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Western Blot

1. Introdução
A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de
proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a
elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extração e quantificação
das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3)
transferências dessas proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um
anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e (5) revelação dessa
membrana para análise dos dados.

2. Extração e quantificação de proteínas
Para realização dos experimentos de western blotting é necessário, inicialmente,
realizar a extração e a quantificação das proteínas. Diversos métodos espectroscópicos são
utilizados para quantificar proteínas em uma solução. O ensaio de Bradford é o mais
utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como rapidez, não exige
aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. O método de
Bradford se baseia na mudança de cor do corante Coomassie Blue G-250 em solução ácida
(cor avermelhada) para cor azulada na presença de proteínas. As interações hidrofóbicas e
iônicas estabilizam o complexo proteína-corante. Para quantificar a concentração de
proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de padronização com concentrações
conhecidas de uma proteína (comumente se utiliza soroalbumina bovina, BSA) versus
absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve).
A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os
valores médios de absorbâncias das amostras, obtendo-se assim os valores da
concentração das proteínas. É importante ressaltar, que para uma maior confiabilidade dos
resultados, o coeficiente de correlação linear deve ser maior que 0,98.

3. Fracionamento de proteínas
Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de
SDS-poliacrilamida, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão
migrar. O gel é preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos
poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para
retardar a migração da sua proteína de interesse. As proteínas podem possuir cargas
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem. É
utilizado, então, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado
negativamente, que se liga nas regiões hidrofóbicas das moléculas de proteínas
mascarando a carga intrínseca, e permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo

(2) elas se ligam na mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas (Figura 1b. pois é capaz de separar todos os tipos de proteínas. A técnica de SDS-PAGE é largamente utilizada. Essas proteínas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por coloração direta do gel. fazendo com que elas voltem a sua estrutura primária. O nitrato de prata é um dos métodos mais sensíveis de detecção. como as proteínas são separadas por tamanho. Além disso. mantendo assim. o SDS quebra as ligações não covalentes das proteínas. Além disso. que permite a visualização de proteínas de até 10ng.positivo em um campo elétrico. geralmente. liberadas da associação com outros monômeros ou outras proteínas e moléculas de lipídeos. proteínas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida. um agente redutor tal como o β-mercaptoetanol. enquanto que a coloração por Coomassie-Blue . na presença de um campo elétrico com as mesmas velocidades. usa-se. outras proteínas ou mesmo a estrutura terciária da mesma proteína. mesmo aquelas que são normalmente insolúveis em água (como por exemplo muitas proteínas de membranas). uma vez que (1) suas estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao βmercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e. c). por corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata. é possível estimar o peso molecular e a composição das subunidades da proteína. que quebra as ligações dissulfito (S-S) dos resíduos de cisteína que promovem a ligação de proteínas a outros monômeros. A partir dessas condições. as proteínas separadas e linearizadas (Figura 1a). Além disso.

Essa transferência das proteínas do gel para a membrana inicialmente era feita por meio da capilaridade. Para que isso seja possível é necessário utilizar anticorpos específicos para a proteína desejada. . o SDS-PAGE somente não permite a análise de proteínas individuais e separadas. 4) Transferência para membrana Embora seja essencialmente uma técnica analítica. mas atualmente usa-se a transferência eletroforética que é muito mais rápida e eficiente (Figura 3). como membranas de nitrocelulose.detecta proteínas de até 300ng. PVDF ou de catiônicas de nylon. A Figura 2 representa proteínas coradas com CoomassieBlue e com Nitrato de Prata. é preciso que essas proteínas estejam em um suporte sólido. mas antes.

e particulares epítopos antigênicos podem ser melhor preservados em um tipo em relação a outro. Os detalhes de cada tipo de membrana podem ser visualizados na Tabela 2. . nylon ou PVDF (polyvinylidene fluoride). Diferentes proteínas podem se ligar com eficiências diferentes nessas membranas.Existem três tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose.

permitindo localizar a proteína de interesse. pode ser policlonal (reconhece mais de um epítopo) ou monoclonal (reconhece apenas um epítopo da proteína de interesse) e é produzido geralmente em camundongo ou em coelho. Depois da lavagem. ou seja. Nos locais onde essa enzima está presente (apenas nos locais onde tem o anticorpo primário. adiciona-se um substrato dessa enzima. pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting. a membrana é lavada intensamente com tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que não está especificamente ligado à proteína de interesse. no momento da revelação da membrana. . ocorrerá a reação e a formação do produto dessa reação. será utilizado um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo. depois disso. Por exemplo. Além disso. a membrana é incubada com um anticorpo secundário. Esse anticorpo secundário possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de interesse. e aparecerá a marcação nas regiões em que ocorreu essa reação. ou seja. As principais modificações utilizadas atualmente são (Figura 4): a) Conjugação do anticorpo com uma enzima: tais como peroxidade ou fosfatase alcalina. é um anticorpo que reconhece um anticorpo.Depois de terminado o tempo de aplicação da corrente elétrica. e verificar se essa transferência ocorreu de maneira igual para todas as amostras. esse anticorpo não possui nenhum tipo de radiomarcação. Esse anticorpo é denominado anticorpo primário. na proteína específica). Em caso afirmativo. que reconhecerá qualquer anticorpo produzido em camundongo. produzido em camundongo. É utilizado um filme. usa-se um corante denominado Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana. Esse anticorpo é um anti-IgG. ou conjugação com alguma enzima. Neste caso. 5) Detecção da proteína específica Para visualizar uma proteína de interesse é utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um epítopo da proteína. formando um complexo anticorpo-antígeno. se foi utilizado um anticorpo primário anti uma proteína de interesse. A incubação da membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre overnight a 4ºC e.

e então as regiões onde o anticorpo se ligou serão evidenciadas.b) Associação do anticorpo com um fluoróforo: que será posteriormente excitado com um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo. .

Protocolo de extração de proteínas totais 1. 3.2. Centrifugar lisado a 15. Plotar no Excel. consistindo num volume final de 200 ul para cada poço da placa.125 ug/ml. obtendo equação de ajuste linear. separados por 1 minuto de intervalo. 0.1. com as concentrações de BSA na abscissa e as absorbâncias médias na ordenada. adicionar 195 ul de reagente Bradford. Após aplicar as amostras de proteína na placa.0 ug/ml. sob leve agitação.75 ug/ml.000 g. Medir a absorbância da amostra do extrato total de proteína (média das triplicatas) e estimar o valor da concentração de proteínas na amostra (variável “x”) substituindo o valor da absorbância na equação linear resultante da curva padrão (variável “y”). Lembrar-se de aplicar o branco. Retirar o sobrenadante (extrato total de proteínas). por 5 minutos. Preparar curva padrão com as seguintes concentrações de BSA: 0.5 mM DTT. Prepara solução estoque de BSA 10 mg/ml. O ensaio de Bradford será realizado em placa de ELISA de 96 poços. no caso o tampão de extração de proteínas (seguir mesma mistura que as proteínas: 5 ul de tampão + 195 ul de reagente Bradford). 37ºC. 4. 0. 2. 200 mM KCl. Extração e Quantificação de proteínas 1. Diluir BSA em tampão de extração de proteínas. . Aplicar 5ul de amostra de proteína na placa. Efetuar leitura da absorbância no comprimento de onda de 595 nm em espectrofotômetro. 1. 0.000 g. 0. Diluir 10 vezes a solução para efetuar as diluições para preparar a curva de calibração.25 ug/ml. Incubar as amostras. a 4ºC. 1% coquetel de inibidor de protease. Ressuspender pellet de células em tampão de lise composto por 20 mM HEPES pH 7. por 10 min. 1. 5.9. Sonicar as células ressuspendidas 3 vezes no nível 3. Coletar células a 3. 0. 3. Protocolo de quantificação de proteínas totais pelo método de Bradford. 20% glicerol. 6.5 mM EDTA. 2. e 1.5% NP-40. 5 min. 7. com tempos de pulso de 10s. Construir curva de padronização. 0.5 ug/ml. 4.Metodologia 1. em triplicata.

Adicionar TEMED/PSA no gel de empilhamento e por em cima do gel de migração.Carregar as amostras e o marcador de peso molecular no gel.2. .Eliminar o isopropanol lavando com água destilada e secar com papel Watmann. Corrida . . .2. Preparo das Amostras .5 cm.Diluir o tampão com a amostra na proporção 1:4.Vortexar o tubo contendo o gel. . Preparo dos géis . 2.Colocar o pente referente ao tamanho do espaçador e polimerizar por 15 minutos. . adicionar isopropanol utilizando pipeta até completar altura de aproximadamente 0.Deixar polimerizar por aproximadamente 15 minutos . .Introduzir o cassete montado dentro do rack e em seguida fechar as abas.3. . 2.Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa menor voltada para o interior do suporte. .Colocar o cassete na cuba e preencher com o tampão de corrida. e depositar a solução até 5.Lavar os pocinhos com tampão de corrida (tampão de corrida 1X e SDS 1%). e aquecer por 3-5 min a 95˚C .Correr em 100 Volts até a amostra percorrer todo o gel de empilhamento . GEL SDS-PAGE 2.Tomar uma alíquota de 475 µl de tampão e adicionar 25 µl de 2-Mercaptoetanol.1. .Pré-aquecer o Sample Buffer 5x em banho-maria 37˚C .5 cm acima da marcação.Após depositar o gel de migração. Marcar a base dos pocinhos com caneta.

.Caso tenha transferido. Enxaguar várias vezes com água destilada até que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas. Transferência . remover os papéis Whatmann sem mover o gel e verificar se a transferência funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso Molecular.Aplicar uma corrente constante segundo as recomendações do equipamento usado. Western 3. Cortar 6 papéis Whatmann do mesmo tamanho (gerar a força de capilaridade). Molhar as pontas dos dedos com o Tampão de Transferência e transferir o gel para o sandwich depositando-o sobre a membrana.Passar para 150 Volts para correr pelo gel de migração durante aproximadamente 60min (o tempo de migração é relativo podendo variar de acordo com a concentração do gel de migração e tamanho da banda de interesse). com o auxílio de uma espátula.Hidratar a membrana em Tampão de Transferência durante 2 minutos e colocá-la sobre os papéis Whatmann. as bandas do Marcador serão bem visualizadas na membrana.Cortar a Membrana de Nitrocelulose nas dimensões do gel.Umedecer a superfície da plataforma superior do Transferidor e fechar o aparelho. separar as duas placas de vidro para retirar o gel.Umedecer a superfície da plataforma inferior do Aparelho Transferidor com o Tampão de Transferência. . Transferir a membrana para um recipiente contendo água destilada. .Enxaguar o excesso de sal e adicionar a Solução Vermelha de Ponceau. Montagem do “Sandwich” . . 3. Deixar agir durante 15 segundos e recuperar a solução. .Encharcar 3 papéis Whatmann em Tampão de Transferência e acomodá-los sobre a superfície do Aparelho Transferidor. . .2.Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular não tenham sido transferidas para a membrana. Rolar levemente uma pipeta de vidro sobre o pré-sandwich para eliminar possíveis bolhas. remontar o sandwich e continuar a transferência por um período maior. . .. 3. . Colocar os 3 papéis Whatmann umedecidos sobre o gel e eliminar as bolhas.Desmontar a cuba de eletroforese e desacoplar as placas de vidro.Após esse tempo.1.

.4. Em todos os casos. (200mg de BSA + 10mL de tampão de lavagem + Anticorpo).Deixar a membrana bloqueando sob leve agitação (orbital) durante 30 minutos a 1 hora. Incubação com o Anticorpo Secundário . 2 X 5 min.5. 3. O Anticorpo primário deve ser diluído segundo as recomendações do fabricante. devendo ser ajustado conforme o anticorpo). 3..Descartar a solução do Tampão de Lavagem e adicionar um volume de Tampão de Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso. . Revelação .3. . Se esse anticorpo for de quim de Tampão de Bloqueio.Vedar o recipiente com veda-filme e incubar a membrana “overnight” sob leve agitação orbital a 4oC.6.Adicionar 10 ml da Solução do Anticorpo Primário.Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que excitar o fluoróforo associado ao anticorpo secundário utilizado no experimento (700 ou 800nm). Bloqueio . 2 X 15 min. . . . Incubação com o Anticorpo Primário .Descartar a Solução do Anticorpo Secundário e lavar a membrana com aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos definidos abaixo: 2 X rápido.Adicionar 10mL da Solução do Anticorpo Secundário. (Obs: pode incubar por um tempo menor. 2 X 15 min. porém pode ser necessário padronizar esta diluição.Descartar a solução do Tampão de Bloqueio e enxaguar rapidamente a membrana com água destilada para remover o excesso de leite. 3. 3. . O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primário.Recuperar a Solução do Anticorpo Primário e lavar a membrana com aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos: 2 X rápido. 2 X 5 min.Enxaguar uma última vez com Tampão de Lavagem até que o Ponceau tenha desaparecido completamente. 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.Preparar a membrana para revelação.

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