artificiais.
As RNAs (Redes Neurais Artificiais) so tcnicas computacionais apresentadas por um
modelo matemtico inspirado na estrutura neural de organismos inteligentes e que adquirem o
conhecimento atravs da experincia. Uma grande RNA pode possuir centenas ou milhares de
unidades de processamento; j um crebro pode possuir bilhes de neurnios.
O sistema nervoso formado por um conjunto extremamente complexo de clulas, os
neurnios. Eles tm um papel essencial na determinao do funcionamento e comportamento do
corpo humano e do raciocnio. Os neurnios so formados pelos dendritos, que so um conjunto
de terminais de entrada, pelo corpo central, e pelos axnios que so longos terminais de sada
(ver Figura 5.1).

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Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

91

Figura 5.1 - Delineamento da estrutura dos constituintes de um neurnio biolgico.10


Os modelos neurais procuram aproximar o processamento dos computadores ao crebro.
As redes neurais possuem um grau de interconexo similar a estrutura do crebro e um
computador convencional moderno a informao transferida em tempos especficos dentro de
um relacionamento com um sinal para sincronizao.
A Tabela 5.1 traa um comparativo entre o crebro humano e o computador.
Tabela 5.1- Quadro comparativo entre crebro e o computador.8
Parmetro

Crebro

Computador

Material

Orgnico

Metal e plstico

Velocidade

Milisegundos

Nanosegundos

Tipo de Processamento

Paralelo

Sequencial

Controle de Processos

Distribudo

Centralizado

Nmero de elementos processados


Ligaes entre elementos processados

11

14

10 a 10
10.000

105 a 106
<10

O mesmo paralelo pode ser traado comparando o computador com as redes neurais (ver
Tabela 5.2). Para tanto, a comparao no se dar com um computador especfico encontrado no
mercado, mas sim com o paradigma predominante nos computadores atuais.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

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92

Tabela 5.2- Comparativo entre computadores e neurocomputadores.8


Computadores

Neurocomputadores

Executa programas

Aprende

Executa operaes lgicas

Executam operaes no-lgicas, transformaes,


comparaes

Depende do modelo ou do

Descobre as relaes ou regras dos dados e exemplos

programador
Testa uma hiptese por vez

Testa todas as possibilidades em paralelo (conjunto)

5.3- Histrico das Redes Neurais artificiais 4-8-9


As primeiras menes sobre a neuro computao datam de 1943, em artigos de
McCulloch e Pitts, em que sugeriam a construo de uma mquina baseada no crebro humano.
A Figura 5.2 ilustra o neurnio projetado por McCulloch e Pitts.

Figura 5.2 Ilustrao esquemtica do neurnio projetado por McCulloch e Pitts.8

Muitos outros artigos e livros surgiram desde ento, porm, por um longo perodo de
tempo, pouco resultado foi obtido. At que em 1949, Donald Hebb escreveu um livro entitulado
"The Organization of Behavior" (A Organizao do Comportamento) que perseguia a idia de
que o condicionamento psicolgico clssico est presente em qualquer parte dos animais pelo

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Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

93

fato de que esta uma propriedade de neurnios individuais. Suas idias no eram
completamente novas, mas Hebb foi o primeiro a propor uma lei de aprendizagem especifica para
as sinpses dos neurnios. Este primeiro e corajoso passo serviu de inspirao para que muitos
outros pesquisadores perseguissem a mesma idia. E embora muito tenha sido estudado e
publicado nos anos que seguiram (1940-1950), estes serviram mais como base para
desenvolvimento posterior que para o prprio desenvolvimento.
Tambm proveniente deste perodo de tempo foi a construo do primeiro neuro
computador, denominado Snark, por Mavin Minsky, em 1951. O Snark operava com sucesso a
partir de um ponto de partida tcnico, ajustando seus pesos automaticamente, entretanto, ele
nunca executou qualquer funo de processamento de informao interessante, mas serviu de
inspirao para as idias de estruturas que o sucederam.
Em 1956 no "Darthmouth College" nasceram os dois paradigmas da Inteligncia
Artificial, a simblica e o conexionista. A Inteligncia Artificial Simblica tenta simular o
comportamento inteligente humano desconsiderando os mecanismos responsveis por tal. J a
Inteligncia Artificial Conexionista acredita que construindo um sistema que simule a estrutura
do crebro, este sistema apresentar inteligncia, ou seja, ser capaz de aprender, assimilar, errar
e aprender com seus erros.
O primeiro neuro computador a obter sucesso (Mark I Perceptron) surgiu em 1957 e 1958,
criado por Frank Rosenblatt, Charles Wightman e outros. Devido profundidade de seus estudos,
suas contribuies tcnicas e de sua maneira moderna de pensar, muitos o vem como o fundador
da neuro computao na forma em que a temos hoje. Seu interesse inicial para a criao do
Perceptron era o reconhecimento de padres. A Figura 5.3 ilustra a rede de perceptrons proposta
por Rosemblatt.

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94

Figura 5.3 - Rede de perceptrons proposta por Rosemblatt.8

Aps Rosenblatt, Bernard Widrow, com a ajuda de alguns estudantes, desenvolveram um


novo tipo de elemento de processamento de redes neurais chamado de Adaline (ver Figura 5.4),
equipado com uma poderosa lei de aprendizado, que diferente do Perceptron ainda permanece em
uso. Widrow tambm fundou a primeira companhia de hardware de neurocomputadores e
componentes.

Figura 5.4 Ilustrao representativa das redes Adaline e Madaline.5


Infelizmente, os anos seguintes foram marcados por um entusiasmo exagerado de muitos
pesquisadores, que passaram a publicar vrios artigos e livros que faziam uma previso pouco
confivel para a poca, sobre mquinas to poderosas quanto o crebro humano que surgiriam em
um curto espao de tempo. Isto tirou quase toda a credibilidade dos estudos desta rea.

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95

Um perodo de pesquisa silenciosa seguiu-se durante 1967 a 1982, quando poucas


pesquisas foram publicadas devido aos fatos ocorridos anteriormente. Entretanto, aqueles que
pesquisavam nesta poca, e todos os que se seguiram no decorrer de treze anos conseguiram
novamente estabelecer um campo concreto para o renascimento da rea.
Nos anos 80, muitos dos pesquisadores foram bastante corajosos e passaram a publicar
diversas propostas para a explorao de desenvolvimento de redes neurais bem como suas
aplicaes. Porm talvez o fato mais importante deste perodo tenha ocorrido quando Ira
Skurnick, um administrador de programas da DARPA (Defense Advanced Research Projects
Agency) decidiu ouvir os argumentos da neuro computao e seus projetistas, e divergindo dos
caminhos tradicionais dos conhecimentos convencionais, fundou em 1983 pesquisas em neuro
computao. Este ato no s abriu as portas para a neuro computao, como tambm deu
DARPA o status de uma das lderes mundiais. Outra potncia que emergiu neste perodo foi John
Hopfield, renomado fsico de reputao mundial, se interessou pela neuro computao, e
escreveu artigos que percorreram o mundo todo persuadindo centenas de cientistas, matemticos,
e tecnlogos altamente qualificados a se unirem esta nova rea emergente.
Apesar de um tero dos pesquisadores da rea terem aderido mesma pela influncia de
Hopfield, foi em 1986 que este campo de pesquisa expandiu-se com a publicao do livro
Parallel Distributed Processing (Processamento Distribudo Paralelo) editado por David
Rumelhart e James McClelland.
Em 1987 ocorreu em San Francisco a primeira conferncia de redes neurais em tempos
modernos, a IEEE International Conference on Neural Networks, e tambm foi formada a
International Neural Networks Society (INNS). A partir destes acontecimentos decorreu a
fundao do INNS journal em 1989, seguido do Neural Computation e do IEEE Transactions on
Neural Networks em 1990.
Rumelhart, Hinton e Williams introduziram o mtodo Backpropagation. A estrututa deste
mtodo pode ser observada na Figura 5.5.

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96

Figura 5.5- Estrutura do mtodo Backpropagation; (a) camada de sada; (b) camada escondida;
(c) camada de entrada.8
O algoritmo de retropropagao do erro (error backpropagation ou simplesmente
backpropagation) um algoritmo utilizado em perceptrons de mltiplas camadas e utiliza funes
de transferncia diferenciveis e no-lineares em um treinamento supervisionado. A
aprendizagem por backpropagation consiste, basicamente, em dois passos: um passo para frente,
que a propagao, e um passo para trs, a retropropagao. No passo para frente, um vetor
apresentado aos ns de entrada da rede e seu efeito se propaga atravs desta, da esquerda para a
direita e de camada em camada. Um conjunto de sadas produzido como resposta da rede.
Durante este processo, os pesos sinpticos da rede so todos fixos. A resposta da rede
subtrada da resposta desejada e, ento, determina-se o sinal de erro. Este sinal de erro
propagado para trs atravs da rede, contra a direo das conexes sinpticas. Os pesos so ento
ajustados de modo a se minimizar o sinal de erro. Na figura 5.6 tem-se a representao dos sinais
de entrada, tambm conhecidos como sinais funcionais e de erro em um perceptron de mltiplas
camadas.

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97

Figura 5.6- Sinais funcionais e de erro de uma rede neural.


5.4- Arquitetura da rede
Em relao ao funcionamento das RNAs, um modelo de neurnio artificial binrio com
limiar unitrio foi portanto proposto inicialmente, no qual as entradas do neurnio so
ponderadas pelos seus pesos com as sadas da clula anterior ou com os sinais de entrada da rede
e que possui estado de ativao definido unicamente por uma funo degrau. Mais tarde
implementou-se um modelo de RNA que consiste de um conjunto de clulas conectadas e com
uma regra de propagao. Cada neurnio recebe suas entradas com os pesos associados, vindas
de outros neurnios ou de estmulo externo. A funo de ativao usualmente uma somatria
agindo nas entradas da rede. Os valores bias de oposio so adicionados somatria das
entradas com pesos. O estado de ativao do neurnio determinado pela funo de sada ou de
transferncia e geralmente uma funo sigmodal. A sada do neurnio chega, pelas sinapses, at
a prxima clula. Portanto, uma RNA completa formada por um conjunto de neurnios
dispostos em uma ou mais camadas, conectados por ligaes de pesos variados. A rede
Feedforward tem a propagao do sinal para frente, entre clulas de camadas adjacentes, at a
ltima camada (sada) (SNNS User Manual, 1995). Na fase de treinamento da rede, h a
determinao e a correo dos pesos e dos bias, para que a mesma responda de forma desejada.
Uma rede neural completa mostrada na Figura 5.6.

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98

Figura 5.6- Representao de uma rede neural com trs camadas.

A Figura 5.6 mostra uma rede neural de trs camadas, onde: X =vetor de dados de
entrada; Wi(m) a matriz de valores de peso associados a cada entrada i e a cada camada m; Fi(m)
a funo de transferncia sigmoidal de cada unidade, associada camada m.

F (h b) =

1
h b ) / 2
(
1+ e

(5.1)

sendo: bi(m) = unidades bias; d = sada desejada da rede para cada entrada; y = sada fornecida
pela rede neural para cada entrada.
A entrada para um dado neurnio i, com seus pesos correspondentes de uma certa camada
m, definida como:
m
m
m
m
m
hi( ) = wi( ) x( ) = kM=1 wik( ) .x( )

(5.2)

A sada do neurnio i na camada m definida como:


m
yi( ) = Fi ( hi bi )

(5.3)

sendo y(m) = X(m+1) ou seja, a entrada da prxima camada a sada da camada anterior. Existe um
vetor de sadas y para cada vetor de entradas X. Os pesos w e bias b so atualizados para cada
clula, at obter-se o critrio de parada do treinamento (erro aceitvel alcanado). A RNA

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99

empregada utilizou o mtodo de treinamento Backpropagation que realiza a busca por um erro
aceitvel.
Este erro dado por:
Ep

2
d y)
(
=

(5.4)

O valor de Ep calculado para as clulas de sada da rede. O objetivo deste algoritmo de


treinamento minimizar o erro de sada para cada vetor de entrada, ou seja, minimizar a distncia
quadrtica entre as sadas desejadas e calculadas. A estrutura de processamento paralelo de
informao permite a incluso de conhecimento hbil no processo, a deteco e a classificao de
sinais. A caracterstica da RNA , ento, considerar o conhecimento adquirido durante o
treinamento e responder a novos dados de entrada da maneira mais apropriada, concluindo assim,
uma generalizao do problema. A arquitetura da rede neural definida pelos pesos
correspondentes e esquema de conexes. J o processo de aprendizagem envolve a mudana nos
valores dos pesos, sendo o aspecto mais explorado em redes neurais artificiais.
5.5- Funcionamento das redes neurais artificiais
As redes neurais artificiais so criadas a partir de algoritmos projetados para uma
determinada finalidade. impossvel criar um algoritmo desses sem ter conhecimento de
modelos matemticos que simulem o processo de aprendizado do crebro humano.
Uma rede neural se assemelha ao crebro em dois pontos; o conhecimento obtido
atravs de etapas de aprendizagem e pesos sinpticos so usados para armazenar o conhecimento.
Uma sinapse o nome dado conexo existente entre neurnios. Nas conexes so atribudos
valores, que so chamados de pesos sinpticos. Isso deixa claro que as redes neurais artificiais
tm em sua constituio uma srie de neurnios artificiais que sero conectados entre si,
formando uma rede de elementos de processamento.
A partir de uma rede neural formada, uma srie de valores podem ser aplicados sobre um
neurnio, sendo que este est conectado a outros pela rede. Estes valores (ou entradas) so
multiplicados no neurnio pelo valor do peso de sua sinapse. Ento, esses valores so somados.
Se esta soma ultrapassar um valor limite estabelecido, um sinal propagado pela sada (axnio)

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

100

deste neurnio. Em seguida, essa mesma etapa se realiza com os demais neurnios da rede. Isso
quer dizer que os neurnios vo enfrentar algum tipo de ativao, dependendo das entradas e dos
pesos sinpticos (ver Figura 5.7).

Figura 5.7- Representao da arquitetura de uma Rede Neural Artificial.17


Existem vrias formas de se desenvolver uma rede neural. Ela deve ser montada de acordo
com os problemas a serem resolvidos. Em sua arquitetura determinado o nmero de camadas
usadas (as camadas so formadas por neurnios) e a quantidade de neurnios em cada camada, o
tipo de sinapse utilizado.
O processo de aprendizagem das redes neurais realizado quando ocorrem vrias
modificaes significantes nas sinapses dos neurnios. Essas mudanas ocorrem de acordo com a
ativao dos neurnios. Se determinadas conexes so mais usadas, estas so reforadas
enquanto que as demais so enfraquecidas. por isso que quando uma rede neural artificial
implantada para uma determinada aplicao, necessrio um tempo para que esta seja treinada.
Existem, basicamente, trs tipos de aprendizado nas redes neurais artificiais;4
(i) Supervisionado; neste tipo, a rede neural recebe um conjunto de entradas padronizado e seus
correspondentes padres de sada, onde ocorrem ajustes nos pesos sinpticos at que o erro entre
os padres de sada gerados pela rede tenha um valor desejado;

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

101

(ii) No-supervisionado; neste tipo, a rede neural trabalha os dados de forma a determinar
algumas propriedades do conjunto de dados. A partir destas propriedades que o aprendizado
constitudo;
(iii) Hbrido; neste tipo ocorre uma juno dos tipos supervisionado e no-supervisionado. Assim,
uma camada pode trabalhar com um tipo enquanto outra camada trabalha com o outro tipo.
O algoritmo utilizado neste trabalho como j mencionado, foi o Backpropagation, sendo o
aprendizado supervisionado, ou seja, a entrada e sada desejadas para a rede so fornecidas por
um supervisor externo. O objetivo , atravs de um mecanismo de correo de erros, ajustar os
parmetros (pesos) da rede, de forma a encontrar uma ligao entre os pares de entrada e sada
fornecidos. O treinamento ocorre em duas fases, onde cada fase percorre a rede em um sentido.
Estas duas fases so chamadas de forward e backward. A fase forward utilizada para definir a
sada da rede para um dado padro de entrada. A fase backward utiliza a sada desejada e a sada
fornecida pela rede para atualizar os pesos de suas conexes a cada iterao.
5.6- Dificuldades encontradas
A modelagem de uma rede neural depende da anlise consistente de um sistema muitas
vezes complexo, implicando em dificuldades para definir qual arquitetura melhor responde s
necessidades do problema proposto e na escolha de quais dados so verdadeiramente relevantes
para o processamento. Alm da entrada, tambm devemos definir de forma ideal os parmetros
de aprendizagem, os pesos sinpticos e os nveis de bias, os quais so de severa importncia para
o processo de aprendizado.
Outra dificuldade encontrada seria a extrao de regras justificativas da deciso tomada
pela rede, as quais representariam o conhecimento adquirido durante o treinamento.
Contudo, pesquisadores vm tentando minimizar as dificuldades da implementao das
redes neurais atravs de algoritmos extratores de regras e o uso de sistemas hbridos,
combinando, por exemplo, uma rede neural com algoritmos genticos, para que se possa otimizar
a definio das taxas de aprendizado, pesos sinpticos e nveis de bias, ou ento utilizando
algoritmos que faam extrao de regras lgicas.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

102

5.7- Consideraes parciais


Apesar da neurocomputao ter iniciado com a computao programada nas dcadas de
40 e 50, deve-se salientar que a implementao de uma rede neural naquela poca era invivel,
pois a fase de aprendizado, a fase mais difcil e demorada no desenvolvimento de uma rede,
dependia (e ainda depende) de complicados algoritmos e de um nmero grande de iteraes, algo
que um ENIAC, (Eletronic Numerical Interpreter and Calculator) primeiro computador digital
eletrnico de grande escala projetado por John W. Mauchly e J. Presper Eckert em 1946, no
teria condies de faz-lo. Hoje, com a tecnologia dos chips VLSI (Very Large Scale Integration)
a implementao das redes neurais tem sido facilitada. Os chips VLSI so chips muito confiveis,
rpidos, baratos, compactos, consomem pouca energia e dissipam menos calor que os antigos
chips.
Todas as informaes aqui expostas nos levam a crer que o campo de redes neurais
artificiais acima de tudo extremamente vasto e promissor. Por ser um assunto que surgiu a
muito tempo atrs, ganhou muita credibilidade, e devido s novas descobertas relacionadas a ela
a cada instante, tornou-se bastante atrativo para profissionais de domnios distintos, tornando-se
um assunto interdisciplinar. Os conhecimentos obtidos at hoje atraem o interesse de
profissionais tais como psiclogos, neurofisiologistas, engenheiros, cientistas cognitivos, e
cientistas da computao, que buscam cada um em sua rea, novos caminhos atravs da
computao neural.
Atualmente, redes neurais tm sido utilizadas em biossensores para o emprego de
diferentes enzimas (seletivas para determinados compostos) e diferentes processos de
imobilizao, assim como o tratamento dos dados experimentais atravs de mtodos
quimiomtricos (redes neurais), desponta como uma grande perspectiva para a determinao
simultnea e "in situ" de todas as espcies presentes em amostras de interesse.18
O mtodo de treinamento utilizado neste trabalho foi do tipo backpropagation e funciona
pelo ajuste de valores de pesos que esto associados s conexes das sucessivas camadas de uma
rede MLP (Multi-Layer Perceptrons). O algoritmo fornece uma forma de definir o erro dos nodos
das camadas intermedirias para a mudana nos pesos em uma rede feedforward (propagao dos
sinais para frente). Esta rede treinada atravs do fornecimento de padres de entrada e de sada

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

103

desejada. A maioria dos mtodos de aprendizado para RNAs do tipo Perceptron de mltiplas
camadas utilizam variaes deste algortmo.19-20-21
O algoritmo Backpropagation supervisionado, ou seja, a entrada e sada desejadas para a
rede so fornecidas por um supervisor externo. O objetivo , atravs de um mecanismo de
correo de erros, ajustar os parmetros (pesos) da rede, de forma a encontrar uma ligao entre
os pares de entrada e sada fornecidos. O treinamento ocorre em duas fases, onde cada fase
percorre a rede em um sentido. Estas duas fases so chamadas de forward e backward. A fase
forward utilizada para definir a sada da rede para um dado padro de entrada. A fase backward
utiliza a sada desejada e a sada fornecida pela rede para atualizar os pesos de suas conexes a
cada iterao.19-20-21
5.8 Referncias
[1] SABBATINI, R.M.E. Informtica Mdica. Disponvel em <http://www.sabbatini.com
/renato/papers/checkup-18.htm> Acessado em 24 mar.2008.
[2] COIERA, E.W. Inteligncia Artificial na Medicina Disponvel em <http://dfm.ffclrp.
usp.br/infobio/ceib /texto4.php> Acessado em 24 mar.2008.
[3] GONGORA, A.D. O Que Inteligncia Artificial. Disponvel em <http://www.pr.
gov.br/batebyte/edicoes/ 2002/bb119/estagiario.htm> Acessado em 24 mar.2008.
[4] HAYKIN S. Redes Neurais: Princpios e Prticas ed. BOOKMAN, p. 900; 2000.
[5] ZHANG, Z., FRIEDRICH, K., Artificial Neural Networks Applied to Polymer Composites:
A Review, Composites Science and technology, v. 63, p. 2029-44, 2003.
[6] GOH, A.T.C., Back-propagation Neural Networks for Modeling Complex Systems,
Artificial Intelligence in Engineering, v. 9, p. 143-51, 1995.
[7] BAHR, H.B., HORROCKS, D.H., Dynamic Weight Estimation Using an Artificial Neural
Network, Artificial Intelligence in Engineering, v. 12, p. 135-9, 1998.
[8] Uma introduo s Redes Neurais. Disponvel em <http://www.din.uem.br /ia/neurais/>
Acessado em 24 mar.2008.
[9] Neural Networks. Disponvel em < http://www.zsolutions.com/Neural.htm> Acessado em 24
mar.2008.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 5 Redes Neurais Artificiais

[10]

HERNANDEZ,

E.D.M.

104

Redes

Neurais.

Disponvel

em

< http://www.lps.usp.

br/neo/Navega.htm> Acessado em 24 mar.2008.


[11] YANG, H.J., ROE, B.P., ZHU, J., Studies of Stability and Robustness for Artificial Neural
Networks and Boosted Decision Trees. Nuclear Instruments and Methods in Physics
Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment,
v. 74, n. 2, p. 342-9, 2007.
[12] RUMELHART, D. E.; MCCLELLAND, J. L. Parallel Distributed Processing, The MIT
Press. v. 1, 1986.
[13] HERTZ, J.; KROGH, A.; PALMER, R.G. Introduction to the Theory of Neural
Computation, Adison-Wesley Pub. Co, 1991.
[14] BRYSON, A.E.; Ho, Y. Applied Optimal Control, Blaisdell, 1969.
[15] WERBOS, P. Beyond Regrssion: New Tools for Prediction and Analysis in the Behavioral
Sciences, PhD thesis, Harvard University, 1974.
[16] PARKER, D. Learning Logic: Casting the Cortex of the Human Brain in Silicon. Technical
Report, Center for Computational Research in Economics and Management Science, MIT, 1985.
[17] MELO, J. D. Aspectos da Implementao de Redes Neurais. Disponvel em
<http://www.dimap.ufrn.br/~ivan/reconfiguraveis/Jorge/hard_NN.ppt#256,1> Acessado em 22
mar. 2008.
[18] ROSATTO, S. S.; FREIRE, R. S.; DURAN, N.; KUBOTA, L. T. Biossensores
amperomtricos para determinao de compostos fenlicos em amostras de interesse ambiental.
Qumica Nova, v. 24, So Paulo, jan./fev. 2001.
[19] KOSKO, B. Neural netwoks and fuzzy systems. Editora Pretince-Hall international
Editions. 1992, 450 p.
[20] BRAGA, A.P.; CARVALHO, A.C.L.F.; LUDERMIR, T. B. Redes Neurais Artificiais:
Teoria e aplicaes. Editora LTC, 262 p.
[21] REZENDE, S. O. Sistemas Inteligentes: Fundamentos e aplicaes. Editora Manole,
525p., 2003.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 6- Objetivos da dissertao

105

Captulo 6- Objetivos da dissertao


De origem petroqumica, os polmeros sintticos afetaram no somente as engenharias,
mas, principalmente, a medicina, a biotecnologia e a rea farmacutica. Esses materiais
orgnicos tornaram possvel a obteno de plataformas para a imobilizao de enzimas;
tornando possvel o desenvolvimento de dispositivos que permitem atualmente a monitorao
de vrios processos biolgicos indispensveis para a manuteno da qualidade de vida do
paciente.
No final do sculo XX, surgiram os polmeros altamente ramificados denominados de
dendrmeros. Tais sistemas macromoleculares causaram uma verdadeira revoluo na
medicina clnica e farmacutica, uma vez que mimetizam vrios processos biolgicos vitais
para o ser humano.
Os dendrmeros so considerados atualmente como um dos blocos fundamentais da
qumica nanoscpica. Tais compostos isomoleculares possuem um elevado nvel de
organizao estrutural e marcam o incio de uma nova era na cincia macromolecular: a era da
qumica nanoscpica. A elevada densidade de grupos funcionais na superfcie dos
dendrmeros torna estes compostos muito interessantes para o projeto de dispositivos
biossensores. Neste sentido, a aplicao dos dendrmeros do tipo PGLD, CHD e PPID com
propriedades biocompatveis, parece ser uma alternativa promissora para a obteno de
biossensores implantveis. Entretanto, resta verificar a que ponto tais materiais afetam as
propriedades cinticas das enzimas, os biocatalisadores fundamentais para o desenvolvimento
de dispositivos biossensores.
A pesquisa desenvolvida neste trabalho multidisciplinar e envolve a biofsica de
nanointerfaces. O objetivo geral o estudo do desenvolvimento de interfaces multibiofuncionais baseadas nas enzimas GOx, COx e Urease para a monitorao dos
hemometablitos glicose, uria e colesterol.
Os objetivos especficos deste trabalho envolveram a avaliao da performance dos
biossensores obtidos procurando-se avaliar as seguintes variveis com a finalidade de
comparar as atividades das formas solvel e imobilizada das enzimas GOx, COx e Urease:
(a) Estudar a atividade cataltica das formas solvel e imobilizada das enzimas GOx, COx
e Urease frente a diferentes concentraes de seus respectivos substratos.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 6- Objetivos da dissertao

106

(b) Comparar o desempenho cataltico dos dispositivos biossensores de glicose, uria e


colesterol em funo do dendrmero utilizado.
(c) Investigar a estabilidade dos dispositivos biossensores desenvolvidos.
(d) Analisar com base na cintica de Michaelis-Menten o dendrmero mais adequado para
a obteno de dispositivos biossensores dos hemometablitos glicose, uria e
colesterol.
(e) Propor a utilizao de uma rede neural artificial para aquisio e tratamento de dados
de um biossensor multienzimtico.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

106

Captulo 7 Procedimento experimental


O procedimento experimental foi dividido basicamente em trs etapas. A primeira referese ao processo de imobilizao das enzimas GOx, COx e urease nos dendrmeros PGLD, CHD e
PPID, previamente sintetizados, purificados e caracterizados por outros mestrandos do grupo de
biomateriais da Unifei.1-2
Na segunda etapa do trabalho descrita a obteno dos biossensores atravs da tcnica de
template, utilizando-se a deposio eletroqumica de nanotubos de polianilina na presena dos
bioconjugados dendrticos. A terceira etapa do trabalho refere-se caracterizao eletroqumica
dos biossensores obtidos, bem como, o estudo de sua performance.
7.1- Reagentes
A anilina foi bi-destilada antes de sua utilizao. As enzimas GOx (Aspergillus nigger,
Tipo X-s, p liofilizado com atividade 100.000-250.000 U/g de slido), COx (Streptomyces sp,
p liofilizado com atividade > 20 U/mg slido), urease (Canavalia ensiformis-Jack bean, Tipo
IX, p liofilizado com atividade 50.000-100.000 U/g slido) e os respectivos substratos (glicose,
colesterol e uria) foram adquiridos da empresa Sigma-Aldrich (Brasil). Todos os reagentes
bioqumicos foram utilizados sem tratamento prvio. Todas as solues aquosas foram
preparadas utilizando-se gua bi-destilada e desionizada (Milli-Q).
7.2- Sntese dos dendrmeros PGLD, CHD e PPID e preparo dos bioconjugados
Os dendrmeros PGLD, CHD e PPID foram os mesmos sintetizados, purificados e
caracterizados anteriormente pelo grupo de biomateriais da Unifei.3-4-5-6
Todos os dendrmeros (Figura 7.1) estudados neste trabalho podem em princpio, serem
utilizados como suporte para imobilizao das enzimas. Isso se deve ao grande percentual de
grupos funcionais nas extremidades da macromolcula. A ateno no processo de imobilizao
se volta para a atividade enzimtica, que pode ser afetada, causando a perda total ou parcial da
atividade, que pode ser atribuda a inmeros fatores, como propriedades da prpria enzima, do
suporte, dos reagentes utilizados e das condies experimentais.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

107

Figura7.1- Esquema das arquiteturas dendrticas; CHD, PGLD e PPID, respectivamente.


O processo de imobilizao das enzimas GOx, COx e urease seguiu uma adaptao das
tcnicas j padronizadas pelo grupo de pesquisa em biomateriais da Unifei para o preparo de
suportes para utilizao em biotecnologia.7
O procedimento para imobilizao das enzimas GOx, COx e urease foram iniciados
utilizando-se 200 mg dos respectivos dendrmeros, os quais foram inicialmente misturados com
25 mL de gua desionizada em bquer de 50 mL e a soluo foi mantida sob agitao magntica
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

108

por 2 horas a 4 oC. Em seguida os dendrmeros foram ativados pela adio de 0,5 mL de
tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP, Sigma-Aldrich) e 0,5 mL de trietil
amina (TEA, Sigma Aldrich). O sistema foi mantido sob agitao constante por 2 minutos e em
seguida dialisado empregando membrana de celofane por trs dias contra soluo aquosa de NaCl
0,2 mol/L e dois dias contra gua destilada e desionizada. Aps a dilise, a amostra do
bioconjugado foi liofilizada, e em seguida, a leitura do sobrenadante em epectrofotmetro
UV/VIS (Varian, Cary 50) a 280 nm permitiu o clculo da quantidade de enzima imobilizada nos
respectivos dendrmeros. A Figura 7.2 ilustra o processo de imobilizao das protenas GOx,
COx e urease nos dendrmeros PGLD, CHD e PPID.
A eficincia de imobilizao das enzimas nos dendrmeros foi expressa em termos de
ndice de imobilizao (IM) definido por:

PT PTs
IM = o
PTo

x100

sendo PTo e PTs as quantidades de protena adicionada (antes da imobilizao) e remanescente no


sobrenadante, respectivamente. Neste trabalho o IM para as enzimas GOx, COX e urease foi de
60%.

Figura 7.2- Ilustrao do processo de imobilizao das enzimas GOx, CHD e urease nos

dendrmeros.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

109

7.3- Preparo dos eletrodos enzimticos

O mtodo de preparo dos biossensores enzimticos baseou-se no mtodo bastante


explorado nas ltimas dcadas denominado de sntese template, a qual consiste em uma reao do
tipo hospedeiro/convidado. Neste caso, a sntese do convidado realizada no interior de
cavidades ou poros denominados de estruturas hospedeiras, criadas pela corroso eletroqumica
de um filme de alumnio.
Para o preparo dos eletrodos enzimticos foram utilizados filmes de alumnio de rea 0,75
x 2,05 cm2 x 30 m (Alcoa, 99,9%). Inicialmente os filmes foram lavados com soluo de lauril
sulfato de sdio a 1% (m:v) em banho de ultra-som e em seguida lavados com gua destilada. Os
filmes foram finalmente lavados com lcool etlico e seco sob vcuo, temperatura ambiente
(25C) por 24 horas antes de sua utilizao.
A soluo para a polimerizao eletroqumica, consistiu de anilina bidestilada (0,1M,
Sigma-Aldrich), o dendrmero bioconjugado com os biocatalizadores e cido p-tolueno sulfnico
(1M, Sigma/Aldrich) em soluo tampo fosfato de sdio salino (NaPBS) (0.1M,
NaH2PO4/Na2HPO4, 0.05 mol.L-1 NaCl, pH 7.4) como eletrlito. O crescimento dos nanotubos
foi obtido em um ciclo potencial de -100mV e 30 mC versus um eletrodo saturado de
calomelano, de forma a se obter PANINTs no seu estado reduzido. Aps o processo de
deposio eletroqumica, os eletrodos foram lavados com soluo PBS pH 7,4 e armazenado em
NaPBS por 24 h para remover qualquer excesso de monmero residual ou bioconjugados que no
tenham sido imobilizados completamente. A microestrutura dos eletrodos enzimticos obtidos foi
caracterizada por microscopia eletrnica de varredura (MEV). Um microscpio MEV modelo
JEOL XL 30 foi utilizado no presente trabalho. As amostras foram previamente recobertas com
Au para o respectivo contato. A Figura 7.3 ilustra a imobilizao dos bioconjugados (vermelho)
nos nanotubos de polianilina.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

110

Figura 7.3- Ilustrao do biossensor preparado neste trabalho atravs da tcnica de imobilizao

fsica dos bioconjugados nos nanotubos de polianilina.


A bioatividade dos eletrodos foram medidas amperometricamente pela corrente produzida
no eletrodo enzimtico devido formao de perxido de hidrognio gerado pela catlise
enzimtica da GOx e COx ou formao de ons NH4+ (urease). Neste caso, a corrente eltrica
produzida demonstrou ser proporcional concentrao dos substratos. Um volume de 10 L da
soluo do substrato considerado foi depositado sobre o eletrodo trabalho (eletrodos enzimticos
baseados nos dendrmeros bioconjugados). Um eletrodo saturado de calomelano (SCE, Ag/AgCl)
foi utilizado como eletrodo de referncia. Para eliminar os efeitos de potencial e oscilaes de pH
e temperatura na condutividade dos PANINTS considerou-se a corrente resposta do biossensor
como a diferena entre a corrente de fundo e a corrente contendo a soluo do analito a se dosar.
O fluxo de corrente medido no biossensor resultante da atividade enzimtica foi medido com o
auxlio de um eletrmetro programvel (Keithley modelo 237), de acordo com a Figura 7.4.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

111

Figura 7.4 Unidade fonte medidora Keithley modelo 237 utilizado na caracterizao do

dispositivo biossensor.
As curvas das correntes em funo da tenso (curva I x V) foram obtidas atravs de uma
fonte tenso/corrente Keitlhey, modelo 237 (K237). O Keitlhey K237 uma unidade fontemedidora de alta preciso, fundamental realizao de medidas de tenso de 10V a 1100 V, e
medidas de corrente de 10 fA a 100 mA, escalas estas fundamentais s medidas de baixos sinais e
quaisquer outras que exijam preciso. Para o controle automatizado de aquisio de dados, este
instrumento possui interface IEEE-488 padro, o que permite a programao via computador.
Quando programado como fonte de tenso, o ampermetro conecta-se em srie com a
fonte de tenso e a sada. Quando programado como fonte de corrente, o voltmetro conecta-se
em paralelo entre fonte de corrente e sada.
Como proteo ao circuito externo, o modelo K237 possui um limite de concordncia
programvel, o qual nunca excedida pela unidade fonte-medidora. Ajustando-se uma corrente
de concordncia apropriada pode-se prevenir dissipao excessiva de energia do dispositivo.
Ajustando-se uma tenso de concordncia apropriada pode-se proteger o dispositivo de uma
sobretenso.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

112

A escala de concordncia selecionada tambm a escala mxima medida. Em todo caso,


quando a funo AUTORANGE est habilitada, a unidade fonte-medidora sempre ir para a
menor, mais sensvel, escala possvel para que a medio seja feita.
O controle e a aquisio de dados foram feitos utilizando-se um sistema automatizado
baseado na plataforma HP VEE 4.0, software com linguagem orientada a objeto e que controla os
instrumentos de medio atravs de interfaces de comunicao GPIB 488.
O HP4284A oferece medidas em todas as frequncias com resoluo de seis dgitos e
nveis de sinal de teste de 5mV a 2Vrms e 50A a 20mArms; possui interface IEEE-488 padro, o
que permite programao via microcomputador.
A aquisio de dados e o controle dos equipamentos durante os experimentos foram
realizados utilizando-se de programas elaborados na plataforma Labview 6.1, um software que
utiliza linguagem orientada a objeto para realizao dos procedimentos de controle em ambientes
de pesquisa, permitindo elaborar tais sistemas sem a utilizao de controladores especficos, pois
capaz de simul-los atravs de rotinas de software.
Para obteno da rede neural foi utilizado como ferramenta o Nets 3.0, sendo trabalhado
em linguagem C:. A topologia da RNA utilizada foi um perceptron multicamada com uma
camada de entrada contendo trs neurnios, uma camada escondida com dez neurnios e trs
neurnios na camada de sada. Os sinais de entrada da rede so as correntes geradas no
biossensor presente nos conjuntos determinados, como pode ser observado na Figura 7.5. Foram
ensaiados vrios nmeros de neurnios na camada escondida, buscando a otimizao dos
resultados. Tambm, vrias taxas de aprendizagem foram utilizadas. A cada simulao, os pesos
sinpticos iniciais foram escolhidos aleatoriamente, utilizando-se um gerador de nmeros
randmicos no intervalo ] 1 , 1 [- , seguindo uma distribuio uniforme de mdia 0 (zero). A
funo de ativao utilizada foi a funo sigmide tangente hiperblica.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

113

Figura 7.5- Ilustrao da configurao da rede neural artificial utilizada neste trabalho.
7.4- Referncias

[1] GIAROLA, V. M. Ressonncia de plsmons de superfcie aplicada ao desenvolvimento


de sistemas arborescentes hemocompatveis. 2007, Dissertao (Mestrado em Engenharia de

Materiais). Universidade Federal de Itajub (UNIFEI). Orientador: Prof. Dr. lvaro A. A. de


Queiroz.
[2] DE QUEIROZ,A.A.A.; ABRAHAM,G.A.; CAMILLO,M.A.P.; HIGA, O.Z.; SILVA, G.S.;
FERNNDEZ, M.M.; ROMN, J.S. Physicochemical and antimicrobial properties of boroncomplexed polyglycerolchitosan dendrimers, J. Biomater. Sci. Polymer Edn, v. 17, n. 6, p.
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[3] DE QUEIROZ A.A.A.; FERNANDES, E.G.R.; ABRAHAM, G.A.; ROMAN, J.S.;
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[4] DE QUEIROZ A.A.A.; ABRAHAM, G.A.; CAMILO, M. A. P.; HIGA, O.Z.; SILVA, G.S. ;
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[5] VIEIRA, N.C.S. Biossensores de glicose nanoestruturados baseados em dendrmeros
PAMAM e filmes finos de In2O3:Sn. Dissertao de Mestrado. Universidade Federal de Itajub
(UNIFEI), 2006. Orientador: Prof. Dr. lvaro A. A. de Queiroz.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 7- Procedimento experimental

114

[6] FERNANDES, E.G.R. Biossensores nanoestruturados para monitorao de glicose. 2005.


175 f. Dissertao (Mestrado em Engenharia de Materiais) Universidade Federal de Itajub.
Orientador: Prof. Dr. lvaro A.A. de Queiroz.
[7] DE QUEIROZ, A.A.A.; VARGAS, R.R.; HIGA, O.Z.; RIBEIRO, R.R.; VITOLO, M.
Lactam-amide graft copolymers as novel support for enzyme immobilization. J Appl Polym Sci;
v.84, p.767-77, 2002.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

115

Captulo 8- Resultados e discusses


8.1- Caracterizao dos nanotubos de PANI

A nanotecnologia desperta atualmente um grande interesse da comunidade cientfica, e ao


longo das ltimas dcadas, muito esforos foram feitos no sentido de se atingir um controle
efetivo a nvel atmico e molecular na produo de nanomateriais. Um dos frutos mais
significativos relativo ao interesse pela nanotecnologia est a obteno dos nanotubos de carbono
(NTC), observados pela primeira vez por Sumio Iijima em 1991 durante os estudos da superfcie
dos eletrodos de grafite utilizados para a sntese de fulerenos.1-2
Imediatamente aps o descobrimento de NTCs na forma de paredes mltiplas, nanotubos
de carbono de paredes simples foram encontrados.3-4 A Figura 8.1 mostra uma ilustrao da
configurao atmica de uma seo de um nanotubo de carbono.

Figura 8.1 Vista lateral e frontal da configurao atmica de uma seo de um nanotubo de

carbono. A estrutura cristalina deste tubo particular denotada como (7, 7).5
Os NTCs possuem propriedades especiais devido sua dimensionalidade, estrutura e
topologia. A constituio bsica do retculo do nanotubo as ligaes covalentes C-C, como nas
camadas do grafite. Portanto, nos nanotubos o carbono tambm se encontraria com uma
hibridizao de orbitais atmicas do tipo sp2. 6
O desenvolvimento de biossensores e dispositivos similares baseados em nanotubos de
carbono ainda encontra-se em sua fase inicial a nvel tecnolgico em vrios pases. De fato, ainda
no existe uma tcnica reprodutiva que garanta a produo de nanotubos de carter
exclusivamente metlico ou semicondutor. Ao mesmo tempo a dopagem de nanotubos ainda est
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

116

longe de ser entendida, sendo que somente recentemente, aps mais de uma dcada aps a
primeira observao experimental dos nanotubos, comeam a aparecer estudos de dopagem de
nanotubos de parede simples (SWNT) de forma a conferir as propriedades eltricas de interesse
para utilizao destes nanomateriais em diversos setores de interesse da indstria eletro-eletrnica
e biomdica. Entretanto, o processo de dopagem ainda est longe de estar dominado. A primeira
etapa de um processo de desenvolvimento de dispositivos base de nanotubos passa
obrigatoriamente pelo domnio das tcnicas de crescimento.
Uma classe de nanotubos, que vem despertando um significativo interesse da comunidade
cientfica a de nanotubos de polmeros condutores. Neste trabalho, nanotubos de PANI foram
utilizados como mediadores de eltrons no processo de obteno de biossensores de glicose,
colesterol e uria.
Os nanotubos de polianilina e seus derivados formam uma classe de polmeros condutores
em relao ao processo de dopagem. Este material pode ser dopado por protonao, isto , sem
que ocorra alterao do nmero de eltrons (oxidao/reduo) associados cadeia polimrica. A
polianilina pode ocorrer em diferentes estados de oxidao, dos quais a forma esmeraldina, 50%
oxidada, a mais estvel.7
O produto da oxidao da anilina foi primeiramente preparado em 1862, porm suas
propriedades foram reconhecidas somente cerca de 100 anos depois (dcada de 80 do sculo 20),
despertando um interesse particular devido ao baixo custo de produo, facilidade de sntese e
alto rendimento. As snteses da polianilina e do polipirrol podem ser realizadas de maneiras
semelhantes sob a ao de um agente oxidante. No caso da polianilina, essencial manter um
meio com pH 1,0.
A forma base esmeraldina (isolante) do polmero pode reagir com solues de cidos
(HCl) resultando na forma sal esmeraldina (condutora). A reao de protonao ocorre
principalmente nos nitrognios imnicos da polianilina (-N=). Esse estado contm duas unidades
repetitivas, a amina-fenileno e a imina-quinona. Alm da elevada condutividade eltrica, que
chega ordem de 102 Scm-1, outra propriedade interessante da polianilina exibir diferentes
coloraes quando se variam as condies de pH ou o potencial eltrico (ver Tabela 8.1).

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

117

Tabela 8.1 Os trs estados de oxidao mais importantes da polianilina: leucoesmeraldina,

esmeraldina (isolante e condutora) e pernigranilina.8

* Os valores numricos referem-se ao comprimento de onda (em nanometros) onde a absoro


mxima.
Os nanotubos de polianilina podem ser sintetizados por trs mtodos de polimerizao:
qumica, eletroqumica e fotoeletroqumica.9 Dentre esses mtodos, a sntese qumica a mais
utilizada e industrialmente a mais vantajosa por possibilitar a produo de grandes quantidades
de material. Algumas rotas de sntese so muito simples e podem ser adaptadas para escala piloto
ou industrial (poli(p-fenil vinileno), polipirrol e polianilina).9-10
Neste trabalho, os biossensores de hemometablitos foram obtidos aps deposio de
eletroqumica de PANINTs sobre um filme fino de alumnio de acordo com metodologia
desenvolvida pelo grupo de biomateriais da Unifei.11 Como consequncia da nucleao de
monmeros de anilina nos poros de alumnio formados durante o processo de oxidao
eletroqumica, nanotubos de polianilina formando uma rede interconectada foram obtidos sobre a
matriz metlica.
A Figura 8.2 ilustra a micrografia MEV de nanotubos de PANI depositados no eletrodo de
alumnio (Al). A eletrodeposio de PANINTs foi efetuada na presena dos dendrmeros
bioconjugados com as respectivas protenas GOx, COx, Urease com a finalidade especfica de
obter-se o dispositivo biossensor.
Verificou-se que os PANINTs obtidos neste trabalho, apresentam dimetros de
aproximadamente 90 nm. A anlise das fibras de PANINTs indicou comprimentos de 1000 nm e
elevada rea superficial. Verificou-se que a presena dos dendrmeros bioconjugados induz a
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

118

formao de aglomerados de redes interconectadas. Entretanto, estudos de microscopia de


transmisso devem ser efetuados a fim de se caracterizar de modo mais adequado a estrutura dos
nanotubos de PANI obtidos neste trabalho.

(A)

(B)
Figura 8.2- Micrografia MEV de PANINTs contendo os dendrmeros bioconjugados

depositados eletroquimicamente em eletrodos de Al. Ampliaes: 5000 (A) e


15.000 x (B).
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

119

8.2 Caracterizao dos Dendrmeros

O peso molecular mdio e a polidisperso de dendrmeros so dois parmetros de maior


importncia para a determinao e explicao do comportamento fsico destes sistemas
macromoleculares.
Dendrmeros de peso molecular muito baixo geralmente apresentam uma menor rea
superficial, indesejvel para o projeto de biossensores, enquanto que os de peso molecular muito
elevado so muito pouco solveis e, geralmente, no possvel utiliz-los no revestimento de
superfcies sintticas.12-13
A cromatografia de permeao em gel (GPC), uma tcnica que tem sido destacada como
fundamental para a cincia macromolecular, uma tcnica de separao introduzida por Moore
em 1964 para a determinao da distribuio de pesos moleculares de um polmero.14 A tcnica
GPC utiliza colunas empacotadas com gis de poliestireno ou polietileno glicis reticulados de
diferentes porosidades constituindo a fase estacionria. O polmero dissolvido em um solvente
conveniente separado de acordo com seu volume hidrodinmico, ou seja, molculas pequenas
tendem a permanecer na fase estacionria enquanto que molculas grandes so excludas
preferencialmente da fase estacionria. Os detectores utilizados podem ser do tipo
refratomtricos, UV ou IR, dependendo da natureza do polmero.
A eficincia do processo de separao funo do volume de reteno (ou eluio) (VR) e da
massa molar do material. O volume de reteno por sua vez funo do volume intersticial Vo e o
volume do poro acessvel no gel, ou seja:
VR=V0+KDVi

(8.1)

sendo Vi o volume interno total do poro e KD o coeficiente de partio entre Vi e a poro


acessvel para um dado soluto. Quando KD = 0 (molculas grandes) VR = Vo, ocorrendo uma
eluio rpida da coluna. Para molculas pequenas que penetram no volume do poro, KD = 1 e a
eluio da coluna mais lenta.
Uma vez que o peso molecular de um polmero determinado por GPC no representa o
seu valor absoluto, ou seja, um valor obtido com base em uma curva de calibrao de polmeros
de conhecidos pesos moleculares, pode-se escrever:

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

120

log[]sMs = log[]uMu

(8.2)

sendo [] e M a viscosidade intrnseca e a massa molar do polmero, respectivamente. Os ndices


s e u representam o padro e a amostra em anlise, respectivamente.
Desde que os volumes hidrodinmicos da amostra e do padro no so necessariamente
iguais, tem-se que []s = KsMvss e []u = Ku.Mvuu. A massa molar da amostra u pode ser
determinada a partir de:15

log M u =

k 1 + vs
1
.log s +
log M s
1 + Vu
ku 1 + vu

(8.3)

Frequentemente as curvas de calibrao so construdas a partir de poliestireno (PS) ou


poli(etileno glicol) (PEG) sendo conhecidos o peso molcula absoluto do polmero. O peso
molecular absoluto de um polmero pode ser determinado a partir de tcnicas como o
espalhamento de luz e a osmometria.
Os dendrmeros estudados neste trabalho mostram uma distribuio de peso molecular
monomodal e um baixo ndice de disperso no peso molecular, obtendo o poliglicerol dendrtico
o menor valor (Mn/Mw = 1,05), isto pode ser verificado na Tabela 8.2.
As estruturas dendrticas do PPID, CHD e PGLD foram confirmadas por ressonncia
magntica nuclear (1H-NMR,

13

CNMR) e cromatografia de permeao em gel (GPC) em

trabalhos recentes do grupo.16-17-18 Os resultados obtidos quanto ao grau de ramificao, peso


molecular e ndice de polidisperso (PI) so apresentados na Tabela 8.2.
Tabela 8.2- Caractersticas fsico-qumicas caractersticas do PPID, CHD e PGLD sintetizados

neste trabalho.
Dendrmero

DB(a)

Mnx10-3 (b)

Mwx10-3 (b)

PIb (Mn/ Mw)

PPID

0.95

1.805

2.831

1.56

CHD

0.89

17.752

21.679

1.22

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

PGLD

0.82

121

16.724

17.564

1,05

(a)

DB=Degree of branching calculado por anlise NMR. (b)Calculado por anlise GPC.

A baixa disperso no peso molecular (Mn/ Mw) observada e o baixo grau de ramificao,
caracterizam as estruturas dendrticas PPID, CHD e PGLD.

8.3 Biossensores de glicose

A razo primria para integrar GOx a superfcies de dendrmeros, sinergisar as


capacidades

de

reconhecimento

moleculares

da

enzima

para

executar

funes

de

biossensoramento e ao mesmo tempo projetar dispositivos que operem a um baixo potencial e


curto tempo de resposta. As molculas de glicose podem sofrer a ao da enzima colesterol
oxidase, produzindo cido glucnico como ilustrado na Figura 8.3.
O problema central para ser resolvido na imobilizao de enzimas para fabricao de
biossensores a escolha do suporte.19 Sendo assim, um nmero de critrios como resistncia
microbiana, estabilidade trmica, inrcia qumica e grupos funcionais na superfcie do suporte,
precisam ser considerados quanto utilizao de suportes orgnicos para o desenvolvimento de
dispositivos biossensores.20

Figura 8.3- Oxidao da molcula de glicose pela ao da enzima glicose oxidase.21

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

122

Deve ser observado que a utilizao dos bioconjugados PGLD, CHD e PPID para
construo de biossensores de glicose podem facilitar a fabricao de dispositivos em nanoescala,
promovendo a integrao de componentes biolgicos a sistemas da microeletrnica a um nvel de
biocompatibilidade aceitvel para o projeto de sistemas implantveis.22-23
A Figura 8.4 ilustra a resposta da corrente em funo do potencial aplicado para os
dispositivos biossensores de glicose baseados nos dendrmeros PPID, PGLD e CHD. Observa-se
que a resposta do biossensor aumenta com o potencial aplicado.

350

(A)
300

(B)
250

I/nA

200

(C)

150

100

50

0
0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

E/V (vs SCE)


Figura 8.4- A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores PGLD (A), CHD

(B) e PPID (C) em NaPBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de Glicose: 20 mM.


Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

123

A relao corrente-tempo quando o potencial dos biossensores PPID, PGLD e CHD foi de
300 mV mostrada na Figura 8.5.

160

(A)
140

120

I (nA)

100

80

(B)

60

(C)

40

20

0
0

10

12

14

16

18

20

Tempo (s)
Figura 8.5- Curva de corrente-tempo para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C), a

300 mV, pH 7,4 e 37 oC, em soluo de glicose de 20 mM.


A maioria dos biossensores de glicose comercialmente disponvel possui tempo de
resposta de 12 segundos. Portanto, os biossensores de glicose desenvolvidos neste trabalho
apresentaram um tempo de resposta significativamente menor relativamente aos biossensores
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

124

comerciais. Considerando que a enzima est uniformemente distribuda nos sistemas dendrticos
estudados a saber; PGLD, CHD e PPID, a reao parece ocorrer predominantemente na
superfcie do biossensor a baixas concentraes de glicose. Entretanto, uma vez que os
fenmenos de difuso da carga eletrnica e de substrato so competitivos, o pequeno desvio
observado no tempo de saturao na corrente eletroqumica gerada na superfcie do transdutor
parece estar associada a processos de difuso ou o transporte de carga na interface
dendrmero/transdutor.
Foi visto que a corrente resposta dos eletrodos enzimticos alcana facilmente o estado de
estabilidade (saturao). Dos resultados na Figura 8.6 o pico de saturao da corrente para o
biossensor PGLD significativamente maior que para os bioconjugados PPID e CHD. O
decaimento observado na corrente resposta para o biossensor CHD e PPID pode estar relacionado
a um processo de inibio da atividade da GOx pelos grupos amina, protonados, na periferia do
CHD e PPID, respectivamente.
A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose mostrada na Figura 8.6.
Conforme pode ser observado, existe uma dependncia da corrente com a concentrao do
substrato indicando que todos os sistemas dendrticos bioconjugados parecem obedecer o modelo
proposto por Michaelis-Menten.
A constante aparente de Michaelis-Menten (KappM), que d indicao da cintica enzimasubstrato para o biossensor de glicose baseado na imobilizao da GOx nos dendrmeros PPID,
CHD e PGLD podem ser calculadas pela equao eletroqumica de Lineweaver-Burk:24

1
i SS

K app M 1
1
+
i Max [ S ] i Max

(8.1)

sendo iSS a corrente de estado-constante depois da adio do substrato, iMax a mxima corrente
medida abaixo da condio de saturao do substrato e [S] a maior concentrao de substrato.
O grfico de Lineweaver-Burk 1/iSS versus 1/[S] dos bioconjugados PGLD, PPID e CHD
imobilizados em nanofibras de PANI mostrado em Figura 8.7 a partir dos quais foi possvel
calcular os valores das correspondentes constantes cinticas, cujos valores esto mostrados na
Tabela 8.3.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

125

200

(A)

160

(B)

I (nA)

120

80

(C)

40

0
0

10

20

30

40

50

Concentrao de glicose (mM)

Figura 8.6- A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose para os biossensores

PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS e pH 7,4 a 37 oC.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

126

0,040

0,035

(C)

0,030

-1

I (nA )

0,025

-1

0,020

(B)
0,015

(A)
0,010

0,005
0,00

0,05

0,10

0,15
-1

0,20

0,25

0,30

-1

[S] (mM )
Figura 8.7- Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores PGLD (A), CHD

(B) e PPID (C). PGLD: [I]-1= 0,02708[S]-1+0,00474 (r2= 0.999), CHD: [I]-1=
0,04351[S]-1 +0,00648 (r2=0.997) e PPID: [I]-1=0,09491[S]-1 +0,01258 (r2=0.994).

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

127

Tabela 8.3- Parmetros cinticos eletroqumico para a GOx imobilizada nos dendrmeros PGLD,

CHD e PPID.
Dendrmero

KMapp (mM)

iMax (nA)

KMapp / iMax

PGLD

5.71

210.97

0.027

CHD

6.71

154.32

0.043

PPID

7.54

79.49

0.095

GOx solvel

5,94 mM 25

--------

--------

A constante de Michaelis, KappM, foi maior para o bioconjugado PPID-GOx, que para o
bioconjugado CHD-GOx e PGLD-GOx. A KappM relacionada concentrao do substrato que
alcana a taxa mxima da reao enzima-catlise. Assim, o menor valor de KappM, a menor
concentrao de substrato para obter o valor mximo da reao enzima-catlise. Para o menor
valor de KappM, maior a afinidade da enzima para o substrato. Deste modo, o dendrmero PGLD
parece ser um promissor portador de GOx. O novo biossensor projetado baseado no aumento da
incorporao de GOx no dendrmero PGLD exibiu melhor desempenho analtico em relao
configuraes dos biossensores que usam os dendrmeros CHD ou PPID.
A topologia do dendrmero um importante parmetro molecular que determina suas
propriedades fsicas e suas aplicaes. Para controlar a topologia do dendrmero e arquitetura
com preciso, atualmente o tema central na cincia dos polmeros com enfoque para o preparo
de macromolculas com novas propriedades.26
A periferia da unidade dendrtica dos dendrmeros CHD e PPID preenchida com grupos
primrios amina, enquanto todos os pontos ramificados, no interior do dendrmero, so ocupados
por amina terciria. possvel que as funes amina primrias, presentes na periferia da unidade
dendrtica pode tambm participar atravs das ligaes de hidrognio com o local cataltico da
enzima, resultando em um decrscimo da bioatividade dos biossensores CHD e PPID.
O baixo desempenho dos bioconjugados PPID e CHD em relao ao PGLD pode ser
explicado em exame das estruturas qumicas do PPID e CHD. Ambos, PPID e CHD so
polmeros catinicos altamente ramificados que possuem aminas primrias, secundrias e
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

128

tercirias. Estes grupos so protonados em pH fisiolgico, tornando o polmero positivamente


carregado. Sua forte carga catinica interage com o local ativo da enzima, reduzindo a atividade
da enzima.
Um dos aspectos mais importantes a ser considerado em imobilizao de enzima a
estabilidade de armazenamento. A estabilidade dos bioconjugados PPID-GOx, CHD-GOx e
PGLD-GOx foi estudada por imerso do biossensor em soluo de PBS pH 7,4 a 4oC por
perodos de tempo predeterminados. Solues de GOx livre tambm foram preparadas e
armazenadas sob as mesmas condies e as atividades relativas dos biossensores PPID, CHD e de
PGLD foram determinados. A atividade relativa (RA) foi definida como a relao das atividades
dos bioconjugados observadas sobre a atividade obtida de uma quantia equivalente da enzima
livre.
Como pode ser visto na Figura 8.8, a ligao covalente da GOx sobre o dendrmero
PGLD tambm apresenta alta estabilidade em relao ao sensor de PANINTs/CHD-GOx e
PANINTs/PPID-GOx, cuja sensibilidade parece quase inalterada com o tempo de
armazenamento durante as primeiras 3 semanas. Com uma maior estabilidade, tem-se a garantia
de que com o decorrer do tempo, a resposta do biossensor continuar estvel, garantindo a
confiabilidade do resultado.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

129

1,2
1,1

Sensibilidade normalizada

1,0

(A)

0,9
0,8
0,7
0,6

(B)

0,5
0,4
0,3

(C)

0,2
0,1
0

10

15

20

25

30

Dias

Figura 8.8- Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para glicose medida para os

biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais representam a
incerteza das medidas em trs sensores diferentes. Quando no em uso, os sensores
foram armazenados em NaPBS (0.1 M, pH 7,4) a 4 oC.
Uma diminuio constante observada para o PANINTs/CHD-GOx e PANINTs/PPIDGOx, provavelmente devido a um efeito de inibio da estrutura de CHD e PPID na atividade da
GOx. A mais baixa estabilidade dos biossensores de CHD e PPID pode ser devido a uma
distribuio menos homognea de GOx na superfcie do sensor, que tambm poderia resultar em
uma certa restrio no acesso de glicose para o stio ativo da enzima.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

130

8.4- Biossensores de colesterol

A maioria dos biossensores de colesterol comercial possui limite de leitura de 150 a 300
mg/dL e tempo de resposta de 180 segundos. Esses biossensores so vendidos em lotes
separadamente do dispositivo eletrnico para anlise.
As molculas de colesterol podem sofrer a ao da enzima colesterol oxidase, produzindo
4-colesten-3-ona e perxido de hidrognio, como ilustrado na Figura 8.9.

Figura 8.9- Representao da reao de catlise da enzima colesterol oxidase.

O biossensor para colesterol foi analisado atravs de ensaios in vitro com solues de
colesterol com diferentes concentraes. A medida da resposta do biossensor foi feita em um
multmetro Keithley modelo K 237, lendo-se a corrente gerada pelo dispositivo. A Figura 8.10
ilustra a relao entre a corrente e o potencial aplicado.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

131

350

(A)
300

250

I/A

200

(B)
150

100

(C)
50

0
0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E/V (vs SCE)


Figura 8.10- A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores PGLD (A), CHD

(B) e PPID (C) em PBS pH 7.02 a 37 oC. Concentrao de colesterol: 1 mmol.dm-3.


Sendo um biossensor um dispositivo analtico, esperado que este apresente uma boa
sensibilidade frente ao analito a ser determinado. Alm de carter sensvel, esperado tambm
que um biossensor seja relativamente rpido quanto monitorao do analito.
Uma anlise in vitro do comportamento do biossensor obtido neste trabalho foi realizada
frente concentrao de colesterol. A Figura 8.11 mostra a resposta dos biossensores baseados
nos bioconjugados PGLD/COx, CHD/COx e PPID/COx em funo do tempo em uma soluo de
colesterol a uma concentrao de 1 mM. A resposta do biossensor cresce com o aumento do
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

132

tempo, indicando que o processo pelo qual o analito (colesterol) chega a superfcie do eletrodo
disfuncional. Este processo se deve ao gradiente de concentrao existente entre o seio da soluo
fisiolgica e a superfcie do eletrodo. A concentrao do analito na superfcie do eletrodo e no
seio da soluo a mesma, caso o sistema se encontre em passagem de corrente. No incio da
varredura catdica, ocorre a polarizao do eletrodo com o aparecimento de uma corrente de
reduo. O perxido de hidrognio formado pela oxidao enzimtica do colesterol reduzido
eletroquimicamente na superfcie do eletrodo, levando a um gradiente de concentrao e, assim,
observa-se a formao de uma corrente difusional. Consequentemente diz-se que o processo
difusional controla a chegada do analito ao eletrodo. A saturao na curva Ixt (Figura 8.11)
ocorre mais rapidamente nos biossensores de CHD e PPID significando que a difuso do analito
menor nestes dois materiais.
A Figura 8.12 mostra a dependncia da resposta do biossensor frente concentrao de
colesterol. Quando a concentrao de colesterol muito baixa, ocorre um decrscimo na
atividade da enzima, contudo se a concentrao da enzima for muito alta, pode ocorrer uma
inibio do substrato. Como pode ser observado na Figura 8.12, observa-se uma saturao nas
respostas dos biossensores de CHD e PPID a 1 mM. Neste caso associaes do colesterol via
ligaes de hidrognio com a periferia do dendrmero poderia reduzir significativamente a
difuso do analito e conseqentemente levar uma saturao mais rpida na corrente. Para o
biossensor de PGLD a saturao ocorreu somente a 60 mM, indicando que a difuso do analito
neste bioconjugado parece ser maior, relativamente aos biossensores de CHD e PPID.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

133

350

(A)

300

250

I/A

200

150

(B)

100

(C)
50

0
0

20

40

60

80

100 120 140 160 180 200

Tempo (s)
Figura 8.11- Dependncia de tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD

(B) e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de colesterol: 1 mM.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

134

300

(A)

250

I/A

200

(B)
150

100

(C)

50

0
0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

[Cho]/mM
Figura 8.12- A relao entre corrente resposta para o PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) eletrodos

enzimticos e concentrao de colesterol de 0,1 M PBS, pH 7,02 a 37 oC e 0,8 V.


O efeito da concentrao do substrato, colesterol, na resposta dos biossensores PGLD,
CHD e PPID apresentado na Figura 8.12. Desta Figura observa-se que todas as formas de COx
obedecem uma cintica prevista pelo modelo de Michaelis-Menten. A seguir, aplicando-se o
mtodo de linearizao preconizado por Lineweaver-Burk, obteve-se a Figura 8.13, da qual foi
possvel calcular os valores das correspondentes constantes cinticas, cujos valores esto
mostrados na Tabela 8.4.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

135

Tabela 8.4- Parmetros cinticos eletroqumico para a COx imobilizada em dendrmeros

bioconjugados.
Dendrmero

KMapp (mM)

iMax (nA)

KMapp / iMax

PGLD

0,84

87,56

0,0096

CHD

0,92

58,46

0,0171

PPID

6,25

0,34

18,621

COx Livre

1,3215 27

------

-----

Observa-se que os valores da constante de Michaelis-Menten so significativamente


maiores para o bioconjugado PPID relativamente enzima livre. Esta observao experimental
pode ser devido ao fato de que o processo de imobilizao parece perturbar de alguma forma o
stio ativo da enzima. Neste sentido, os bioconjugados PGLD e CHD parecem ser mais
adequados para o projeto de dispositivos biossensores. Entretanto, deve-se observar que a
comparao direta em termos absolutos dos valores das constantes cinticas das formas solvel e
imobilizada da enzima colesterol oxidase com os da literatura difcil, devido s diferentes
condies de medida da atividade, da origem e do grau de pureza da enzima e do tipo de
imobilizao e de suportes utilizados.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

136

1,2

(C)
1,0

0,6

-1

I /A

-1

0,8

0,4

(B)

0,2

(A)
0,0
0

6
-1

10

-1

[Cho] /mM

Figura 8.13- Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores de colesterol

PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A): [I]-1 =0.0096 [S]-1 0.01142
(r2=0.941), CHD (B): [I] -1 = 0,0159 [S]-1-0,0171 (r2=0.950) e PPID: [I]-1=18,621
[S]-1 + 2,977 (r2=0.854).
A Figura 8.14 ilustra a sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para a
medida de colesterol para os biossensores de PGLD(A), CHD (B) e PPID (C). Observa-se na
Figura 8.14 uma queda acentuada na resposta do biossensor com o tempo de armazenamento para
os bioconjugados CHD e PPID relativamente ao bioconjugado PGLD. O fato de a resposta decair
mais acentuadamente para os bioconjugados amnicos seria justificado como sendo devido
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

137

alteraes na estrutura terciria da enzima devido a associaes do tipo ligao de hidrognio


com o stio ativo da enzima. Entretanto, estudos sobre a densidade de cargas (potencial zeta) da
superfcie dos dendrmeros CHD e PPID so necessrios para confirmar esta hiptese.

1,1
1,0

Sensibilidade normalizada

0,9
0,8
0,7

(A)

0,6
0,5
0,4

(B)

0,3
0,2

(C)

0,1
0,0
0

10

15

20

25

30

Dias

Figura 8.14- Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para medida de colesterol

para os biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais
representam a incerteza das medidas em trs sensores diferentes. Quando no em
uso, os sensores foram armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

138

8.5- Biossensores de uria

fato conhecido da literatura de que existe atualmente um grande interesse voltado para a
incorporao de materiais nanoestruturados na construo de biossensores para que a transduo
do sinal qumico resultante da reao enzimtica seja mais eficiente, seja pela contribuio da
grande rea superficial desses materiais ou pela facilidade do analito se difundir atravs da
nanoestruturas.
A metodologia de nanoestruturao do biossensor de uria adotado neste trabalho
analogamente aos outros biossensores se baseou na formao de um depsito dos dendrmeros
bioconjugados dispersos regularmente nos interstcios dos nanotubos de polianilina, obtidos pela
tcnica de matriz digitalizada por eletropolimerizao, conforme discutido anteriormente.
A dosagem da uria no sangue empregada principalmente para avaliar doenas renais e
hepticas. Neste trabalho estudou-se a deteco eletroqumica da amnia pelos bioconjugados
dendrticos PGLD, CHD e PPID. A enzima imobilizada nas superfcies dendrticas foi a urease.
Uma vez que esta enzima capaz de catalisar a decomposio da uria em amnia, os
dispositivos desenvolvidos neste trabalho podem ser denominados de biossensores de uria,
conforme exemplificado na Figura 8.15.

Figura 8.15- Esquema do biossensor de uria.

A Figura 8.16 ilustra a relao entre a corrente amperomtrica e o potencial aplicado para
a deteco de amnia para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). Como pode ser
observado, a resposta do biossensor aumenta com o potencial aplicado saturando em cerca de 600
mV para os sistemas estudados. Observa-se que a sensibilidade de deteco do filme de PGLD
significativamente maior para o dendrmero de PGLD indicando que esta nanoestrutura parece
ser mais apropriada para a imobilizao da enzima relativamente aos dendrmeros amnicos.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

139

A Figura 8.17 mostra a resposta dos biossensores baseados nos bioconjugados


PGLD/COx, CHD/COx e PPID/COx em funo do tempo em uma soluo de uria a uma
concentrao de 10 mM. A resposta do biossensor cresce com o aumento do tempo, indicando
que o processo pelo qual o analito (uria) chega a superfcie do eletrodo difusional. Este
processo se deve ao gradiente de concentrao existente entre o seio da soluo fisiolgica e a
superfcie do eletrodo como j discutido anteriormente.
A Figura 8.18 mostra a dependncia da resposta do biossensor frente concentrao de
uria. Quando a concentrao de uria muito baixa, ocorre um decrscimo na atividade da
enzima, contudo se a concentrao da enzima for muito alta, pode ocorrer uma inibio do
substrato. Como pode ser observado na Figura 8.18, observa-se uma saturao nas respostas dos
biossensores de PGLD e CHD a 50 mM enquanto que para o dendrmero de PPID a saturao
ocorre a 40 mM. Neste caso associaes do de ons amnia via ligaes de hidrognio com a
periferia do dendrmero de PPID poderia reduzir significativamente a difuso do analito e
consequentemente levar a uma saturao mais rpida na corrente. Ao mesmo tempo observa-se
que o comportamento das enzimas parece concordar com a cintica prevista pelo modelo de
Michaelis-Menten. Aplicando-se o mtodo de linearizao preconizado por Lineweaver-Burk,
obteve-se a Figura 8.19, da qual foi possvel calcular os valores das correspondentes constantes
cinticas, cujos valores esto mostrados na Tabela 8.5.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

140

600

(A)
500

I/nA

400

300

200

(B)

100

(C)

0
0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E/V (vs SCE)


Figura 8.16 A relao entre corrente resposta e o potencial para os biossensores PGLD (A),

CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS, pH 7,02 e 37 oC. Concentrao de uria:
10 mM.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

141

500

(A)
400

I/nA

300

200

(B)
100

(C)

0
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (s)

Figura 8.17- Dependncia do tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD

(B) e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

142

(A)
400

I/nA

300

(B)

200

100

(C)

0
0

20

40

60

80

100

Concentrao de uria(mM)

Figura 8.18- A relao da corrente resposta dos eletrodos enzimticos PGLD (A), CHD (B) e

PPID (C) e a concentrao de uria em 0,1 M PBS, pH 7,02 a 37 oC e 0,6 V.


A linearizao da relao da corrente resposta dos eletrodos enzimticos PGLD (A), CHD
(B) e PPID (C) e a concentrao de uria est ilustrada na Figura 8.16.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

143

0,05

(C)
0,04

(B)

-1

I /nA

-1

0,03

0,02

(A)
0,01

0,00
0,00

0,05

0,10

Concentrao de uria (mM)

Figura 8.19- Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores de uria baseados

nos sistemas PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A): [I]-1 =0.168[S]-1
9.86.10-4 (r2=0.990), CHD (B): [I]=0,321[S]-1-0,0011 (r2=0.994) e PPID: [I]1

=0.305 [S]-1 + 0.016 (r2=0.999).

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

144

Tabela 8.5- Parmetros cinticos eletroqumicos para a enzima urase imobilizada nos

dendrmeros PGLD, CHD e PPID.


Dendrmero

KMapp (mM)

iMax (nA)

KMapp / iMax

PGLD

170,39

1,04.103

0,168

CHD

291,81

909,09

0,321

PPID

19,06

62,5

0,305

Urease Solvel

4,0 mM 28

-----------

------------

Observa-se que os valores da constante de Michaelis-Menten so significativamente


maiores para os bioconjugados PPGLD e CHD indicando que a estrutura mais propcia para o
projeto de biossensores de uria o dendrmero de PPID. Esta observao experimental pode
estar relacionada maior afinidade existente entre o dendrmero de PPID e ons amnia, gerada
pela reao catalizada pela urease. Ressalta-se que, similarmente aos estudos anteriores, a
comparao direta em termos absolutos dos valores das constantes cinticas obtidas neste
trabalho das formas solvel e imobilizada da enzima urease com os da literatura no parece ser
adequado devido s diferentes condies de medida da atividade, da origem e do grau de pureza
da enzima e do tipo de imobilizao e de suportes utilizados.
A sensibilidade em funo do tempo de armazenamento em soluo PBS para uria dos
biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) est ilustrada na Figura 8.20. Observa-se na
Figura 8.20 uma queda acentuada na resposta do biossensor com o tempo de armazenamento para
os bioconjugados CHD e PPID relativamente ao bioconjugado PGLD. O fato de a resposta decair
mais acentuadamente para os bioconjugados amnicos seria justificado como sendo devido
alteraes na estrutura terciria da enzima urease devido a associaes do tipo ligao de
hidrognio com o stio ativo da enzima. Entretanto, como citado anteriormente, estudos sobre a
densidade de cargas (potencial zeta) da superfcie dos dendrmeros CHD e PPID so necessrios
para confirmar esta hiptese.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

145

1,2

Sensibilidade normalizada

1,0

0,8

(A)

0,6

(B)
0,4

0,2

(C)

0,0
0

10

15

20

25

30

Dias

Figura 8.20- Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para uria medida para os

biossensores de uria baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As
barras verticais representam a incerteza das medidas em trs sensores diferentes.
Quando no em uso, os sensores foram armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC.
8.6- Determinao dos hemometablitos glicose, colesterol e uria simultaneamente
utilizando uma RNA

Os biossensores representam atualmente uma ferramenta promissora para suplementar as


tcnicas da qumica clnica existentes, devido as suas caractersticas nicas, tais como:
seletividade; relativo baixo custo de construo e estocagem; potencial para miniaturizao;
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

146

facilidade de automao e construo de equipamentos simples e portteis para um


monitoramento pelo prprio paciente. Entretanto, necessrio enfatizar que a determinao
simultnea de hemometablitos ainda permanece um desafio devido dificuldade da
determinao simultnea de vrias variveis.
Uma anlise mais completa dos constituintes do sangue aumenta tambm a complexidade
do problema, conduzindo ao uso de ferramentas estatsticas mais sofisticadas, dentre as quais a
mais simples sem dvida a regresso linear mltipla. Outras tcnicas como as anlises de
componentes principais e anlises de agrupamento hierrquicas tambm podem ser utilizadas.29
Tem-se observado na literatura que em qumica analtica, os problemas classicamente resolvidos
por tcnicas multivariadas como, por exemplo, a anlise dos componentes de uma mistura; tem
sido atualmente comparado com a soluo atravs de redes neurais.30
Como j mencionado anteriormente, as RNAs so programas computacionais que imitam
o funcionamento do crebro humano atravs de uma estrutura em rede, na qual as informaes
so passadas camada de entrada, processadas em uma ou mais camadas escondidas (tambm
chamadas intermedirias) e o resultado emerge na camada de sada. Estes sistemas
computacionais funcionam por meio de aprendizagem, que pode ser supervisionada ou nosupervisionada.
A aprendizagem supervisionada consiste em fornecer informaes rede atravs dos
dados de entrada e dos resultados desejados. A rede, na fase de treinamento, utiliza os dados de
entrada e, atravs de pesos, tenta chegar ao resultado desejado pelo supervisor.
Neste trabalho foi utilizado a RNA mais simples, do tipo Backpropagation, que utiliza a
aprendizagem supervisionada e um algoritmo utiliza a retroalimentao, ou seja, neste tipo de
rede, os pesos so modificados durante o clculo de modo que o prximo peso ser dado em
funo do peso atual, da diferena entre a sada desejada e a sada atual e da denominada taxa de
aprendizado. O processo foi considerado concludo quando os resultados obtidos nesta fase de
treinamento reproduziram adequadamente a sada desejada. Neste sentido, foram utilizadas
solues onde a composio dos hemometablitos uria, glicose e colesterol de 11 amostras com
concentraes de glicose, colesterol e uria foram variadas de 0 a 24 mM, 0 a 1,2 mM e 0 a 40
mM em soluo tampo PBS pH 7,4, respectivamente (Tabela 8.6).

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

147

Tabela 8.6- Concentraes das solues dos hemometablitos glicose, uria e colesterol para

treinamento da rede neural.


[Glicose]
0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
20,0
24,0

[Colesterol]
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1,0
1,2

[Uria]
0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
28,0
32,0
36,0
40,0

Foram obtidas 11 curvas IxV sendo cada intensidade da curva tomada como entrada na
RNA. Pesos apropriados foram aplicados para treinamento do algoritmo at que os resultados
esperados fossem atingidos dentro do erro estabelecido.
As Figuras 8.21 a 8.23 ilustram os resultados obtidos na determinao simultnea dos
hemometablitos glicose, colesterol e uria utilizando a RNA tipo backpropagation. O erro
quadrtico mdio para os conjuntos de treinamento foi aproximadamente de 1,5%, portanto a
rede consegue reproduzir bem o teor de hemometablitos das amostras utilizadas na sua
construo.
A Tabela 8.7 mostra os resultados obtidos pela aplicao da RNA treinada a um conjunto
teste. A RNA treinada parece ser adequada para a determinao dos hemometablitos glicose,
uria e colesterol uma vez que os erros absolutos foram baixos.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

148

Tabela 8.7- Erro obtido durante o teste da rede neural para os hemometablitos colesterol,

glicose e uria em ensaios in vitro.


Amostras

Valor esperado

Valor obtido

Erro Absoluto (%)

(mM)

(mM)

Glicose

0,000

0,003

-0,3

Glicose

3,890a

3,873

1,7

Glicose

6,132b

6,095

3,7

Uria

0,000

0,009

-0,9

Uria

1,340c

1,309

3,1

Uria

3,351d

3,312

3,9

Colesterol

0,000

-0,001

0,1

Colesterol

1,200

1,185

1,5

Colesterole

1,200

1,185

1,5

a,b

Correspondentes aos limites clnicos superior e inferior para glicose, respectivamente.

c,d

Correspondentes aos limites clnicos superior e inferior para uria, respectivamente.

Correspondente ao limite clnico desejvel para colesterol total.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

149

25

Valores Obtidos
[Glicose] (mM)

20

15

10

0
0

10

15

20

25

V a lo re s E sp e ra d o s
[G lico se ] (m M )

Figura 8.21- Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA para as

concentraes de glicose. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos: Y = 1,023


(+0,014) [Glicose] - 0,335 (+0,177), R= 0,999.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

150

1,4

1,2

Valores Obtidos
[Colesterol] (mM)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0,0

0 ,2

0 ,4

0,6

0 ,8

1,0

1 ,2

V a lo re s E s p e ra d o s
[C o le s te ro l] (m M )

Figura 8.22- Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA para as

concentraes de colesterol. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos: Y =0,943


(+ 0,025) [Colesterol] 0,02452 (+ 0,0159), R = 0,997.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 8- Resultados e discusses

151

50

40

Valores Obtidos
[Uria] (mM)

30

20

10

0
0

10

20

30

40

V a lo re s E s p e ra d o s
[U r ia ] (m M )

Figura 8.23- Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA para as

concentraes de uria. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos: Y = 0,998 (+


0,008) [Uria] 0,500 (+ 0,0190), R = 0,999.
8.7- Referncias

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Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 9- Concluses

154

Captulo 9- Concluses
O estudo das propriedades cinticas dos dendrmeros PGLD, CHD e PPID
bioconjugados com as enzimas GOx, COx e urease foi realizado atravs de ensaios
eletroqumicos para anlise da resposta do biossensor ao seu respectivo substrato. Cada ensaio
foi essencial tanto para a caracterizao dos dendrmeros quanto sua utilizao como
nanoplataforma para imobilizao do biocatalizador quanto sua performance na anlise
clnica dos hemometablitos glicose, colesterol e uria.
Em linhas gerais, concluiu-se deste trabalho que os dendrmeros PGLD, CHD e PPID
bioconjugados com as enzimas GOx, COx e urease apresentam respostas eletroqumicas
diferenciadas em presena dos substratos glicose, colesterol e uria, respectivamente. Dentre
os bioconjugados, mereceu destaque o bioconjugado baseado no dendrmero PGLD que
apresentou alta estabilidade operacional e de armazenamento. No caso particular dos
dendrmeros CHD e PPID, concluiu-se serem necessrios estudos mais aprofundados do
trinmio densidade de cargas/difuso do substrato/topologia. Finalmente, os resultados
obtidos neste trabalho permitem as seguintes concluses:

9.1- Quanto ao mediador de eltrons


a) A polianilina depositada eletroquimicamente pela tcnica da matriz digitalizadora
apresentou estrutura de nanotubos com elevada rea superficial.
b) Os nanotubos de polianilina apresentaram comportamento eltrico adequado para
atuarem no processo de transferncia eletrnica nas reaes enzimticas.

9.2- Quanto aos dendrmeros


a) Os sistemas macromoleculares PGLD, CHD e PPID apresentaram baixa polidisperso
e grau de ramificao prximo de 1, propriedades estas caractersticas de dendrmeros.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 9- Concluses

155

9.3- Quanto aos biossensores


a) As caractersticas eltricas observadas permitem concluir uma boa homogeneidade na
distribuio dos bioconjugados na rede de nanotubos de polianilina.
b) Os bioconjugados de PGLD apresentaram melhor resposta biossensora relativamente
aos bioconjugados de CHD e COx.
c) A constante aparente de Michaelis-Menten (KMapp) para os bioconjugados baseados no
PGLD so: 5,71 mM (GOx), 0,84 mM (COx) e 170,39 (urease).
d) A constante aparente de Michaelis-Menten (KMapp) para os bioconjugados baseados no
CHD so: 6,71 mM (GOx), 0,92 mM (COx) e 291,81 (urease).
e) A constante aparente de Michaelis-Menten (KMapp) para os bioconjugados baseados no
PPID so: 7,54 mM (GOx), 6,25 mM (COx) e 19,06 (urease).
f) As constantes cinticas indicaram que o PGLD como a nanoplataforma mais adequada
para o preparo de biossensores dos hemometablitos glicose, colesterol e uria.
g) Os biossensores desenvolvidos nesta dissertao apresentaram a corrente resposta aos
hemometablitos em tempo inferior aos valores da literatura/comerciais.
h) A relao entre a corrente resposta e o potencial aplicado para os biossensores
amperomtricos desenvolvidos neste trabalho foram da ordem de 400 mV (glicose),
700 mV (colesterol) e 600 mV (uria).
i) Os bioconjugados baseados no dendrmero de PGLD apresentaram uma maior
estabilidade quanto ao tempo de armazenamento em soluo fisiolgica, relativamente
s enzimas livres.
j) A rede neural construda para a determinao dos hemometablitos mostrou-se
eficiente durante a fase de treinamento e teste da rede. Entretanto, a aplicao da rede
deve ser validada frente a amostras clnicas reais.

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

Captulo 10- Perspectivas futuras

156

Captulo 10- Perspectivas futuras


O nmero de pessoas com disfunes hemometablicas nos nveis de glicose, colesterol e
uria tem se mostrado elevado no Brasil e no mundo. Os altos nveis destes metablitos no
sangue fator de risco para o desenvolvimento de vrias complicaes, como diabetes, infarto do
miocrdio, amputao de membros inferiores, hemodilise, perda da viso dentre outras.
Sistemas inteligentes para o monitoramento de hemometablitos representam um elevado
potencial de crescimento mercadolgico. Os biossensores j tm sido utilizados para tal
finalidade, contudo, ainda grande o nmero de pessoas que ainda no tm acesso ao
monitoramento dos nveis de glicose, colesterol e uria, devido ao alto custo dos dispositivos
atuais. Neste sentido, espera-se que o presente trabalho possa despertar o interesse para o
desenvolvimento de biossensores nacionais.
Algumas etapas necessitam ser estudadas e analisadas cuidadosamente quanto ao projeto
de um biossensor multienzimtico genuinamente nacional. Neste sentido, esta dissertao se
props a estudar novas plataformas orgnicas para a imobilizao de enzimas. Como j citado
anteriormente, a imobilizao de enzimas representa uma etapa essencial no projeto de
biossensores.
As perspectivas de continuidade deste trabalho repousam em trs aspectos principais a
saber, validar clinicamente o biossensor obtido, avaliar as propriedades biocompatveis com
vistas obteno de um biossensor implantvel, desenvolver um chip de armazenamento de
dados no voltil (EPROM- erasable programmable read-only memory).

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